專利名稱：一種大豆蛋白低聚肽及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶催化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大豆蛋白低聚肽及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：
大豆蛋白在食品工業(yè)、飼料工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。大豆分離蛋白可應(yīng)用于魚(yú)類制品、肉類制品、乳制品和營(yíng)養(yǎng)食品等，大豆?jié)饪s蛋白分為粉狀、粒狀兩種，粉狀用于食品增加蛋白質(zhì)含量；粒狀基本上是用來(lái)增強(qiáng)食品的組織結(jié)構(gòu)，兩種產(chǎn)品都能增強(qiáng)食品的保水性。在肉制品中，大豆蛋白可用于容留肉汁、吸收脂肪，改善口感。大豆蛋白氨基酸組成平衡，必須氨基酸含量豐富，作為高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的飼料，也廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)。
迄今為止，大豆蛋白產(chǎn)品自身功能的一些缺陷使得它們的應(yīng)用受到了很大的影響。如大豆蛋白的敏感性特別強(qiáng)，在熱、酸、堿等條件下極易發(fā)生物理、化學(xué)變化，形成絮片或沉淀，也就是所謂的速溶性問(wèn)題，這也就局限了大豆蛋白的應(yīng)用面；大豆蛋白溶解度低，無(wú)法作為功能性成分在乳制品、飲料和糖果等食品體系中加以利用；大豆蛋白具有一定的抗原性，而且其消化率和生物效價(jià)遠(yuǎn)不及牛奶，雞蛋等動(dòng)物性蛋白等。我國(guó)大豆分離蛋白的開(kāi)發(fā)較國(guó)外落后，吸收消化后還有一定差距，國(guó)產(chǎn)較好的分離蛋白雖然蛋白含量可以達(dá)到85％以上，但NSI值仍只有65％左右。
為了改善大豆蛋白的功能特性，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域，因此提出了大豆蛋白水解，即大豆多肽的研究開(kāi)發(fā)。大豆肽是由大豆蛋白降解而生成的一種復(fù)合物，主要成分為分子鏈不等的各級(jí)肽類，還包括一些游離氨基酸、少量糖類、水分、灰分等。大豆肽具有易消化吸收、分子量小、無(wú)豆腥味，在熱、酸、堿條件下不發(fā)生變性，NSI值在90％以上，速溶性好，這一產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的成功將使大豆蛋白的功能特性與應(yīng)用面更上一層樓。
現(xiàn)階段大豆肽的研究已較為普遍，但在應(yīng)用上還存在不少問(wèn)題①大豆肽在風(fēng)味上需要達(dá)到的目標(biāo)是無(wú)味、無(wú)臭。但蛋白質(zhì)水解過(guò)程中產(chǎn)生的苦味、臭味無(wú)法完全抑制，尤其是大規(guī)模生產(chǎn)中。蛋白質(zhì)水解生產(chǎn)蛋白水解肽之所以會(huì)有苦味，主要是由于常規(guī)的蛋白酶水解時(shí)，會(huì)使蛋白質(zhì)中的疏水性氨基酸殘基大量暴露，并且這些蛋白酶本身就有較濃的臭味，從而使得到的大豆肽產(chǎn)品帶有苦味和臭味，因此需要用化學(xué)修飾、活性炭吸附和離子交換等工藝進(jìn)行脫苦及除臭，這些工藝繁瑣復(fù)雜，而且過(guò)程中大豆肽的損失也很大，使得生產(chǎn)成本大大增加。②大豆多肽與氨基酸混合物和蛋白質(zhì)相比價(jià)格高是不可避免的，這也是多肽進(jìn)入市場(chǎng)困難的主要原因。目前大豆肽產(chǎn)品的限制性因素主要有兩個(gè)一是生產(chǎn)工藝復(fù)雜，效率低，收率低，成本高；二是產(chǎn)品品質(zhì)差，質(zhì)量不穩(wěn)定。③目前，采用的大豆蛋白質(zhì)水解用的酶制劑無(wú)法徹底消除水解過(guò)程中產(chǎn)生的苦味和臭味。能有效克服水解過(guò)程中的苦味的蛋白酶，任務(wù)仍然非常艱巨。另外，水解度控制要求特別高，仍然是人工操作，自動(dòng)化程度低，誤差較大，工藝復(fù)雜，產(chǎn)品收率低、成本較高、質(zhì)量不夠穩(wěn)定等。
因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種水解大豆蛋白的新方法，它可以高效、快速、徹底地水解大豆蛋白獲得大豆蛋白肽，其工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、性能好，并且能夠從根本上解決大豆蛋白肽的苦味和臭味問(wèn)題。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種大豆蛋白低聚肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述大豆蛋白低聚肽的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述大豆蛋白低聚肽的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種大豆蛋白低聚肽，以大豆蛋白低聚肽總重量計(jì)，粗蛋白含量90％-95％，灰分2％-3％，水分3％-5％，糖及脂肪含量2％-3％，其氮溶指數(shù)NSI為98.5％-99.9％，酸溶性蛋白含量99.5％-99.9％。
在另一優(yōu)選例中，以大豆蛋白低聚肽總重量計(jì)，分子量在6000Da±100Da的組分占47％-54w/w％，分子量在300-1000Da的組分占35％-42w/w％。
在另一優(yōu)選例中，所述大豆蛋白低聚肽在所有pH下都能溶液水，溶液澄清，呈淡黃褐色-淡紅褐色，顯弱酸性；所述大豆蛋白低聚肽無(wú)異味，無(wú)苦味；對(duì)熱很穩(wěn)定，100℃煮沸無(wú)沉淀析出；室溫下保存6個(gè)月含量無(wú)明顯變化。
在另一優(yōu)選例中，所述的大豆蛋白低聚肽通過(guò)下述步驟制備得到 (1)將原材料和復(fù)合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小時(shí)，得到大豆蛋白低聚肽；以固形物的總重量計(jì)，復(fù)合酶A的量為1-3w/w％；所述的原材料選自大豆分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白、大豆蛋白粉、大豆粉、或大豆餅粉；所述的復(fù)合酶A由下述成份構(gòu)成以復(fù)合酶A的干物的總重量計(jì)，角蛋白酶60-70w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，中性蛋白酶5-10w/w％，枯草桿菌蛋白酶1-5w/w％，地衣芽孢桿菌蛋白酶1-5w/w％，菠蘿蛋白酶0.5-5w/w％。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種如上所述的大豆蛋白低聚肽的制備方法，所述的方法包括步驟 (1)將原材料和復(fù)合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小時(shí)，得到大豆蛋白低聚肽；以固形物的總重量計(jì)，復(fù)合酶A的量為1-3w/w％；所述的原材料選自大豆分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白、大豆蛋白粉、大豆粉、或大豆餅粉；所述的復(fù)合酶A由下述成份構(gòu)成以復(fù)合酶A的干物的總重量計(jì)，角蛋白酶60-70w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，中性蛋白酶5-10w/w％，枯草桿菌蛋白酶1-5w/w％，地衣芽孢桿菌蛋白酶1-5w/w％，菠蘿蛋白酶0.5-5w/w％。
在另一優(yōu)選例中，所述步驟(1)為將原材料和復(fù)合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小時(shí)后，在75-85℃保溫30分鐘。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)前，所述原材料經(jīng)過(guò)以下步驟處理 (a)將原材料和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳狀液。
在另一優(yōu)選例中，所述原材料經(jīng)過(guò)以下步驟處理 (a′)將大豆?jié)饪s蛋白或大豆蛋白粉和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳狀液；和 (b′)將步驟(a′)得到的乳狀液和復(fù)合酶B在45-55℃混合、過(guò)濾，得到經(jīng)過(guò)處理的大豆?jié)饪s蛋白或大豆蛋白粉；以固形物的總重量計(jì)，復(fù)合酶B的量為0.3-0.5w/w％；所述的復(fù)合酶B由下述成份構(gòu)成以復(fù)合酶B的干物的總重量計(jì)，木聚糖酶20-35w/w％，葡聚糖酶25-35w/w％，α-淀粉酶10-25w/w％，果膠酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纖維素酶0.01-1.0w/w％，酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％。
在另一優(yōu)選例中，所述原材料經(jīng)過(guò)以下步驟處理 (a″)將大豆粉或大豆餅粉和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳狀液；和 (b″)將步驟(a″)得到的乳狀液和復(fù)合酶C在45-55℃混合、過(guò)濾，得到經(jīng)過(guò)處理的大豆粉或大豆餅粉；以固形物的總重量計(jì)，復(fù)合酶C的量為0.5-1.0w/w％；所述的復(fù)合酶C由下述成份構(gòu)成以復(fù)合酶C的干物的總重量計(jì)，木聚糖酶15-30w/w％，葡聚糖酶20-30w/w％，α-淀粉酶20-35w/w％，果膠酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纖維素酶0.01-1.0w/w％，酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％，脂肪酶1-5w/w％。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種如上所述的大豆蛋白低聚肽的用途，所述的大豆蛋白低聚肽用于制備清除自由基、抗氧化的組合物；或用于制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑；或用于制備抑制血栓形成的組合物；或用于制備預(yù)防或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的組合物。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種水解大豆蛋白的新方法，它可以高效、快速、徹底地水解大豆蛋白獲得大豆蛋白肽，其工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、性能好，并且能夠從根本上解決大豆蛋白肽的苦味和臭味問(wèn)題。



圖1顯示了復(fù)合酶A中不同濃度的角蛋白酶對(duì)大豆蛋白的水解能力。
圖2顯示了不同用量的復(fù)合酶A對(duì)大豆蛋白的水解能力。
圖3是大豆蛋白低聚肽制備工藝流程示意圖。
圖4是大豆蛋白低聚肽的凝膠色譜圖。
圖5顯示了本發(fā)明大豆蛋白低聚肽對(duì)羥自由基的清除效果。
圖6顯示了本發(fā)明大豆蛋白低聚肽對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果。
圖7顯示了本發(fā)明大豆蛋白低聚肽對(duì)DPPH自由基的清除效果。
圖8是大豆蛋白低聚肽對(duì)ACE活性的抑制測(cè)定譜圖；其中 A是ACE抑制活性測(cè)定標(biāo)樣圖譜；B是大豆肽ACE抑制活性樣品圖譜。
圖9顯示了本發(fā)明大豆蛋白低聚肽對(duì)ACE活性的抑制效果。
圖10顯示了本發(fā)明大豆蛋白低聚肽對(duì)血小板聚集的抑制效果。
圖11顯示了本發(fā)明大豆蛋白低聚肽對(duì)癌細(xì)胞的抑制效果；其中 A是未加本發(fā)明大豆蛋白低聚肽的人胚腎上皮細(xì)胞變種293FT生長(zhǎng)情況；B是加本發(fā)明大豆蛋白低聚肽后人胚腎上皮細(xì)胞變種293FT生長(zhǎng)情況；C是未加本發(fā)明大豆蛋白低聚肽的人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)情況；D是加本發(fā)明大豆蛋白低聚肽后人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)情況。
圖12是本發(fā)明大豆蛋白低聚肽經(jīng)胃、胰蛋白酶消化前后的凝膠色譜圖；其中A是消化前的凝膠色譜圖；B是經(jīng)胃蛋白酶消化后的凝膠色譜圖；C是經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后的凝膠色譜圖。

具體實(shí)施例方式 發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)使用復(fù)合酶A可以有效地水解大豆分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白、大豆粉、或大豆餅粉得到大豆蛋白低聚肽，所得到的大豆蛋白低聚肽無(wú)苦味、異味，水解程度高，其幾乎所有組分的分子量在6000Da以下，含有少量游離氨基酸。本發(fā)明得到的大豆蛋白低聚肽可以清除自由基、抗氧化；可以抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)；可以抑制ACE的活性；還具有抗凝血的作用。
本發(fā)明所采用的以角蛋白酶為主的復(fù)合酶，能夠高效、快速地水解大豆蛋白獲得大豆蛋白多肽，并且所得產(chǎn)品無(wú)苦味、臭味，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，工藝簡(jiǎn)單，成本低，從而可有效地解決本領(lǐng)域所存在的問(wèn)題。
定義 如本文所用，“大豆分離蛋白”是指利用脫皮脫脂冷榨豆餅或低溫脫溶豆粕為原料，經(jīng)稀堿萃取、酸沉淀、離心分離、噴霧干燥等工序加工而成的食用大豆蛋白產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量(干基)在90％以上，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可參照食品工業(yè)用大豆蛋白的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20371-2006。
如本文所用，“大豆?jié)饪s蛋白”是指以去雜脫脂后的冷榨大豆餅或低溫脫溶豆粕為原料，除去其中的非蛋白質(zhì)成分后，制得的蛋白質(zhì)含量(干基)在65％以上的大豆蛋白產(chǎn)品，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可參照食品工業(yè)用大豆蛋白的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20371-2006。
如本文所用，“大豆蛋白粉”是指采用脫皮大豆、脫脂豆餅豆粕、冷榨豆餅或低溫脫溶豆粕為原料，經(jīng)粉碎、滅酶脫腥等工藝生產(chǎn)所得的大豆蛋白產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量(干基)在50％以上，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可參照食品工業(yè)用大豆蛋白的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T20371-2006。
如本文所用，“大豆粉”是指大豆進(jìn)行了加熱脫腥及干燥后，進(jìn)行粉碎加工所得的大豆蛋白產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量(干基)在40％以上，質(zhì)量要求如下淺黃色，顆粒均勻，不結(jié)塊，無(wú)任何異味；水≤20％，蛋白質(zhì)≥40％。
如本文所用，“大豆餅粉”是指大豆經(jīng)過(guò)壓榨脫油后所得的殘餅，再進(jìn)行干燥粉碎后所得的大豆蛋白產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量(干基)在40％以上，質(zhì)量要求如下淺黃色至深黃色粉末，無(wú)蟲(chóng)蛀，無(wú)霉變；水≤15％，蛋白質(zhì)≥40％。
如本文所用，“復(fù)合酶A”是指由下述成份構(gòu)成的組合物，以復(fù)合酶A的干物的總重量計(jì)，其中角蛋白酶60-70w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，中性蛋白酶5-10w/w％，枯草桿菌蛋白酶1-5w/w％，地衣芽孢桿菌蛋白酶1-5w/w％，和菠蘿蛋白酶0.5-5w/w％。
復(fù)合酶A中所用的角蛋白酶是地衣形芽孢桿菌L-25角蛋白酶及編碼該角蛋白酶的DNA，對(duì)多種動(dòng)物蛋白和植物蛋白均有很強(qiáng)的水解能力和很高的水解效率，在公開(kāi)號(hào)為CN1361279A的中國(guó)專利申請(qǐng)中有詳盡的描述，該專利中的有關(guān)內(nèi)容并入本申請(qǐng)中。其余蛋白酶都可以從市售渠道獲得。
如本文所用，“復(fù)合酶B”是指由下述成份構(gòu)成的組合物，以復(fù)合酶B的干物的總重量計(jì)，其中木聚糖酶20-35w/w％，葡聚糖酶25-35w/w％，α-淀粉酶10-25w/w％，果膠酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纖維素酶0.01-1.0w/w％，和酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％。
如本文所用，“復(fù)合酶C”是指由下述成份構(gòu)成的組合物，以復(fù)合酶C的干物的總重量計(jì)，其中木聚糖酶15-30w/w％，葡聚糖酶20-30w/w％，α-淀粉酶20-35w/w％，果膠酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纖維素酶0.01-1.0w/w％，酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％，和脂肪酶1-5w/w％。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”或“食品學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。
大豆蛋白低聚肽 本發(fā)明提供一種大豆蛋白低聚肽，是大豆蛋白水解產(chǎn)物，以固體物質(zhì)的總重量計(jì)，其中分子量在6000Da±100Da的組分占47％-54w/w％，分子量在300-1000Da的組分占35％-42w/w％。
本發(fā)明提供的大豆蛋白低聚肽還具有如下特征 1)是一種乳白色-白色粉末，粗蛋白含量90-95w/w％，灰分2-3w/w％，水分3-5w/w％，糖及脂肪含量2-3w/w％，其氮溶指數(shù)NSI為98.5-99.9％，酸溶性蛋白含量99.5-99.9w/w％； 2)是一種多肽組合物，組合物中各組分的分子量均在6000Da以下，其中分子量在6000Da左右的占47％-54％，分子量在300-1000Da之間的占35％-42％，含有少量的游離氨基酸； 3)無(wú)異味，無(wú)苦味； 4)在所有pH下都能溶液水，溶液澄清，呈淡黃褐色-淡紅褐色，顯弱酸性； 5)對(duì)熱很穩(wěn)定，100℃煮沸無(wú)沉淀析出； 6)在室溫下保存6個(gè)月含量無(wú)明顯變化。
本發(fā)明提供的大豆蛋白低聚肽還具有以下功能 1)具有強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)羥自由基和DPPH自由基的清除能力均顯著高于維生素C；對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除率分別可達(dá)96％、32％和100％； 2)具有強(qiáng)的ACE抑制活性，活性抑制率可達(dá)87％，有降低血壓的功效； 3)能夠抗血小板聚集，抑制率可達(dá)63％，能有效防止血栓的形成； 4)能夠顯著的抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率可達(dá)56％，而對(duì)正常體細(xì)胞并無(wú)明顯的影響； 5)有強(qiáng)的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性，在體內(nèi)消化吸收后仍有很強(qiáng)的活性。
本發(fā)明提供的大豆蛋白低聚肽可以是液體或液體濃縮物。
制備方法 本發(fā)明提供一種大豆蛋白低聚肽的制備方法，它包括步驟將原材料經(jīng)過(guò)處理后加入復(fù)合酶A水解，水解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)微濾后，過(guò)D315和335樹(shù)脂除鹽、脫色，最終制成大豆蛋白低聚肽。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，以固形物的總重量計(jì)，復(fù)合酶A的加量按固形物含量的1-3w/w％加入。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所采用的水解是在55℃-65℃，pH8-9條件下水解8-12小時(shí)；更佳地，然后在75-85℃保溫30分鐘。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述的制備大豆蛋白低聚肽的方法的原材料是大豆分離蛋白，包括以下步驟 1)原材料預(yù)處理按固液比1∶3-1∶9將大豆分離蛋白與水混合，然后將混合液磨碎成乳狀液； 2)酶水解將乳狀液和復(fù)合酶A在pH8-9，55℃-65℃下混合8-12小時(shí)，按照固形物總量計(jì)，復(fù)合酶A的量為1％-3％(m/m)；更佳地，在水解8-12小時(shí)后，迅速升溫至75℃-85℃，并保溫30分鐘； 3)分離降低反應(yīng)液的溫度至15℃-20℃，調(diào)節(jié)pH至3.5-4.5，進(jìn)行膜濾，除去不溶的固形物殘?jiān)?，收集大豆蛋白低聚肽溶液?br> 本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述的制備大豆蛋白低聚肽的方法的原材料是大豆?jié)饪s蛋白或大豆蛋白粉，包括以下步驟 1)原材料預(yù)處理按固液比1∶3-1∶9將大豆?jié)饪s蛋白或大豆蛋白粉與水混合，然后將混合液磨碎成乳狀液； 2)第一次酶水解將乳狀液和復(fù)合酶B在45℃-55℃下混合2-3小時(shí)，以去除淀粉、纖維素、以及葡聚糖等半纖維素多糖雜質(zhì)；按照固形物總量計(jì)，復(fù)合酶B的量的0.3％-0.5％(m/m)； 3)過(guò)濾降低反應(yīng)液溫度至20℃-25℃，壓入板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，并壓水進(jìn)板框洗滌濾渣1-2次； 4)第二次酶水解將濾渣與水按固液比1∶2-1∶4混合，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，調(diào)節(jié)pH至8-9之間，升溫至55℃-65℃，按照固形物含量的1％-3％(m/m)加入復(fù)合蛋白酶，混合均勻后于此條件下水解8-12小時(shí)，然后迅速升溫至75℃-85℃，并保溫30分鐘； 5)分離降低反應(yīng)液的溫度至15℃-20℃，調(diào)節(jié)pH至3.5-4.5，進(jìn)行膜濾，除去不溶的固形物殘?jiān)?，收集大豆蛋白低聚肽溶液?br> 本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述的制備大豆蛋白低聚肽的方法的原材料是大豆粉或大豆餅粉，包括以下步驟 1)原材料預(yù)處理按固液比1∶3-1∶9將大豆粉或大豆餅粉和水混合，然后將混合液磨碎成乳狀液； 2)第一次酶水解將乳狀液和復(fù)合酶C在45℃-55℃下混合2-3小時(shí)，以去除淀粉、纖維素、以及葡聚糖等半纖維素多糖雜質(zhì)和油脂；按照固形物總量計(jì)，復(fù)合酶C的量的0.5％-1.0％(m/m)； 3)除脂降低反應(yīng)液溫度至15℃-20℃，靜置30-45分鐘后，放出下層的混合液，去除浮于表面的油脂層； 4)過(guò)濾將混合液壓入板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，并壓水進(jìn)板框洗滌濾渣1-2次； 5)第二次酶水解將濾渣與水按固液比1∶2-1∶4混合，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，調(diào)節(jié)pH至8-9之間，升溫至55℃-65℃，按照固形物含量的1％-3％加入復(fù)合蛋白酶，混合均勻后于此條件下水解8-12小時(shí)，然后迅速升溫至75℃-85℃，并保溫30分鐘； 6)分離降低反應(yīng)液的溫度至15℃-20℃，調(diào)節(jié)pH至3.5-4.5，進(jìn)行膜濾，除去不溶的固形物殘?jiān)?，收集大豆蛋白低聚肽溶液?br> 更佳地，在上述各優(yōu)選例的分離步驟得到大豆蛋白低聚肽溶液后還可以包括以下的一個(gè)或多個(gè)步驟 純化用D315和335樹(shù)脂除鹽并脫色； 濃縮用薄膜蒸發(fā)或真空濃縮對(duì)大豆蛋白低聚肽溶液進(jìn)行濃縮，使固形物含量達(dá)到15％-20％； 干燥濃縮液經(jīng)冷凍干燥、噴霧干燥或真空烘干制成大豆蛋白低聚肽粉。
用途 本發(fā)明提供的大豆蛋白低聚肽可以用于清除自由基、抗氧化；用于食品保鮮；用于保濕；可以用于抗血小板聚集及預(yù)防和治療血栓形成；還可以用于預(yù)防癌細(xì)胞形成或用于抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供的大豆蛋白低聚肽可以和食品學(xué)上或藥學(xué)上可接受的載體混合得到保健食品、飲料、化妝品或藥品。
所述的化妝品可以是發(fā)乳劑或面霜。
本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書(shū)所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于 1、本發(fā)明從原料組成入手，開(kāi)辟了大豆蛋白低聚肽制備的新工藝，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品概念的內(nèi)在本質(zhì)和技術(shù)創(chuàng)新。
2、獨(dú)特的復(fù)合蛋白酶有著特殊的酶切位點(diǎn)，水解產(chǎn)物均一、穩(wěn)定、基本無(wú)疏水性末端暴露，從而在根本上消除了大豆蛋白低聚肽的苦味和臭味，避免了繁瑣復(fù)雜的脫苦、除臭工藝，大大提高了產(chǎn)品的收率，降低了生產(chǎn)成本。
3、本發(fā)明以角蛋白酶為主的復(fù)合酶水解大豆蛋白生產(chǎn)大豆肽的方法，效率高、速度快，能夠在短時(shí)間內(nèi)徹底地水解大豆蛋白，工藝簡(jiǎn)單，并且有很高的原料利用率和多肽產(chǎn)出率。
4、所制備的大豆蛋白低聚肽其溶解性和粘度不受pH和溫度的影響，乳化性、保濕性、發(fā)泡性好，分子量在均300-6000Da之間，基本無(wú)游離氨基酸產(chǎn)生，吸收速度快，效率高。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計(jì)。
本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質(zhì)的重量。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
苦味和臭味的檢測(cè)可以直觀地通過(guò)味覺(jué)和嗅覺(jué)進(jìn)行評(píng)判，苦味也可以用不同濃度的喹啉做標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行簡(jiǎn)單的分級(jí)評(píng)判。一般情況下，取一種帶有苦味或臭味的標(biāo)準(zhǔn)樣品，將其按照不同濃度依次劃分為不同的苦味或臭味級(jí)別，然后再用樣品與之比較，從而對(duì)樣品進(jìn)行分級(jí)評(píng)判。比如將喹啉配置成不同的濃度，然后通過(guò)味覺(jué)將其劃分為不苦、微苦、稍苦、苦、很苦等，然后再去感覺(jué)樣品的苦味程度，并與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，從而確定其苦味的程度。
實(shí)驗(yàn)條件 1.材料 大豆分離蛋白、大豆?jié)舛鹊鞍住⒋蠖沟鞍追?、大豆粉和大豆餅粉均由福建福興醫(yī)藥有限公司提供；胃蛋白酶(1∶3000)，胰蛋白酶(1∶250)，購(gòu)自上海生工；實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株293FT購(gòu)自Invitrogen公司，HepG2購(gòu)自ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基，Glutamine，細(xì)胞培養(yǎng)用非必需氨基酸均購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清購(gòu)自HyClone公司。
2.試劑 實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售的分析純?cè)噭?br> 3.本發(fā)明中所用到的生物化學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實(shí)施例中，除非特殊說(shuō)明，所有實(shí)驗(yàn)操作均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊(cè)或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分進(jìn)行，包括程瑾瑞等，中國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)匯編(第二版)；趙永芳等，生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用(第二版)；朱檢等，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]；D.L斯佩克特等，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南(上、下)。
在本專利的以下實(shí)施例中，所提及的大豆蛋白低聚肽、大豆肽或大豆多肽均是指按照本專利的方法所制備的同一種大豆蛋白水解產(chǎn)物。
在本專利的以下實(shí)施例中，所提及的IC50均是指抑制率為50％時(shí)，反應(yīng)液中抑制物的濃度。
實(shí)施例1 復(fù)合酶A對(duì)大豆蛋白的水解 在45-85w/w％范圍內(nèi)，逐漸依次調(diào)整復(fù)合酶A中角蛋白酶的百分比濃度，然后按照實(shí)施例2(1)中所述的步驟1)至步驟2)，或?qū)嵤├?(2)中所述的步驟1)至步驟4)，或?qū)嵤├?(3)中所述的步驟1)至步驟5)實(shí)施復(fù)合酶A對(duì)大豆蛋白的水解(復(fù)合酶A的量按照原料量的2w/w％加入)，水解結(jié)束后，取酶解液5ml12000rpm離心5分鐘，取上清液用Folin-酚法測(cè)定可溶性蛋白含量，并按照下式計(jì)算水解度DH 式中N2——酶解反應(yīng)后酶解液的可溶性蛋白含量，mg/mL； N1——酶解反應(yīng)前溶液的可溶性蛋白含量，mg/mL； N0——參加酶解反應(yīng)的大豆蛋白的總蛋白量(原料的粗蛋白含量×原料的加入量，原料的粗蛋白含量按照凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定)，mg； V——酶解反應(yīng)液體積，mL。
再取2ml以上所得酶解液離心后上清，與2ml20％TCA混合，振蕩均勻，靜置5分鐘后，10000rpm離心10min，取上清液，用Folin-酚法測(cè)定可溶性蛋白含量，即為酶解液中酸溶性蛋白含量，酸溶性蛋白的百分比含量按照下式計(jì)算 酸溶性蛋白百分比含量％＝Ns/N×100 式中Ns——酶解液中酸溶性蛋白含量，mg/ml； N——酶解液中可溶性蛋白含量，mg/ml。
在1-3w/w％(復(fù)合酶A的量相對(duì)于原料量的百分比數(shù))的范圍內(nèi)，逐漸依次改變復(fù)合酶A的添加量，然后按照實(shí)施例2(1)中所述的步驟1)至步驟2)，或?qū)嵤├?(2)中所述的步驟1)至步驟4)，或?qū)嵤├?(3)中所述的步驟1)至步驟5)實(shí)施復(fù)合酶A對(duì)大豆蛋白的水解(復(fù)合酶A中角蛋白酶的含量為65％)，水解結(jié)束后，按照以上同樣的方法分別測(cè)定酶解液的水解度和酸溶性蛋白的百分比含量。
以上所得結(jié)果如圖1和圖2所示。從圖1中可以看出，角蛋白酶對(duì)大豆蛋白有很強(qiáng)的水解能力，復(fù)合酶A中角蛋白酶含量在60-70％范圍內(nèi)時(shí)，酶解液的水解度及酸溶性蛋白的百分比含量均可達(dá)到100％。當(dāng)復(fù)合酶A中角蛋白酶的含量低于60％后，酶解液中酸溶性蛋白的含量迅速減少，角蛋白酶含量為45％時(shí)，酸溶性蛋白含量降低至60％左右，這說(shuō)明角蛋白酶對(duì)大豆蛋白多肽的產(chǎn)生有至關(guān)重要的作用。從圖2中可以看出，在1-3％復(fù)合酶A添加量的范圍內(nèi)，均能夠快速、有效、徹底的水解大豆蛋白產(chǎn)生大豆蛋白低聚肽。
實(shí)施例2 大豆蛋白低聚肽的制備 (1)以大豆分離蛋白為原料 以大豆分離蛋白為原料，制備大豆蛋白低聚肽按照以下步驟進(jìn)行，工藝流程如圖3所示。
1)原材料預(yù)處理按固液比1∶3-1∶9將大豆分離蛋白與水混合(m/v)，調(diào)節(jié)pH至5-6之間，升溫至30℃-40℃，并在此條件下保溫30分鐘，然后將混合液通過(guò)膠體磨磨碎成乳狀液； 2)酶水解將乳狀液加入到反應(yīng)罐中，調(diào)節(jié)pH至8-9，升溫至55℃-65℃，按照固形物含量的1％-3％加入復(fù)合酶A(m/m)，混合均勻后于此條件下水解8-12小時(shí)，然后迅速升溫至75℃-85℃，并保溫30分鐘； 3)分離降低反應(yīng)液的溫度至15℃-20℃，調(diào)節(jié)pH至3.5-4.5，并靜置30分鐘，然后進(jìn)行膜濾，除去不溶的固形物殘?jiān)?，收集大豆低聚肽溶液? 4)純化用D315和335樹(shù)脂對(duì)大豆低聚肽進(jìn)行純化，除鹽并脫色； 5)濃縮用薄膜蒸發(fā)或真空濃縮對(duì)大豆低聚肽溶液進(jìn)行濃縮，使固形物含量達(dá)到15％-20％； 6)干燥濃縮液經(jīng)冷凍干燥、噴霧干燥或真空烘干制成大豆蛋白低聚肽粉。
(2)以大豆?jié)饪s蛋白或大豆蛋白粉為原料制備大豆蛋白低聚肽 以大豆?jié)饪s蛋白或大豆蛋白粉為原料，制備大豆蛋白低聚肽按照以下步驟進(jìn)行，工藝流程如圖3所示。
1)原材料預(yù)處理按固液比1∶3-1∶9將大豆?jié)饪s蛋白或大豆蛋白粉與水混合(m/v)，調(diào)節(jié)pH至4-6之間，升溫至30℃-40℃，并在此條件下保溫30min，然后將混合液通過(guò)膠體磨磨碎成乳狀液； 2)第一次酶水解將乳狀液加入到反應(yīng)罐中，升溫至45℃-55℃，按照固形物含量的0.3％-0.5％加入復(fù)合酶B(m/m)，混合均勻后于此條件下水解2-3小時(shí)； 3)過(guò)濾降低反應(yīng)液溫度至20℃-25℃，壓入板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，并壓水進(jìn)板框洗滌濾渣1-2次； 4)第二次酶水解將濾渣與水按固液比1∶2-1∶4混合(m/v)，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅{(diào)節(jié)pH至8-9之間，升溫至55℃-65℃，按照固形物含量的1％-3％加入復(fù)合酶A(m/m)，混合均勻后于此條件下水解8-12小時(shí)，然后迅速升溫至75℃-85℃，并保溫30分鐘； 5)分離降低反應(yīng)液的溫度至15℃-20℃，調(diào)節(jié)pH至3.5-4.5，并靜置30分鐘，然后進(jìn)行膜濾，除去不溶的固形物殘?jiān)?，收集大豆低聚肽溶液? 6)純化用D315和335樹(shù)脂對(duì)大豆低聚肽進(jìn)行純化，除鹽并脫色； 7)濃縮用薄膜蒸發(fā)或真空濃縮對(duì)大豆低聚肽溶液進(jìn)行濃縮，使固形物含量達(dá)到15％-20％； 8)干燥濃縮液經(jīng)冷凍干燥、噴霧干燥或真空烘干制成大豆蛋白低聚肽粉。
(3)以大豆粉或大豆餅粉為原料制備大豆蛋白低聚肽 以大豆粉或大豆餅粉為原料，制備大豆蛋白低聚肽按照以下步驟進(jìn)行，工藝流程如圖3所示。
1)原材料預(yù)處理按固液比1∶3-1∶9將大豆粉或大豆餅粉與水混合(m/v)，調(diào)節(jié)pH至5-6之間，升溫至30℃-40℃，并在此條件下保溫30min，然后將混合液通過(guò)膠體磨磨碎成乳狀液； 2)第一次酶水解將乳狀液加入到反應(yīng)罐中，升溫至45℃-55℃，按照固形物含量的0.5％-1.0％加入復(fù)合酶C(m/m)，混合均勻后于此條件下水解2-3小時(shí)； 3)除脂降低反應(yīng)液溫度至15℃-20℃，靜置30-45分鐘后，放出下層的混合液，去除浮于表面的油脂層； 4)過(guò)濾將混合液壓入板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，并壓水進(jìn)板框洗滌濾渣1-2次； 5)第二次酶水解將濾渣與水按固液比1∶2-1∶4混合(m/v)，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，調(diào)節(jié)pH至8-9之間，升溫至55℃-65℃，按照固形物含量的1％-3％加入復(fù)合酶A(m/m)，混合均勻后于此條件下水解8-12小時(shí)，然后迅速升溫至75℃-85℃，并保溫30分鐘； 6)分離降低反應(yīng)液的溫度至15℃-20℃，調(diào)節(jié)pH至3.5-4.5，并靜置30分鐘，然后進(jìn)行膜濾，除去不溶的固形物殘?jiān)占蠖沟途垭娜芤海? 7)純化用D315和335樹(shù)脂對(duì)大豆低聚肽進(jìn)行純化，除鹽并脫色； 8)濃縮用薄膜蒸發(fā)或真空濃縮對(duì)大豆低聚肽溶液進(jìn)行濃縮，使固形物含量達(dá)到15％-20％； 9)干燥濃縮液經(jīng)冷凍干燥、噴霧干燥或真空烘干制成大豆蛋白低聚肽粉。
通過(guò)以上方法獲得的產(chǎn)品，經(jīng)苦味和臭味檢測(cè)，無(wú)苦味、無(wú)臭味。
用反相高壓液相色譜法分析所制備大豆蛋白肽的氨基酸組成，結(jié)果如表1所示。
表1氨基酸組成分析結(jié)果 通過(guò)對(duì)大豆肽粉的氨基酸組成分析(表1)，可以看出，大豆肽各氨基酸組成平衡，除蛋氨酸、半胱氨酸、組氨酸含量較少外，其余的均在3％以上。天冬氨酸和谷氨酸含量較高，分別為11.3％和19.4％。大豆肽含有人體必需的8種氨基酸齊全，含量也較高，是一種較為理想的人體蛋白質(zhì)補(bǔ)充源，特別是亮氨酸和精氨酸含量達(dá)到6％。由此可見(jiàn)，大豆肽營(yíng)養(yǎng)成分均衡，具有開(kāi)發(fā)成為保健食品的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。
對(duì)所制備的大豆蛋白低聚肽粉的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示，從表2可以看出，大豆肽蛋白質(zhì)含量在90％以上，酸溶性蛋白含量占總蛋白含量的99％以上，游離氨基酸含量小于5％，分子量多在6000Da以下，灰分低于3％，很適合開(kāi)發(fā)成為保健食品。
表2大豆蛋白低聚肽分析表 實(shí)施例3 大豆蛋白低聚肽分子量分布的測(cè)定 采用凝膠過(guò)濾色譜法分析大豆蛋白低聚肽的分子量分布。凝膠過(guò)濾色譜根據(jù)分子量大小對(duì)混合物組分進(jìn)行分離，根據(jù)各組分的保留體積，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)譜圖，可計(jì)算出被測(cè)樣品中各組分的分子量大小。
以標(biāo)準(zhǔn)譜圖中各標(biāo)準(zhǔn)蛋白的保留體積為橫坐標(biāo)，以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得解析式1gY＝-0.1877X+6.0231，式中Y為組分的分子量(Da)，X為組分的保留體積。
取2ml大豆蛋白低聚肽溶液(實(shí)施例2所制備)25℃，10000rpm離心10min，上清液用0.2um的微濾膜過(guò)濾后，取100ul進(jìn)行HPLC分析。色譜條件為0.05M磷酸鹽緩沖液，0.15M NaCl，pH7.0；0.5ml/min，25℃；紫外檢測(cè)器，220nm；上樣100ul；SuperdexTMPeptide 10/300GL色譜柱。
所得色譜圖如圖4所示，根據(jù)譜圖中各組分的保留體積計(jì)算出各組分的分子量，根據(jù)譜圖中各組分的峰面積計(jì)算出各組分的百分比含量，結(jié)果如表3所示。
表3大豆肽中各組分的分子量及百分比含量 從圖4和表3可以看出在大豆蛋白水解產(chǎn)物中多肽和氨基酸的比例占絕大部分，多肽分子量大多數(shù)在6.0kDa以下，其中8號(hào)峰為氨基酸，其峰面積占總峰面積的3.374％；2號(hào)至7號(hào)峰為多肽，多肽的峰面積占總峰面積的95.75％.多肽與氨基酸占到總峰面積的95％以上，這說(shuō)明大豆蛋白經(jīng)過(guò)角蛋白酶的酶解成為多種可溶的多肽與氨基酸，大分子量的蛋白已不存在。
實(shí)施例4 大豆蛋白低聚肽的抗氧化活性 1)大豆蛋白低聚肽對(duì)羥基自由基(·OH)的清除作用 參考Fenton反應(yīng)體系模型，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，但由于·OH具有很高的反應(yīng)活性，存活時(shí)間短，若在體系中加入水楊酸，就能有效地捕捉·OH，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在波長(zhǎng)510nm處有強(qiáng)吸收，若在反應(yīng)體系中加入具有清除·OH功能的被測(cè)物，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，而使有色產(chǎn)物生成量減少。采用固定反應(yīng)時(shí)間法，因此，可以用來(lái)評(píng)價(jià)樣品對(duì)·OH的清除效果(Sabu MC，Smitha K，et al.Anti-diabetic activity of green tea polyphenols and their role in reduceing oxidative stress in experimental diabetes[J].J.Ethnopharmacol，2002，83109-116.)。
在試管中依次加0.5ml 9mM水楊酸-乙醇溶液，0.5ml的不同濃度的大豆肽樣品溶液(在1-18mg/ml濃度范圍內(nèi)，所用大豆蛋白肽為實(shí)施例2所制備)，0.5ml 9mMFe2+溶液(現(xiàn)配)，3.5ml蒸餾水，最后加入5ml 8.8mM H2O2啟動(dòng)Fenton反應(yīng)，搖勻后于510nm處測(cè)定吸光度A1；取0.5ml的蒸餾水代替9mM Fe2+溶液所測(cè)得的吸光度為A2；取0.5ml蒸餾水代替樣品所測(cè)得的吸光度為A3。羥基自由基的清除率P(％)可按照式(1)進(jìn)行計(jì)算，所得結(jié)果如圖5所示。
式(1) 式中P—清除率，％； A1——樣品溶液反應(yīng)后的吸光值； A2——取0.5ml的蒸餾水代替9mM Fe2+溶液后的吸光值； A3——取0.5ml蒸餾水代替樣品的吸光值。
從圖5可以看出，大豆肽對(duì)羥基自由基有很好清除效果，當(dāng)大豆肽濃度為11mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率可達(dá)到96％。在0-10mg/mL濃度范圍內(nèi)，大豆肽對(duì)·OH自由基的清除率隨著濃度的升高而迅速增大，大豆肽對(duì)羥基自由基的IC50為4mg/mL。
文獻(xiàn)對(duì)大豆肽清除羥基自由基作用的報(bào)道很多，研究表明，大豆分離蛋白經(jīng)中性蛋白酶Asl.398酶解，得到的酶解物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在濃度0.1-250mg/mL范圍內(nèi)對(duì)羥自由基都有明顯的清除作用，且在上述濃度下無(wú)促氧化作用(榮建華，李小定，謝筆鈞.大豆肽抗氧化效果的研究[J].食品科學(xué)，2002，23(11)118-120.)。本專利所制備的大豆肽，在0.1-10mg/ml的濃度范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基就有很好的清除效果，比其他同類的大豆肽產(chǎn)品具有更強(qiáng)的活性。
2)大豆蛋白低聚肽對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用 鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，釋放超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基加速自氧化，同時(shí)生成有色中間產(chǎn)物。中間產(chǎn)物的積累在滯后40s到45s時(shí)與時(shí)間成良好線性關(guān)系，有色產(chǎn)物在420nm處有強(qiáng)烈光吸收，從而可用于評(píng)價(jià)受試物清除超氧陰離子自由基的能力(鄒國(guó)林等.一種SOD的測(cè)活方法——鄰苯三酚自氧化法的改進(jìn)[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1986，471-73)。
取4.5ml pH 8.3的10mM PBS緩沖液與100μl不同濃度的大豆肽樣品溶液(在2-20mg/ml濃度范圍內(nèi)，所用大豆蛋白肽為實(shí)施例2所制備)混合，于25℃恒溫15min，取混合液3ml加入45mM的鄰苯三酚(用10mM HCl溶液配制)100μl，搖勻，反應(yīng)3min，在波長(zhǎng)420nm測(cè)定吸光值A(chǔ)1。超氧陰離子自由基的清除率P(％)可按照式(2)進(jìn)行計(jì)算，所得結(jié)果如圖6所示。
式(2) 式中P—清除率，％； A1——樣品溶液反應(yīng)后的吸光值； A2——4.5ml PBS溶液+100μl HCl(10mM)+100μl蒸餾水的吸光值； A3——4.5ml PBS溶液+100μl鄰苯三酚溶液+100μl蒸餾水的吸光值。
從圖6可以看出，大豆肽對(duì)超氧陰離子自由基也具有較好的清除效果，當(dāng)大豆肽濃度為6mg/mL時(shí)，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除率可達(dá)到29％，在0-6.0mg/mL濃度范圍內(nèi)，大豆肽對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨著濃度的升高而迅速增大，其對(duì)超氧陰離子自由基的最大清除率可達(dá)到32％。1999年，張學(xué)忠等發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)體系中添加40mg/mL大豆多肽，鄰苯三酚自氧化速率被抑制27％(張學(xué)忠，王寰宇，陳松明，等.大豆功能短肽的制備及其生理活性研究「A 」.李榮和.大豆新加工技術(shù)原理與應(yīng)用「M 」.北京科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1999.181-227.)，而本專利所制備的大豆肽其對(duì)鄰苯三酚的自養(yǎng)化速率最大抑制率達(dá)到32％，在低濃度下就能起作用，并且在2-8mg/ml的濃度范圍內(nèi)對(duì)超氧陰離子自由基就有很好的清除效果，因此具有更好的抗氧化性。
3)大豆蛋白低聚肽對(duì)DPPH自由基的清除作用 DPPH(1，1-二苯-2-苦肼基)是一種穩(wěn)定的自由基。其乙醇溶液呈紫色，在可見(jiàn)光區(qū)最大吸收峰為517nm。當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，溶液顏色變淺，517nm處的吸光度變小，而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線性關(guān)系。因此，可用來(lái)檢測(cè)自由基的清除情況，從而評(píng)價(jià)某物質(zhì)的抗氧化能力。其能力用抑制率來(lái)表示，抑制率越大，抗氧化能力越強(qiáng)(陸冬蓮等.太白山區(qū)23種中藥抗氧化活性的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2001，1320-22.)。
配制濃度為1×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。稱取適量的大豆蛋白肽樣品(所用大豆蛋白低聚肽為實(shí)施例2所制備)，并用95％乙醇配置成不同濃度的溶液(在1-11mg/ml的濃度范圍內(nèi))。在517nm處，按照如下計(jì)算公式(3)中的方法加樣測(cè)定，室溫下反應(yīng)30min，每樣重復(fù)3次，取平均值，并計(jì)算自由基清除率P，所得結(jié)果如圖7所示。
式(3) 式中P—清除率，％； A1——2ml DPPH溶液+2ml樣品溶液的吸光值； A2——2ml待測(cè)溶液+2ml乙醇的吸光值； A3——2ml DPPH溶液+2ml乙醇的吸光值。
圖7反映了大豆蛋白低聚肽清除DPPH自由基效果，可以看出，大豆蛋白低聚肽對(duì)DPPH自由基有著較強(qiáng)的清除效果，在1-5mg/mL濃度范圍內(nèi)，其對(duì)DPPH自由基清除率隨著含量的增大而迅速增大，清除率最高可達(dá)到100％，大豆蛋白低聚肽對(duì)清除DPPH自由基的IC50為3mg/mL。
很多研究報(bào)道了其他具有抗氧化活性物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除作用，但是關(guān)于大豆肽對(duì)DPPH自由基的清除作用的報(bào)道較少，本專利所制備的大豆肽對(duì)DPPH自由基亦有很強(qiáng)的清除作用，進(jìn)一步說(shuō)明本專利的大豆肽較其他同類產(chǎn)品有更好的功能和更強(qiáng)的活性。
在相同的濃度和條件下，分別比較本專利所制備的大豆蛋白低聚肽與Vc清除DPPH、·OH和O2-三種自由基的能力，結(jié)果見(jiàn)表4所示。
表4大豆肽與Vc抗氧化活性的比較
注大豆肽濃度及Vc濃度均為10mg/mL，Vc對(duì)三種自由基清除能力的測(cè)定均按照本實(shí)施例所描述的方法進(jìn)行。
由表4可以看出，在相同的條件下大豆肽對(duì)三種自由基的清除能力均顯著高于Vc，這說(shuō)明本專利的大豆肽具有很好的抗氧化活性。
實(shí)施例5 大豆蛋白低聚肽的AGE抑制活性 三肽馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate，簡(jiǎn)稱HHL)在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的催化下快速地分解產(chǎn)生馬尿酸和二肽His-Leu(簡(jiǎn)稱HL)。當(dāng)加入對(duì)ACE有抑制作用的樣品時(shí)，ACE的活性受到抑制，馬尿酸和二肽的生成量減少，因此可通過(guò)HPLC測(cè)定馬尿酸的生成量來(lái)評(píng)價(jià)ACEI對(duì)ACE活性的抑制率(張蓉真等.福建老酒中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制物質(zhì)的分離鑒定.福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).1996，24(6))。
ACE活性測(cè)定根據(jù)經(jīng)Raoetal改進(jìn)過(guò)的Cushman法。先將2.5μL的ACE酶加人5μL待測(cè)大豆肽樣品中(用5μL 0.2mol/L的NaCl代替樣品作為空白對(duì)照，所用大豆肽樣品為實(shí)施例2所制備)，在37℃下保溫3min后，加人25μL三肽(Hip-His-Leu)反應(yīng)液(2.5mmol/LHip-His-Leu)，在37℃下保溫1h后，加人42.5μL的0.1N的HCl溶液終止反應(yīng)。
取上述終止反應(yīng)后的反應(yīng)混合液10uL，上樣高效液相凝膠過(guò)濾色譜，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物馬尿酸(Hip)進(jìn)行定量，結(jié)果如圖8所示，圖中，峰1為ACE酶，峰2為三肽HHL，峰3為組分馬尿酸，峰4為二肽HL。
ACE抑制率直接從加人待測(cè)大豆肽樣品的混合反應(yīng)液的馬尿酸的峰高或面積B與以分離用的洗脫緩沖液為對(duì)照的混合反應(yīng)液的馬尿酸的峰高或面積A按下式計(jì)算出，即 抑制率％＝(A-B)/A×100 色譜條件為0.05M磷酸鹽緩沖液，0.15M NaCl，pH7.0；0.4ml/min，25℃；紫外檢測(cè)器，280nm；上樣10ul；Toyopearl HW40S色譜柱。
分別測(cè)定不同濃度的大豆蛋白低聚肽對(duì)ACE活性的抑制作用，結(jié)果如圖9所示。從圖中可以看出，大豆肽對(duì)ACE活性具有很強(qiáng)的抑制作用，抑制率隨著濃度的增大而增大，當(dāng)大豆肽濃度為18mg/mL時(shí)，抑制率可達(dá)到86.7％。
實(shí)施例6 大豆蛋白低聚肽的抗血小板聚集活性 在二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)劑作用下，血小板膜上糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)、纖維蛋白原、鈣離子。在未被激活的血小板，其GPⅡb和GPⅢa彼此分開(kāi)分布于血小板膜表面，誘導(dǎo)劑作用后，兩種糖蛋白相互作用形成復(fù)合物成為纖維蛋白原的受體，纖維蛋白原結(jié)合在活化血小板上，在Ca2+參與下實(shí)現(xiàn)聚集反應(yīng)。因此，可以通過(guò)檢測(cè)加入樣品對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)的結(jié)果與未加入樣品的空白作對(duì)照，測(cè)定樣品對(duì)血小板聚集的抑制活性。
取新鮮兔血9ml，與1ml 3.8％檸檬酸鈉混合(m/v)，室溫下500rpm離心10min，血漿約占總血1/4，取上層血漿，即為富血小板血漿(PRP)，下層紅細(xì)胞3000r/min離心10min，上清液為貧血小板血漿(PPP)。血小板聚集實(shí)驗(yàn)在LBY-NJ的血小板聚集儀上進(jìn)行。以PPP調(diào)PRP使透光度在30左右(血小板數(shù)在2×109ml)。分別取200μl調(diào)過(guò)的PRP與40μl不同濃度的大豆蛋白低聚肽(10mg/ml-50mg/ml，所用大豆蛋白低聚肽為實(shí)施例2所制備)或生理鹽水于比濁管中37℃下孵育至少5min，在電磁攪拌下分別加入致聚劑ADP 10μl(300μmol/L)誘導(dǎo)血小板聚集，觀察樣品對(duì)血小板聚集的影響，比較空白PRP與樣品PRP在3min內(nèi)最大聚集程度，計(jì)算聚集百分率和試樣抑制聚集百分率，計(jì)算公式如下
分別測(cè)定不同大豆肽濃度對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率，結(jié)果如圖10所示， 從圖中可以看出，大豆蛋白低聚肽對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)有很強(qiáng)的抑制作用，隨著肽濃度的升高，其對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率逐漸提高，當(dāng)濃度達(dá)到50mg/mL時(shí)，其對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)抑制率可達(dá)到63.4％。其IC50為27mg/mL。Kyung-Ae Lee，Seung-Ho Kim 2005年從大豆蛋白水解物中分離得到兩個(gè)具有抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)作用的活性肽SSGE和DEE，其IC50分別為480μM和460μM，對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)的最大抑制率為70％(Kyung-Ae Lee，Seung-Ho Kim.SSGEand DEE，new pep“des isolated from a soy proteinhydrolysate that inhibit platelet aggregation.Food Chemistry.2005(90)389-393.)。由此可知，本專利所制備的大豆肽具有相當(dāng)高的血小板聚集反應(yīng)抑制率水平，對(duì)于預(yù)防和治療心血管疾病具有重要意義。
實(shí)施例7 大豆蛋白低聚肽的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)活性 HepG2細(xì)胞來(lái)自Invitrogen，培養(yǎng)條件為10％FBS(Hyclone)DMEM，100ug/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
293FT細(xì)胞來(lái)自ATCC，培養(yǎng)條件為10％FBS(Hyclone)DMEM，100ug/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，2mM L-谷胺酰氨，1％(V/V)非必需氨基酸，37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
100ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到95％匯合率后，胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞懸浮液中取5ul與等體積臺(tái)盼蘭混合染色計(jì)數(shù)，適當(dāng)稀釋后鋪96孔板，2.0×104個(gè)/孔，培養(yǎng)12h后換液，并添加大豆蛋白低聚肽(所用大豆蛋白低聚肽為實(shí)施例2所制備)。培養(yǎng)24h后拍照，消化細(xì)胞，臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)。
圖11顯示了大豆蛋白低聚肽對(duì)正常細(xì)胞(人胚胎腎上皮細(xì)胞變種293FT)及肝癌細(xì)胞(HepG2)生長(zhǎng)的影響從圖11a、11b的比較可以看出，大豆蛋白低聚肽對(duì)正常細(xì)胞293FT無(wú)明顯的影響，添加大豆肽與不添加大豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)后，細(xì)胞數(shù)未發(fā)生明顯變化，細(xì)胞形態(tài)也無(wú)變化。從圖11c、11d的比較可以看出，大豆蛋白低聚肽對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，加入大豆肽細(xì)胞培養(yǎng)后，不僅細(xì)胞數(shù)大量減少，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生較大變化?？梢?jiàn)大豆肽在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，顯示了良好的抑制肝癌細(xì)胞活性。
表5顯示了添加不同大豆蛋白低聚肽濃度對(duì)正常細(xì)胞(人胚胎腎上皮細(xì)胞變種293FT)及肝癌細(xì)胞(HepG2)生長(zhǎng)的影響。由表可知，大豆肽對(duì)人腎上皮細(xì)胞變種生長(zhǎng)無(wú)明顯的影響，而對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)顯示了良好的抑制活性，當(dāng)大豆肽濃度達(dá)到10μg/mL時(shí)，其對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率為15％，當(dāng)大豆肽濃度達(dá)到10mg/mL時(shí)，其對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率可高達(dá)56.30％。
原發(fā)性肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，源于細(xì)胞生長(zhǎng)、分化與凋亡之間的調(diào)控失衡，以及環(huán)境與機(jī)體的相互作用。目前肝癌的治療多采用化療藥物通過(guò)不同機(jī)制作用于肝癌細(xì)胞，但其療效不佳，相互之間可產(chǎn)生交叉耐藥性，毒副作用大。復(fù)合角蛋白酶水解大豆蛋白所產(chǎn)生的大豆肽具有良好的癌細(xì)胞抑制效果，且隨著濃度的增大而抑制逐漸增大，而對(duì)正常細(xì)胞并無(wú)明顯影響，有望從中分離出具有抗癌效果的藥物，應(yīng)用于臨床治療惡性腫瘤。
表5大豆蛋白低聚肽體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)施例8 大豆蛋白低聚肽對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性 本實(shí)驗(yàn)采用體外模擬消化來(lái)考察大豆蛋白低聚肽對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性。
(1)胃蛋白酶體外消化 于25ml具塞試管中，加入50mg大豆蛋白低聚肽(所用大豆肽為實(shí)施例2所制備)，5ml蒸餾水，溶解后用鹽酸調(diào)pH至2.5，然后按照2000U/g大豆肽的比例加入胃蛋白酶，置于37℃水浴中3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后加入2ml 20％TCA終止反應(yīng)，將反應(yīng)液于10000rpm，25℃下離心5min，取上清100ul進(jìn)行HPLC分析(按實(shí)施例3中所敘的方法進(jìn)行，采用Toyopearl HW-40s凝膠柱)。
(2)胰蛋白酶體外消化 于25ml具塞試管中，加入50mg大豆蛋白低聚肽(所用大豆肽為實(shí)施例2所制備)，5ml蒸餾水，溶解后用鹽酸調(diào)pH至8.0，然后按照2000U/g大豆肽的比例加入胰蛋白酶，置于37℃水浴中3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后加入2ml 20％TCA終止反應(yīng)，將反應(yīng)液于10000rpm，25℃下離心5min，取上清100ul進(jìn)行HPLC分析(按實(shí)施例3中所敘的方法進(jìn)行，采用Toyopearl HW-40s凝膠柱)。
以未經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶消化的大豆肽為對(duì)照，比較消化前、后大豆肽分子量分布的變化，結(jié)果如圖12所示。從圖中可以看出，大豆肽體外消化前、后峰型沒(méi)有大的變化，保留時(shí)間在20min前的峰為大分子蛋白，這些小峰消化后幾乎都被降解，40min后的峰為氨基酸，峰面積大大提高，保留時(shí)間為20-40min的多肽峰基本沒(méi)有變化，但峰面積略有提高。這說(shuō)明大豆肽經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶作用后，剩余的大分子蛋白繼續(xù)分解為多肽與氨基酸。多肽部分的峰型不變說(shuō)明其主要組分沒(méi)有降解。
將所得胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后的大豆肽樣品，按照實(shí)施例4中所敘述的方法分析其對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的去除率，并與消化前的樣品進(jìn)行比較，結(jié)果如表6所示。
表6大豆肽體外消化前后抗氧化活性的比較
注大豆肽樣品濃度為10mg/ml 由表6可以看出，大豆肽經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后，其對(duì)DPPH、·OH及超氧陰離子三種自由基的清除能力不但沒(méi)有降低，反而略有提高，結(jié)合大豆肽體外消化的分子量分布(圖12)可知，大豆肽經(jīng)過(guò)胃蛋白酶、胰蛋白酶體外消化后不僅原有的抗氧化活性肽不會(huì)被降解，還會(huì)有少量的抗氧化活性肽產(chǎn)生。由此可知，本專利所制備的大豆肽經(jīng)生物體吸收利用后，其抗氧化活性不會(huì)喪失，而且還有所提高，是一種很好的生物保健肽。
將所得胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后的大豆肽樣品，按照實(shí)施例5中所敘述的方法分析其對(duì)ACE活性的抑制率，并與消化前的樣品進(jìn)行比較，結(jié)果如表7所示。
表7大豆肽體外消化前后ACE抑制活性的比較 注大豆肽樣品濃度為18mg/ml 由表7可以看出，大豆肽分別經(jīng)過(guò)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，其對(duì)ACE活性的抑制效果無(wú)明顯的變化，這進(jìn)一步說(shuō)明本專利的大豆肽在體內(nèi)消化吸收后，仍保持很高的生物活性，具有很強(qiáng)的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，任何他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種大豆蛋白低聚肽，其特征在于，以大豆蛋白低聚肽總重量計(jì)，粗蛋白含量90％-95％，灰分2％-3％，水分3％-5％，糖及脂肪含量2％-3％，其氮溶指數(shù)NSI為98.5％-99.9％，酸溶性蛋白含量99.5％-99.9％。
2.如權(quán)利要求1所述的大豆蛋白低聚肽，其特征在于，以大豆蛋白低聚肽總重量計(jì)，分子量在6000Da±100Da的組分占47％-54w/w％，分子量在300-1000Da的組分占35％-42w/w％。
3.如權(quán)利要求1所述的大豆蛋白低聚肽，其特征在于，所述大豆蛋白低聚肽在所有pH下都能溶液水，溶液澄清，呈淡黃褐色-淡紅褐色，顯弱酸性；所述大豆蛋白低聚肽無(wú)異味，無(wú)苦味；對(duì)熱很穩(wěn)定，100℃煮沸無(wú)沉淀析出；室溫下保存6個(gè)月含量無(wú)明顯變化。
4.如權(quán)利要求1所述的大豆蛋白低聚肽，其特征在于，所述的大豆蛋白低聚肽通過(guò)下述步驟制備得到
(1)將原材料和復(fù)合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小時(shí)，得到大豆蛋白低聚肽；以固形物的總重量計(jì)，復(fù)合酶A的量為1-3w/w％；所述的原材料選自大豆分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白、大豆蛋白粉、大豆粉、或大豆餅粉；所述的復(fù)合酶A由下述成份構(gòu)成以復(fù)合酶A的干物的總重量計(jì)，角蛋白酶60-70w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，中性蛋白酶5-10w/w％，枯草桿菌蛋白酶1-5w/w％，地衣芽孢桿菌蛋白酶1-5w/w％，菠蘿蛋白酶0.5-5w/w％。
5.一種如權(quán)利要求1-4任一所述的大豆蛋白低聚肽的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟
(1)將原材料和復(fù)合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小時(shí)，得到大豆蛋白低聚肽；以固形物的總重量計(jì)，復(fù)合酶A的量為1-3w/w％；所述的原材料選自大豆分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白、大豆蛋白粉、大豆粉、或大豆餅粉；所述的復(fù)合酶A由下述成份構(gòu)成以復(fù)合酶A的干物的總重量計(jì)，角蛋白酶60-70w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，中性蛋白酶5-10w/w％，枯草桿菌蛋白酶1-5w/w％，地衣芽孢桿菌蛋白酶1-5w/w％，菠蘿蛋白酶0.5-5w/w％。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)為將原材料和復(fù)合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小時(shí)后，在75-85℃保溫30分鐘。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，在步驟(1)前，所述原材料經(jīng)過(guò)以下步驟處理
(a)將原材料和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳狀液。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述原材料經(jīng)過(guò)以下步驟處理
(a′)將大豆?jié)饪s蛋白或大豆蛋白粉和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳狀液；和
(b′)將步驟(a′)得到的乳狀液和復(fù)合酶B在45-55℃混合、過(guò)濾，得到經(jīng)過(guò)處理的大豆?jié)饪s蛋白或大豆蛋白粉；以固形物的總重量計(jì)，復(fù)合酶B的量為0.3-0.5w/w％；所述的復(fù)合酶B由下述成份構(gòu)成以復(fù)合酶B的干物的總重量計(jì)，木聚糖酶20-35w/w％，葡聚糖酶25-35w/w％，α-淀粉酶10-25w/w％，果膠酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纖維素酶0.01-1.0w/w％，酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％。
9.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述原材料經(jīng)過(guò)以下步驟處理
(a″)將大豆粉或大豆餅粉和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳狀液；和
(b″)將步驟(a″)得到的乳狀液和復(fù)合酶C在45-55℃混合、過(guò)濾，得到經(jīng)過(guò)處理的大豆粉或大豆餅粉；以固形物的總重量計(jì)，復(fù)合酶C的量為0.5-1.0w/w％；所述的復(fù)合酶C由下述成份構(gòu)成以復(fù)合酶C的干物的總重量計(jì)，木聚糖酶15-30w/w％，葡聚糖酶20-30w/w％，α-淀粉酶20-35w/w％，果膠酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纖維素酶0.01-1.0w/w％，酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％，脂肪酶1-5w/w％。
10.一種如權(quán)利要求1-4任一所述的大豆蛋白低聚肽的用途，其特征在于，所述的大豆蛋白低聚肽用于制備清除自由基、抗氧化的組合物；或用于制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑；或用于制備抑制血栓形成的組合物；或用于制備預(yù)防或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種大豆蛋白低聚肽，以大豆蛋白低聚肽總重量計(jì)，粗蛋白含量90％-95％，灰分2％-3％，水分3％-5％，糖及脂肪含量2％-3％，其氮溶指數(shù)NSI為98.5％-99.9％，酸溶性蛋白含量99.5％-99.9％。本發(fā)明還公開(kāi)了這種大豆蛋白低聚肽的制備方法及其用途。
文檔編號(hào)A61P39/06GK101824455SQ20091012850
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者葉秀云, 靳偉剛, 張洋, 羅鋆琳 申請(qǐng)人:香港百特有限公司