專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)酪酸有益菌在制備防治重癥疾病腸道屏障損傷及損傷后并發(fā)癥制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種或一種以上產(chǎn)酪酸有益菌在制備預(yù)防和治療重癥疾病中腸道屏 障損傷及損傷后并發(fā)癥制劑中的應(yīng)用，具體是指產(chǎn)酪酸有益菌通過(guò)在腸道產(chǎn)生酪酸，將酪 酸引入腸道，而提供腸粘膜能量、促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞增殖和抑制腸粘膜細(xì)胞凋亡，改善腸粘膜 通透性，預(yù)防和治療腸粘膜屏障損傷而發(fā)揮對(duì)腸屏障的防治作用，屬于生物藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大量研究表明重癥疾病患者，包括嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、燒傷、手術(shù)、重癥感染、危重患 者、入住重癥監(jiān)護(hù)室患者、應(yīng)激打擊患者、急性胰腺炎、重癥急性胰腺炎、肝硬化、肝炎、腸 癌、腸癌術(shù)后、腫瘤患者、腫瘤放化療、重癥膽管炎、饑餓、長(zhǎng)期全胃腸道外營(yíng)養(yǎng)、多系統(tǒng)器官 功能衰竭、急性呼吸道窘迫綜合征、腎衰、心衰、肝衰、顱腦外傷、呼吸衰竭、循環(huán)衰竭、糖尿 病等，在應(yīng)激狀態(tài)下最先且最易受累的部位是腸粘膜，腸表現(xiàn)為粘膜糜爛、出血、細(xì)胞凋亡 壞死和細(xì)胞增殖受到抑制，腸粘膜通透性增加，腸屏障功能遭到破壞。腸道中的致病微生物 和毒素透過(guò)損傷的腸屏障進(jìn)一步導(dǎo)致各種并發(fā)癥，比如內(nèi)源性感染、炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒 癥、多器官功能不全綜合征、內(nèi)毒血癥、細(xì)菌移位、全身感染、多系統(tǒng)器官功能衰竭，從而影 響患者的康復(fù)。Venkatraman等研究表明丁酸(酪酸)能夠逆轉(zhuǎn)腸粘膜通透性的增加[Scand. J. Gastroenterol. 2000,35 1053-1059]。目前，谷氨酰胺已經(jīng)作為重癥疾病患者預(yù)防和治 療腸粘膜屏障損傷及預(yù)防并發(fā)癥的主要物質(zhì)，但Chapman等1994年發(fā)現(xiàn)，在大腸的不同區(qū) 段中，其細(xì)胞都優(yōu)先利用丁酸作為能量來(lái)源，其次為谷氨酰胺，再次為葡萄糖[Gut，1994， 35-76]，因此對(duì)于重癥疾病患者應(yīng)用丁酸預(yù)防和治療腸粘膜屏障損傷及并發(fā)癥的療效要好 于谷氨酰胺。Clausen等利用小鼠結(jié)腸細(xì)胞，在體外測(cè)定14C標(biāo)記的短鏈脂肪酸，發(fā)現(xiàn)腸粘膜 優(yōu)先吸收利用丁酸[Gastroenterology，1994，106 (2) :423_432]。丁酸已經(jīng)被證實(shí)是結(jié)腸 能量的首選來(lái)源，提供腸粘膜70 %的能量，促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，改善腸粘膜通透性， 修復(fù)受損的腸粘膜，因此，對(duì)于重癥疾病患者給腸道補(bǔ)充丁酸，能夠有效預(yù)防和治療腸粘膜 屏障損傷，并進(jìn)一步預(yù)防內(nèi)源性感染、炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥、多器官功能不全綜合征、內(nèi) 毒血癥、細(xì)菌移位、全身感染、多系統(tǒng)器官功能衰竭等并發(fā)癥。但如果丁酸以其自由鹽的形 式給予會(huì)產(chǎn)生難聞的氣味，同時(shí)口服給予會(huì)在胃和小腸被吸收，不能有效達(dá)到大腸發(fā)揮作 用。制成緩釋或腸溶制劑，制劑又相對(duì)較貴，且隨著腸道蠕動(dòng)會(huì)很快被排出體外，劑量也不 好控制。制成灌腸劑，應(yīng)用不方便，又不能有效達(dá)到近端腸道。因此，以上各種問(wèn)題制約了 丁酸制劑在重癥疾病患者中的應(yīng)用。因此，是否能找到一種載體把丁酸帶到腸道并持續(xù)釋放，且劑量容易控制，價(jià)錢(qián)便 宜，是臨床藥理專(zhuān)家、臨床醫(yī)生共同關(guān)心的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種由產(chǎn)酪酸的有益菌制成的制劑，能在重癥患者的腸道內(nèi) 分泌大量丁酸，預(yù)防和治療腸粘膜損傷及腸粘膜損傷后并發(fā)癥，克服了直接應(yīng)用丁酸上述 存在的各種問(wèn)題。根據(jù)背景技術(shù)所述重癥疾病患者由于腸粘膜屏障損傷，腸腔中的致病微 生物及內(nèi)毒素和腸毒素可穿越腸粘膜，導(dǎo)致內(nèi)源性感染、炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥、多器官 功能不全綜合征、內(nèi)毒血癥、細(xì)菌移位、全身感染、多系統(tǒng)器官功能衰竭等并發(fā)癥，而丁酸能 夠提供腸粘膜能量和抑制腸粘膜細(xì)胞凋亡，改善腸粘膜通透性，保護(hù)腸粘膜和修復(fù)受損的 腸粘膜。其中重癥疾病指嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、燒傷、手術(shù)、重癥感染、危重患者、入住重癥監(jiān)護(hù)室 患者、應(yīng)激打擊患者、急性胰腺炎、重癥急性胰腺炎、肝硬化、肝炎、腸癌、腸癌術(shù)后、腫瘤和 腫瘤放化療、重癥膽管炎、饑餓、長(zhǎng)期全胃腸道外營(yíng)養(yǎng)、多系統(tǒng)器官功能衰竭、急性呼吸道窘 迫綜合征、腎衰、心衰、肝衰、顱腦外傷、呼吸衰竭、循環(huán)衰竭、糖尿病等。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒 定手冊(cè)》(第八版)或相關(guān)細(xì)菌鑒定資料梭菌屬和真桿菌屬的主要特征之一就是在代謝過(guò) 程中能產(chǎn)生大量的丁酸，因此，本發(fā)明的主要技術(shù)方案就是通過(guò)分離鑒定獲得沒(méi)有毒性的 梭菌和真桿菌制成制劑，通過(guò)口服或灌胃等方式補(bǔ)充到重癥患者腸道代謝產(chǎn)生丁酸，提供 腸粘膜能量，促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞增殖，改善腸粘膜通透性，修復(fù)受損的腸粘膜，預(yù)防和治療腸 粘膜損傷及腸粘膜損傷后并發(fā)癥。由于本發(fā)明首次提出通過(guò)產(chǎn)酪酸的有益菌在上述中的應(yīng) 用，因此本發(fā)明并不局限于梭菌和真桿菌，所有產(chǎn)酪酸的有益菌在重癥疾病中預(yù)防和治療 腸粘膜損傷及腸粘膜損傷后并發(fā)癥中的應(yīng)用均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，包括在動(dòng)物中的 應(yīng)用。本發(fā)明所述真桿菌和梭菌的技術(shù)方案只是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施說(shuō)明，并不是對(duì)本發(fā)明的 限制。本發(fā)明的制劑的制備優(yōu)選是通過(guò)下述步驟實(shí)施的，但不局限于此制備工藝，公知 的能實(shí)現(xiàn)的制備工藝均可以采取含真桿菌或梭菌的樣本，優(yōu)選人或動(dòng)物糞便，更優(yōu)選健 康嬰兒糞便，然后將樣品置于滅菌厭氧瓶?jī)?nèi)，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混合，迅速?gòu)闹腥?克樣品 加入18mL滅菌的稀釋液中，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混勻，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，進(jìn)行10入10_2、10_3、 10_4，10_5，10_6，10_7梯度稀釋?zhuān)?0_5，10_6，10_7三個(gè)稀釋梯度，分別涂布于真桿菌或梭菌選 擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C下培養(yǎng)48小時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的 單菌落分別接種于液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時(shí)。將 所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出各菌種的干燥菌 粉，然后根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)或相關(guān)細(xì)菌鑒定資料進(jìn)行菌種鑒定、產(chǎn)丁酸實(shí) 驗(yàn)和毒性試驗(yàn)，將能產(chǎn)生丁酸和無(wú)毒性的真桿菌或梭菌干燥菌粉單獨(dú)或組合按需要比例添 加輔料制成片劑、膠囊、散劑、灌腸劑和液體制劑等各種劑型，或制成藥品、保健食品、飲品、 腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑、食品、獸藥和飼料添加劑。真桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于純化水100mL，胰蛋白胨 lg，酵母浸膏0. 5g，磷酸氫二鈉0. 4g，葡萄糖0. 15g，可溶性淀粉0. 05g, L-半胱氨酸0. 02g, L-半胱氨酸鹽酸鹽0. 05g,瓊脂1. 5g，調(diào)pH值7. 7，115°C，20分鐘高壓滅菌。滅菌后在冷卻 到60°C后加入5mL脫纖維馬血，ES溶液4mL。其中ES溶液丙酸鈉30%，硫酸鏈霉素4%， 硫酸巴龍霉素2%，硫酸多粘菌素B0. 02%。真桿菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于絞碎的牛肉500g，蒸餾水1L，INNaOH 25. OmL，用精牛肉或馬肉，絞碎去除脂肪和連接組織，混合肉、水和氫氧化鈉煮沸，同時(shí)攪
4拌，冷卻至室溫，略去表面的脂肪并過(guò)濾，保留濾液，補(bǔ)充足夠的蒸餾水濾液恢復(fù)1升原 體積。向每100mL濾液中添加蛋白胨2. Og、葡萄糖0. 5g、酵母浸膏1. 0g、鹽酸半胱氨酸 0. 05g、鹽溶液4. OmL,維生素溶液0. lmL、5mg/mL氯化血紅素溶液0. 5mL,調(diào)pH至7. 2 士 0. 1，在厭氧管內(nèi)通入97%的氮，3%的氫，蓋緊丁基橡膠瓶塞帽，121°C高壓滅菌15min。其 中1、鹽溶液的配制稱(chēng)取無(wú)水氯化鈣0. 2g，硫酸鎂0. 2g，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg， 碳酸氫鈉10g，氯化鈉2g，加蒸餾水至1000mL ；2、氯化血紅素溶液(5mg/mL)的配制稱(chēng)取氯 化血紅素0. 5g溶于lmol/L氫氧化鈉lmL中，加蒸餾水至100mL，121°C高壓滅菌15min，冰 箱保存；3、維生素&溶液的配制稱(chēng)取維生素& lg加無(wú)水乙醇99mL，過(guò)濾除菌，放冷暗處 保存。梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于純化水1L，蛋白胨40.0g， Na2HP04 5. 0g, K2HP04 1. Og, NaCl 2. Og, MgS04 0. lg，葡萄糖 2. 0g，瓊脂 25. 0g，調(diào) pH 7. 6， 116°C滅菌20分鐘，待其冷至50°C左右，加入卵黃液50. OmL，加入終濃度為200 u g/mL的硫 酸多粘菌素B，加入終濃度200 u g/mL的新霉素，充分混勻后，分注于平皿中。梭菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于純化水1L，胰蛋白胨10.0g，牛肉浸膏 10. 0g,酵母浸膏3. 0g,葡萄糖5. 0g, NaCl 5. 0g,可溶性淀粉1. 0g,半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g，醋 酸鈉 3. 0g,瓊脂 0. 5g，調(diào) pH 6. 6-7. 0，121°C，滅菌 15 分鐘。為進(jìn)一步具體說(shuō)明本發(fā)明，發(fā)明人利用上述方法通過(guò)真桿菌選擇性單菌落分離固 體培養(yǎng)基和梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基分離鑒定出了無(wú)毒性的真桿菌中的直腸真 桿菌、柱狀真桿菌、凸腹真桿菌和兩形真桿菌，無(wú)毒性的梭菌中的第三梭菌和丁酸梭菌(酪 酸梭菌)，直腸真桿菌、柱狀真桿菌、凸腹真桿菌、兩形真桿菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸 梭菌)只是作為本發(fā)明實(shí)施說(shuō)明的優(yōu)選菌種，本發(fā)明所述真桿菌和梭菌并不局限于上述七 種菌，只要能產(chǎn)生丁酸和無(wú)毒性的真桿菌菌種或梭菌菌種均是本發(fā)明所述，均在本發(fā)明的 保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明所述直腸真桿菌優(yōu)選但不限于直腸真桿菌QQ-66保藏編號(hào)CGMCC2124 ；柱 狀真桿菌優(yōu)選但不限于柱狀真桿菌QC-01保藏編號(hào)CGMCC2302 ；凸腹真桿菌優(yōu)選但不限于 凸腹真桿菌QD-01保藏編號(hào)CGMCC2465 ；兩形真桿菌優(yōu)選但不限于兩形真桿菌QE-01保 藏編號(hào)CGMCC2466 ；酪酸梭菌優(yōu)選但不限于酪酸梭菌DF96101保藏編號(hào)CGMCC0313. 1和 丁酸梭菌QA-08保藏編號(hào)CGMCC2303 ；第三梭菌優(yōu)選但不限于第三梭菌QH-07保藏編號(hào) CGMCC2304。本發(fā)明實(shí)施說(shuō)明中優(yōu)選使用的直腸真桿菌的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)1、菌種分離來(lái)源優(yōu)選人體腸道，直腸真桿菌QQ-66分離自山東省膠南市健康嬰兒 糞便中。2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察長(zhǎng)3微米，寬0. 8微米，短細(xì)桿菌，革蘭氏染色陽(yáng)性。平板形態(tài)菌體呈圓形、凸起、周邊整齊、光滑；顏色灰白，半透明。3、生理生化鑒定石蕊牛奶_ ；脂酶_ ；明膠液化+ ；過(guò)氧化氫酶_ ；精氨酸產(chǎn)氨_ ；七葉苷水 解-；卩引哚-;硫化氫-;乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V-P試驗(yàn))_;是否需氧厭氧性。4、糖酵解實(shí)驗(yàn)鑒定
5
纖維二糖+ ；D-果糖+ ；D-半乳糖+ ；葡萄糖+ ；D-甘露糖+ ；D-棉子糖+ ；鼠 李糖_ ；山梨糖+ ；松三糖+ ；蔗糖+ ；海藻糖_ ；木糖+ ；麥芽糖+ ；淀粉+ ；菊糖+ ； 蜜二糖+ ；核糖_ ；甘露醇_ ；甘油_ ；七葉靈_ ；阿拉伯糖+ ；果糖+。本發(fā)明實(shí)施說(shuō)明中優(yōu)選使用的柱狀真桿菌的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)1、菌種分離來(lái)源優(yōu)選人體腸道，柱狀真桿菌QC-01分離自山東省膠南市一健康嬰 兒糞便中。2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察長(zhǎng)2-5微米，寬1微米，中長(zhǎng)桿，革蘭氏染色陽(yáng)性。平板形態(tài)菌體呈類(lèi)圓形、凸起、周邊整齊、光滑；顏色灰白，不透明。3、生理生化鑒定石蕊牛奶_ ；脂酶_ ；明膠液化+ ；過(guò)氧化氫酶_ ；精氨酸產(chǎn)氨_ ；七葉苷水解 + (-)；吲哚“；硫化氫“；V-P試驗(yàn)-；是否需氧厭氧性。4、糖酵解實(shí)驗(yàn)鑒定纖維二糖+ ；D-果糖+ ；D-半乳糖+ ；葡萄糖+ ；D-甘露糖+ ；D-棉子糖_ ；鼠 李糖_ ；山梨糖_ ；松三糖_ ；蔗糖_ ；海藻糖_ ；木糖_ ；葡萄糖酸鹽_ ；麥芽糖_ ；淀 粉_ ；蜜二糖_ ；核糖_ ；甘露醇_ ；甘油_。本發(fā)明優(yōu)選使用的凸腹真桿菌的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)1、菌種分離來(lái)源優(yōu)選人體腸道，凸腹真桿菌QD-01分離自山東省膠南市_健康嬰 兒糞便中。2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察長(zhǎng)1. 5-2微米，寬0. 5微米，短桿，革蘭氏染色陽(yáng)性。平板形態(tài)菌體呈圓形、凸起、周邊整齊、光滑；顏色灰色，不透明。3、生理生化鑒定石蕊牛奶_ ；脂酶_ ；明膠液化_ ；過(guò)氧化氫酶_ ；精氨酸產(chǎn)氨_ ；七葉苷水解 + ;吲哚_ ；硫化氫_;乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V-P試驗(yàn))_;是否需氧厭氧性。4、糖酵解實(shí)驗(yàn)鑒定纖維二糖_ ；D-果糖+ ；D-半乳糖+ ；葡萄糖+ ；D-甘露糖+ ；D-棉子糖-；鼠 李糖_ ；山梨糖_ ；松三糖_ ；蔗糖_ ；海藻糖_ ；木糖+ ；麥芽糖+ ；淀粉+ ；蜜二糖+ ； 核糖+ ；甘油“；七葉靈+ ；阿拉伯糖“；果糖+。本發(fā)明優(yōu)選使用的兩形真桿菌的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)1、菌種分離來(lái)源優(yōu)選人體腸道，兩形真桿菌QE-01分離自山東省膠南市_健康嬰 兒糞便中。2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察長(zhǎng)2. 0-5微米，寬1. 0微米，中長(zhǎng)桿，革蘭氏染色陽(yáng)性。平板形態(tài)菌體呈圓形、凸起、周邊整齊、光滑；顏色灰色，不透明。3、生理生化鑒定石蕊牛奶_ ；脂酶_ ；明膠液化_ ；過(guò)氧化氫酶_ ；精氨酸產(chǎn)氨_ ；七葉苷水解 + ；噴哚_ ；硫化氫_ ；V-P試驗(yàn)_ ；是否需氧厭氧性。4、糖酵解實(shí)驗(yàn)鑒定
纖維二糖_ ；D-果糖+ ；D-半乳糖+ ；葡萄糖+ ；D-甘露糖+ ；D-棉子糖-；鼠 李糖_ ；山梨糖_ ；松三糖_ ；蔗糖_ ；海藻糖+ ；木糖_ ；麥芽糖_ ；淀粉_ ；蜜二糖_ ； 核糖“；七葉靈I ；甘油“；阿拉伯糖_。本發(fā)明實(shí)施說(shuō)明中優(yōu)選使用的第三梭菌的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)1、菌種分離來(lái)源優(yōu)選人體腸道，第三梭菌QH-07分離自山東省膠南市一健康嬰兒
糞便中。2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察長(zhǎng)3-4微米，寬0. 6-1. 0微米，直桿菌，革蘭氏染色陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢，孢子端生。平板形態(tài)菌落圓形，邊緣稍不規(guī)則，不透明，顏色灰白，表面無(wú)光澤。3、生理生化鑒定硫化氫_ ；吲哚_ ；明膠液化_ ；氨_ ；硝酸鹽還原_ ；卵磷脂酶反應(yīng)_ ；脲 酶_ ；V-P試驗(yàn)_ ；接觸酶_ ；是否需氧厭氧性。4、糖酵解實(shí)驗(yàn)鑒定阿拉伯糖+ ；鼠李糖+ ；纖維二糖+ ；D-山梨醇+ ；D-果糖+ ；可溶性淀粉+ ； D-半乳糖+ ；蔗糖+ ；葡萄糖+ ；海藻糖+ ；菊糖+ ；木糖+ ；乳糖+ ；葡萄糖酸鹽(鈉) + ；DM甘露糖+ ；麥芽糖+ ；D-甘露醇+ ；甘油W㈠；DM棉籽糖+ ；核糖+ ；松三糖 + ；蜜二糖+。本發(fā)明實(shí)施說(shuō)明中優(yōu)選使用的丁酸梭菌(酪酸梭菌)包括酪酸梭菌DF96101和丁 酸梭菌QA-08的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)1、菌種分離來(lái)源優(yōu)選人體腸道2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察長(zhǎng)3. 0-6. 0微米，寬0. 6-1. 2微米，直桿或梭狀菌，革蘭氏染色陽(yáng)性， 產(chǎn)芽孢，孢子次端生。平板形態(tài)菌落圓形，邊緣不整齊，稍凸，不透明，顏色淡黃，表面無(wú)光澤。3、生理生化鑒定硫化氫_ ；吲哚_ ；明膠液化_ ；氨_ ；硝酸鹽還原_ ；卵磷脂酶反應(yīng)_ ；脲 酶_ ；V-P試驗(yàn)_ ；接觸酶_ ；是否需氧厭氧性。4、糖酵解實(shí)驗(yàn)鑒定阿拉伯糖+ ；鼠李糖+ ；纖維二糖+ ；D-山梨醇_ ；D-果糖+ ；可溶性淀粉+ ； D-半乳糖+ ；蔗糖+ ；葡萄糖+ ；海藻糖+ ；菊糖+ ；木糖+ ；乳糖+ ；葡萄糖酸鹽(鈉) + ;D(+)甘露糖+；麥芽糖+ ；D-甘露醇+；甘油+ ；DM棉籽糖+；核糖+；松三糖+；
蜜二糖+。本發(fā)明所述的真桿菌和梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌指活生物個(gè)體。本發(fā)明是以有效劑量的上述真桿菌或梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌單獨(dú)或組合作為 主要藥物活性成份，按照一定的制劑工藝，加入常規(guī)的賦形劑、調(diào)味劑、崩解劑、防腐劑、潤(rùn) 滑劑、濕潤(rùn)劑、黏合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等藥物輔料，制成任何一種適合于臨床上使用 的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑、灌腸劑等劑型。本發(fā)明所述以有效劑量的上述真桿菌或梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌單獨(dú)或組合作為主要藥物活性成份制成活菌制劑，也可以是上述產(chǎn)酪酸有益菌單獨(dú)或組合與雙歧桿菌、 凝結(jié)芽孢桿菌、乳桿菌、鏈球菌、枯草芽孢桿菌等益生菌中的一種或幾種或其他活性成份組 合制成活菌制劑，以起到協(xié)同治療作用，提高治療效果。本發(fā)明所述產(chǎn)酪酸有益菌既可以是 腸道常住菌也可以是腸道過(guò)路菌。本發(fā)明中的制劑在臨床上的用量，因患者年齡、體重及癥狀、用藥目的所決定的用 藥方式和方法、治療效果及用藥時(shí)間等因素而不同，正確的用量應(yīng)該由醫(yī)師來(lái)決定，且應(yīng)用 劑量也是臨床醫(yī)生和臨床藥師根據(jù)病情很容易掌握和調(diào)整的。本發(fā)明所指有效劑量是指以上述真桿菌或梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌根據(jù)上面 所述單獨(dú)或組合作為主要藥物活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于 1 X 106CFU/g，一般在 1 X 107CFU/g 以上，最高可達(dá)到 1 X 1012CFU/g 或 1 X 1012CFU/g 以上。本發(fā)明所指有效劑量是指以上述真桿菌或梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌根據(jù)上面 所述單獨(dú)或組合作為主要藥物活性成份制成的液體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于 1 X 106CFU/mL, 一般在 1 X 107CFU/mL 以上，最高可達(dá)到 1 X 1012CFU/mL 或 1 X 1012CFU/mL 以 上。由于本發(fā)明首次公開(kāi)了真桿菌和梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌在作為主要活性成份 制成制劑在預(yù)防和治療腸粘膜損傷及損傷后并發(fā)癥中的應(yīng)用，因此含上述真桿菌或梭菌及 其他產(chǎn)酪酸有益菌的藥劑在預(yù)防和治療腸粘膜損傷及損傷后并發(fā)癥中的應(yīng)用均屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。由于本發(fā)明首次公開(kāi)了直腸真桿菌、柱狀真桿菌、凸腹真桿菌、兩形真桿菌、第三 梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)在作為主要活性成份制成制劑中的應(yīng)用，因此含上述直腸真 桿菌、柱狀真桿菌、凸腹真桿菌、兩形真桿菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)的藥劑在預(yù) 防和治療腸粘膜損傷及損傷后并發(fā)癥中的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述的真桿菌或梭菌中的任何一個(gè)菌種，包括直腸真桿菌、柱狀真桿菌、凸 腹真桿菌、兩形真桿菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)，在制成任何一種劑型時(shí)，均具有 治療上述疾病的作用。任何藥劑，如果其組份中含有上述真桿菌或梭菌中的任何一個(gè)菌種 成份制備成藥，在其包裝或說(shuō)明書(shū)等標(biāo)識(shí)上或者在其他任何宣傳品上只要注明或提示具有 治療上述疾病的作用，則落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明所述的真桿菌或梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌中的任何一個(gè)菌種，包括直腸真 桿菌、柱狀真桿菌、凸腹真桿菌、兩形真桿菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)可以制成保 健食品、飲品、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑或食品。將上述真桿菌或梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌中的任何一 個(gè)菌種制成的保健食品、飲品、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑或食品，如果在其包裝或說(shuō)明書(shū)等標(biāo)識(shí)上或者 在其他任何宣傳品上只要注明或提示具有治療上述疾病的作用，則落入本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。本發(fā)明所述的真桿菌或梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌中的任何一個(gè)菌種，包括直腸真 桿菌、柱狀真桿菌、凸腹真桿菌、兩形真桿菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)可以制成獸 藥或飼料添加劑。將上述真桿菌或梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌中的任何一個(gè)菌種制成的獸藥 或飼料添加劑在預(yù)防和治療腸粘膜損傷及損傷后并發(fā)癥中的應(yīng)用，則落入本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
8
具體實(shí)施例方式藥物制備例說(shuō)明上述已經(jīng)對(duì)真桿菌或梭菌的制備進(jìn)行說(shuō)明，這里通過(guò)直腸真桿菌散 劑、柱狀真桿菌散劑、凸腹真桿菌散劑、兩形真桿菌散劑、第三梭菌散劑和丁酸梭菌(酪酸梭菌) 散劑為例進(jìn)行具體說(shuō)明，其他真桿菌或梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌菌種制劑的制備方法本領(lǐng)域技 術(shù)人員通過(guò)本實(shí)施例很容易掌握，其他劑型的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本實(shí)施很容易掌握， 在此不再一一敘述說(shuō)明。制備方法并不局限于本發(fā)明實(shí)施例所述，公知的能夠達(dá)到制備目的的方 法均可以，實(shí)施例的制備說(shuō)明只是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，并不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。藥物制備實(shí)施例1 口服真桿菌活菌散劑的制備1菌粉的制備和菌種的鑒定采取健康嬰兒糞便，然后將糞便置于滅菌厭氧瓶?jī)?nèi)，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混合，迅速 從中取2克糞便加入18mL滅菌的稀釋液中，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混勻，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，進(jìn)行 lo-iuo^ioAio—4，10_5，10_6，10_7梯度稀釋?zhuān)?0_5，10_6，10_7三個(gè)稀釋梯度，涂布于真桿菌 選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C下培養(yǎng)48小時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好 的四個(gè)單菌落分別接種到真桿菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C下擴(kuò)增培養(yǎng) 48小時(shí)。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出四個(gè) 菌種的干燥菌粉，活菌數(shù)均為lX1012CFU/g以上，然后進(jìn)行菌種鑒定，經(jīng)鑒定為直腸真桿菌 QQ-66保藏編號(hào)CGMCC2124、柱狀真桿菌QC-01保藏編號(hào)CGMCC2302、凸腹真桿菌QD-01保藏 編號(hào)CGMCC2465和兩形真桿菌QE-01保藏編號(hào)CGMCC2466。2產(chǎn)丁酸實(shí)驗(yàn)將上述直腸真桿菌、柱狀真桿菌、凸腹真桿菌和兩形真桿菌菌種分別接種到真桿 菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C下擴(kuò)增培養(yǎng)96小時(shí)，離心(12000rpm)，取上 清液用氣相檢測(cè)代謝產(chǎn)物丁酸含量分別為37mmol/L、37. 5mmol/L,38mmol/L和37mmol/L， 表明均產(chǎn)丁酸。并留取發(fā)酵上清液備用。3生理生化鑒定經(jīng)鑒定均不產(chǎn)生硫化氫、吲哚、氨等有害物質(zhì)。4毒性試驗(yàn)4. 1動(dòng)物及分組取50只SPF級(jí)別小鼠，6 8周齡，體重15 19g，隨機(jī)分入直腸 真桿菌組、柱狀真桿菌組、凸腹真桿菌、兩形真桿菌和未給藥組，每組10只。4. 2制備菌液將直腸真桿菌菌粉、柱狀真桿菌菌粉、凸腹真桿菌菌粉和兩形真桿 菌菌粉用純化水調(diào)制為含菌數(shù)均為lX1012CFU/mL的菌液。4. 3方法直腸真桿菌組、柱狀真桿菌組、凸腹真桿菌、兩形真桿菌和未給藥組均 給予相同的基礎(chǔ)飼料，且飼養(yǎng)條件均一致，直腸真桿菌組每天灌服直腸真桿菌菌液0. 5mL, 柱狀真桿菌組每天灌服柱狀真桿菌菌液0. 5mL,凸腹真桿菌組每天灌服凸腹真桿菌菌液 0. 5mL，兩形真桿菌組每天灌服兩形真桿菌菌液0. 5mL，未給藥組每天灌服純化水0. 5mL，飼 喂6個(gè)月，觀察體重及毒性反應(yīng)。4. 4 結(jié)果各組小鼠均未出現(xiàn)異常情況，未發(fā)生振顫、痙攣、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、姿態(tài)異常，無(wú)眼球突 出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無(wú)死亡情況，且直腸真桿菌組、柱狀真桿菌組、凸腹真桿菌、 兩形真桿菌的體重增加顯著高于未給藥組(P < 0. 05)，表明直腸真桿菌、柱狀真桿菌、凸 腹真桿菌和兩形真桿菌等腸道產(chǎn)丁酸真桿菌菌種有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育作用，說(shuō)明四菌株效果良好，未見(jiàn)中毒反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。表1小鼠體重增加情況 5制備成散劑等劑型根據(jù)上述步驟和方法分離鑒定直腸真桿菌、柱狀真桿菌、凸腹真桿菌、兩形真桿菌 等真桿菌菌種后，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)產(chǎn)丁酸、不產(chǎn)毒素、無(wú)毒性，就可將真桿菌菌種制成菌粉，然后 按照需要添加相關(guān)輔料制成各種劑型，優(yōu)選據(jù)真桿菌菌粉的活菌數(shù)，按比例添加脫脂奶粉、 葡萄糖制成散劑，使活菌數(shù)不低于1 X 106CFU/g,然后裝袋。藥物制備實(shí)施例2口服第三梭菌活菌散劑和口服丁酸梭菌(酪酸梭菌)活菌散劑的制備1菌粉的制 備和菌種的鑒定采取健康嬰兒糞便，然后將糞便置于滅菌厭氧瓶?jī)?nèi)，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混合，迅速 從中取2克糞便加入18mL滅菌的稀釋液中，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混勻，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，進(jìn)行 10—1、10_2、10_3、10_4，10_5，10_6，10_7 梯度稀釋?zhuān)?10_5，10_6，10_7 三個(gè)稀釋梯度，80°C水浴 13 分 鐘，涂布于梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C下培養(yǎng)48小時(shí)， 選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的三個(gè)單菌落分別接種到梭菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C 下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時(shí)。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出三個(gè)菌種的干燥菌粉，活菌數(shù)均為lX1012CFU/g以上，然后進(jìn)行菌種鑒定，經(jīng)鑒定為 酪酸梭菌DF96101保藏編號(hào)CGMCC0313. 1、丁酸梭菌QA-08保藏編號(hào)CGMCC2303和第三梭菌 QH-07 保藏編號(hào) CGMCC2304。2產(chǎn)丁酸實(shí)驗(yàn)將上述酪酸梭菌、丁酸梭菌和第三梭菌菌種分別接種到梭菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中， 置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C下擴(kuò)增培養(yǎng)96小時(shí)，離心(12000rpm)，取上清液用氣相檢測(cè)代謝 產(chǎn)物丁酸含量分別為39mmol/L、39. 5mmol/L和40mmol/L，表明均產(chǎn)丁酸。并留取發(fā)酵上清 液備用。3生理生化鑒定經(jīng)鑒定均不產(chǎn)生硫化氫、吲哚、氨等有害物質(zhì)。4毒性試驗(yàn)4. 1動(dòng)物及分組取40只SPF級(jí)別小鼠，6 8周齡，體重15 19g，隨機(jī)分入酪酸 梭菌組、丁酸梭菌組和第三梭菌組和未給藥組，每組10只。4. 2制備菌液將酪酸梭菌菌粉、丁酸梭菌菌粉和第三梭菌菌粉用純化水調(diào)制為含 菌數(shù)均為1 X 1012CFU/mL的菌液。4. 3方法酪酸梭菌組、丁酸梭菌組、第三梭菌組和未給藥組均給予相同的基礎(chǔ)飼 料，且飼養(yǎng)條件均一致，酪酸梭菌組每天灌服酪酸梭菌菌液0. 5mL，丁酸梭菌組每天灌服丁 酸梭菌菌液0. 5mL,第三梭菌組每天灌服第三梭菌菌液0. 5mL，未給藥組每天灌服純化水 0. 5mL,飼喂6個(gè)月，觀察體重及毒性反應(yīng)。4. 4 結(jié)果各組小鼠均未出現(xiàn)異常情況，未發(fā)生振顫、痙攣、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、姿態(tài)異常，無(wú)眼球突 出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無(wú)死亡情況，且酪酸梭菌組、丁酸梭菌組和第三梭菌組的體 重增加顯著高于未給藥組(P < 0. 05)，表明酪酸梭菌、丁酸梭菌和第三梭菌菌種有促進(jìn)生 長(zhǎng)發(fā)育作用，說(shuō)明三菌株效果良好，未見(jiàn)中毒反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。表3小鼠體重增加情況 表4小鼠體重增加情況
18. 12±0. 63 39. 65±1.56 45. 78 ±2. 42 47. 18±3.96 49. 52±4. 47 51. 96±5. 51 53. 79±4. 75
18. 96 土 0. 47 39. 42±1.51 45. 89±2.03 47. 21 ±4. 07 49. 25±4. 18 51.87±4. 75 53. 69±5. 27
服用1個(gè)月 服用2個(gè)月 服用3個(gè)月 服用4個(gè)月 服用5個(gè)月 服用6個(gè)月5制備成散劑等劑型根據(jù)上述步驟和方法分離鑒定酪酸梭菌、丁酸梭菌和第三梭菌等梭菌菌種后，經(jīng) 實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)產(chǎn)丁酸、不產(chǎn)毒素、無(wú)毒性，就可將梭菌菌種制成菌粉，然后按照需要添加相關(guān)輔 料制成各種劑型，優(yōu)選據(jù)梭菌菌粉的活菌數(shù)，按比例添加脫脂奶粉、葡萄糖制成散劑，使活 菌數(shù)不低于lX106CFU/g，然后裝袋。藥物制備實(shí)施例3雙歧桿菌和乳酸桿菌菌粉和發(fā)酵上清液的制備為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的新穎性和創(chuàng)造性，在應(yīng)用效果實(shí)施例中用雙歧桿菌和乳酸 桿菌做對(duì)照研究。其中選用的雙歧桿菌為嬰兒雙歧桿菌DF96102保藏編號(hào)CGMCC0313. 2，乳 酸桿菌為嗜酸乳桿菌DF96106保藏編號(hào)CGMCC0313. 4。1雙歧桿菌菌粉和發(fā)酵上清液的制備培養(yǎng)基為(培養(yǎng)基不限于本發(fā)明所述的，公知的培養(yǎng)基均可以)蛋白胨15.0g， 酵母粉2. 0g,葡萄糖20. 0g,可溶性淀粉0. 5g，氯化鈉5. 0g, 5 %半胱氨酸10. OmL,西紅柿 浸出液400. OmL,吐溫80 1. OmL,肝提取液80. OmL,瓊脂20. 0g,蒸餾水520. OmL,調(diào)PH7. 0， 115°C 20min滅菌。將嬰兒雙歧桿菌DF96102接種到上述培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C 下擴(kuò)增培養(yǎng)96小時(shí)。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥， 調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)為lX1012CFU/g以上。并將離心后的發(fā)酵上清液留取備用。上清 液經(jīng)氣相色譜分析不含丁酸，含乙酸和乳酸分別為25mmol/L和14mmol/L。2乳酸桿菌菌粉和發(fā)酵上清液的制備培養(yǎng)基為(培養(yǎng)基不限于本發(fā)明所述的，公知的培養(yǎng)基均可以)大豆蛋白胨(國(guó) 產(chǎn))5g，胰胨(Tryptone) 5g，酵母提取物5g，肉膏10g, K2HP04 10g,檸檬酸二銨2g，乙酸鈉 5g,葡萄糖 20g，吐溫 80 1. OmL, MgS04 7H20 4. 8g，MnS04. 4H200. 05g,蒸餾水 1000M1，調(diào) PH6. 2-6.4，121°C滅菌15分鐘。將嗜酸乳桿菌DF96106接種到上述培養(yǎng)基中，置于厭氧罐 內(nèi)，厭氧37°C下擴(kuò)增培養(yǎng)96小時(shí)。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷 凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)為lX1012CFU/g以上。并將離心后的發(fā)酵上清液留取 備用。上清液經(jīng)氣相色譜分析不含丁酸和乙酸，含乳酸為38. 5mmol/L。應(yīng)用效果實(shí)施例說(shuō)明雖然真桿菌或梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌有許多菌種， 但按上述方法分離的不同菌種具有相同的生物學(xué)特性，且主要作用機(jī)理基本相同，代 謝過(guò)程中均能分泌大量丁酸，因此本發(fā)明選用按上述方法分離的直腸真桿菌QQ-66保
12藏編號(hào)CGMCC2124、柱狀真桿菌QC-01保藏編號(hào)CGMCC2302、凸腹真桿菌QD-01保藏編 號(hào)CGMCC2465、兩形真桿菌QE-01保藏編號(hào)CGMCC2466、酪酸梭菌DF96101保藏編號(hào) CGMCC0313. 1、丁酸梭菌QA-08保藏編號(hào)CGMCC2303和第三梭菌QH-07保藏編號(hào)CGMCC2304 為研究對(duì)象，介紹真桿菌和梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌的應(yīng)用效果。本技術(shù)領(lǐng)域人員按照本 發(fā)明所述很容易得出按照上述步驟和方法分離的其他真桿菌或梭菌及其他產(chǎn)酪酸有益菌 菌種單獨(dú)或組合具有相同的應(yīng)用效果，因此本發(fā)明只選擇通過(guò)直腸真桿菌、柱狀真桿菌、凸 腹真桿菌、兩形真桿菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)來(lái)揭示和證實(shí)真桿菌或梭菌及其 他產(chǎn)酪酸有益菌的應(yīng)用效果為代表，其他菌種的應(yīng)用效果不再一一敘述說(shuō)明。應(yīng)用效果實(shí)施例真桿菌和梭菌對(duì)腸粘膜屏障保護(hù)作用的研究1材料與方法1.1 材料1. 1. 1 藥物1.1. 1.1菌液的制備將上述各菌種菌粉分別用蒸餾水溶解成107CFU/mL菌液(隨用隨溶解)。1.1. 1.2發(fā)酵上清液將上述直腸真桿菌、柱狀真桿菌、凸腹真桿菌、兩形真桿菌、第三梭菌和丁酸梭菌 (酪酸梭菌)的發(fā)酵上清液分別調(diào)節(jié)成含丁酸為35mmol/L和用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值為7. 00 的發(fā)酵上清液。將上述雙歧桿菌的發(fā)酵上清液調(diào)節(jié)成含乙酸和乳酸的總濃度為35mmol/L 和用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值為7. 00的發(fā)酵上清液。將上述乳酸桿菌發(fā)酵上清液調(diào)節(jié)成含乳酸 為35mmol/L和用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值為7. 00的發(fā)酵上清液。35mmol/L的丁酸納溶液、乳酸 納溶液和乙酸納溶液作對(duì)照。1. 2方法[參考文獻(xiàn)彭曦，等.腸道營(yíng)養(yǎng)支持對(duì)燒傷大鼠腸粘膜屏障功能的保護(hù) 作用及其機(jī)理.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2001，21 (4) 352-356]1.2. 1模型制作與分組健康成年雄性Wistar大鼠240只，體重200g左右，隨機(jī)分成24組正常對(duì)照組、 模型對(duì)照I組、模型對(duì)照II組、直腸真桿菌組、直腸真桿菌發(fā)酵上清液組、柱狀真桿菌組、柱 狀真桿菌發(fā)酵上清液組、凸腹真桿菌組、凸腹真桿菌發(fā)酵上清液組、兩形真桿菌組、兩形真 桿菌發(fā)酵上清液組、酪酸梭菌組、酪酸梭菌發(fā)酵上清液組、丁酸梭菌組、丁酸梭菌發(fā)酵上清 液組、第三梭菌組、第三梭菌發(fā)酵上清液組、丁酸鈉組、乙酸鈉組、乳酸鈉組、雙歧桿菌組、雙 歧桿菌發(fā)酵上清液組、乳酸桿菌組和乳酸桿菌發(fā)酵上清液組。正常對(duì)照組不予燒傷，其他各 組燒傷前禁食12小時(shí)，戊巴比妥鈉(40mg/Kg)腹腔麻醉，背部電推剃毛，稱(chēng)重后置剃毛 區(qū)于92°C水浴中18秒，造成30%體表面積III度燒傷(病理切片證實(shí))。傷后按50mL/Kg腹 腔注入乳酸林格氏液抗休克。1.2. 2各組處理正常對(duì)照組、模型對(duì)照I組處死，觀察測(cè)定腸粘膜通透性、腸粘膜上皮細(xì)胞增殖指 數(shù)和腸粘膜細(xì)胞凋亡數(shù)。各活菌組造模后灌服上述菌液10ml/kg 體質(zhì)量/次，1次/天， 連續(xù)7天，7天后斷頭處死，觀察測(cè)定腸粘膜通透性、腸粘膜上皮細(xì)胞增殖指數(shù)和腸粘膜細(xì) 胞凋亡指數(shù)，并于灌服前和灌服7天后用氣相色譜測(cè)定新鮮糞便中丁酸的含量。各發(fā)酵上 清液組、丁酸鈉組、乙酸鈉組、乳酸鈉組造模后，灌腸，lmL/次，每天1次，連續(xù)7天，7天后斷
13頭處死，觀察測(cè)定腸粘膜通透性、腸粘膜上皮細(xì)胞增殖指數(shù)和腸粘膜細(xì)胞凋亡指數(shù)。模型對(duì) 照II組造模后生理鹽水灌腸，lmL/次，1次/天，連續(xù)7天，7天后斷頭處死，觀察測(cè)定腸粘膜 通透性、腸粘膜上皮細(xì)胞增殖指數(shù)和腸粘膜細(xì)胞凋亡指數(shù)，并于灌服前和灌服7天后用氣 相色譜測(cè)定新鮮糞便中丁酸的含量。1. 2. 3腸粘膜通透性測(cè)定經(jīng)股靜脈注入[99mTc]DTPA-HAS，劑量為1480kBq/Kg，30min后斷頭處死大鼠，測(cè)定 腸腔灌洗液的cpm值，以對(duì)照大鼠腸粘膜通量為1，用各處理組與之的比值來(lái)反映腸粘膜通 透性的改變。1. 2. 4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定腸粘膜上皮細(xì)胞增殖指數(shù)分離腸粘膜細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為1X105，75%乙醇固定，棄固定劑，PBS洗2次，加 5g/L的RNA酶0. 5mL,混勻，37°C水浴30min,加50mg/L的PI染色液0. 5mL,搖勻，避光冷藏 30min,上機(jī)檢測(cè)，每份標(biāo)本分析1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。據(jù)&、S、G2及M各期細(xì)胞所占百分比，計(jì)算增 殖指數(shù)(s+g2+m)。1. 2. 5腸粘膜細(xì)胞凋亡指數(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡TUNEL原位檢測(cè)，石蠟切片脫蠟入水，10%福爾馬林溶液固定，新鮮配制 蛋白酶K工作液消化30min，10%福爾馬林液固定5min，滴加Equilibration Buffer，室溫 平衡lOmin，滴加50iiLTdT酶反應(yīng)液，蓋上蓋玻片于濕盒內(nèi)37°C反應(yīng)120min，去除蓋玻片， 加2 X SSC溶液終止反應(yīng)，用H202/甲醇浸洗5min，滴加Str印tavidin_HRP溶液，室溫5min， 滴加100 yL DAB工作液，蘇木素復(fù)染，脫水，封片，光鏡觀察。光鏡下正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋 亡細(xì)胞核為深淺不一的棕褐色。在低倍鏡下(X100)選取細(xì)胞分布均勻的視野，再在高倍 鏡下(X400)計(jì)數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)，重復(fù)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，分別計(jì)算各組 的細(xì)胞凋亡指數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)=細(xì)胞凋亡數(shù)/細(xì)胞總數(shù)X 100%。2 結(jié)果2. 1腸粘膜通透性、腸粘膜細(xì)胞增殖指數(shù)和腸粘膜細(xì)胞凋亡指數(shù)直腸真桿菌組、直腸真桿菌發(fā)酵上清液組、柱狀真桿菌組、柱狀真桿菌發(fā)酵上清液 組、凸腹真桿菌組、凸腹真桿菌發(fā)酵上清液組、兩形真桿菌組、兩形真桿菌發(fā)酵上清液組、酪 酸梭菌組、酪酸梭菌發(fā)酵上清液組、丁酸梭菌組、丁酸梭菌發(fā)酵上清液組、第三梭菌組、第三 梭菌發(fā)酵上清液組、丁酸鈉組的腸粘膜通透性和腸粘膜凋亡指數(shù)顯著低于模型對(duì)照I組、 模型對(duì)照II組、乙酸鈉組、乳酸鈉組、雙歧桿菌組、雙歧桿菌發(fā)酵上清液組、乳酸桿菌組和乳 酸桿菌發(fā)酵上清液組，而腸粘膜細(xì)胞增殖指數(shù)顯著高于模型對(duì)照I組、模型對(duì)照II組、乙酸 鈉組、乳酸鈉組、雙歧桿菌組、雙歧桿菌發(fā)酵上清液組、乳酸桿菌組和乳酸桿菌發(fā)酵上清液 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，但直腸真桿菌組、直腸真桿菌發(fā)酵上清液組、柱狀真 桿菌組、柱狀真桿菌發(fā)酵上清液組、凸腹真桿菌組、凸腹真桿菌發(fā)酵上清液組、兩形真桿菌 組、兩形真桿菌發(fā)酵上清液組、酪酸梭菌組、酪酸梭菌發(fā)酵上清液組、丁酸梭菌組、丁酸梭菌 發(fā)酵上清液組、第三梭菌組、第三梭菌發(fā)酵上清液組、丁酸鈉組之間比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義(P > 0.05)，模型對(duì)照II組、乙酸鈉組、乳酸鈉組、雙歧桿菌組、雙歧桿菌發(fā)酵上清液組、 乳酸桿菌組和乳酸桿菌發(fā)酵上清液組之間比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)，見(jiàn)表1。表1腸粘膜通透性、腸粘膜細(xì)胞增殖指數(shù)和腸粘膜細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(X 士S) 2. 2腸道丁酸測(cè)定直腸真桿菌組、柱狀真桿菌組、凸腹真桿菌組、兩形真桿菌組、酪酸梭菌組、丁酸梭 菌組和第三梭菌組7天后的腸道丁酸含量分別是灌服活菌前、模型對(duì)照II組、雙歧桿菌組 和乳酸桿菌組的5 6倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。模型對(duì)照II組、雙歧桿菌組和 乳酸桿菌組腸道丁酸含量差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)。3 結(jié)論以上研究結(jié)果表明，能夠分泌丁酸的有益菌可以通過(guò)提供腸粘膜細(xì)胞能量，促進(jìn) 腸粘膜細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，而改變腸粘膜的通透性。而不能分泌丁酸的有益菌沒(méi)有 以上作用。在危重疾病發(fā)展過(guò)程中，腸道是機(jī)體應(yīng)激的中心器官之一，而腸粘膜屏障首當(dāng)其沖受到損害，腸粘膜損傷、萎縮、凋亡增加和通透性增高等可導(dǎo)致整個(gè)腸屏障功能障礙，腸 內(nèi)致病微生物和毒素透過(guò)腸屏障引發(fā)各種并發(fā)癥。而產(chǎn)丁酸的益生菌進(jìn)入腸道，分泌大量 丁酸，從而預(yù)防和治療腸粘膜損傷，保護(hù)腸屏障功能和預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生。本發(fā)明在實(shí)施過(guò)程中所使用的微生物菌種已分別于1997年7月28日、2007年8 月2日、2007年12月26日和2008年04年25日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所郵編100101)保藏，共9個(gè)下述 微生物菌種，但本發(fā)明所述的真桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬等并不局限于這 9微生物菌種。(1)分類(lèi)命名直腸真桿菌Eubacterium rectale，保存編號(hào)2124。(2)分類(lèi)命名柱狀真桿菌Eubacterium cylindroides，保存編號(hào)2302。(3)分類(lèi)命名凸腹真桿菌Eubacterium ventriosum，保存編號(hào)2465。(4)分類(lèi)命名兩形真桿菌Eubacterium biforme，保存編號(hào)2466。(5)分類(lèi)命名酪酸梭菌 Clostridium butyricum，保存編號(hào) 0313. 1。(6)分類(lèi)命名丁酸梭菌 Clostridium butyricum，保存編號(hào) 2303。(7)分類(lèi)命名第三梭菌Clostridium tertium，保存編號(hào)2304。(8)分類(lèi)命名嬰兒雙歧桿菌Bifidobacterium infantis，保存編號(hào)0313. 2。(9)分類(lèi)命名嗜酸乳桿菌 Lactobacillus acidophilus，保存編號(hào) 0313. 4。上述9個(gè)微生物菌種經(jīng)該微生物中心檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為存活。
1權(quán)利要求
一種或一種以上產(chǎn)酪酸(丁酸)有益菌在制備預(yù)防和治療重癥疾病中腸道屏障損傷及損傷后并發(fā)癥的制劑中的應(yīng)用，其中所述預(yù)防和治療重癥疾病中腸道屏障損傷及損傷后并發(fā)癥是指通過(guò)在腸道產(chǎn)生酪酸，將酪酸引入腸道，而提供腸粘膜能量、促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞增殖和抑制腸粘膜細(xì)胞凋亡，改善腸粘膜通透性，預(yù)防和治療腸粘膜屏障損傷而發(fā)揮對(duì)腸屏障的防治作用。
2.按權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于產(chǎn)酪酸有益菌優(yōu)選但不限于梭菌、真桿菌。
3.按權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于產(chǎn)酪酸有益菌是腸道常住菌或腸道過(guò)路菌。
4.按權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于重癥疾病優(yōu)選但不限于嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、燒傷、 手術(shù)、重癥感染、危重患者、入住重癥監(jiān)護(hù)室患者、應(yīng)激打擊患者、急性胰腺炎、重癥急性胰 腺炎、肝硬化、肝炎、腸癌、腸癌術(shù)后、腫瘤患者、腫瘤放化療、重癥膽管炎、饑餓、長(zhǎng)期全胃腸 道外營(yíng)養(yǎng)、多系統(tǒng)器官功能衰竭、急性呼吸道窘迫綜合征、腎衰、心衰、肝衰、顱腦外傷、呼吸 衰竭、循環(huán)衰竭、糖尿病。
5.按權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于并發(fā)癥包含內(nèi)源性感染、炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒 癥、多器官功能不全綜合征、內(nèi)毒血癥、細(xì)菌移位、全身感染、多系統(tǒng)器官功能衰竭。
6.按權(quán)利要求1所述應(yīng)用中的制劑，其特征在于有效劑量的一種或一種以上產(chǎn)酪酸的 有益菌制成藥品、保健食品、飲品、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑、食品、獸藥和飼料添加劑。
7.按權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在產(chǎn)酪酸有益菌指活的生物個(gè)體。
8.按權(quán)利要求1所述應(yīng)用中的制劑，其特征在于固體制劑包含的總活菌數(shù)不能低于 1 X 106CFU/g, 一般在 1 X 107CFU/g 以上，最高可達(dá)到 1 X 1012CFU/g 或 1 X 1012CFU/g 以上；或 液體制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1 X 106CFU/mL，一般在lX107CFU/mL以上，最高可達(dá)到 1 X 1012CFU/mL 或 1 X 1012CFU/mL 以上。
9.按權(quán)利要求2所述產(chǎn)酪酸有益菌，其特征在于梭菌優(yōu)選但不限于酪酸梭菌(丁酸梭 菌)、第三梭菌；真桿菌優(yōu)選但不限于直腸真桿菌、柱狀真桿菌、凸腹真桿菌和兩形真桿菌。
10.按權(quán)利要求9所述產(chǎn)酪酸有益菌，其特征在于酪酸梭菌優(yōu)選但不限于酪酸梭菌 DF96101保藏編號(hào)CGMCC0313. 1和丁酸梭菌QA-08保藏編號(hào)CGMCC2303 ；第三梭菌優(yōu)選但不 限于第三梭菌QH-07保藏編號(hào)CGMCC2304 ；凸腹真桿菌優(yōu)選但不限于凸腹真桿菌QD-Ol保 藏編號(hào)CGMCC2465 ；兩形真桿菌優(yōu)選但不限于兩形真桿菌QE-Ol保藏編號(hào)CGMCC2466 ；直腸 真桿菌優(yōu)選但不限于直腸真桿菌QQ-66保藏編號(hào)CGMCC2124 ；柱狀真桿菌優(yōu)選但不限于柱 狀真桿菌QC-Ol保藏編號(hào)CGMCC2302。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)酪酸有益菌的新用途，具體涉及一種或一種以上產(chǎn)酪酸(丁酸)有益菌在制備預(yù)防和治療重癥疾病中腸道屏障損傷及損傷后并發(fā)癥的制劑中的應(yīng)用，其中所述預(yù)防和治療重癥疾病中腸道屏障損傷及損傷后并發(fā)癥是指通過(guò)在腸道產(chǎn)生酪酸，將酪酸引入腸道，而提供腸粘膜能量、促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞增殖和抑制腸粘膜細(xì)胞凋亡，改善腸粘膜通透性，預(yù)防和治療腸粘膜屏障損傷而發(fā)揮對(duì)腸屏障的防治作用。
文檔編號(hào)A61P1/00GK101849969SQ200910134078
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者崔云龍, 李洪福 申請(qǐng)人:青島東海藥業(yè)有限公司;北京普爾康醫(yī)藥高科技有限公司