專利名稱：：廣譜抗病毒的治療和預(yù)防的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可用于預(yù)防和治療人與動物個體病原感染的治療組合物，而且特別是可用于預(yù)防和治療病毒感染，例如預(yù)防和治療流感性感染，基于蛋白質(zhì)的治療組合物。相關(guān)文獻的描述流感是一種高傳染性急性呼吸道疾病，從古時起即困擾人類。其特征是每年復(fù)發(fā)的流行病和周期性的、主要的全球性大流行病。由于該疾病相關(guān)的發(fā)病率和死亡率較高，流感對社會經(jīng)濟的直接和間接影響是巨大的。僅在美國，每年的流行病導(dǎo)致300，000人住院和25，000人死亡。上世紀(jì)爆發(fā)了四次大流行??；共導(dǎo)致數(shù)千萬人死亡?；谠缙诖罅餍胁〗?jīng)驗的數(shù)學(xué)模型，預(yù)計在下一次大流行病期間將發(fā)生89，000-207，000人死亡，18-42百萬人門診病人就診和20-47百萬人患另外的疾病(Meltzer，MI,Cox,NJ和Fukuda，K.(1999)EmergInfectDis5:659_671)。流感主要由兩種類型病毒，流感病毒A型和流感病毒B型(第三種類型的流感病毒C型只導(dǎo)致少數(shù)人的普通傷風(fēng)樣癥狀)，感染而引起。它們屬于RNA病毒的正粘病毒科。A型和B型病毒都具有封閉在源自宿主細(xì)胞的脂包封(lipidenvelope)中的、8節(jié)段的負(fù)鏈RNA基因組。這種病毒包封被刺突覆蓋，該刺突由三種類型的蛋白質(zhì)組成血凝素(HA)，將病毒附著于宿主細(xì)胞受體和調(diào)節(jié)病毒的與細(xì)胞的膜融合；神經(jīng)氨酸酶(NA)，便利于新病毒從宿主細(xì)胞中釋放；以及少數(shù)的M2蛋白，用作離子通道。流感A型和B型病毒的感染主要始于上呼吸道粘膜表面。病毒復(fù)制主要被限于上呼吸道，但是能夠延伸至下呼吸道，而且導(dǎo)致可致命的支氣管肺炎。流感病毒的蛋白血凝素(HA)是主要的病毒包封蛋白。其在病毒感染中發(fā)揮著重要作用。HA的重要性已經(jīng)被下列事實所證明，它是用于保護宿主免疫應(yīng)答產(chǎn)生的中性抗體的主要靴(Hayden,FG.(1996)InAntiviraldrugresistance(主編D.D.Richman)，pp.59-77.Chichester,UKJohnffiley&SonsLtd·)?，F(xiàn)已明確，HA在病毒感染中具有兩種不同的功能。首先，HA負(fù)責(zé)將病毒附著于唾液酸細(xì)胞受體。其次，HA通過刺激病毒包封與細(xì)胞膜融合來調(diào)節(jié)病毒進入靶細(xì)胞。HA被合成為前體蛋白，ΗΑ0，其作為三聚體分子復(fù)合物從高爾基體被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面。HAO被進一步切割，產(chǎn)生HAl的C末端(ΗΑ0的328殘基)和HA2的N末端。通常認(rèn)為，切割發(fā)生在細(xì)胞表面或在被釋放的病毒之上。對于HA結(jié)合至唾液酸受體而言，不需要HAO切割成HA1/HA2；但是，據(jù)認(rèn)為，對于病毒的感染性而言還是必要的(Klenk，HD和Rott，R.(1988)AdvVirRes.34247-281;Kido，H，Niwa，Y，Beppu，Y*Towatari，T.(1996)AdvanEnzymeRegul36325-347；Skehel,JJandWiley,DC.(2000)AnnuRevBiochem69531-569；Zambon,Μ.(2001)RevMedVirol11:227_241.)目前，通過疫苗接種和抗病毒化合物來控制流感。滅活流感疫苗現(xiàn)已在全世界范圍內(nèi)使用，尤其用于高危人群。將疫苗病毒生長在能繁殖的母雞卵中，通過化學(xué)手段滅活和純化。疫苗通常是三價的，含有代表性的流感A型病毒(Hmi和H3N2)和流感B型病毒株。為了維持有效性，需要定期更新疫苗株；世界衛(wèi)生組織(WHO)協(xié)調(diào)此工作。在洲際大流行病(inter-pandemic)期間，在更新的流感疫苗可以上市前通常需要8個月(Wood，J.(2001)PhilTransRSocLondB356:1953-1960)。盡管如此，從歷史上看，在6個月內(nèi)大流行病傳播至大多數(shù)的洲，而且隨著國際旅游的增加，預(yù)計未來大流行病傳播得更快(Gust，ID,Hampson,Aff.，和Lavanchy，D.(2001)RevMedVirol11:59_70)。因此，不可避免的是，在未來大流行病的第一輪期間有效的疫苗將是得不到的或者非常短缺的?？共《净衔镆呀?jīng)成為治療洲際大流行性疾病主流。目前，在初始階段當(dāng)?shù)貌坏揭呙鐣r，它們也是唯一用于控制大流行病的有效選擇。目前上市的有兩類抗病毒化合物M2抑制劑，例如金剛烷胺和金剛乙胺；和NA抑制劑，其包括奧司他韋(Tamiflu)和扎那米韋(Relenza)。兩類分子都證明了在預(yù)防和治療流感方面的有效性。但是，就作為化學(xué)預(yù)防(chemoprophylaxis)廣泛地使用它們而言，副作用和產(chǎn)生抗藥性病毒的風(fēng)險仍然是兩個主要的顧慮(Hayden,FG.(1996)InAntiviraldrugresistance(主編D.D.Richman)，pp.59-77.Chichester,UKJohnffiley&SonsLtd.)。最重要的是，未來大流行病毒株，既可能是自然進化的也可能是通過生物戰(zhàn)爭中遺傳工程人造的，對所有可獲得的抗病毒化合物有抗性，這將導(dǎo)致全球毀滅性后果?？傊?，目前可獲得的疫苗免疫和抗病毒化合物都受限于一些基礎(chǔ)性缺陷，需要新的治療和預(yù)防形式來應(yīng)對未來流感大流行病。發(fā)明概述本發(fā)明認(rèn)識到用于預(yù)防和治療病原感染的現(xiàn)有治療常常是難于及時的提供，有副作用，以及導(dǎo)致抗藥性病原株。本發(fā)明提供了預(yù)防和治療病原感染的新組合物和方法。特別是，本發(fā)明提供了化合物，所述化合物具有將該化合物錨定至靶細(xì)胞表面的錨定域，和在細(xì)胞外發(fā)揮作用來預(yù)防病原如病毒對靶細(xì)胞感染的治療域。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療病原感染的、基于蛋白質(zhì)的組合物。所述的組合物包含一種化合物，該化合物包含至少一個含一種肽或蛋白質(zhì)的治療域，這里所述的治療域具有至少一種能預(yù)防病原對靶細(xì)胞感染的細(xì)胞外活性，和至少一個可結(jié)合在或者接近靶細(xì)胞膜的錨定域。在本發(fā)明這方面的一些具體實施例中，所述至少一個治療域包括預(yù)防或阻止病原對靶細(xì)胞感染的一種抑制活性。在優(yōu)選的具體實施例中，所述的抑制活性抑制能加工靶細(xì)胞感染必需的病毒蛋白質(zhì)的蛋白酶活性。在特別優(yōu)選的具體實施例中，所述的化合物包括能抑制流感病毒的HA蛋白加工的治療域，和能在呼吸道上皮細(xì)胞表面結(jié)合該化合物的錨定域。在本發(fā)明的一些具體實施例中，至少一個治療域包括催化活性。在優(yōu)選的具體實施例中，所述的催化活性從靶細(xì)胞表面除去靶細(xì)胞感染必需的部分。在特別優(yōu)選的具體實施例中，所述的治療域是在上皮靶細(xì)胞表面上能消化唾液酸部分的唾液酸酶，以及所述的錨定域是在上皮細(xì)胞表面能結(jié)合肝素或者硫酸乙酰肝素部分的人蛋白質(zhì)的GAG-結(jié)合域。另一個方面，本發(fā)明包括一種用于治療或者預(yù)防病原在個體中感染的藥物組合物。所述的藥物組合物含有包含至少一個治療域和至少一個錨定域的本發(fā)明化合物。所述的藥物組合物還可含有溶液、穩(wěn)定劑、填充劑及其他。在一些優(yōu)選的具體實施例中，將所述的藥物組合物制成吸入劑。在一些優(yōu)選的具體實施例中，將該藥物組合物制成鼻噴劑。另一方面，本發(fā)明包括一種治療或者預(yù)防病原感染的方法。所述的方法包括將一種藥學(xué)上有效量的本發(fā)明化合物應(yīng)用于至少一種個體的靶細(xì)胞。通過使用噴劑或吸入劑，來應(yīng)用所述的藥物組合物。圖1是抑肽酶(aprotinin)主要的氨基酸示意描述。圖2表示下列四種人類基因的GAG-結(jié)合序列PF4，人血小板因子4；IL8，人白介素8;ATIII，人抗凝血酶III；ApoE，人阿樸脂蛋白E；AAMP，人血管相關(guān)遷移細(xì)胞蛋白。圖3表示的是人唾液酸酶NEU2和NEU4之間的序列比較。圖4表示的是細(xì)菌和真菌唾液酸酶的底物特異性對比的表格。本發(fā)明的詳細(xì)描述^X除另有定義外，這里使用的所用技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員一般理解的相同含義。一般而言，這里使用的命名和下面描述的制造或?qū)嶒灢襟E是本領(lǐng)域熟知的和經(jīng)常使用的。這些步驟都是使用常規(guī)的方法，如本領(lǐng)域和各種一般參考文獻規(guī)定的那些。當(dāng)以單數(shù)規(guī)定術(shù)語時，本發(fā)明人也考慮到了該術(shù)語的復(fù)數(shù)。在引入作為參考的文獻中使用的術(shù)語和定義存在歧義時，本申請中使用的術(shù)語將在這里給出定義。如在本公開通篇使用的，下列術(shù)語，除非另有說明，應(yīng)當(dāng)被理解為具有如下的含義一種“病原”可以是能感染細(xì)胞的任何的病毒或微生物。一種病原可以是一種病毒、細(xì)菌或者原生蟲。一種“靶細(xì)胞”是能被病原感染任何細(xì)胞。一種“能預(yù)防病原對靶細(xì)胞感染的細(xì)胞外活性”是指通過在或接近靶細(xì)胞表面外部起作用能阻礙或阻止病原對靶細(xì)胞感染的任何活性。所述的細(xì)胞外活性可以是如，但不限于，催化活性或者抑制性活性的一種活性。例如，催化活性可以是一種能破壞病原上、靶細(xì)胞上或者在靶細(xì)胞鄰近內(nèi)的一種或多種實體(如，但不限于，配體、受體或者酶)的酶活性，其中，所述的一種或多種實體有助于該感染過程。催化活性也可修飾病原上、靶細(xì)胞上或者在靶細(xì)胞鄰近內(nèi)的一種或多種實體，以致于該實體的促進感染性質(zhì)被減少。抑制性活性可以是指這樣的活性，例如，結(jié)合受體或配體和防止該受體和配體結(jié)合部分(moiety)，其中，所述的結(jié)合是感染過程必需的或者促進感染過程。抑制性活性也可以是一種酶或者受體的抑制劑，所述的抑制劑防止該酶或受體發(fā)揮感染過程必需的或促進感染過程的作用。靶細(xì)胞的外部包括該靶細(xì)胞膜自身以及圍繞靶細(xì)胞的細(xì)胞外圍(extracelluarmilieu),包括細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)空間和細(xì)胞腔空間。就上皮細(xì)胞而言，靶細(xì)胞的外部還包括形成腔襯(luminallining)的細(xì)胞膜的頂端或腔表面，和接近腔表面的細(xì)胞外圍。一種“能預(yù)防病原對靶細(xì)胞感染的細(xì)胞外活性”可以是任何類型化學(xué)實體，包括蛋白質(zhì)、多肽、肽、核酸、肽核酸、核酸類似物、核苷、核苷類似物、小的有機分子、聚合物、脂類、留體、脂肪酸、碳水化合物及其它，包括它們的任意組合。盡管如此，優(yōu)選地，該活性包括一種肽或蛋白質(zhì)或者被偶合到一種肽或蛋白質(zhì)。一種“能錨定所述至少一個治療域至靶細(xì)胞膜的域”，也稱作“細(xì)胞外錨定域”或者簡稱，“錨定域”是指這樣的化學(xué)實體，其能穩(wěn)定地結(jié)合位于或在細(xì)胞表面外部上或者在細(xì)胞表面鄰近內(nèi)的部分。細(xì)胞外錨定域可以被可逆或不可逆地連接至一個或多個部分，如，優(yōu)選地，一個或多個治療域，和因此導(dǎo)致一個或多個被附著的治療部分被保留在或者鄰近真核細(xì)胞外表面。優(yōu)選地，細(xì)胞外錨定域結(jié)合至少一種在靶細(xì)胞表面上的分子或者一種發(fā)現(xiàn)與靶細(xì)胞表面有密切相關(guān)的分子。例如，細(xì)胞外錨定域能共價或者非共價地結(jié)合與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜相關(guān)的分子，或者結(jié)合存在于靶細(xì)胞周圍細(xì)胞外基質(zhì)的分子。細(xì)胞外錨定域優(yōu)選地是一種肽、多肽或者蛋白質(zhì)，而且也可含有任何另外類型的化合物實體，包括一種或多種另外的蛋白質(zhì)、多肽或者肽、核酸、肽核酸、核酸類似物、核苷、核苷類似物、小的有機分子、聚合物、脂質(zhì)、留體、脂肪酸、碳水化合物，或者它們?nèi)我獾慕M合。如這里所用的，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或肽與參考序列相同，或者含有一個或多個氨基酸缺失、一個或多個另外的氨基酸或者一種或多種保持型(conservative)氨基酸取代，和保留與參考序列相同或基本相同的活性的時候，蛋白質(zhì)或肽序列與參考序列是“實質(zhì)同源的”。保持型取代可定義為下列五組中之一的互換I.小的、脂肪族的、非極性或弱極性殘基Ala，Ser,Thr,Pro,GlyII.極性、帶負(fù)電荷殘基及其酰胺Asp，Asn,Glu,GlnIII.極性、帶正電荷殘基His，Arg,LysIV.大的、脂肪族非極性殘基Met，Leu,lie,Val,CysV.大的芳香族殘基Phe，Try,Trp在上述的各組中，下列的取代被認(rèn)為是“高度保持型”:Asp/Glu，His/Arg/Lys,Phe/Tyr/Trp，和Met/Leu/Ile/Val。半保持型取代定義為在上述(I)-(IV)兩組之間的互換，限定于包括上述(I)、(II)、和(III)的大組㈧或者包括(IV)和(V)的大組(B)。另夕卜，在應(yīng)用中指定為疏水性氨基酸，它們是指Ala、Gly、Pro、Met、Leu、lie、Val、Cys、Phe和Trp,而親水性氨基酸是指Ser、Thr、Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Lys和Tyr?！巴僖核崦浮笔且环N能從底物分子除去唾液酸殘基的酶。唾液酸酶(N-acylneuraminosylglycohydrolases,EC3.2.1.18)是一組從唾液酸化糖綴合物(sialo-glycoconjugates)中水解除去唾液酸殘基。唾液酸是具有9碳骨架的α-酮酸，常見于附著于糖蛋白和糖脂的寡糖鏈的最外端。其中一個主要類型的唾液酸是N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，為大多數(shù)其它類型的生物合成前體。底物分子可以是，作為非限定性例子，寡糖、多糖、糖蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂或者一種合成的分子。例如，唾液酸酶能切斷在唾液酸殘基和底物分子剩余部分之間具有α(2，3)-Gal,α(2，6)_Gal或者α(2，8)-Gal連接的鍵。唾液酸酶也能切斷在唾液酸殘基和該底物分子剩余部分之間的任何的或者所有的連接。在自然界中發(fā)現(xiàn)了在Neu5Ac與碳水化合物支鏈的次末端半乳糖殘基之間兩種主要的連接，Neu5Acα(2，3)-Gal和Neu5Acα(2，6)-GalοNeu5Acα(2，3)-Gal和Neu5Acα(2，6)-Gal分子都能被流感病毒認(rèn)作受體，然而人類的病毒似乎優(yōu)選Neu5Acα(2，6)_6￡11，禽類和馬科的病毒主要識別徹1154(3α(2，3)_Gal。唾液酸酶可以是天然唾液酸酶、(基因)工程唾液酸酶(例如，但不限于，具有基于天然唾液酸酶序列的氨基酸序列的唾液酸酶，包括與天然唾液酸酶序列是實質(zhì)上同源的序列)。如這里所用的，“唾液酸酶”也可以是指天然唾液酸酶的活性部分，或者含有基于天然唾液酸酶活性部分序列的一種肽或蛋白質(zhì)。I預(yù)防或者治療病原感染的組合物本發(fā)明包括基于肽或者蛋白質(zhì)的化合物，所述的化合物含有至少一個能將至少一個治療域錨定至真核細(xì)胞膜的域，和至少一個具有預(yù)防病原感染細(xì)胞活性的治療域。所述的“基于肽或者蛋白質(zhì)”化合物，其含義為該化合物的兩個主要域具有氨基酸構(gòu)架，其中氨基酸是通過肽鍵連結(jié)的。一種基于肽或者蛋白質(zhì)的化合物也可具有附著至該氨基酸構(gòu)架或骨架的其它化學(xué)化合物或基團，包括有助于錨定域的錨定活性的部分、或者有助于預(yù)防感染活性或治療域的部分。例如，本發(fā)明的基于蛋白質(zhì)的治療劑可含有化合物和分子如但不限于碳水化合物、脂肪酸、脂質(zhì)、留體、核苷、核苷類似物、核酸分子、核酸類似物、肽核酸分子、小的有機分子或者聚合物。本發(fā)明的基于蛋白質(zhì)的治療劑也可含有修飾的或者非天然氨基酸。所述化合物的非氨基酸部分可用作任何目的，包括但不限于便于該化合物的純化，改善溶解度或分配或者該化合物(如在治療制劑中)，該化合物的域連接或者將化學(xué)部分連接至該化合物，有助于該化合物二維或者三維結(jié)構(gòu)，增加該化合物總的大小，提高該化合物的穩(wěn)定性，以及有助于該化合物錨定活性或治療活性。本發(fā)明基于肽或者蛋白質(zhì)的化合物，除了含有錨定域或治療域的那些序列外，也可包括蛋白質(zhì)或者肽序列。所述另外的蛋白質(zhì)序列可用于任何目的，包括但不限于上面概括的任何目的(便于該化合物的純化，改善溶解度或分配或者該化合物，該化合物的連接域或者將化學(xué)部分連接至該化合物，有助于該化合物二維或者三維結(jié)構(gòu)，增加該化合物總的大小，提高該化合物的穩(wěn)定性，或者有助于該化合物錨定活性或治療活性)。優(yōu)選地，任何另外的蛋白質(zhì)或氨基酸序列是包括錨定域(或域)和治療域(或域)的單一多肽或蛋白質(zhì)鏈的部分，但是蛋白質(zhì)序列任何可行的排列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。能以任何合適的方式排列所述的錨定域和治療域，允許該化合物結(jié)合在或者接近靶細(xì)胞膜，以便于該治療域能發(fā)揮預(yù)防或者阻止病原對靶細(xì)胞感染的細(xì)胞外活性。所述化合物優(yōu)選地具有至少一個基于蛋白質(zhì)或肽的錨定域和至少一個基于肽或蛋白質(zhì)的治療域。在此情況下，可以沿著肽骨架以任何順序、線性地排列該域。該錨定域可以是治療域的N末端、或者可以是治療域的C末端。也可能的是，具有一個或多個治療域在每個末端被至少一個錨定域側(cè)接。換言之，一個或多個錨定域可以被至少一個治療域在每個末端側(cè)接?？扇芜x使用化學(xué)的優(yōu)選肽的連接子連結(jié)化合物一些或全部的該域。也可能的是，具有以非線性、分支排列的域。例如，治療域可以被附著于氨基酸的衍生側(cè)鏈，該氨基酸是多肽鏈的部分，也包括或者被連接至錨定域。本發(fā)明的化合物可具有一種以上的錨定域。在化合物具有一種以上錨定域的情況下，該錨定域可以是相同的或不同的。本發(fā)明的化合物可具有一種以上的治療域。在化合物具有一種以上治療域的情況下，該治療域可以是相同的或不同的。當(dāng)化合物含有多個錨定域時，該錨定域被(使用或者沒使用連接子)串聯(lián)排列，或者被排列在其它域如治療域的交替?zhèn)让?。?dāng)化合物含有多個治療域時，該治療域被(使用或者沒使用連接子)串聯(lián)排列，或者被排列在其它域如，但不限于，錨定域的交替?zhèn)让?。本發(fā)明的基于肽或蛋白質(zhì)的化合物可以任何適宜的方式制備，包括純化天然蛋白質(zhì)，任選地蛋白水解切斷該蛋白質(zhì)以獲得所需的功能域，以及將該功能域綴合至其它功能域。肽也可以化學(xué)合成，和任選地化學(xué)綴合至其它的肽或化學(xué)部分。盡管如此，優(yōu)選地，本發(fā)明的基于肽或蛋白質(zhì)的化合物是通過(遺傳)工程核酸構(gòu)建將至少一種錨定域和至少一種治療域共同(使用或者不使用核酸連接子)編碼在一個連續(xù)多肽中制備的。該核酸構(gòu)建，優(yōu)選具有適宜表達序列的，可以轉(zhuǎn)染至原核或真核細(xì)胞，而且基于蛋白質(zhì)治療化合物可以通過細(xì)胞表達和純化。任何想得到的化合物部分都可以在純化后綴合到基于肽或蛋白質(zhì)的化合物。在有些情況下，可以選擇細(xì)胞系來表達基于蛋白質(zhì)的治療，能夠進行滿意的后轉(zhuǎn)譯修飾(post-translationalmodifi-cations)(例如，但不限于糖基化)。可以設(shè)計大量的構(gòu)建，以及檢驗它們的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的期待活性(如，例如，錨定域的結(jié)合活性，或者治療域的結(jié)合、催化或抑制活性)。也可以檢測核酸構(gòu)建的蛋白質(zhì)產(chǎn)品在預(yù)防或阻止病原對靶細(xì)胞感染方面的有效性。在現(xiàn)有技術(shù)中，已知病原感染體外和體內(nèi)的檢驗，如在流感病毒感染的實施例中描述的那些。錨定域如這里所用的，“細(xì)胞外錨定域”或“錨定域”是指任何的能穩(wěn)定地結(jié)合位于或在靶細(xì)胞外表面上或者鄰近靶細(xì)胞外表面的實體。錨定域用于保持本發(fā)明化合物位于或接近靶細(xì)胞的外表面。細(xì)胞外錨定域優(yōu)選地結(jié)合1)表達在靶細(xì)胞表面上的分子，或者表達在靶細(xì)胞表面上分子的殘基、域或表位，2)附著至表達在靶細(xì)胞表面上分子的化學(xué)實體，或者3)靶細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)的分子。錨定域優(yōu)選地為肽或蛋白質(zhì)的域(包括修飾的或衍生的肽或者蛋白質(zhì)的域)，或者包含偶連至肽或蛋白質(zhì)的部分。偶連至肽或蛋白質(zhì)的部分可以是任何類型的能有助于錨定域結(jié)合至位于或接近靶細(xì)胞表面的分子，而且優(yōu)選地是有機分子，如，例如核酸、肽核酸、核酸類似物、核苷、核苷類似物、小的有機分子、聚合物、脂質(zhì)、留體、脂肪酸、碳水化合物，或者它們的任意組合。通過錨定域結(jié)合的分子、復(fù)合物、域或表位對靶細(xì)胞可以是或者不是特異性的。例如，錨定域可結(jié)合存在于分子上之上或在靶細(xì)胞鄰近表位，以及在位點而不是靶細(xì)胞附近發(fā)生的表位。在許多情況下，盡管如此，本發(fā)明治療化合物的局部化傳輸限制其主要出現(xiàn)在靶細(xì)胞表面。在其它情況下，錨定域結(jié)合的分子、復(fù)合物、部分、域或者表位對靶組織或靶細(xì)胞類型可以是特異性的。靶組織或靶細(xì)胞包括動物或人體內(nèi)病原侵入或擴增的位點。例如，靶細(xì)胞可以是能被病原感染的上皮細(xì)胞。本發(fā)明的組合物可以含有治療域，該治療域能結(jié)合細(xì)胞表面的表位，例如對上皮細(xì)胞類型是特異性的表位。在另一個例子中，靶細(xì)胞可以是一種上皮細(xì)胞，而且本發(fā)明的組合物可以結(jié)合存在于許多類型上皮細(xì)胞的細(xì)胞表面上的表位，或者存在于不同類型上皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中表位。在這種情況下，該組合物的局部化傳輸可限制其定位于病原靶的上皮細(xì)胞的位點。—種用于預(yù)防或治療病原感染的化合物可以含有能結(jié)合位于或接近上皮細(xì)胞表面的錨定域。例如，硫酸類肝素，與肝素密切相關(guān)，是一類糖胺聚糖(GAG)，其普遍地存在于細(xì)胞膜上，包括呼吸道上皮的表面。許多蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合到硫酸肝素/類肝素上，而且在這些蛋白質(zhì)中的GAG-結(jié)合序列已經(jīng)被鑒定(Meyer，F(xiàn)A,King，M和Gelman，RA.(1975)BiochimicaetBiophysicaActa392:223_232;Schauer，S.等，pp233.唾液酸化學(xué)、代謝和功能。Springer-Verlag，1982)。例如，人血小板因子(PF4)的GAG-結(jié)合序列(SEQIDNO:2)、人白介素(IL8)(SEQIDNO3)、人抗凝血酶III(ATIII)(SEQIDNO:4)、人阿樸脂蛋白E(ApoE)(SEQIDNO:5)、人血管相關(guān)遷移細(xì)胞蛋白(AAMP)(SEQIDNO6)或者人雙調(diào)蛋白(SEQIDNO7)(附圖2)都表現(xiàn)出對肝素具有極高的親合性(在毫微摩爾的范圍內(nèi))(Lee，MK和Lander，AD.(1991)ProNatlAcadSciUSA88:2768-2772；Goger,B,Halden,Y,Rek,A,Mosl，R，Pye,D.Gallagher,J和Kungl，AJ.(2002)Biochem.411640-1646；Witt，DP和LanderAD(1994)CurrBio4394-400；Weisgraber,KH,Rail,SC,Mahley,Rff,Milne,RW和Marcel，Y.(1986)JBioChem261:2068-2076)。這些蛋白質(zhì)的GAG-結(jié)合序列不同于它們受體結(jié)合的序列，因此它們就不能誘導(dǎo)與全長的蛋白質(zhì)或受體結(jié)合域有關(guān)的生物活性。這些序列，或者已經(jīng)或?qū)龛b定為硫酸肝素/類肝素結(jié)合序列的，或者實質(zhì)上同源于已鑒定的硫酸肝素/類肝素結(jié)合序列并且具有硫酸肝素/類肝素結(jié)合活性的其它序列，可以在本發(fā)明的化合物中用作上皮_錨定_域，可用于預(yù)防或治療，例如，呼吸道上皮_感染病毒如，但不限于，流感病毒。錨定域能結(jié)合對某一特定種類的靶細(xì)胞類型為特異性的部分，或者能結(jié)合在一種以上種類的靶細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)的部分。當(dāng)錨定域能結(jié)合在一種以上種類的靶細(xì)胞表面存在的部分，而且病毒或病原能感染一種以上種類的時候，治療化合物對一種以上的種類有效(如果該治療域?qū)λ械南嚓P(guān)種類也有效。)例如，如果治療化合物能用作抗流感病毒、本發(fā)明的治療化合物具有結(jié)合硫酸肝素/類肝素的錨定域，該化合物能用于哺乳動物(包括人)以及禽類。治療域本發(fā)明的化合物包括至少一種具有能預(yù)防或阻止病原對細(xì)胞感染的細(xì)胞外活性的治療域。該治療活性可以是，非限定性舉例，結(jié)合活性、催化活性或者抑制性活性。在本發(fā)明的一些具體實施例中，該治療活性發(fā)揮作用，來修飾或抑制有助于病原對細(xì)胞感染性的該病原功能。在其它的具體實施例中，治療域能修飾或抑制該靶細(xì)胞或靶有機體的功能。例如，該治療域能結(jié)合靶細(xì)胞上的、病原結(jié)合至靶細(xì)胞所必需的受體。通過這種方式，該治療部分能阻滯病原結(jié)合至靶細(xì)胞和預(yù)防感染。換言之，治療域也能結(jié)合病原上的分子或表位來預(yù)防感染所必需的、該分子或表位與靶細(xì)胞的相互作用。治療域也具有催化活性，降解允許或促進宿主對靶細(xì)胞感染的該病原或宿主的分子或者表位。在其它的具體實施例中，治療域可以是病原對靶細(xì)胞感染所必需活性的抑制劑。該抑制的活性可以是該宿主有機體的或病原的活性。該治療域優(yōu)選地在細(xì)胞外發(fā)揮作用，含義為其預(yù)防感染活性發(fā)生在靶細(xì)胞表面或在靶細(xì)胞周圍的中間地區(qū)內(nèi)，包括在細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)空間或組織內(nèi)腔空間內(nèi)的位點。治療域優(yōu)選地是一種肽或蛋白質(zhì)域(包括修飾或衍生的肽或蛋白質(zhì)域)，或者含有偶聯(lián)至一種肽或蛋白質(zhì)的部分。偶聯(lián)至一種肽或蛋白質(zhì)的部分可以是任何類型的、能預(yù)防或阻止病原對靶細(xì)胞感染的分子并且優(yōu)選地使有機分子，如，例如，核酸、肽核酸、核酸類似物、核苷、核苷類似物、小的有機分子、聚合物、脂質(zhì)、留體、脂肪酸、碳水化合物，或者它們的任意組合。治療域可以是一種合成的肽或多肽，或者可以含有能綴合至肽或多肽的合成的分子，可以是一種天然的肽或蛋白質(zhì)，或者天然蛋白質(zhì)的域。治療域也可以是一種與天然肽或蛋白質(zhì)實質(zhì)上同源的肽或蛋白質(zhì)。治療域可用于特定種類中，或者可預(yù)防和阻止在一個以上種類中的病原感染。例如，抑制病原功能的治療域通?？捎糜趶V泛的能被宿主感染的種類中，而通過干擾該宿主的所有物來阻斷宿主-病原相互作用的治療域，可以是或者可以不是種類-特異性的。在許多情況下，錨定域和治療域在一種以上的品種中可以是有效的，所以本發(fā)明的化合物可用于發(fā)展人類和動物的健康，同時，減少通過動物宿主的病毒繁殖和傳播。例如，當(dāng)該治療域為唾液酸酶時，能切斷唾液酸殘基與底物分子剩余部分之間一種以上連接類型的唾液酸酶，特別是，能切斷α(2，6)_Gal與α(2，3)-Gal之間連接的唾液酸酶，能保護人類免于廣譜流感病毒的感染，該病毒包括自然宿主在不同種類如鳥、豬或者馬中的病毒。連接子本發(fā)明的化合物可任選包括能連結(jié)該化合物域的一種或多種連接子。連接子可用于提供化合物域的優(yōu)化間隔或折疊。連接子連結(jié)的化合物的域可以是治療域、錨定域或者任何其它的域或能提供額外功能如增加化合物穩(wěn)定性、易于純化等的該化合物殘基。用于連結(jié)本發(fā)明化合物域的連接子可以是化學(xué)連接子或者氨基酸或肽連接子。當(dāng)化合物含有一種以上連接子時，該連接子可以是相同的或不同的。當(dāng)化合物含有一種以上連接子時，該連接子可以是相同長度的或不同的長度的。各種組合物的許多化學(xué)連接子、極性、反應(yīng)性、長度、彈性以及可切斷性在有機化學(xué)的現(xiàn)有技術(shù)中都是已知的。本發(fā)明優(yōu)選的連接子包括氨基酸或肽連接子。在現(xiàn)有技術(shù)中肽連接子是熟知的。優(yōu)選的連接子是長度為1至100個之間的氨基酸，特別地優(yōu)選長度為1至30個之間的氨基酸，盡管如此，長度卻不是對本發(fā)明化合物連接子的限制。優(yōu)選地，連接子含有不影響本發(fā)明單體編碼的肽或蛋白質(zhì)的構(gòu)象和活性。一些本發(fā)明優(yōu)選的連接子是那些包括甘氨酸的。例如，具有序列(GGGGS(SEQIDNO10))n，這里η是1至20間的整數(shù)，或更優(yōu)選1至12間的連接子，可用于連接本發(fā)明治療化合物的域。含有至少一個錨定域和至少一個蛋白酶抑制劑的組合物在本發(fā)明的一些方面，具有能預(yù)防病原對細(xì)胞感染細(xì)胞外活性的治療域是蛋白酶抑制劑。該蛋白酶抑制劑可以是任何類型化學(xué)實體，如，例如，一種碳水化合物或聚合物，但優(yōu)選的是抑制酶活性的一種蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，該蛋白酶抑制劑抑制至少部分加工至少一種病原或宿主細(xì)胞蛋白的酶活性，這里，該病原或宿主細(xì)胞蛋白的這種加工對于病原感染性來說是必需的。能加工病原感染性必需的病毒蛋白的酶，可以是一種病原酶，或源自宿主有機體的一種酶。優(yōu)選地，該加工酶發(fā)揮作用于或者接近靶細(xì)胞表面，因此，被錨定在或接近靶細(xì)胞表面的本發(fā)明化合物，能有效地抑制該酶的活性。含有蛋白酶抑制域的本發(fā)明化合物可用于抑制任何病原的感染，所述的病原在其生命周期中需要一種蛋白酶，其中，該蛋白酶位于或接近宿主細(xì)胞表面是活性的。這些基于蛋白質(zhì)的組合物可具有，例如，其中一個下列的結(jié)構(gòu)(錨定域)η-連接子_(蛋白酶抑制劑)η(η=1，2，3，或者更大)或者(蛋白酶抑制劑)η-連接子_(錨定域)η(η=1，2，3，或者更大)該蛋白酶抑制劑可以是一種肽或多肽的單體形式，或者可以是直接或之間具有間隔序列連接的同樣多肽的多倍(體)。作為一種選擇，不同的基于多肽的蛋白酶抑制劑可互相連接，如，例如，用大豆蛋白酶抑制劑連接的抑肽酶用作蛋白酶抑制功能的域。該多肽或肽可以被直接或者通過含有肽連接子序列的間隔片(spacer)連接。該錨定域可以是能結(jié)合在或者接近靶細(xì)胞表面的任何肽或多肽。該蛋白酶抑制劑可以是一種天然的蛋白酶抑制劑(或者其活性部分)或者可以是一種(遺傳)工程的蛋白酶抑制劑。用在本發(fā)明化合物中的一種蛋白酶抑制劑可以具有實質(zhì)上同源于天然蛋白酶的序列，當(dāng)保持天然蛋白酶抑制劑活性或?qū)嵸|(zhì)上保持相同活性時，具有一個或多個缺失、加成或取代。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施例中，本發(fā)明的治療化合物是用于人流感的預(yù)防和治療，和該治療域是一種能抑制絲氨酸蛋白酶的蛋白質(zhì)或肽的蛋白酶抑制劑，該絲氨酸蛋白酶能將流感病毒的血凝素前體蛋白HAO切成HAl和HA2?，F(xiàn)已表明，許多絲氨酸蛋白酶抑制劑在培養(yǎng)細(xì)胞中、在雞卵中和在感染小鼠的肺中減少HA切割以及流感病毒活性。它們包括許多常用胰蛋白酶抑制劑，如抑肽酶(ZhirnovOP,IkizlcrMR和WrightPF.(2002)JVirol76:8682_8689)，亮抑肽酶(ZhirnovOP,IkizlerMR和WrightPF.(2002)JVirol768682-8689；TashiroM,KlenkHD和RottR.(1987)JGenVirol68:2039_2043)，大豆蛋白酶抑制劑(Barbey-MorelCL,OeltmannTN，EdwardsKM和WrightPF.(1987)JInfectDis155:667_672)，e_氨基己酸(ZhirnovOP,OvchartenkoAV和BukrinskayaAG.1982.ArchVirol73:263_272)和η-對甲苯磺酰-L-賴氨酸氯甲基酮(TLCK)(Barbey-MorelCL，OeltmannTN,EdwardsKM禾口WrightPF.(1987)JInfectDis155:667_672)。其中，抑肽酶氣霧吸入劑在小鼠(ZhirnovOP,OvcharenkoAV禾口BukrinskayaAG.(1984)JGenVirol65191-196；ZhirnovOP,OvcharenkoAV和BukrinskayaAG.(1985)JGenVirol661633-1638；ZhimovOP.(1987)JMedVirol21161-167；OvcharenkoAV和ZhirnovOP.(1994)AntiviralRes23:107-118)以及人(ZhirnovOP.(1983)ProblemsVirol.4:9_12(俄文))抗流感和副流感支氣管肺炎方面已表現(xiàn)出確切的治療作用。抑肽酶(SEQIDNO1；附圖1)是58個氨基酸的多肽抑制劑(也稱作Trasylol或牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI))。本發(fā)明的化合物可具有一個或多個抑肽酶的域；例如例如，本發(fā)明的治療組合物可具有從1個至6個抑肽酶多肽，更優(yōu)選從1個至3個抑肽酶多肽。本發(fā)明的化合物也可具有含實質(zhì)上同源于抑肽酶氨基酸序列的多肽或肽的一種治療域。用于預(yù)防或治療流感的、含有蛋白酶抑制劑的化合物，優(yōu)選地，包含一種能結(jié)合在或接近上皮細(xì)胞表面的錨定域。在一些優(yōu)選的具體實施例中，該上皮錨定域是一種來自人蛋白質(zhì)的GAG-結(jié)合序列，如，例如，人血小板因子4(PF4)(SEQIDNO:2)、人白介素8(IL8)(SEQIDNO3)、人抗凝血酶III(ATIII)(SEQIDNO4)、人阿樸脂蛋白E(ApoE)(SEQIDN0:5)、人血管相關(guān)遷移細(xì)胞蛋白(AAMP)(SEQIDNO6)的GAG-結(jié)合序列或者人雙調(diào)蛋白(SEQIDN0:7)(附圖7)。本發(fā)明的化合物也可具有包含一個多肽或肽的錨定域，該多肽或肽具有實質(zhì)上同源于在SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDNO6和SEQIDNO7中列出的GAG結(jié)合域的氨基酸序列。臨床上，含有抑肽酶和一種上皮錨定域的藥品可通過氣霧吸入的方式給藥，覆蓋整個呼吸道來預(yù)防和治療在其生命周期內(nèi)需要絲氨酸蛋白酶的流感病毒或者任何其它的病毒如副流感病毒引起的支氣管肺炎。作為一種選擇，一種抑肽酶/上皮錨定域融合蛋白可通過鼻噴劑給藥，來治療非并發(fā)的早期流感病例或呼吸道病毒的其它感染。另外，抑肽酶/上皮錨定域融合蛋白可用于感染發(fā)生前流感或其它病毒感染的預(yù)防?！锉倏p/]>一#細(xì)舌十牛_勁勿在本發(fā)明的一些方面中，具有能預(yù)防病原對細(xì)胞感染的細(xì)胞外活性的治療域是一種催化的活性。這種酶活性可以是一種催化的活性，其除去、破壞或修飾有助于病原感染性的一種宿主分子或復(fù)合物或者一種病原分子或復(fù)合物。優(yōu)選地，通過本發(fā)明化合物的這種酶活性來除去、破壞或修飾的該種宿主分子或復(fù)合物或者該種病原分子或復(fù)合物是在靶細(xì)胞表面之上、位于或接近靶細(xì)胞表面，這樣，被錨定至靶細(xì)胞表面的本發(fā)明化合物能有效地抑制該宿主或病原分子或者復(fù)合物。例如，治療域可具有能消化病原或者靶細(xì)胞的分子或表位的催化活性，該分子或表位是宿主-病原結(jié)合以及該病原隨后進入靶細(xì)胞所必需的。在靶細(xì)胞上允許病毒進入細(xì)胞的受體可以是本發(fā)明化合物的一種酶活性的靶。含有催化域的本發(fā)明化合物可用于抑制任何病原的感染，該病原利用受體進入靶細(xì)胞，條件是除去該受體不妨礙該有機體。這些基于蛋白質(zhì)的組合物可具有，例如，其中一個下列的結(jié)構(gòu)(錨定域)η-連接子-(酶活性)η(η=1，2，3，或者更大)或者(酶活性)η-連接子-(錨定域)η(η=1，2，3，或者更大)，這里連接子是任選的。這種酶的活性可以是一種肽或多肽的單體形式，或者可以是直接或之間具有間隔序列連接的同樣多肽的多倍(體)。該多肽或肽可以被直接或者通過含有肽連接子序列的間隔片連接。該錨定域可以是能結(jié)合至或者接近靶細(xì)胞表面的任何肽或多肽。作為一種選擇，不同的基于多肽的蛋白酶抑制劑可互相連接，如，例如，用大豆蛋白酶抑制劑連接的抑肽酶用作蛋白酶抑制功能的域。在本發(fā)明一個優(yōu)選的具體實施例中，治療域含有一種唾液酸酶，該唾液酸酶能消除或大量地降低在上皮細(xì)胞表面的唾液酸水平。唾液酸是流感病毒的一種受體。因此，用唾液酸酶處理呼吸道上皮細(xì)胞的表面能預(yù)防流感感染或阻斷早期感染。該治療域可以包含一個完整的唾液酸酶蛋白，或者其活性部分。使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的以及在實施例中描述的方法，可以檢測組合物在切斷唾液酸殘基和減少流感病毒對靶細(xì)胞感染方面的有效性。優(yōu)選的唾液酸酶是能破壞受體唾液酸Neu5Acα(2,6)-Gal和Neu5Acα(2，3)-Gal的較大的細(xì)菌唾液酸酶。例如，可以使用源自產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)(Genbank、豐占個生方文(Actinomycesviscosus)(Genbankg錄號X62276)、Arthrobacterureafaciens或Micromonosporaviridifaciens(Genbank登錄號D01045)的細(xì)菌唾液酸酶的酶。本發(fā)明化合物的治療域可以含有全部的或部分的較大細(xì)菌唾液酸酶的氨基酸序列，或者可以含有實質(zhì)上與全部的或部分的較大細(xì)菌唾液酸酶的氨基酸序列是同源的氨基酸序列。其它優(yōu)選的唾液酸酶是人唾液酸酶如下列基因編碼的那些唾液酸酶:NEU2(SEQIDNO8；Genbank登錄號Y16535；Monti,Ε,Preti,Rossi,Ε.，Ballabio,A和BorsaniG.(1999)Genomics57137-143)和NEU4(SEQIDNO9；Genbank登錄號NM080741；Monti,Ε,Preti,A,Venerando,B禾口Borsani，G.(2002)NeurochemRes27=646-663)(附圖3)。本發(fā)明化合物的治療域可以含有全部的或部分的人唾液酸酶的氨基酸序列，或者可以含有實質(zhì)上與全部的或部分的人唾液酸酶的氨基酸序列是同源的氨基酸序列。優(yōu)選地，當(dāng)治療域含有天然唾液酸酶的或者與其氨基酸序列實質(zhì)上同源的一部分氨基酸序列時，該部分含有如人唾液酸酶的基本相同的活性。用于預(yù)防或治療流感的、含有一種酶域的化合物，優(yōu)選地包含能結(jié)合在或接近上皮細(xì)胞表面的一種錨定域。在一些優(yōu)選的具體實施例中，這種上皮_錨定域是一種GAG-結(jié)合序列，源自人蛋白，如，例如，人血小板因子4(PF4)(SEQIDNO:2)、人白介素8(IL8)(SEQIDNO3)、人抗凝血酶III(ATIII)(SEQIDNO4)、人阿樸脂蛋白E(ApoE)(SEQIDNO5)、人血管相關(guān)遷移細(xì)胞蛋白(AAMP)(SEQIDNO6)的GAG-結(jié)合氨基酸序列和人雙調(diào)蛋白(SEQIDNO7)(附圖2)。上皮錨定域也可以是實質(zhì)上同源于天然GAG-結(jié)合序列，如附圖2中列出的那些。含有人唾液酸酶、或者含有實質(zhì)上同源于人唾液酸酶的唾液酸酶的化合物，在缺少錨定域的情況下，用于治療和預(yù)防病原感染如但不限于流感、副粘性病毒、冠狀病毒、輪狀病毒和銅綠假單胞菌感染，這些也都屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明認(rèn)識到，通過使用唾液酸酶，如但不限于人唾液酸酶如NEU2和NEU4，可以預(yù)防或減少這種感染.遺傳或化學(xué)工程或者藥學(xué)的制劑，使得該唾液酸酶可任意地適應(yīng)于改善其半衰期或在呼吸道上皮的保持性。因為流感病毒首先感染上呼吸道，所以除去分布在鼻腔和鼻咽區(qū)內(nèi)的受體唾液酸就可以預(yù)防感染或者阻斷早期感染。該唾液酸酶可以隨著鼻噴劑傳輸至上呼吸道，而且可用于流感(或其他感染)早期的治療模式中或者感染發(fā)生之前的預(yù)防模式中。作為一種選擇，它可隨著吸入劑傳輸至下呼吸道，來治療流感和預(yù)防流感并發(fā)癥如支氣管肺炎。II藥物組合物本發(fā)明包括制成藥物組合物的化合物。該藥物組合物含有制備用于儲備和優(yōu)選后來用藥目的的、藥學(xué)上可接受的載體，其在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中含有藥學(xué)上有效量的該化合物。在藥學(xué)的現(xiàn)有技術(shù)中，治療用的可接受的載體或稀釋劑都是熟知的，而且是有描述的，例如，Remington的《制藥學(xué)》18版，Mack出版公司，Easton市，賓夕法尼亞州(1990年))。在該藥物組合物中可以規(guī)定有防腐劑、穩(wěn)定劑、染料及其芳香劑。例如，可以加入苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯作防腐劑。另外，也可使用抗氧化劑和助懸劑。根據(jù)靶細(xì)胞的情況，本發(fā)明的化合物可以制成并作為下列劑型來使用片劑、膠囊劑或口服給藥的酏劑；局部應(yīng)用的藥膏或軟膏；用于直腸給藥的栓劑；用作吸入或鼻噴的無菌溶液劑、混懸劑及其類似劑型。也可將注射劑制成常規(guī)的形式如液體溶液或混懸劑、在注射前為適合溶解的固體形式或液體混懸劑、或者乳劑。適合的賦形劑為，例如，水、鹽水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸鈉、鹽酸半胱氨酸及類似物。另外，如需要，該可注射的藥物組合物可以含有少量的無毒性輔助物質(zhì)如潤濕劑、PH緩沖劑及類似物。根據(jù)劑量要求的、檢驗化合物的藥學(xué)上有效量將依賴于給藥途徑、治療動物或患者的類型以及考慮到的特定動物的身體特點。為了取得理想效果，劑量可進行修整但是將依賴于這些因素如體重、飲食、共同用藥以及那些醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識到的其他因素。在實施本發(fā)明的方法時，該藥物組合物可單獨或與另一種組合、或者與其他的治療或診斷劑組合使用。這些產(chǎn)品可用于體內(nèi)，優(yōu)選地用于哺乳動物，優(yōu)選地用于人，或者體外。在體內(nèi)使用這些產(chǎn)品時，可以各種方式對患者給藥，包括局部的、非胃腸道的、靜脈的、皮下的、肌肉內(nèi)的、結(jié)腸的、直腸的、鼻腔的或者腹膜內(nèi)的方式，同時使用各種劑型。這些方法也可用于檢驗檢測化合物在體內(nèi)的活性。在優(yōu)選的具體實施例中，這些藥物組合物可以是以下列形式可口服給藥的混懸齊U、片劑；鼻噴劑；或吸入劑。當(dāng)作為混懸劑口服給藥時，根據(jù)藥物制劑現(xiàn)有技術(shù)中熟知的技術(shù)制備本發(fā)明的組合物，而且該組合物可含有用作填充劑的微晶纖維素、用作助懸劑的藻酸或藻酸鈉、用作增稠劑的甲基纖維素以及現(xiàn)有技術(shù)中已知的甜味劑/芳香劑。作為即釋性片劑，這些組合物可含有微晶纖維素、磷酸二鈣、淀粉、硬脂酸鎂以及乳糖和/或現(xiàn)有技術(shù)已知的其它賦形齊U、粘合劑、填充劑、崩解劑、稀釋劑以及潤滑劑。在漱口水或漱洗的制劑中成份包括抗菌齊U、表面活性劑、共表面活性劑(consurfactants)、油、水和其它的現(xiàn)有技術(shù)已知的添加劑如甜味劑/芳香劑。當(dāng)通過飲用溶液給藥時，該組合物含有一種或多種本發(fā)明的化合物，溶解在水中，具有適宜的PH調(diào)節(jié)以及載體。該化合物可以溶解于蒸餾水、自來水、礦泉水以及類似物中。優(yōu)選地，將PH調(diào)節(jié)至約3.5和約8.5之間?？梢蕴砑犹鹞秳├?w/v)蔗糖?？梢愿鶕?jù)美國專利號3，439，089，這里為此目的而引入作參考，制備錠劑(lozenges)0當(dāng)通過鼻腔氣霧劑或吸入劑給藥時，根據(jù)藥物制劑現(xiàn)有技術(shù)中熟知的技術(shù)制備該藥物組合物，并且可制備成含鹽水的溶液，同時使用了芐醇或者現(xiàn)有技術(shù)已知的其它合適的防腐劑、提高生物利用度的助吸收劑、氟碳化合物和/或其它增溶或分散劑。參見，例如，H.C.Ansel等，《藥物劑型和傳輸系統(tǒng)》，第六版.(1995年)。優(yōu)選地，用合適的、無毒的、藥學(xué)上可接受的成份制備這些組合物和制劑。對于那些在鼻用劑型和Remington的《制藥學(xué)》，18版，Mack出版公司，Easton市，賓夕法尼亞州(1990年)——該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考書中可發(fā)現(xiàn)的一些(劑型)的制備方面熟悉的技術(shù)人員來說，這些成份是已知的。適合載體的選擇主要取決于所需鼻用劑型(例如溶液劑、混懸劑、軟膏或凝膠)的準(zhǔn)確性質(zhì)。通常，鼻用劑型除了活性成份外含有大量的水。也可含有少量的其它成份如PH調(diào)節(jié)劑、乳化劑或分散齊U、防腐劑、表面活性劑、凝結(jié)劑、或者緩沖劑以及其它的穩(wěn)定劑和助溶劑。優(yōu)選地，該鼻用劑型應(yīng)當(dāng)與鼻腔分泌物是等滲的。鼻用制劑可以滴劑、噴霧劑、氣霧劑或者任何其它鼻腔內(nèi)的劑型來給藥。任選地，該傳輸系統(tǒng)可以是單位劑量傳輸系統(tǒng)。每一劑量傳輸?shù)娜芤夯蚧鞈覄w積可以是優(yōu)選地從約5至約2000毫升之間，更優(yōu)選地從約10至約1000毫升之間，和更加優(yōu)選地從約50至約500毫升之間的任一值。用于這些各種劑型的傳輸系統(tǒng)可以是以單位劑量或多劑量包裝的滴瓶、塑料擠壓裝置、噴霧器、霧化器或者藥用氣霧劑。本發(fā)明的制劑可以是變化的，包括(1)調(diào)節(jié)PH值的其它酸和堿；(2)其它的增滲劑如山梨醇、甘油和葡萄糖；(3)其它抗菌防腐劑如其它的對羥基苯甲酸酯、山梨酸鹽、苯甲酸鹽、丙酸鹽、三氯丁醇、苯乙醇、苯扎氯銨和汞制劑；(4)其它增稠劑如羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和其它的樹膠；(5)適合的助吸收劑；(6)穩(wěn)定劑如抗氧化劑、類酸式亞硫酸鹽和抗壞血酸鹽，金屬絡(luò)合劑如依地酸鈉和藥物增溶劑如聚乙烯二醇。III.預(yù)防或治療病原感染的方法本發(fā)明也包括預(yù)防或治療病原感染的方法。該方法包括用本發(fā)明的組合物治療病原感染的或者有病原感染風(fēng)險的個體，該組合物含有這樣的化合物，該化合物含有至少一種能錨定該化合物在或接近靶細(xì)胞表面的錨定域和至少一種含肽或蛋白質(zhì)的治療域，所述的肽或蛋白質(zhì)具有至少一種能預(yù)防病原對靶細(xì)胞感染的細(xì)胞外活性。被治療的個體可以是動物或人。本發(fā)明的化合物可以設(shè)計為人用或者動物用。在本發(fā)明的一些方面中，本發(fā)明的化合物可用于預(yù)防在一類動物如哺乳類動物中的病原感染。在本發(fā)明的一些方面中，組合物可用于人用和動物用(盡管制劑可以不同)。在這些方面中，化合物的活性域可以有效地抵抗一種以上的病原種類、型、亞型(subtype)或株，而且可以在一種以上的宿主種類中是活性的。例如，一些優(yōu)選的本發(fā)明化合物可用于鳥類、哺乳動物或人，所述的化合物含有例如活性域如預(yù)防流感病毒的HA蛋白加工的蛋白酶抑制劑、或者從靶細(xì)胞除去唾液酸受體的唾液酸酶、或者錨定域如結(jié)合硫酸類肝素或肝素。這些化合物也能用于人，來抗擊被天然宿主于其它種類的病原感染，該化合物可有效地抵抗具有感染不同宿主種類能力的廣泛的病原。在一些本發(fā)明優(yōu)選的具體實施例中，該藥物組合物預(yù)防流感感染，和將治療有效量的該藥物組合物應(yīng)用于個體的呼吸道上皮細(xì)胞。這可以通過使用吸入器或者使用鼻噴器來實現(xiàn)。優(yōu)選地，每天使用一至四次該吸入器或鼻噴器。劑量對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是非常顯然的，在體內(nèi)有用的給藥劑量和特定的給藥模式將根據(jù)被治療患者的年齡、體重和類型、使用的特定藥物組合物以及該藥物組合物的特定用途而變化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用上述的常規(guī)方法可以完成有效劑量水平即達到預(yù)期結(jié)果必需劑量水平的確定。在非人類的動物研究中，開始時以高劑量水平應(yīng)用該藥物組合物，降低劑量，直至不再達到預(yù)期效果或者副作用減少或消失。本發(fā)明化合物的劑量范圍廣泛，取決于預(yù)期的效果、治療的適應(yīng)癥、給藥途徑以及該化合物的純度和活性。典型地，產(chǎn)品的人臨床應(yīng)用開始時以較低的劑量，劑量水平升高，直至達到預(yù)期的效果。作為一種選擇地，可接受的體外試驗可用于建立該檢驗化合物的有用的劑量和給藥途徑。典型地，劑量可以是約lng/kg至約10mg/kg之間，優(yōu)選約10ng/kg至約lmg/kg之間，更優(yōu)選約100ng/kg至約100μg/kg之間。單獨的醫(yī)生視患者的情況可選擇正確的制劑、給藥途徑和劑量(參見，F(xiàn)ingle等，治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)(1975年))。應(yīng)當(dāng)注意的是，主治醫(yī)生須知道由于毒性、器官功能障礙或者其它的副作用如何和何時終止、中斷或調(diào)節(jié)給藥。相反地，如果臨床響應(yīng)不足，該主治醫(yī)生也應(yīng)當(dāng)知道將治療調(diào)節(jié)至較高水平。在感興趣的疾病管理方面，給藥劑量的大小隨著被治療狀況的嚴(yán)重程度和給藥的途徑而變化。例如，通過標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后評價方法，可部分地評價該狀況的嚴(yán)重程度。進一步地，劑量和可能的劑量頻率也可根據(jù)年齡、體重和個體患者的響應(yīng)而變化，包括用于獸藥應(yīng)用的那些情況。因此，根據(jù)本發(fā)明，進一步地提供了一種檢測方法和一種用于治療流感病毒感染和預(yù)防流感病毒的藥物組合物。該治療涉及向需要此種治療的患者給予一種藥物載體和一種治療有效量的本發(fā)明的任一組合物、或者其藥學(xué)上可接受的鹽。在一個優(yōu)選的方案中，通過鼻噴劑或口服錠劑，給予每個患者合適的劑量。盡管如此，應(yīng)當(dāng)理解為，用于任何特定患者的特定劑量和劑量頻率可以是變化的，而且取決于各種因素，包括特定鹽或其它使用形式的活性、該化合物代謝的穩(wěn)定性和作用的時間長短、年齡、體重、總健康狀況、性別、飲食、給藥時間和模式、排泄速度、藥物組合、特定狀況的嚴(yán)重程度以及經(jīng)歷治療的宿主。實施例實施例1合成抑肽酶基因、純化和檢測抑肽酶融合蛋白簡介流感病毒蛋白血凝素(HA)是主要的包封蛋白。其在病毒感染中發(fā)揮著重要作用。HA的重要性已經(jīng)被下列事實所證明，它是主要的靶，用于保護宿主免疫反應(yīng)產(chǎn)生的中性抗體(Hayden,FG.(1996)InAntiviraldrugresistance(主編D.D.Richman),pp.59-77.Chichester,UKJohnWiley&SonsLtd.)。現(xiàn)已明確，HA在病毒感染中具有兩種不同的功能。首先，HA負(fù)責(zé)將病毒附著至唾液酸細(xì)胞受體。其次，HA通過刺激病毒包膜與細(xì)胞膜融合來調(diào)節(jié)病毒進入靶細(xì)胞。HA被合成為前體蛋白，ΗΑ0,其作為三聚體分子復(fù)合物通過高爾基體被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面。HAO被進一步分裂，產(chǎn)生HAl的C末端(ΗΑ0的328殘基)和HA2的N末端。通常認(rèn)為，分裂發(fā)生在細(xì)胞表面或在釋放的病毒上。HAO分裂成HA1/HA2不需要HA結(jié)合到唾液酸受體；但是，對于病毒的感染性而言這還是非常重要的(Klenk，HD和Rott，R.(1988)AdvVirRes.34247-281；Kido,H,Niwa,Y,Beppu,Y禾口Towatari，Τ.(1996)AdvanEnzymeRegul36325-347；Skehel,JJ和Wiley,DC.(2000)AnnuRevBiochem69:531_569)。HAO對宿主蛋白酶的敏感性由在HAO分子的外環(huán)內(nèi)的蛋白水解位點確定。該蛋白水解位點可包含單個Arg或Lys殘基(單堿基切割位點)或者在R-X-K/R-R基元(motif)中的幾個Lys和/或Arg殘基(多堿基切割位點)。只有流感病毒A型的亞型H5和H7具有帶有多堿基切割位點的HA蛋白。其它的所有流感病毒A型、B型和C型都含有帶有單堿基切割位點的HA蛋白。具有多堿基切割位點的流感病毒A型致病性更強，并且在宿主中誘導(dǎo)系統(tǒng)感染，而帶有單堿基HA位點的病毒只是在哺乳動物的呼吸道內(nèi)或者禽類的呼吸道和腸道內(nèi)開始感染(Klenk，HD和GartenW.1994.TrendMicro239-43forreview)。幸運的是，高致病性的、帶有多堿基切割位點的禽流感A型的H5和H7亞型導(dǎo)致的人感染，迄今僅發(fā)生在少數(shù)的病例中，而且這些病例主要是在香港發(fā)現(xiàn)的。絕大多數(shù)的流感感染是由具有在單堿基切割位點切割的HA蛋白的病毒引起的。包含多堿基切割位點的流感病毒HA亞型5和7是由弗林蛋白酶(furin)即枯草桿菌蛋白酶樣內(nèi)源蛋白酶或者前體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化酶家族的成員活化的。弗林蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)切割該病毒，而且普遍地存在于許多細(xì)胞類型之中，使得高致病性、系統(tǒng)性感染與這些病毒同時可見(Klenk，HD和GartenW.1994.TrendMicro2:39_43；Nakayama，K.1997.Biochem327625-635)。其它所有的流感病毒，即具有帶有單堿基切割位點HAs的，是由分泌的、胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活化的。已包含在流感病毒活化中的酶包括血漿酶(LazarowitzSG,GoldbergAR和ChoppinPff.1973.Virology56172-180)，小型-血菜酶(MurakamiΜ,TowatariΤ,OhuchiΜ,ShiotaΜ,AkaoM,OkumuraY,ParryMA禾口KidoH.(2001)EurJBiochem268:2847_2855)，類胰蛋白酶Clara(KidoH,ChenY和MurakamiΜ.(1999)InB.Dunn(主編)，Proteasesofinfectiousagents,p.205-217,AcademicPress,NewYork,N.Y)，激肽釋放酶，尿激酶，凝血酶(ScheiblauerH,ReinacherM,TashiroM和RottR.(1992)JInfecDis166:783_791)，凝血因子Xa(GotohB,OgasawaraT,ToyodaT,InocencioN,HamaguchiM和NagaiY.(1990)EMBOJ9:4189_4195)，精子頂體酶(GartenW,BoschFX,LinderD,RottR和KlenkHD.(1981)Virology115:361_374·)，源自人呼吸道灌洗的蛋白酶(Barbey-MorelCL,OeltmannTN,EdwardsKM禾口WrightPF.(1987)JInfectDis155:667_672)，和源自金黃色葡萄球菌的細(xì)菌蛋白酶(TashiroM,CiborowskiP,ReinacherM,PulvererG,KlenkHD和RottR.(1987)Virology157:421_430)，和銅綠假單胞菌(CallanRJ,HartmannFA,WestSE和HinshawVS.(1997)JVirol717579-7585)。通常認(rèn)為，宿主絲氨酸蛋白酶對流感病毒的活化發(fā)生在細(xì)胞外，或者位于質(zhì)膜，或者病毒從細(xì)胞釋放之后。抑肽酶，亦稱作Trasylol或牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI)，是具有58個氨基酸的多肽抑制劑。其屬于Kimitz類型抑制劑家族，并且競爭性地抑制廣譜地絲氨酸蛋白酶，包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、血漿酶和血漿激肽釋放酶。抑肽酶作為人的治療劑已很長時間了，如治療胰腺炎、休克綜合癥的各種情形、高纖溶出血(hyperfibrinolytichaemorrhage)和心肌梗塞。其也可用于心臟手術(shù)，包括體外循環(huán)術(shù)，以減少失血(FritzH和WundererG.(1983)Arzneim-Forsch33479-494)。通過多年的臨床應(yīng)用，已經(jīng)詳細(xì)地記錄了抑肽酶在人中的安全性。另外，抑肽酶顯然是一種非常弱的免疫原，因為迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)抑肽酶特異性抗體(FritzH和WimdererG.(1983)Arzneim-Forsch33:479-494)。抑肽酶作為藥物候選的另一個理想的特性是其超穩(wěn)定性?？稍谑覝貙⑵浔４嬷辽?8個月而活性沒有任何損失(FritzHandffundererG.(1983)Arzneim-Forsch33:479-494)。為了在已經(jīng)進行的動物研究中取得顯著的病毒抑制，高劑量給予抑肽酶。例如，每天將280μg至840μg的抑肽酶腹膜內(nèi)注射給每個小鼠，共6天(ZhirnovOP,OvcharenkoAV和BukrinskayaAG.(1984)JGenVirol65:191-196)；對于氣霧劑吸入則需要較低的劑量，也是每天給予每個小鼠63-126μg，共6天(OvcharenkoAV和ZhirnovOP.(1994)AntiviralRes23:107-118)。基于從小鼠的數(shù)據(jù)外推，人會需要很高劑量的抑肽酶。因此，為了在人中取得較好的療效，抑肽酶分子的效力需要顯著地改進。通過競爭性抑制主要在宿主呼吸道上皮細(xì)胞表面上地絲氨酸蛋白酶，抑肽酶發(fā)揮作用。在宿主蛋白酶鄰近內(nèi)，抑肽酶的局部濃度因此成為了決定抑肽酶競爭優(yōu)勢的關(guān)鍵因素。我們使用了兩種協(xié)同運作方法，來增強抑肽酶在呼吸道上皮表面上的競爭優(yōu)勢。首先，通過連接子連接，制備由兩個、三個或更多的抑肽酶蛋白組成的多價抑肽酶融合蛋白，提高抑肽酶的親合力(功能親合力)。這樣的分子能以多價的方式結(jié)合至膜蛋白酶，這比抑肽酶單體具有顯著的動力學(xué)優(yōu)勢。單體抑肽酶非常緊密地結(jié)合至牛胰蛋白酶，其解離常數(shù)(Ki)為6.0X10_14mol/l。盡管如此，與已經(jīng)包含在流感病毒活化中其它蛋白酶如糜蛋白酶、血漿酶和激肽釋放酶相比較其親合力還比較低的，Ki位于10_8至10_9mol/l水平(FritzHandWundererG.(1983)Arzneim-Forsch33:479_494)。多聚化可以呈指數(shù)級地提高抑肽酶對這些蛋白酶的親合力。其次，我們將一種呼吸道上皮錨定域與抑肽酶融合。該錨定域?qū)⒁蛛拿妇窒抻谒拗髂は嚓P(guān)的蛋白酶的附近，并且維持在上皮表面上抑肽酶的局部高濃度。該錨定域也增加藥物在呼吸道上皮上保留的時間?？寺∫蛛拿甘且粋€具有58個氨基酸、3個鏈內(nèi)二硫鍵的單鏈多肽(SEQIDNO:1)。抑肽酶的氨基酸序列表示在附圖1中。通過使用寡核苷與用于大腸桿菌表達為模板的優(yōu)化密碼子重疊的PCR，合成編碼抑肽酶的基因和抑肽酶融合蛋白酶。將該PCR產(chǎn)物克隆至pCR2.1-T0P0載體(Invitrogen)。排序后，將該基因亞克隆至一種表達載體pQE(Qiagen)。該載體帶有純化標(biāo)簽Hisx6，使得該重組蛋白質(zhì)易于純化。該構(gòu)建可用于轉(zhuǎn)換大腸桿菌。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，用IPTG將在LB-氨芐西林媒介中生長的轉(zhuǎn)換細(xì)胞誘導(dǎo)至中等對數(shù)階段(mid-logphase)。通過超聲降解法，細(xì)胞在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中被丸狀化和溶化。使用鎳填充柱(Qiagen)純化具有Hisx6純化標(biāo)簽的酶。制備下列的抑肽酶融合蛋白1.二聚和三聚的抑肽酶.通過柔性連接子(flexiblelinker)將兩個或三個抑肽酶基因連接，構(gòu)建如下抑肽酶-(GGGGS(SEQIDNO10))η(η=3，4或5)-抑肽酶；和抑肽酶-(GGGGS(SEQIDNO10))η(η=3，4或5)-抑肽酶-(GGGGS(SEQIDNO:10))η(η=3，4或5)-抑肽酶該連接子序列的長度可決定多聚抑肽酶的三維柔性，也因此影響該分子的功能親合力。于是，制備了具有不同長度連接子的構(gòu)建。全功能重組單體抑肽酶已經(jīng)在大腸桿菌中生產(chǎn)出來(AuerswaldEA,HorleinD，ReinhardtG,SchroderW和SchnabelE.(1988).BiolChemHoppe-SeylerVol369，Suppl.，pp27-35)。因此，我們期望在大腸桿菌細(xì)胞中得到適當(dāng)倍數(shù)的多價抑肽酶蛋白。除了在各種常用的如BL21、JM83等大腸桿菌細(xì)胞株中表達蛋白質(zhì)，多價抑肽酶蛋白質(zhì)也可表達在Origami細(xì)胞(Novagen，BadSoden，德國)中。Origami細(xì)胞株沒有硫氧還蛋白和谷胱甘肽還原酶，因此具有氧化性細(xì)胞質(zhì)。已經(jīng)用這種細(xì)胞株成功地表達許多含有二硫鍵的蛋白質(zhì)(BessettePH,AslundF,BeckwithJ禾口GeorgiouG.(1999)ProNatlAcadSciUSA9613703-13708；VenturiM,SeifertC和HunteC.(2001)JMolBiol315:1-8·)。2.上皮細(xì)胞錨定抑肽酶.將上皮細(xì)胞錨定序列與抑肽酶融合。該上皮錨定序列可以是任何的對上皮細(xì)胞表面具有親合力的肽或者多肽。我們選擇了三種人GAG結(jié)合序列PF4(氨基酸47-70；SEQIDNO:2)、IL-8(氨基酸46-72;SEQIDNO3)和ATIII(氨基酸118-151;SEQIDNO:4)(附圖2)。這些序列以毫微摩爾水平親合力結(jié)合至類肝素/肝素硫酸鹽(表1)。類肝素/肝素硫酸鹽普遍地存在于呼吸道上皮上。在單獨的構(gòu)建中，GAG結(jié)合序列與抑肽酶基因通過一個通用連接子序列GGGGS在N末端上和在C末端上融合，構(gòu)建如下(GAG域-GGGGS(SEQIDNO10-抑肽酶)；禾口(抑肽酶-GGGGS(SEQIDNO10)-GAG域)表1對肝素的親合力<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>光度測定的胰蛋白酶抑制檢驗抑肽酶和抑肽酶融合蛋白的胰蛋白酶抑制活性通過以前詳細(xì)描述的光度測定檢驗來測量(FritzHandWundererG.(1983)Arzneim-Forsch33:479_494)。概括地說，在本檢驗中，抑肽酶抑制胰蛋白酶催化的Na-苯甲酰-L-精氨酸-對硝基酰替苯胺(BzArgpNA或者L-BAPA)(Sigma公司)的水解，L-BAPA的光度測定是在405nm。一個胰蛋白酶單位(Ubapa)對應(yīng)于每分鐘水解1微摩爾底物。一個抑制劑單位(IUbapa)降低兩個胰蛋白酶單位活性的50%，即相當(dāng)于算術(shù)上抑制IUBAPA的胰蛋白酶。抑肽酶的這種特異性活性是以IUbapa/mg多肽表示的。表面等離子體諧振檢驗使用表面等離子體諧振檢驗，或BIAcore分析(BIAcore，皮斯卡塔韋，新澤西州)用人血漿酶作為靶，來比較二聚和三聚抑肽酶與各種連接子相對于單體抑肽酶的親合力。同樣地，用肝素作為靶的BIAcore檢驗用于分析GAG結(jié)合抑肽酶融合蛋白與肝素之間的親合力。當(dāng)血漿酶用作靶時，根據(jù)制造商的說明書(BIAcore，皮斯卡塔韋，新澤西州)，將純化的人血漿酶(Sigma)固定在CM5芯片。當(dāng)肝素為靶時，生物素化白蛋白和白蛋白-肝素(Sigma)被捕獲在包被鏈酶親合素地BIAcoreSA芯片上，如以前文獻描述的(XiangY和MossB.(2003)JVirol77:2623-2630)。實施例2建立用于研究流感病毒感染的改進的組織培養(yǎng)模型。流感病毒備料流感病毒株獲得來自于ATCC(美國菌種保藏中心)和位于圣朱迪」L童研究醫(yī)院貯藏室。所有涉及流感病毒的實驗都是在生物安全水平II級條件下進行的。通過注射至九天大的小雞胚胎中，繁殖病毒，如(ZhirnovOP,OvcharenkoAV和BukrinskayaAG.(1985)JGenVirol661633-1638)所描述的。作為一種選擇地,將病毒備料生長在最低要求培養(yǎng)基(MEM)中的考克斯班尼犬腎臟(MDCK)細(xì)胞上，該培養(yǎng)基每毫升還補充了0.3%牛血清白蛋白和0.5微克的胰蛋白酶。在孵化48至72小時后，使用低速離心機將培養(yǎng)基分離。用超聲離心法并通過25%蔗糖墊將病毒顆粒小球化。將純化病毒懸浮域50%甘油-0.IMTris緩沖液，并儲藏于-20°C。空斑檢驗通過兩種空斑檢驗，一種傳統(tǒng)的和一種改進的(Tobita，K，Sugiura，A,Enomoto,C禾口Furuyama,M.(1975)MedMicrobiolImmnuol1629-14；ZhirnovOP,OvcharenkoAV禾口BukrinskayaAG.(1982)ArchVirol71:177-183)，來測定病毒備料的感染性和滴度。該傳統(tǒng)空斑檢驗通常用作病毒滴定方法。其要求是，在病毒感染至MDCK單層之后，將外源的胰蛋白酶迅速地加入瓊脂覆層(Tobita，K,Sugiura,A,Enomoto,C和Furuyama，Μ.(1975)MedMicrobiolImmnuol162:9-14)?？梢酝ㄟ^活化具有未切割HA的所有病毒檢測到，這種方法人為地增加了病毒備料的感染性。Zhirnov等設(shè)計了一種改進的空斑檢驗，包括一個雙瓊脂覆層，在感染24小時后，將胰蛋白酶加入到第二層(ZhirnovOP,OvcharenkoAV和BukrinskayaAG.(1982)ArchVirol71:177-183)。在感染三天后，用10%的甲醛溶液穩(wěn)定細(xì)胞，除去瓊脂糖層，用蘇木素_伊紅溶液染色穩(wěn)定化細(xì)胞，以及空斑計數(shù)。改進的空斑檢驗可以準(zhǔn)確地測定含有切割和未切割HA病毒備料的真實感染性。將從傳統(tǒng)和改進空斑檢驗的結(jié)果相組合，就可區(qū)分含有切割或未切割HA的病毒，并且病毒備料的感染性與HA切割的狀態(tài)相關(guān)。人細(xì)胞培養(yǎng)模型1.原牛的人上皮細(xì)胞的短期培養(yǎng)基傳統(tǒng)的體外流感病毒感染多數(shù)是在MDCK細(xì)胞中完成，將外源的胰蛋白酶加入到培養(yǎng)基。這絕非生理學(xué)的，而且不適合這里提出的工作，原因是胰蛋白酶不是活化體內(nèi)流感病毒的蛋白酶。迄今為止，已報道非常有限數(shù)量的沒有外源蛋白酶而能支持流感病毒生長的體外組織培養(yǎng)基模型，那些都是原生培養(yǎng)基，具有腎來源的靈長類細(xì)胞、內(nèi)襯胚胎卵尿囊腔和羊膜腔細(xì)胞，胎兒氣管環(huán)器官培養(yǎng)以及原生的人腺樣上皮細(xì)胞(EndoY，CarrollKN,IkizlerMR和WrightPF.(1996)JVirol70:2055-2058)。其中，最近關(guān)于原生的人腺樣上皮細(xì)胞的工作是最接近人的條件的。在這個工作中，Endo等(EndoY,CarrollKN,IkizlerMR和WrightPF.(1996)JVirol70:2055-2058)從人腺樣的手術(shù)樣品中分離到上皮細(xì)胞，并將該上皮細(xì)胞培養(yǎng)在Transwell嵌入物(Costar，Cambridge，Mass)內(nèi)的膠原基質(zhì)(Vitrogen100,CeltrixLaboratories,PaloAlto,California)上。將細(xì)胞維持在50%的Ham’sF12和補充了生長因子和微量元素的50%Eagles最低要求培養(yǎng)基。該細(xì)胞在10至14天內(nèi)達到匯合(confluency)，大部分是以單層保留，但是帶有離散的纖毛細(xì)胞片，在達到匯合后將維持常規(guī)的纖毛活性1至3周。在這個系統(tǒng)中，流感A型病毒生長至106PFU/ml滴度，具有0.001的感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection)(EndoY,CarrollKN,IkizlerMR和WrightPF.(1996)JVirol70:2055_2058)。在感染期間，也存在進行性細(xì)胞致病作用。這個系統(tǒng)的缺點是它需要新鮮的腺樣組織。為了解決這個問題，用商業(yè)上可得到的、原生的人氣管上皮細(xì)胞(Cambrex)代替原生的人腺樣上皮細(xì)胞，而且在同樣的條件下生長這些細(xì)胞。原生的人氣管上皮細(xì)胞的短期培養(yǎng)基可相對較快地建立，而且作為用于大多數(shù)體外感染和抗病毒實驗的一線實驗?zāi)Ｊ绞怯杏玫摹?.分化良好的人氣管上皮(TO-HAE)為了最佳地模擬人氣管的體內(nèi)條件，使用分化良好的人氣管上皮(WD-HAE)。WD-HAE是覆層上皮，具有正常的人氣管上皮的所有分化細(xì)胞，包括功能纖毛細(xì)胞和粘液分泌細(xì)胞。因此，在這個模型系統(tǒng)中，流感病毒最大的可能是被生理上相關(guān)的宿主蛋白酶活化。盡管已經(jīng)廣泛地使用WD-HAE以研究呼吸道病毒感染如呼吸道合胞病毒(RSV)ZhangL，PeeplesME,BoucherRC,CollinsPL和PicklesRJ.(2002)JVirol76:5654-5666)麻疹病毒(SinnPL,WilliamsG,VongpunsawadS,CattaneoR禾口McCrayPB.(2002)JVirol76:2403-2409)，或人鼻病毒，但是之前沒有用它來研究流感病毒。WD-HAE的詳細(xì)方案已經(jīng)在此前被描述了(KrunkoskyTM,FischerBM,MartinLD,JonesN,AkleyNJ和AdlerKB.(2000)AmJRespirCellMolBiol22:685-692)。概括地說，商業(yè)上的原生的人支氣管上皮細(xì)胞(Cambrex)被培養(yǎng)在Transwell-clear培養(yǎng)嵌入物(Coster)上，該嵌入物用鼠尾膠原(rat-tailcollagen)I薄薄地包被著。最初的5至7天，將細(xì)胞培養(yǎng)浸在含支氣管上皮細(xì)胞生長媒介(BEGM)(Cambrex)與帶有高濃度葡萄糖的、補充了生長因子的DMEMl:1的混合物的媒介中(KrunkoskyTM，F(xiàn)ischerBM,MartinLD,JonesN,AkleyNJ和AdlerKB.(2000)AmJRespirCellMolBiol22:685_692)。當(dāng)培養(yǎng)是70%匯合(5至7天)時，通過除去頂部的媒介產(chǎn)生氣-液界面，和將細(xì)胞只暴露于在它們基礎(chǔ)表面上的媒介。氣_液界面中再培養(yǎng)細(xì)胞14天，總共培養(yǎng)21天，就準(zhǔn)備好了用于實驗的細(xì)胞。分化的上皮可在體外維持?jǐn)?shù)周。在常規(guī)的組織學(xué)中記載了上皮形態(tài)和分化程度(EndoY,CarrollKN,IkizlerMR和WrightPF.(1996)JViro170:2055-2058)。概括地說，在用10%緩沖甲醛溶液穩(wěn)定化后，將該上皮細(xì)胞植入石蠟，切開，用蘇木糖和伊紅染色，和使用過碘酸-SchifT氏染色用于粘液分泌細(xì)胞。通過加入MOI值為0.001至1的病毒至分化細(xì)胞，在上面的兩個模型系統(tǒng)中完成流感感染。在上清液中病毒地滴度和感染性延續(xù)3至7天的周期。使用傳統(tǒng)的和改進的空斑檢驗來評價流感病毒擴增的水平和流感病毒的感染性。實施例3體外比較抑肽酶融合蛋白功能抑肽酶融合蛋白的抗病毒作用1.感染前的處理將抑肽酶融合蛋白加入各種濃度的原生的人細(xì)胞培養(yǎng)基，和這些細(xì)胞孵化1小時。用新鮮的媒介沖洗細(xì)胞，然后立刻與MOI至0.01至1的流感病毒孵化。1小時后，再次沖洗細(xì)胞，然后培養(yǎng)3至5天。在各個時間點，用兩種空斑檢驗法來測定上清液中病毒的滴度和感染性。用結(jié)晶紫染色活細(xì)胞，來評價病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞病理作用，和在實驗尾聲測定在570nm處吸收，來進行定量。以IOOX{(抑肽酶處理的樣品-未處理感染的樣品)/(未感染對照_未處理的感染的樣品)}來計算抑肽酶融合蛋白保護細(xì)胞的百分比。藥物細(xì)胞保護功效是通過達到50%細(xì)胞保護(EC5tl)的其作用濃度來描述的。由于HA活化僅發(fā)生于新釋放的病毒顆粒，病毒感染的首輪正常地發(fā)生，而且病毒滴度在感染后的最初24小時內(nèi)上升。盡管如此，從第二輪起，抑肽酶的治療結(jié)果是，病毒的感染性降低而且病毒滴度逐漸下降。這個實驗結(jié)果通過在單一預(yù)防性處理中的功效來區(qū)分各種類型的不同抑肽酶融合蛋白。作為一種選擇的，開始病毒孵化的時間從抑肽酶處理后的立刻到2-24小時的后處理是變化的。如上所述，在感染之后3-5天，測定病毒滴度、感染性和細(xì)胞病理作用。這些實驗的結(jié)果通過單一預(yù)防性處理之后有效窗口的長度來區(qū)別各種抑肽酶融合蛋白。2.感染后的處理對于多劑量的處理，細(xì)胞通過在0.001至0.1M0I值病毒接種(viralinoculations)1小時被最初感染。然后，立刻加入各種濃度的抑肽酶融合蛋白，在感染后的最初48小時期間以8小時的間隔應(yīng)用另外的處理。在整個過程中，跟蹤在媒介里的病毒滴度和感染性。在實驗尾聲時評價細(xì)胞病理作用。對于單一劑量的處理，細(xì)胞通過在0.001至0.IMOI值病毒接種1小時被最初感染。在感染后的最初48小時期間，在不同的時間點應(yīng)用各種濃度的抑肽酶融合蛋白的治療，但是，在整個實驗過程中，每一個細(xì)胞樣品僅接受一種處理。培養(yǎng)細(xì)胞直至7天感染后。在整個過程中，跟蹤在媒介里的病毒滴度和感染性。在實驗尾聲時評價細(xì)胞病理作用。這些實驗的結(jié)果區(qū)分不同類型的抑肽酶融合蛋白的治療效力。用抑肽酶融合蛋白抑制HA切割為了證實抑肽酶融合蛋白通過抑制流感HA蛋白切割來抑制流感病毒的感染，將人原生上皮細(xì)胞培養(yǎng)基用MOI值為1的流感病毒來感染?？稍诓《窘臃N前或者在病毒感染后立刻將抑肽酶融合蛋白加入培養(yǎng)基。在感染后6.5小時，在缺少冷甲硫氨酸而含有35S標(biāo)記甲硫氨酸(Amersham)、濃度為lOOmicroCi/ml的MEM中孵化該培養(yǎng)基(脈沖)。然后，用含有10倍濃度冷甲硫氨酸的MEM沖洗細(xì)胞兩次，而且在MEM中孵化額外3小時(跟蹤)。在標(biāo)價后，將細(xì)胞溶解于發(fā)射免疫沉淀檢驗(RIPA)緩沖液，用抗用于感染的特定病毒株的抗血清(可以從ATCC和美國疾病預(yù)防與控制中心獲得抗流感血清)沉淀HA，然后用蛋白G-瓊脂糖(Amersham)純化免疫復(fù)合物。用帶有自動射線照相術(shù)的SDS-PAGE分離樣品。在抑肽酶融合蛋白沒有處理過的樣品中，HAl和HA2是主要的HA種類；而在抑肽酶處理過的樣品中，HAO是存在的HA的主要類型。實施例4合成五個唾液酸酶的基因，表達和純化該唾液酸酶蛋白簡介流感病毒屬于RNA病毒的正粘病毒科。A型和B型病毒都具有8節(jié)段負(fù)鏈RNA基因組，其封閉于源自宿主細(xì)胞的脂包膜中。病毒包膜被刺突覆蓋，該刺突由三種類型蛋白質(zhì)組成血凝素(HA)，將病毒附著于宿主細(xì)胞受體和調(diào)節(jié)病毒和細(xì)胞的膜融合；神經(jīng)氨酸酶(NA)，便利于新病毒從宿主細(xì)胞中釋放；以及少量的M2蛋白，用作離子通道。對于流感A性病毒而言，HA和NA都經(jīng)過了抗原性飄流和抗原性轉(zhuǎn)移，病毒亞型是通過它們的HA和NA蛋白之間的血清學(xué)差異來區(qū)別的。總共有15個HA類型(H1-H15)和9個NA類型(N1-N9)，但是，迄今為止在人流感A型病毒中僅發(fā)現(xiàn)了3個HA(H1-H3)和2個NA(m和N2)(Granoff，A.&ffebster,R.G.編輯，《病毒學(xué)百科全書》，第二版，卷2)。與流感A型病毒相對照，流感病毒B沒有獨特的抗原亞型。流感B型病毒僅在人類中傳播，而流感A型病毒可以從動物如豬、馬、雞、鴨和其它鳥類的所有宿主中分離到，這說明了產(chǎn)生抗原轉(zhuǎn)移的流感A型病毒的遺傳重配。野生的水鳥被認(rèn)為是禽類和哺乳動物類的所用流感病毒的原始蓄積地。有大量的證據(jù)表明水鳥與包括豬和馬的其它種類之間傳播病毒，以及通過豬間接傳播給人。從豬或雞到人的直接傳播也已經(jīng)有報道(Ito，T.(2000)MicrobiolImmunol44(6):423_430)。宿主細(xì)胞的流感病毒受體是該細(xì)胞表面的唾液酸。唾液酸是具有9碳骨架的α-酮酸，常見于寡糖鏈的最外端，并且附著于糖蛋白和糖脂。其中一個主要的唾液酸類型是N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，為大多數(shù)其它類型的生物合成前體。在自然界中發(fā)現(xiàn)了在Neu5Ac與碳水化合物支鏈的次末端半乳糖殘基之間兩種主要的連接，Neu5Acα(2,3)-Gal和Neu5Acα(2,6)-Gal0Neu5Acα(2，3)—Gal和Neu5Acα(2，6)—Gal都能被流感病毒認(rèn)作受體(Schauer，R.(1982)Adv.CarbohydrateChem&Biochem40:131_235)，即使人類的病毒似乎優(yōu)選Neu5Aca(2，6)_Gal，禽類和馬科的病毒主要認(rèn)可Neu5Acα(2，3)-Gal(Ito，Τ.(2000)MicrobiolImmunol44(6):423_430)。流感A型和B型病毒的感染典型地開始于上呼吸道的粘膜表面。病毒復(fù)制最初限于上呼吸道，但是能延伸至下呼吸道并且導(dǎo)致可致命的支氣管肺炎。致死的風(fēng)險為每10，000感染有一例，但是，在大流行期，對于具有既存心肺狀況的高風(fēng)險組以及免疫學(xué)上的初始個體來說，該風(fēng)險顯著性增加。一種含有能有效地破壞Neu5Acα(2,3)-Gal和Neu5Acα(2,6)-Gal兩種受體的唾液酸酶的治療化合物，可以給予抗最寬泛的、包括動物的流感病毒的保護。即使病毒株每年都改變，它也能保持有效。由于唾液酸酶以宿主細(xì)胞而不是病毒為靶，而且在病毒生命周期的“臨界點(chokingpoint)”發(fā)揮作用，所以抗性病毒的產(chǎn)生是不可能的。結(jié)合了蛋白質(zhì)的唾液酸在細(xì)胞表面同源性交接(turnsover)，半衰期為33小時(Kreisel，W，Volk,ΒΑ,Buchsel,R.^PReutter,W.(1980)ProcNatlAcadSciUSA77:1828-1831)。因此，我們估計，每天一次或每天二次給予唾液酸酶將產(chǎn)生充分的抗病毒保護。在高級真核細(xì)胞中以及在一些主要的病原微生物包括病毒、細(xì)菌和原生蟲中可發(fā)現(xiàn)唾液酸酶。病毒和細(xì)菌的唾液酸酶已經(jīng)被明確地表征，而且其中一些的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定(Crennel1，SJ,Garman,E,Laver，G,Vimr,E禾口Taylor，G.(1994)Structure2535-544；Janakiraman,MN,White,CL,Laver,WG,Air,GM禾口Luo，Μ.(1994)Biochemistry33:8172_8179；Pshezhetsky,A,Richard,C,Michaud,L,Igdoura,S,Wang,S,Elsliger,M,Qu,J,Leclerc,D,Gravel,R,Dallaire,L禾口Potier,Μ.(1997)NatureGenet15316-320)。在最近幾年里，也已經(jīng)克隆了幾個人唾液酸酶(MiIner，CM，Smith，SV，CarriIloMB,Taylor,GL,Hollinshead,M和Campbell，RD.(1997)JBioChem272:4549_4558；Monti,Ε,Preti,A,Nesti,C,Ballabio,A禾口BorsaniG.1999.Glycobiol91313-1321；Wada,Τ,Yoshikawa,Y,Tokuyama,S,Kuwabara,Μ,Akita,H禾口Miyagi,Τ.(1999)BiochemBiophyResCommuni261:21_27；Monti,Ε,Bassi,MT,Papini,N,Riboni,Μ,Manzoni,Μ,Veneranodo,B,Croci,G,Preti,A,Ballabio,A,Tettamanti,G禾口Borsani,G.(2000)BichemJ349:343-351)。所有表征的唾液酸酶在氨基末端部分共享一4個氨基酸的基團，跟著是取決于蛋白質(zhì)被重復(fù)三至四次的Asp盒(box)基元(Monti，E，Bassi，MT，Papini，N，Riboni，Μ,Manzoni,Μ,Veneranodo,B,Croci,G,Preti,A,Ballabio,A,Tettamanti,G禾口Borsani,G.(2000)BichemJ349:343_351；Copley,RR,Russell,RB和Ponting，CP.(2001)ProteinScilO=285-292)0盡管唾液酸酶超級家族的所有氨基酸的相同性較低，為約20_30%，分子的全部折疊，尤其是催化氨基酸，是非常相似(Wada，Τ,Yoshikawa,Y，Tokuyama,S，Kuwabara,Μ,Akita,H禾口Miyagi，Τ.(1999)BiochemBiophyResCommuni26121-27；Monti,Ε,Bassi,MT,Papini,N,Riboni,Μ,Manzoni,Μ,Veneranodo,B,Croci,G,Preti,A,Ballabio,A,Tettamanti,G禾口Borsani，G.(2000)BichemJ349:343_351；Copley,RR,Russell,RBandPonting,CP.(2001)ProteinSci10:285_292)。唾液酸酶通常被分為兩個家族“小的”唾液酸酶具有約42kDa的分子量，而且為了最大活性不需要二價金屬離子；“大的”唾液酸酶具有約65kDa的分子量，而且為了最大活性需要二價金屬離子(Wada，Τ,Yoshikawa,Y,Tokuyama,S,Kuwabara,Μ,Akita,H和Miyagi,T.(1999)BiochemBiophyResCommuni261:21_27;Monti，E，Bassi，MT，Papini，N，Riboni,M,Manzoni,M,Veneranodo,B,Croci,G,Preti,A,Ballabio,A,Tettamanti,G禾口Borsani,G.(2000)BichemJ349:343_351；Copley,RR,Russell,RB和Ponting，CP.(2001)ProteinSci10:285_292)。15個以上的唾液酸酶蛋白已被純化，而且在底物特異性和酶動力方面彼此變化較大。為了產(chǎn)生廣譜抗流感病毒的保護，唾液酸酶必須有效地破壞在α(2，6)_Gal和α(2，3)-Gal連接中以及在糖蛋白和一些糖脂彼此關(guān)系中的唾液酸。病毒唾液酸酶，如那些源自流感A型病毒、禽瘟病毒、紐卡斯?fàn)?Nercastle)疫病毒，通常是Neu5Acα(2，3)_Gal特異性的，而且僅破壞Neu5Aca(2，6)-Gal。小的細(xì)菌唾液酸酶通常與在糖蛋白和糖脂彼此關(guān)系中的唾液酸基本不發(fā)生反應(yīng)。相反地，大的細(xì)菌唾液酸酶可有效地切割在多數(shù)天然底物彼此關(guān)系的(α2，6)-Gal和(α2,3)-Gal連接中的唾液酸(附圖4;Vimr，DR.(1994)TrendsMicrobiol2271-277；Drzeniek,R.(1973)HistochemJ5271-290；Roggentin,P,Kleineidam,RG禾口Schauer,R.(1995)BiolChemHoppe-Seyler376569-575；Roggentin,P,Schauer,R,Hoyer,LL和Vimr,ER.(1993)MolMicrob9:915_921)。由于它們廣泛的底物特異性，大的細(xì)菌唾液酸酶是較好的候選。在附圖4表示的、已知底物特異性的大的細(xì)菌唾液酸酶中，霍亂弧菌(Vibriocholera)唾液酸酶為了活性需要Ca2+，使得較少優(yōu)選它。更優(yōu)選的唾液酸酶包括源自產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)的71kDa酶、源自粘性放線菌(ActinomycesViscosus)的113kDa酶以及Arthrobacterureafaciens的唾液酸酶。第三個唾液酸酶，即源自Micromonosporaviridifaciens的68kDa酶，已知可破壞流感病毒受體(Air，GMandLaver,WG.(1995)Virology211:278_284)，并且也是一個候選。這些酶具有高度特異活性(產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(C.perfringens)為600U/mg蛋白質(zhì)(Corfield,AP,Veh,Rff,ffember,M,Michalski，JC和Schauer,R.(1981)BichemJ197:293-299)，和粘性放線菌(A.Viscosus)為680U/mg蛋白質(zhì)(Teufel,M,Roggentin,P.和Schauer，R.(1989)BiolChemHoppeSeyler370:435_443))，都是沒有二價金屬離子的完全活性，而且已經(jīng)被克隆和從大腸桿菌種純化為重組蛋白(Roggentin，P，Kleineidam，RG禾口Schauer，R.(1995)BiolChemHoppe-Seyler376:569_575，Teufel,Μ,Roggentin,P.禾口Schauer，R.(1989)BiolChemHoppeSeyler370:435_443，Sakurada，K，Ohta，T和Hasegawa，Μ.(1992)JBacteriol174:6896-6903)。另外，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(C.perfringens)于2_8°C在溶液中經(jīng)過數(shù)周仍是穩(wěn)定的，而且于4°C和白蛋白存在的條件下可達兩年以上(Wang，F(xiàn)Z,Akula,SM,Pramod,NP,Zeng,L和Chandran，B.(2001)JVirol75:7517-27)。粘性放線菌(A.Viscosus)對于冷凍和融合是不穩(wěn)定的，但是于4°C、在0.IM醋酸緩沖液中PH5的條件下是穩(wěn)定的(Teufel,M，Roggentin,P.和Schauer,R.(1989)BiolChemHoppeSeyler370:435-443)。盡管用細(xì)菌唾液酸酶誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的幾率較低，原因是這些蛋白質(zhì)典型地用于上呼吸道而不是全身性被吸收，但是對于在人個體中長期使用，一種人的酶是更理想的。目前，已經(jīng)從人克隆了四種唾液酸酶基因NEU1/G9/溶酶體(lysosomal)唾液酸酶(Pshezhetsky,A,Richard,C,Michaud,L,Igdoura,S,Wang,S,Elsliger,Μ,Qu,J,Leclerc,D,Gravel,R,Dallaire,L禾口Potier,Μ.(1997)NatureGenet15:316-320.，Milner，CM，Smith，SV，CarrilloMB，Taylor，GL，Hollinshead，M和Campbell,RD.(1997).JBioChem272:4549_4558)，NEU3，一種從人腦中分離到的膜相關(guān)的唾液酸酶(ffada,T,Yoshikawa,Y,Tokuyama,S,Kuwabara,M,Akita,H禾口Miyagi,T.(1999)BiochemBiophyResCommuni261:21_27,Monti,Ε,Bassi,MT,Papini,N,Riboni,Μ,Manzoni,Μ,Veneranodo,B,Croci,G,Preti,A,Ballabio,A,Tettamanti,G禾口Borsani,G.(2000)BichemJ349:343-351)，NEU2，一種以非常低的水平在人骨骼肌中表達的42kDa唾液酸酶(Monti，Ε,Preti,A,Nesti,C,Ballabio,A和BorsaniG.(1999)Glycobiol9:1313-1321)，以及NEU4，一種在所用的人檢查組織中表達的、含497個氨基酸的蛋白質(zhì)(GenebankNM080741)(Monti,Ε,Preti,A,Venerando,B禾口Borsani，G.(2002)NeurochemRes27:646_663)。氨基酸序列對比揭示了，NEU2(SEQIDNO:8)和NEU4(SEQIDNO:9)都是胞液唾液酸酶。形成鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)唾液酸酶催化位點的12個氨基酸殘基中的9個被保存在NEU2和NEU4中(Monti，Ε,Preti,A,Nesti,C,Ballabio,A和BorsaniG.(1999)Glycobiol9:1313_1321，附圖3)。另外，NEU4也表示一個延展度(stretch)約80個氨基酸的殘基(氨基酸294-373)，其可能是已知哺乳動物類唾液酸酶中獨有的(Monti，E，Preti，A，Venerando，B禾口Borsani，G.(2002)NeurochemRes27:646—663)。不像被選的、大的細(xì)菌唾液酸酶，NEU2和NEU4的底物特異性是未知的。需要檢測NEU2和NEU4能否有效地破壞流感病毒受體。唾液酸酶檢驗將NEU2、NEU4和M.viridifaciens于-20°C保存在PBS和50%甘油中。將產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(C.perfringens)和粘性放線菌(A.Viscosus)酶于4°C保存在IOmM醋酸緩沖液(PH5)中。蛋白質(zhì)制品通過HPLC和SDS-PAGE電泳表征。通過唾液酸酶檢驗可監(jiān)視酶的特異性活性和穩(wěn)定性。用作為底物的熒光的2’-(4-甲基傘形酮基)-α-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸)(4Mu-NANA)(Sigma)來測定唾液酸酶的酶活性。特別地，將反應(yīng)以兩份的形式(induplicate)建立在0.IM枸櫞酸/磷酸鈉緩沖液pH5.6，在最終的100微升中還含有400微克牛血清白蛋白以及0.2mM4MU-NANA,并且37°C孵化5_10分鐘。加入Iml的0.2M甘氨酸/NaOHρΗΙΟ.2停止反應(yīng)。通過365nm激發(fā)和445nm發(fā)射的熒光計測定熒光發(fā)射，利用4-甲基傘形酮(4-MU)獲得校正曲線。實施例5比較體外唾液酸酶的功能以及為進一步研究挑選出一種唾液酸酶1.流感病毒備料從ATCC和圣朱迪兒童研究醫(yī)院獲得流感病毒株。將病毒備料生長在最低要求培養(yǎng)基(MEM)中的考克斯班尼犬腎臟(MDCK)細(xì)胞上，該培養(yǎng)基每毫升還補充了0.3%牛血清白蛋白和0.5微克的胰蛋白酶。在孵化48至72小時后，使用低速離心機將培養(yǎng)基分離。用超聲離心法并通過25%蔗糖墊將病毒顆粒小球化。將純化病毒懸浮于50%甘油-0.IMTris緩沖液中，并儲藏于-20°C。用空斑檢驗(法)(Tobita,K,Sugiura,A,Enomoto,C禾口Furuyama,M.(1975)MedMicrobiolImmnuol1629-14)或者TCID5tl測定病毒滴度，TCID50是感染50%的MDCK細(xì)胞所需要的病毒劑量。選出的人與動物流感A性株，對Neu5Aca(2，6)-Gal或Neu5Aca(2，3)-Gal具有特異性和對受體具有高度親合性(通過高血凝聚活性測定)，選擇其作體外檢測1.識別受體Neu5Acα(2,6)-Gal的株，包括從人分離的A/aichi/2/68，A/Udom/307/72,A/ProtChaimers/1/73禾口A/Victoria/3/75等(Connor，RJ,Kawaoka,Y,Webster，RG和PaulsonJC.(1994)Virology205:17-23)。2.具有Neu5Acα(2,3)-Gal特異性的株，包括從動物分離的A/duckUkraine/1/63,A/duckMemphis/928/74,A/duckhokk/5/77,A/Eq/Miami/1/63,A/Eq/Ur/1/63,A/Eq/Tokyo/71,A/Eq/Prague/71，等等(Connor，RJ,Kawaoka,Y,Webster,RG和PaulsonJC.(1994)Virology205:17-23)。2.血凝聚檢驗本檢驗用于快速測定每種酶破壞受體Neu5Acα(2,6)-Gal和Neu5Acα(2,3)-Gal的效率。特別地，將6ml雞的紅(血)細(xì)胞(redbloodcells)(SPAFAS公司，Norwich，CT)稀釋于兩倍體積的PBS，以500xg離心5分鐘，再懸浮于原始容量的PBS中。將唾液酸酶加入各種濃度的雞紅細(xì)胞中，室溫孵化30分鐘。然后，沖洗該細(xì)胞三次以除去唾液酸酶蛋白，然后再懸浮于6ml的PBS中。用BSA孵化對照細(xì)胞，并且沖洗。將各種流感病毒的株，即，將Neu5Acα(2,6)-Gal或Neu5Acα(2,3)-Gal識別為上面列出受體的株，制備在微滴度板(microtiterplates)中，用原病毒備料的PBS(100微升)連續(xù)稀釋。將處理的唾液酸酶或者對照的雞紅細(xì)胞混懸液(100微升上述制備的0.5%溶液)于4°C加入每一個井。2小時后讀取這些板。導(dǎo)致血細(xì)胞凝聚的病毒最低濃度定義為一個血凝聚單位。我們將尋找能有效地消除所用病毒株產(chǎn)生血凝聚的酶。3.病毒抑制性檢驗用各種濃度的唾液酸酶處理匯合單層的MDCK細(xì)胞1小時，用緩沖液沖洗兩次，然后用各種流感病毒株感染。在孵化1小時后，再次沖洗這些細(xì)胞以除去未結(jié)合的病毒。由于預(yù)計在細(xì)胞表面上的病毒結(jié)合位點減少，故用瓊脂過載細(xì)胞，并于37°C孵化。用在唾液酸酶處理過的細(xì)胞內(nèi)的空斑數(shù)與在對照細(xì)胞內(nèi)的那些進行對比。作為一種選擇地，將細(xì)胞于37°C培養(yǎng)在常規(guī)的媒介中，并且在培養(yǎng)過程中的各個時刻，測定在培養(yǎng)媒介中的病毒滴度如TCID5Q。為了證實唾液酸酶處理可以抑制既存的感染，首先用一低滴度的病毒感染MDCK單層。在沖洗掉未結(jié)合的病毒后，在唾液酸酶存在的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。每24小時向細(xì)胞培養(yǎng)基添加新鮮的唾液酸酶。在逾72小時的周期里，測定在培養(yǎng)媒介中的病毒滴度。4.細(xì)胞毒性檢驗購買原生的人支氣管上皮細(xì)胞(Clonetics)，并根據(jù)制造商的說明書在補充最小培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將唾液酸酶加入各種濃度的培養(yǎng)媒介。細(xì)胞生長逾7-10天周期后進行測定。為了(獲得)顯微鏡可見的細(xì)胞病理效應(yīng)，也可定期地觀察細(xì)胞。實施例6.構(gòu)建和檢測唾液酸酶融合蛋白1.挑選作為錨定域的GAG結(jié)合序列一種唾液酸酶被選定是由于其最佳的總的性質(zhì)，包括抗病毒活性、毒性、穩(wěn)定性和易生產(chǎn)等。然后，我們通過基因(genetically)將其連接到一個GAG結(jié)合序列，將融合基因亞克隆至PQE載體，表達并從大腸桿菌中純化該融合蛋白。我們選擇了六種可能的人GAG結(jié)合序列PF4(氨基酸47-70)(SEQIDNO2),IL_8(氨基酸46-72)(SEQIDNO3),ATIII(氨基酸118-151)(SEQIDNO:4)，ApoE(氨基酸132-165)(SEQIDNO:5)，人雙調(diào)蛋白(氨基酸25-45)(SEQIDNO:6)，和人血管相關(guān)遷移細(xì)胞蛋白(AAMP)(氨基酸14-25)(SEQIDNO7)(附圖2)。這些序列通常以毫微摩爾水平親合力來結(jié)合肝素；盡管如此，它們的親合力彼此間卻以數(shù)量級變化(表1)。由于不清楚哪一個錨定域使得唾液酸酶發(fā)揮功能最有效，所以，將所有的四個GAG結(jié)合序列通過基因連接子序列GGGGS與唾液酸酶基因在N末端或者C末端融合，構(gòu)建如下(GAG結(jié)合域-GGGGS(SEQIDNO10)-唾液酸酶)；或(唾液酸酶-GGGGS(SEQIDNO10)-GAG結(jié)合域)通過一種改進的病毒抑制性檢驗來比較不同的融合蛋白。特別地，在有限的期限如30分鐘內(nèi)，用相同數(shù)量的每一種融合蛋白處理匯合單層的MDCK細(xì)胞。然后用緩沖液沖洗細(xì)胞兩次，以除去未結(jié)合的唾液酸酶融合蛋白，并且在培養(yǎng)媒介中再孵化1小時。隨后，將流感病毒株加入細(xì)胞1小時，然后再次沖洗細(xì)胞以除去未結(jié)合病毒。在72小時培養(yǎng)過程中，測定在培養(yǎng)媒介中的病毒滴度如TCID5tlt5用未融合唾液酸酶蛋白與本檢驗的融合蛋白相比較。如果結(jié)果太相近無法對所用融合蛋白分級，我們就通過縮小用于融合蛋白的處理窗口、降低蛋白質(zhì)濃度和提高病毒激發(fā)水平使檢驗更精確。2.優(yōu)化融合蛋白構(gòu)建從早期的實驗中選定最佳的融合蛋白之后，通過檢測不同連接子的長度進一步優(yōu)選該構(gòu)建?；诖丝紤]，制備了下列構(gòu)建(唾液酸酶-GGGS(SEQIDNO10))η(η=0，1，2，3，或4)-GAG結(jié)合域)根據(jù)上述的改進病毒保護檢驗(法)，進行蛋白表達、純化和比較。另外，如果早期的數(shù)據(jù)顯示融合蛋白對硫酸肝素的親合力越高帶來功效更好，同樣，我們就會設(shè)計來檢測是否通過提高GAG結(jié)合的親合力能進一步改善功效。這可以通過在如下構(gòu)建的融合蛋白中創(chuàng)造一個多價的GAG結(jié)合機制來取得(唾液酸酶-(GGGGS(SEQIDNO10))η-HS結(jié)合域-GAG結(jié)合域)；或(GAG結(jié)合域-(GGGGS(SEQIDNO10))η-唾液酸酶-(GGGGS(SEQIDNO10))n-GAG結(jié)合蛋白)根據(jù)上述的改進病毒保護檢驗(法)，對純化的融合蛋白基于其活性進行分級。3.細(xì)胞毒性檢驗通過用各種濃度融合蛋白來培養(yǎng)原生的人支氣管上皮細(xì)胞、遵循細(xì)胞生長曲線以及觀察任何顯微鏡下可見的細(xì)胞病理效應(yīng)，監(jiān)控融合蛋白對正常細(xì)胞生長和多態(tài)性的作用。實施例7抗其它傳染性微生物的融合蛋白設(shè)計由一個功能域和一個錨定域組成的融合蛋白，用于許多不同的應(yīng)用。例如，這里提出的唾液酸酶融合蛋白也可用作一種抗除流感病毒以外的其它病毒和細(xì)菌感染的治療/預(yù)防劑，原因是同樣已知了許多其它的傳染性微生物，如副粘性病毒(paramyxoviruses)(ffassilewa,L.(1977)ArchVirol54:299_305)、冠狀病毒(Vlasak,R.，Luytjes,W.，Spaan,W.和Palese，P.(1988)ProcNatlAcadSciUSA85:4526_4529)、輪狀病毒(Fukudome，K.，Yoshie，0.和Κοηηο,Τ.(1989)Virology172196-205)和銅綠假單胞菌(Ramphal，R.和Pyle，Μ.(1983)InfectImmun41:339_44)等，用唾液酸作為細(xì)胞受體。例如用肝素結(jié)合域融合的抑肽酶可制造一種融合蛋白，其可用于預(yù)防/治療除需要宿主絲氨酸蛋白酶活化的流感之外的其它病毒如副流感病毒的感染。參考目錄AchyuthaniKEandAchyuthanAM.2001.Comparativeenzymology,biochemistryandpathophysiologyofhumanexo-a-sialidases(neuraminidases).ComparativeBiochem&PhysiolpartB129:29-64.Air，GMandLaver,WG.1995.RedcellsboundtoinfluenzavirusN9neuraminidasearenotreleasedbytheN9neuraminidaseactivity.Virology211278-284.AuerswaldEA,HorleinD，ReinhardtG，SchroderWandSchnabelE.1988.Expression,isolationandcharacterizationofrecombinant[Arg'5，Glu52]Aprotinin.BiolChemHoppe-SeylerVol369，Suppl.，pp27_35.Barbey-MorelCL，OeltmannTN，EdwardsKMandWrightPF.1987.RoleofrespiratorytractproteasesininfectivityofinfluenzaAvirus.JInfectDis155:667-672.BessettePH，AslundF，BeckwithJandGeorgiouG.1999.EfficientfoldingofproteinswithmultipledisulfidebondsintheEscherichiacolicytoplasm.ProNatlAcadSciUSA9613703-13708.CallanRJiHartmannFAiWestSEandHinshawVS.1997.CleavageofinfluenzaAvirusHlhemagglutininbyswinerespiratorybacterialproteases.JVirol717579-7585.Connor,RJ,Kawaoka,Y,Webster,RGandPaulsonJC.1994.Receptorspecificityinhuman，avian,andequineH2andH3influenzavirusisolates.Virology20517-23.Copley,RR,Russell,RBandPonting,CP.2001.Sialidase-IikeAsp-boxessequence-similarstructureswithindifferentproteinfolds.ProtSci10285-292.Corfield，AP，Veh，RW，Wember，M，Michalski，JCandSchaueriR.1981.ThereleaseofN-acetyl-andN-glycolloyl-neuraminicacidfromsolublecomplexcarbohydratesanderythrocytesbybacterial,viralandmammaliansialidases.BichemJ197293-299.Crennell，SJ，Garman，E，Laver，G，Vimr，EandTaylor,G.1994.CrystalstructureofVibrioCholeraeneuraminidaserevealsduallectin—likedomainsinadditiontothecatalyticdomain.Structure2:535_544·Drzeniek，R.Substratespecificityofneuraminidases.1973.HistochemJ5:271-290.EndoY,CarrollKN,IkizlerMRandWrightPF.1996.Growthofinfluenzavirusinprimary,differentiatedepithelialcellsderivedfromadenoids.JVirol70:2055_2058.FritzHandWundererG.1983.Biochemistryandapplicationsofaprotinin,thekallikreininhibitorfrombovineorgans.Arzneim-Forsch33:479_494.Fukudome,K.，Yoshie，0.andKonno,T.1989.Comparisonofhuman，simian，andbovinerotavirusesforrequirementofsialicacidinhemagglutinationandcelladsorption.Virology172:196-205.GartenW，BoschFX，LinderD，RottRandKlenkHD.1981.Proteolyticactivationoftheinfluenzavirushemagglutinin:thestructureofthecleavagesiteandtheenzymesinvolvedincleavage.Virology115:361—374.Goger,B，Halden,Y，Rek，A，Mosl，R，Pye,D，Gallagher，JandKungl,AJ.2002.Differentaffinitiesofglycosaminoglycanoligosaccharidesformonomericanddimericinterleukin—8:amodelforchemokineregulationatinflammatorysites.Bichem411640-1646.GotohB，OgasawaraT，ToyodaT，InocencioN，HamaguchiMandNagaiY.1990.AnendoproteasehomologoustothebloodclottingfactorXasadeterminantofviraltropisminchickembryo.EMBOJ9:4189—4195·Granoff，A.&Webster,R.G.，ed.EncyclopediaofVirology,2“dEdition，Vol2.Gust，ID，Hampson，AW.andLavanchy,D.2001.Planningforthenextpandemic.RevMedVirol11:59_70·Hayden,FG.1996.Amantadineandrimantadine-mechanisms.InAntiviraldrugresistance(ed.D.D.Richman)，pp.59-77.Chichester，UKJohnWiley&SonsLtd.HosoyaM，MatsuyamaS，BabaM，SusukiHandShigetaS.1992.Effectsofproteaseinhibitorsonreplicationofvariousmyxoviruses·AntimicrobialAgentsandChemotherapy361432-1436.Ito，T.2000.Interspeciestransmissionandreceptorrecognitionofinfluenzaavirus.MicrobiolImmunol44(6):423_430·Janakiraman,MN,White,CL,Laver,WG,Air,GMandLuo,M.1994.StructureofinfluenzavirusneuraminidaseB/lee/40complexedwithsialicacidandadehydroanalogat1.8~Aresolution!implicationsforthecatalyticmechanism.Biochemistry33:8172_8179.Kido，H，Niwa，Y，Beppu，YandTowatari,T.1996.Cellularproteasesinvolvedinthepathogenicityofenvelopedanimalviruses,humanimmunodeficiencyvirus,influenzavirusAandsendaivirus.AdvanEnzymeRegul36:325-347.KidoH，ChenYandMurakamiM.1999.Cellularproteinasesandviralinfectioninfluenzavirus,sendaivirusandHIV-I,p.205-217.InB.Dunn(ed.),Proteasesofinfectiousagents.AcademicPress,NewYork,N.Y.Klenk,HDandRott，R.1988.Themolecularbiologyofinfluenzaviruspathogenicity.AdvVirRes34:247_281.Klenk，HDandGartenW.1994.Hostcellproteasescontrollingviruspathogenicity.TrendMicro2:39_43·Kreisel,W，Volk，ΒΑ,Buchsel,R.andReutter,W.1980.Differenthalf-livesofthecarbohydrateandproteinmoietiesofa110，000_daltonglycoproteins!solatedfromplasmamembranesofratliver.ProcN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he165170175LeuTyrCysAsnAlaArgSerProLeuGlySerArgValGlnAlaLeu180185190SerThrAspGluGlyThrSerPheLeuProAlaGluArgValAlaSer195200205LeuProGluThrAlaTrpGlyCysGlnGlySerlieValGlyPhePro210215220AlaProAlaProAsnArgProArgAspAspSerTrpSerValGlyPro225230235240ArgSerProLeuGlnProProLeuLeuGlyProGlyValHisGluPro245250255ProGluGluAlaAlaValAspProArgGlyGlyGlnValProGlyGly260265270ProPheSerArgLeuGlnProArgGlyAspGlyProArgGlnProGly275280285ProArgProGlyValSerGlyAspValGlySerTrpThrLeuAlaLeu290295300ProMetProPheAlaAlaProProGlnSerProThrTrpLeuLeuTyr305310315320SerHisProValGlyArgArgAlaArgLeuHisMetGlylieArgLeu325330335SerGlnSerProLeuAspProArgSerTrpThrGluProTrpVallie340345350TyrGluGlyProSerGlyTyrSerAspLeuAlaSerlieGlyProAla355360365ProGluGlyGlyLeuValPheAlaCysLeuTyrGluSerGlyAlaArg370375380ThrSerTyrAspGlulieSerPheCysThrPheSerLeuArgGluVal385390395400LeuGluAsnValProAlaSerProLysProProAsnLeuGlyAspLys405410415ProArgGlyCysCysTrpProSer420<210>10<211>5<212>PRT<213>人造序列<220><223>合成的構(gòu)建<400>10GlyGlyGlyGlySer1權(quán)利要求一種基于蛋白質(zhì)的組合物，所述的組合物包含含一種肽或蛋白質(zhì)的至少一個治療域，其具有能預(yù)防病原對靶細(xì)胞感染的至少一種細(xì)胞外唾液酸酶或蛋白酶抑制劑活性；和含一種肽或蛋白質(zhì)的至少一個錨定域，其中，所述的錨定域能結(jié)合在或接近所述的靶細(xì)胞表面的糖胺聚糖。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的靶細(xì)胞為上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述的靶細(xì)胞為上皮細(xì)胞。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述的上皮細(xì)胞是呼吸道上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞或腺樣上皮細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的錨定域能結(jié)合肝素或硫酸乙酰肝素。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述的錨定域是一種肽。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述的錨定域的肽含有一種天然存在的蛋白質(zhì)的一段糖胺聚糖結(jié)合氨基酸序列，或一段實質(zhì)上同源于天然存在的蛋白質(zhì)的糖胺聚糖結(jié)合序列的序列。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述的錨定域的肽含有一種哺乳動物蛋白質(zhì)的糖胺聚糖結(jié)合氨基酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的錨定域的肽含有一種人蛋白質(zhì)的糖胺聚糖結(jié)合氨基酸序列。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述的氨基酸序列包括人血小板因子4(SEQIDNO:2)、人白介素8(SEQIDNO3)、人抗凝血酶III(SEQIDNO:4)、人阿樸脂蛋白E(SEQIDNO:5)、人血管相關(guān)遷移細(xì)胞蛋白(SEQIDNO6)或者人雙調(diào)蛋白(SEQIDNO7)的糖胺聚糖結(jié)合氨基酸序列或其實質(zhì)上同源的序列。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的病原是一種病毒。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述的病毒是一種流感病毒或一種副流感病ο13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述的病毒是一種流感病毒，所述的流感病毒是一種流感A型病毒或一種流感B型病毒。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述的至少一個治療域含有一種蛋白酶抑制劑。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述的蛋白酶抑制劑抑制一種涉及加工病毒蛋白質(zhì)的酶。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述的涉及加工病毒蛋白質(zhì)的酶是一種宿主的酶。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述的蛋白酶抑制劑是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述的絲氨酸蛋白酶抑制劑是抑肽酶、亮抑酶肽、大豆蛋白酶抑制劑、e-氨基己酸或者η-對甲苯磺酰-L-賴氨酸。19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的治療域是唾液酸酶或者其活性部分，其中所述的活性部分保留唾液酸酶活性并且不含有全長的唾液酸酶。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于至少一種病毒唾液酸酶、至少一種細(xì)菌唾液酸酶或者至少一種真核唾液酸酶。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于至少一種細(xì)菌唾液酸酶。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于能切割唾液酸α2-6連接和唾液酸α2-3連接的一種細(xì)菌唾液酸酶。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于霍亂弧菌唾液酸酶、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌唾液酸酶、粘性放線菌唾液酸酶或者Micromonosporaviridifaciens唾液酸酶。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于粘性放線菌唾液酸酶。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其含有僅一種細(xì)菌唾液酸酶。26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于至少一種真核唾液酸酶。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于至少一種人唾液酸酶。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于NEU1、NEU3、NEU2或者NEU4。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于NEU2(SEQIDNO8)或者NEU4(SEQIDNO9)。30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其進一步含有將所述的至少一個錨定域連接至所述的至少一個治療域的至少一種肽連接子。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述的至少一種肽連接子含有至少一個甘氨酸殘基。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述的至少一種肽連接子含有序列(GGGGS)η,這里η是從1至20的一個整數(shù)。33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其含有僅一個錨定域。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述的錨定域是所述的至少一個治療域的N末端。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述的錨定域是所述的至少一個治療域的C末端。36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其含有至少兩個錨定域。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述的錨定域中的至少一個是所述的治療域的N末端，和所述的錨定域中的至少一個是所述的治療域的C末端。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述的錨定域和所述的治療域是用肽連接子連接的。39.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其含有至少兩個治療域。40.一種藥物制劑，其含有權(quán)利要求1所述的組合物。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物制劑，其被配制成噴劑、吸入劑、混懸液、用于注射的溶液、用于口服施用的混懸液、藥膏、凝膠、軟膏劑、片劑、膠囊或錠劑。42.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物在制備防止、預(yù)防或治療流感感染的藥物制劑中的用途。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的用途，其中所述的藥物制劑在一種遞送系統(tǒng)中。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的用途，其中所述的遞送系統(tǒng)是噴霧器。45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的用途，其中所述的遞送系統(tǒng)是霧化器或滴瓶。46.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物在制備防止、預(yù)防或治療病原感染的藥物制劑中的用途。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其中所述的組合物含有唾液酸酶，所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于至少一種病毒唾液酸酶、至少一種細(xì)菌唾液酸酶或者至少一種真核唾液酸酶。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的用途，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于至少一種真核唾液酸酶。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的用途，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于至少一種人唾液酸酶。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的用途，其中所述的唾液酸酶的編碼基因是或者是實質(zhì)上同源于NEU2或者NEU4基因，并且編碼是或者是實質(zhì)上同源于SEQIDNO8或者SEQIDNO:9中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。51.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其中所述的藥物制劑在一種遞送系統(tǒng)中。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的用途，其中所述的遞送系統(tǒng)是噴霧器、霧化器或滴瓶。53.根據(jù)權(quán)利要求47所述的用途，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于至少一種細(xì)菌唾液酸酶。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的用途，其中所述的細(xì)菌唾液酸酶選自由霍亂弧菌唾液酸酶、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌唾液酸酶、粘性放線菌唾液酸酶和Micromonosporaviridifaciens唾液酸酶組成的組。55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的用途，其中所述的細(xì)菌唾液酸酶是粘性放線菌唾液酸酶。56.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其中所述的病原是一種細(xì)菌。57.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其中所述的病原是一種病毒。58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的用途，其中所述的病毒是副流感病毒或流感病毒。59.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其中受治療者是人類受治療者或動物受治療者。60.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述的治療域是或者是實質(zhì)上同源于人唾液酸酶，所述的人唾液酸酶的編碼基因選自NEU1、NEU3、NEU2或NEU4基因；或者細(xì)菌唾液酸酶，所述的細(xì)菌唾液酸酶選自霍亂弧菌唾液酸酶、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌唾液酸酶、粘性放線菌唾液酸酶和Micromonosporaviridifaciens唾液酸酶。61.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其中所述的靶細(xì)胞是上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的用途，其中所述的靶細(xì)胞是上皮細(xì)胞。63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的用途，其中所述的上皮細(xì)胞是呼吸道上皮細(xì)胞、腺樣上皮細(xì)胞或支氣管上皮細(xì)胞。64.一種遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)含有權(quán)利要求40所述的藥物制劑。65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的遞送系統(tǒng)，所述的遞送系統(tǒng)是噴霧器、霧化器或者滴瓶。66.根據(jù)權(quán)利要求47所述的用途，其中所述的唾液酸酶是或者是實質(zhì)上同源于至少一種細(xì)菌唾液酸酶。67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的用途，其中所述的細(xì)菌唾液酸酶選自由霍亂弧菌唾液酸酶、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌唾液酸酶、粘性放線菌唾液酸酶和Micromonosporaviridifaciens唾液酸酶組成的組。68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的用途，其中所述的細(xì)菌唾液酸酶是粘性放線菌唾液酸酶。69.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其中所述的病原是一種細(xì)菌。70.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其中所述的病原是一種病毒。71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的用途，其中所述的病毒是副流感病毒或流感病毒。72.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其中受治療者是人類受治療者或動物受治療者。73.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述的治療域是或者是實質(zhì)上同源于人唾液酸酶，所述的人唾液酸酶的編碼基因選自NEU1、NEU3、NEU2或NEU4基因；或者細(xì)菌唾液酸酶，所述的細(xì)菌唾液酸酶選自霍亂弧菌唾液酸酶、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌唾液酸酶、粘性放線菌唾液酸酶和Micromonosporaviridifaciens唾液酸酶。74.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其中所述的靶細(xì)胞是上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的用途，其中所述的靶細(xì)胞是上皮細(xì)胞。76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的用途，其中所述的上皮細(xì)胞是呼吸道上皮細(xì)胞、腺樣上皮細(xì)胞或支氣管上皮細(xì)胞。77.一種藥物制劑，其包括唾液酸酶或者其活性部分，其中所述的活性部分保留酶活性并且不含有全長的酶。78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的藥物制劑，其被配制成噴劑、吸入劑、混懸液、用于注射的溶液、用于口服施用的溶液、用于滴眼劑的溶液、霜劑、藥膏、凝膠、軟膏劑、片劑、膠囊或錠劑。79.根據(jù)權(quán)利要求77所述的藥物制劑，其中所述的唾液酸酶是一種真核唾液酸酶、一種細(xì)菌唾液酸酶或者一種病毒唾液酸酶或?qū)嵸|(zhì)上與其同源的唾液酸酶。80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的藥物制劑，其中所述的唾液酸酶是一種真核唾液酸酶或者實質(zhì)上同源于真核唾液酸酶。81.根據(jù)權(quán)利要求79所述的藥物制劑，其中所述的唾液酸酶是一種細(xì)菌唾液酸酶或者實質(zhì)上同源于細(xì)菌唾液酸酶。82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的藥物制劑，其中所述的細(xì)菌唾液酸酶選自由霍亂弧菌唾液酸酶、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌唾液酸酶、粘性放線菌唾液酸酶和Micromonosporaviridifaciens唾液酸酶組成的組。83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的藥物制劑，其中所述的細(xì)菌唾液酸酶是粘性放線菌唾液酸酶。84.—種遞送系統(tǒng)，所述的遞送系統(tǒng)含有權(quán)利要求77所述的藥物制劑。85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的遞送系統(tǒng)，所述的遞送系統(tǒng)是噴霧器、霧化器或者滴瓶。全文摘要本發(fā)明提供了用于預(yù)防和治療病原感染的新組合物和方法。特別是，本發(fā)明提供了化合物，該化合物具有一個將該化合物錨定至靶細(xì)胞表面的錨定域，和一個能在細(xì)胞外發(fā)揮作用以預(yù)防病原如病毒對靶細(xì)胞感染的治療域。優(yōu)選的靶細(xì)胞為上皮細(xì)胞。本發(fā)明提供了用于預(yù)防病毒疾病如流感的組合物和方法，使用了這樣的化合物，該化合物具有能將連接的靶細(xì)胞結(jié)合至能在細(xì)胞外發(fā)揮作用來影響靶細(xì)胞病毒感染的酶活性的錨定域。本發(fā)明也提供了用于預(yù)防病毒疾病如流感的組合物和方法，使用了這樣的化合物，該化合物具有能將連接的靶細(xì)胞結(jié)合至能在細(xì)胞外發(fā)揮作用來影響靶細(xì)胞病毒感染的蛋白酶抑制劑的錨定域。文檔編號A61K38/17GK101804200SQ200910180019公開日2010年8月18日申請日期2003年11月21日優(yōu)先權(quán)日2002年11月22日發(fā)明者余芒,房芳申請人:余芒;房芳