專利名稱：Toll樣受體9阻斷劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種阻斷劑，特別涉及一種Toll樣受體9(TLR9)阻斷劑及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病原微生物感染人體通常引起全身或局部的免疫炎癥反應(yīng)。以往普遍認(rèn)為微生物的蛋白質(zhì)、脂多糖是主要的免疫剌激源，而最近研究發(fā)現(xiàn)微生物中特有的非甲基化CpG核苷酸序列片段(CpG-0DN)同樣具有免疫剌激作用，從而提示抗炎、抗過敏的策略不僅僅局限于傳統(tǒng)的方法，而需要考慮清除非甲基化CpG-ODN導(dǎo)致的致炎作用。
非甲基化CpG-ODN的致炎機(jī)制與哺乳動(dòng)物的眾多免疫細(xì)胞上具有TLR9受體(Tolllike rec印tor 9)有關(guān)。TLR9受體為I型跨膜蛋白，能特異性地識(shí)別來(lái)自病原微生物中非甲基化CpG-0DN中的CpG-motif結(jié)構(gòu)，與其結(jié)合后，能觸發(fā)經(jīng)典的TLR信號(hào)級(jí)聯(lián)，通過MyD88、 IRAK、 TRAF-6信號(hào)通路，活化MAP激酶、NF-KB等轉(zhuǎn)錄因子。這些因子啟動(dòng)了保守的前炎癥過程，導(dǎo)致TNF-a等前炎癥介質(zhì)的大量釋放，繼而引發(fā)后續(xù)的炎癥效應(yīng)。因此，尋找阻斷由TLR9介導(dǎo)的前炎癥反應(yīng)，對(duì)于臨床感染導(dǎo)致的抗炎抗過敏治療具有積極的意義。
雖然CpG-0DN是已明確的TLR9配基，但是不同結(jié)構(gòu)的CpG-0DN仍然具有不同的特性，主要表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面一是種屬特異性，如(l)CpG-0DN1826對(duì)鼠免疫細(xì)胞有很強(qiáng)剌激作用，而對(duì)人的免疫細(xì)胞沒有作用；(2)CpG-0DN2216對(duì)人有作用，對(duì)鼠無(wú)作用；(3)CpG-ODN M362對(duì)兩者均有作用；二是效應(yīng)強(qiáng)度差異，開始發(fā)現(xiàn)的主要剌激性CpG-ODN片段，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)有些CpG-ODN片段被認(rèn)為具有中和作用，能消除剌激性CpG-ODN的致炎效應(yīng)，然而，迄今不明確是否通過TLR9拮抗方式來(lái)起作用，更不明確這些CpG-ODN的結(jié)構(gòu)特征，更同時(shí)，也未見通過阻斷TLR9受體來(lái)進(jìn)行抗炎、抗過敏的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種Toll樣受體9(TLR9)阻斷劑及應(yīng)用。所述阻斷劑能特異性與TLR9結(jié)合，有效阻斷其它剌激性配基與TLR9的結(jié)合，抑制由此受體介導(dǎo)的前炎癥效應(yīng)，可用于抗炎、抗過敏的輔助治療。
本發(fā)明的技術(shù)方案是 Toll樣受體9特異性阻斷劑，其特征在于所述阻斷劑為非甲基化CpG核苷酸序列片段，其核心結(jié)構(gòu)為CGCG核苷酸序列。 所述非甲基化CpG核苷酸序列片段的長(zhǎng)度為12-30個(gè)核苷酸。 所述非甲基化CpG核苷酸序列片段的核心結(jié)構(gòu)CGCG位于序列第4_7位點(diǎn)。 所述非甲基化CpG核苷酸序列片段的側(cè)翼序列為來(lái)自微生物基因組核苷酸序列
或人工設(shè)計(jì)的核苷酸序列結(jié)構(gòu)。 所述非甲基化CpG核苷酸序列為骨架為全硫代，其分子結(jié)構(gòu)為
Toll樣受體9特異性阻斷劑用于制備抗炎、抗過敏的輔助治療藥物以及制備免疫炎癥的實(shí)驗(yàn)用試劑的應(yīng)用。 本發(fā)明所述核心結(jié)構(gòu)為CGCG核苷酸序列的非甲基化CpG核苷酸序列片段能與TLR9發(fā)生特異性結(jié)合，并阻斷其它具有剌激性配基與TLR9結(jié)合，具有較高親和力， 一般不具有炎癥剌激性，沒有細(xì)胞毒性，能夠到達(dá)拮抗并阻斷其它剌激分子與TLR9的結(jié)合，從而抑制前炎癥效應(yīng)。 本發(fā)明所述的CpG-ODN可用于輔助治療抗微生物感染所致的過度炎癥和過敏性疾病，以及作為生物醫(yī)學(xué)科研試劑輔助有關(guān)炎癥和過敏的研究，具有廣泛的應(yīng)用前景。用于臨床抗炎、抗炎過敏輔助治療藥物，其作用靶點(diǎn)明確、阻斷活性較高、安全性好的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所述的CpG-0DN可以注射劑或輸液劑等形式給藥。 本發(fā)明所述的CpG-ODN體外實(shí)驗(yàn)證明，所述阻斷劑能夠顯著阻斷等當(dāng)量的剌激分子， 一般地，兩倍于剌激劑或2 ii M阻斷劑能夠較為完全地阻斷1 X 106個(gè)免疫細(xì)胞上的TLR9受體。 上述CpG-0DN可以通過化學(xué)合成的方法獲得。


圖1為MTT檢測(cè)CpG-0DN c41對(duì)RAW264. 7的細(xì)胞毒性； 圖2為MTT檢測(cè)CpG-0DN c32對(duì)RAW264. 7的細(xì)胞毒性； 圖3為MTT檢測(cè)CpG-0DN c35對(duì)RAW264. 7的細(xì)胞毒性； 圖4為MTT檢測(cè)CpG-0DN c41對(duì)人巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性； 圖5為MTT檢測(cè)CpG-0DN c32對(duì)人巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性； 圖6為MTT檢測(cè)CpG-0DN c35對(duì)人巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性； 圖7為CpG-0DN c41競(jìng)爭(zhēng)性阻斷RAW264. 7細(xì)胞TLR9對(duì)TNF- a釋放影響； 圖8為CpG-0DN c32競(jìng)爭(zhēng)性阻斷RAW264. 7細(xì)胞TLR9對(duì)TNF- a釋放影響； 圖9為CpG-0DN c35競(jìng)爭(zhēng)性阻斷RAW264. 7細(xì)胞TLR9對(duì)TNF- a釋放影響； 圖10為CpG-0DN c41競(jìng)爭(zhēng)性阻斷人巨噬細(xì)胞TLR9對(duì)TNF_ a釋放影響； 圖11為CpG-0DN c32競(jìng)爭(zhēng)性阻斷人巨噬細(xì)胞TLR9對(duì)TNF_ a釋放影響； 圖12為CpG-0DN c35競(jìng)爭(zhēng)性阻斷人巨噬細(xì)胞TLR9對(duì)TNF_ a釋放影響。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但不以此限制本發(fā)明。 實(shí)施例1 CpG-0DN樣TLR9阻斷劑實(shí)例及制備 1. 1阻斷劑名稱C41序列結(jié)構(gòu)TGGCGCGCACCCACGGCCTG 1. 2阻斷劑名稱C32序列結(jié)構(gòu)CTTCGCGTTAGCGTTGAGTG 1. 3阻斷劑名稱C35序列結(jié)構(gòu)TTGCGCGCCCTCCATCGAGG 以上三種CpG-0DN樣TLR9阻斷劑均具有該發(fā)明所述結(jié)構(gòu)特征，即于第4_7位點(diǎn)處具有CGCG核心結(jié)構(gòu)，只是側(cè)翼序列有所不同，均具有類似的阻斷作用。其制備方式為化
4學(xué)合成全硫代核苷酸片段(委托上海生工生物有限公司合成)，以上每種阻斷劑合成量為300D。 實(shí)施例2 CpG-0DN樣TLR9阻斷劑對(duì)細(xì)胞活力影響的測(cè)定(MTT法) 2. 1主要材料、試劑與設(shè)備 l)MTT試劑Sigma， Inc. USA. 2)DMEM培養(yǎng)液(1L/袋)，Gibco， Inc. USA. 3) 二甲基亞砜，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司。 4)酶標(biāo)儀:Bio-RAD Model 550. 5)細(xì)胞培養(yǎng)箱FORMA 3111. 6) RAW264. 7細(xì)胞株ATCC， USA. 7)(健康)人外周血巨噬細(xì)胞西南醫(yī)院血庫(kù)提供 2. 2實(shí)驗(yàn)方法采用四氮噻唑藍(lán)(MTT)法，用DMEM培養(yǎng)液將鼠RAW264. 7細(xì)胞和人外周血巨噬細(xì)胞分別稀釋至1X106/mL，加入96孔板(200iiL/孔)，置37。C，5X C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，C41、C32、C35三種阻斷劑均分別按不同濃度(0. 5線1線2線4 y M)依次設(shè)立實(shí)驗(yàn)組；正常對(duì)照組不加任何試劑。各組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄上清，每孔加入180 ii L DMEM培養(yǎng)液和20 ii L MTT溶液(5g/L)，再繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入150ii L 二甲基亞砜，振蕩lOmin使結(jié)晶充分溶解，以550nm處測(cè)定的各孔吸光度(0D55。)值表示鼠RAW264. 7細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞活力。 2. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的C41、C32、C35對(duì)鼠RAW264. 7細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞活力均無(wú)影響(P > 0. 05)，表明其對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用和增殖剌激作用。結(jié)果如附圖1-6所示。 實(shí)施例3 :CpG-ODN樣TLR9阻斷劑對(duì)剌激分子誘導(dǎo)RAW264. 7細(xì)胞和人外周血巨噬
細(xì)胞釋放TNF-a的影響 3. 1主要材料、試劑與設(shè)備 l)DMEM培養(yǎng)液(1L/袋)，Gibco， Inc. USA. 2)人TNF- a ELISA i式劑盒，eBioscience， Inc. USA. 3)鼠TNF- a ELISA i式劑盒，eBioscience, Inc. USA. 4)酶標(biāo)儀:Bio-RAD Model 550. 5)細(xì)胞培養(yǎng)箱FORMA 3111. 6) RAW264. 7細(xì)胞株ATCC， USA. 7)(健康)人外周血巨噬細(xì)胞西南醫(yī)院血庫(kù)提供 3. 2實(shí)驗(yàn)方法采用DMEM培養(yǎng)液將鼠RAW264. 7細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞分別稀釋至1X106/mL，分別加入96孔板(200 iiL/孔，各實(shí)驗(yàn)組為4復(fù)孔)，在37°C 、5% C02條件下孵育2h，細(xì)胞貼壁后，更換細(xì)胞上清為200 L無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組依次加入終濃度為1 M的TLR9剌激分子(CpG-ODN 1826 (鼠敏感)、CpG_0DN2216 (人敏感)、CpG-ODNM362(人鼠敏感))，除作為陽(yáng)性對(duì)照外，相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組分別補(bǔ)加C41、C32、C35三種不同的阻斷劑，每種阻斷劑均分別按以下濃度分組0. 5 M、 1 M、2 M，繼續(xù)孵育4h ;同時(shí)設(shè)不加任何藥物的空白對(duì)照組(medium)，繼續(xù)孵育4h ;取上清按照人和鼠ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，檢測(cè)TNF-a濃度，結(jié)果以均值表示。
3. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果1)C41、C32、C35阻斷劑與空白對(duì)照相比無(wú)顯著差異(P > 0. 05)， 不刺激細(xì)胞釋放TNF-a，表明自身無(wú)炎癥剌激效應(yīng)。2)各阻斷劑在l-2i!M均能顯著抑制 TLR9剌激分子對(duì)鼠RAW264. 7細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞的TNF- a釋放，量效關(guān)系明顯。結(jié)果如附 圖7-12所示。 序列表 〈110〉中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 〈120>Toll樣受體9阻斷劑及應(yīng)用 〈130〉 〈160>3 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉阻斷劑C41的序列 〈400〉 1 tggcgcgcac ccacggcctg 20 〈210>2 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉阻斷劑C32的序列 〈400>2 cttcgcgtta gcgttgagtg 20 〈210>3 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉阻斷劑C35的序列 〈400>3 ttgcgcgccc tccatcgagg 20
權(quán)利要求
一種Toll樣受體9特異性阻斷劑，其特征在于所述阻斷劑為非甲基化CpG核苷酸序列片段，其核心結(jié)構(gòu)為CGCG核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的Toll樣受體9特異性阻斷劑，其特征在于所述非甲基化CpG 核苷酸序列片段的長(zhǎng)度為12-30核苷酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的Toll樣受體9特異性阻斷劑，其特征在于所述非甲基化CpG 核苷酸序列片段的核心結(jié)構(gòu)CGCG位于序列第4-7位點(diǎn)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Toll樣受體9特異性阻斷劑，其特征在于所述非甲基化 CpG核苷酸序列片段的側(cè)翼序列為來(lái)自微生物基因組核苷酸序列或人工設(shè)計(jì)的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的Toll樣受體9特異性阻斷劑，其特征在于所述非甲基化CpG 核苷酸序列為骨架為全硫代，其分子結(jié)構(gòu)為NNNCGCGNNNNNNNNNNNNN。
6. 權(quán)利要求1-5任一所述的Toll樣受體9特異性阻斷劑用于制備抗炎、抗過敏的輔助 治療藥物以及制備免疫炎癥的實(shí)驗(yàn)用試劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對(duì)Toll樣受體9(TLR9)的特異性阻斷劑，所述阻斷劑為非甲基化CpG核苷酸序列片段，其核心結(jié)構(gòu)為CGCG核苷酸序列，所述非甲基化CpG核苷酸序列片段的長(zhǎng)度為12-30核苷酸。所述阻斷劑能特異性與TLR9結(jié)合，有效阻斷其它刺激性配基與TLR9的結(jié)合，抑制由此受體介導(dǎo)的前炎癥效應(yīng)，可用于抗炎、抗過敏的輔助治療以及制備免疫炎癥的實(shí)驗(yàn)用試劑。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101712957SQ20091019157
公開日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者向陽(yáng), 周紅, 曹紅衛(wèi), 李彥, 王寧, 趙苛岑, 鄭江, 魯永玲 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院