專利名稱：治療癌癥的siRNA藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及一種核苷酸藥物，特別涉及一種多靶標(biāo)SiRNA雞尾酒藥物，應(yīng)用 RNA干擾(RNAi)技術(shù)來(lái)治療乳腺癌等多種疾病。
背景技術(shù)：
乳腺癌是由于乳腺導(dǎo)管上皮發(fā)生病變產(chǎn)生惡性腫瘤，是一種常見(jiàn)的癌癥，尤其對(duì) 于女性。常見(jiàn)的乳腺癌有三種，最常見(jiàn)的一種是乳腺導(dǎo)管癌，發(fā)生于乳腺導(dǎo)管細(xì)胞；其次是 發(fā)生在乳腺葉或小葉的乳腺小葉癌，與其他類(lèi)型的乳腺癌相比，這種癌癥更容易致使兩個(gè) 乳房都患病；最后是炎性乳腺癌(IBC)，不如前面兩類(lèi)常見(jiàn)。目前，有關(guān)這三種乳腺癌的致 病原因還沒(méi)有徹底了解，但是通常認(rèn)為與遺傳(BRCA1和BRCA2基因變異)和環(huán)境因素(高 脂肪飲食、肥胖、吸煙等)有關(guān)系?，F(xiàn)有的乳腺癌的治療方法，四種標(biāo)準(zhǔn)化的治療手段是外科手術(shù)、放療、化療和激 素療法。如果發(fā)現(xiàn)及時(shí)，上述療法可以使乳腺癌患者有很高的生存率5年的生存率目前超 過(guò)70%，而10年的生存率也達(dá)到了 50%左右。然而，一旦癌細(xì)胞擴(kuò)散到其他組織和器官， 即使通過(guò)上述任何一種療法，生存率也會(huì)急劇下降。乳腺癌的治療取決于癌癥變化的程度， 成功幾率差別很大。然而目前還沒(méi)有對(duì)所有程度乳腺癌患者都通用的、比較有效的治療方法。乳腺癌種類(lèi)較多、致病因素也有很多，但乳腺癌細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)極大地依賴于 細(xì)胞內(nèi)的一些常見(jiàn)的分子信號(hào)通路。目前，已經(jīng)披露了一些與乳腺癌形成和擴(kuò)散有關(guān)的 介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的分子靶標(biāo)，并且也已開(kāi)發(fā)或設(shè)計(jì)了相應(yīng)的小分子藥物和單克隆抗體 來(lái)阻斷這些靶標(biāo)，取得了不同程度的成功，但是目前還無(wú)法做到在RNA水平，特別是信使 RNA(mRNA)水平抑制這些靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
在上述的這些靶標(biāo)中，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、Raf-I激酶和mTOR激酶這 三個(gè)癌基因產(chǎn)物被認(rèn)為能夠促進(jìn)乳腺癌的生長(zhǎng)，并且作用非常顯著，具體如下表皮生長(zhǎng)因子受體在乳腺癌中的作用表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是一個(gè)活 化癌基因的產(chǎn)物。在大量的表皮性癌細(xì)胞中經(jīng)常可以看到EGFR水平的升高，例如乳腺癌、 肺癌、頭頸癌、宮頸癌細(xì)胞，而且與預(yù)后差相關(guān)。一些以EGFR家族成員為靶標(biāo)的試劑已經(jīng)被 批準(zhǔn)用于癌癥治療，例如ZD1839/IreSSa (易瑞沙)和Here印tin (赫賽汀)。目前，EGFR配體 家族中已知的有七個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α (TGF α)、肝素結(jié)合性表皮生 長(zhǎng)因子(HB-EGF)、雙調(diào)蛋白(AR)、β -細(xì)胞調(diào)節(jié)素(BTC)、外調(diào)蛋白(EPR)和表原(epigen)， 所有這些配體都以I型跨膜前配體的形式合成，在細(xì)胞外形成包含一個(gè)或多個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu) 域，酶切后得到成熟的生長(zhǎng)因子。EGFR信號(hào)通路也可以被G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的配體反 式激活，研究表明，GPCR激動(dòng)劑，如內(nèi)皮素-1、溶血磷脂酸或凝血酶，可以通過(guò)酪氨酸殘基快速磷酸化EGFR。GPCR-EGFR交互技術(shù)現(xiàn)在被認(rèn)為是激活MAP激酶通路的一種廣泛互動(dòng)信 號(hào)途徑。EGFR的反式活化可通過(guò)許多GPCR和大量G蛋白的活動(dòng)來(lái)完成。胃泌素釋放肽結(jié) 合其受體GPCR，促進(jìn)細(xì)胞的自分泌生長(zhǎng)，刺激產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞，并加速腫瘤細(xì)胞增殖。當(dāng)頭頸 癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌細(xì)胞的自分泌途徑中的TGF/EGFR和 GRP/GRH 被闡明后，這一途徑(通過(guò)抑制EGFR基因來(lái)治療乳腺癌)的重要性更加明顯。Raf-I激酶在乳腺癌中的作用Raf_l激酶是一個(gè)分子量為72kDa的胞質(zhì)色氨 酸_蘇氨酸激酶，作為第二信使在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到重要作用。在配體結(jié)合多種諸如EGF 受體的跨膜酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體后，72kDa的Raf-I激酶被其他細(xì)胞質(zhì)激酶磷酸化而 成為74kDa的磷蛋白。在許多轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，Raf-I激酶被組成性(constitutive)的激活， 這種激活可以是氨基末端調(diào)控區(qū)域的突變直接活化，或者是自分泌因子過(guò)表達(dá)或鄰近癌基 因被過(guò)度激活而導(dǎo)致的間接活化。已經(jīng)報(bào)道了一些人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞系表達(dá)數(shù)量各異的EGF 受體，從而影響Raf-I蛋白表達(dá)水平和Raf-I表達(dá)成高分子量形式的比率。為研究血清饑餓 和EGF刺激對(duì)Raf-I蛋白的影響，在T47D、BT474和MDA-MB231細(xì)胞系中進(jìn)行免疫沉淀，從 細(xì)胞裂解液中分離Raf-I蛋白進(jìn)行免疫印跡分析。根據(jù)EGF刺激細(xì)胞后對(duì)[3H]胸腺嘧啶 的整合檢測(cè)DNA合成，以此反映細(xì)胞循環(huán)周期情況。在所有被研究的三種乳腺癌細(xì)胞系中， Raf-I蛋白以70kDa和74kDa兩種分子結(jié)合的形式存在。三個(gè)細(xì)胞系中的Raf-I水平類(lèi)似， 而且似乎與細(xì)胞表面EGF受體表達(dá)無(wú)關(guān)。即使經(jīng)過(guò)血清饑餓，大多數(shù)Raf-I蛋白是以74kDa 形式存在。EGF處理后的細(xì)胞中Raf-I能發(fā)生微弱的從低分子量到高分子量形式的轉(zhuǎn)變。 EGF刺激后能顯著增加[3H]胸腺嘧啶的整合。74kDa或活化形式的Raf-I蛋白激酶在所 研究的乳腺癌細(xì)胞系中基線表達(dá)水平上升，這意味著蛋白激酶被組成性激活，也說(shuō)明Raf-I 蛋白在乳腺癌發(fā)生中的作用有待進(jìn)一步調(diào)查。乳腺癌疾病進(jìn)展的特征之一即為從激素依賴 型到激素非依賴型的轉(zhuǎn)變，其中涉及一些細(xì)胞變化，這已成為乳腺癌治療的一個(gè)主要問(wèn)題。 ER陽(yáng)性的MCF-7人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞中Raf組成性活化表達(dá)導(dǎo)致雌激素非依賴型生長(zhǎng)，說(shuō)明通 過(guò)Raf的生長(zhǎng)因子信號(hào)途徑的激活使乳腺癌細(xì)胞在雌激素缺乏條件下具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。這一 發(fā)現(xiàn)突顯了多層面抑制方法的重要性，這一方法能夠促進(jìn)當(dāng)其中一個(gè)靶基因缺失/突變后 的臨床應(yīng)用效率。Raf激酶抑制蛋白(RKIP)最初被認(rèn)為是Raf/有絲裂原(mitogen)活化 蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路的第一生理性抑制劑。這一通路可以調(diào)節(jié)基本 的細(xì)胞功能，包括那些腫瘤細(xì)胞的破壞作用，例如增殖、轉(zhuǎn)化、存活和轉(zhuǎn)移。近來(lái)，細(xì)胞和動(dòng) 物模型系統(tǒng)的研究表明RKIP極可能是一種候選的轉(zhuǎn)移抑制劑。臨床研究顯示，在人類(lèi)乳腺 癌中，RKIP是一個(gè)轉(zhuǎn)移抑制基因，轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)其表達(dá)量下降。RKIP的表達(dá)與乳腺癌發(fā)生和 預(yù)后的其他一些標(biāo)志無(wú)關(guān)。因此，抑制Raf-I可能會(huì)控制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。mTOR激酶在乳腺癌中的作用哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)途徑中的一個(gè)色氨酸-蘇氨酸激酶成員，參與包括轉(zhuǎn)錄和翻譯在內(nèi)的多種生物 學(xué)功能。在Akt/PI3K信號(hào)途徑中，mTOR是一個(gè)下游調(diào)節(jié)子，對(duì)細(xì)胞的生存起重要作用。在 乳腺癌中，這一途徑能被諸如生長(zhǎng)因子受體家族的HER或ErbB、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體和 雌激素受體等膜受體激活。有證據(jù)表明，Akt能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的存活，并使細(xì)胞對(duì)曲妥珠 單抗(trastuzumab)和他莫昔芬(tamoxifen)等化療產(chǎn)生抵抗。雷帕霉素是靶向這一途徑 的特異性mTOR拮抗劑，阻斷下游信號(hào)成分，導(dǎo)致細(xì)胞停留在Gl期。使用靶向Akt/PI3K途 徑的mTOR拮抗劑可能增加乳腺癌治療的效果。
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總之，EGFR、Raf_l和mTOR三個(gè)基因的產(chǎn)物均是乳腺癌發(fā)生過(guò)程中的重要蛋白質(zhì)， 它們?cè)谌橄侔┲械淖饔靡约霸谀[瘤信號(hào)傳導(dǎo)途徑中所起的作用各不相同，EGFR是具備酪氨 酸激酶活性的細(xì)胞表面受體，Raf-I是MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路中一種MAP3K激酶并與G蛋 白的信號(hào)偶聯(lián)相關(guān)，而mTOR在被AKT磷酸化后激活，這些均與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。通過(guò)siRNA抑制基因作為替代治療手段分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)的進(jìn) 步使我們更進(jìn)一步了解了癌癥的基因調(diào)控機(jī)制。因而，諸如siRNA等新技術(shù)的建立并在動(dòng) 物模型中測(cè)定對(duì)疾病治療的效果，這些疾病包括但不限于癌癥?；虺聊椒?，如反義技 術(shù)和核酶(ribozyme)，被證明可以下調(diào)疾病相關(guān)基因從而導(dǎo)致乳腺癌病人治療方法上的轉(zhuǎn) 移。RNA干擾(RNAi)是一種序列特異性的RNA降解過(guò)程，理論上這一方法能相對(duì)容 易和直接的抑制(或沉默)任何具有同源序列的基因。天然發(fā)生的RNA干擾中，一條雙鏈 RNA(dsRNA)被名為Dicer的RNA酶III (RNase III)/解旋酶蛋白切割成小的干擾RNA分 子(siRNA)，這是一種19-27個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的、3’末端含有2個(gè)堿基突出的雙鏈RNA。接 著，siRNA整合進(jìn)入一個(gè)名為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的多組分核酶中，siRNA中的一 條鏈保持與RISC連接，并將復(fù)合物引導(dǎo)到與RISC中引導(dǎo)ss-siRNA鏈序列互補(bǔ)的RNA上， siRNA指導(dǎo)核酶消化RNA，導(dǎo)致目標(biāo)RNA的斷裂。最近的研究揭示利用化學(xué)合成的21-27個(gè) 堿基的siRNA在哺乳動(dòng)物中具有RNAi效果，表明siRNA雜交(末端或者中部)的熱力學(xué)穩(wěn) 定性對(duì)分子的功能具有重要的作用。有關(guān)RISC、siRNA分子和RNAi的更多細(xì)節(jié)特征在大量 的、數(shù)量不斷上升的發(fā)表文獻(xiàn)中都有描述。通過(guò)RNAi下調(diào)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)在實(shí)驗(yàn)室取得了很大成功，顯示了利用化 學(xué)合成siRNA或者內(nèi)源性表達(dá)siRNA進(jìn)行臨床治療應(yīng)用的巨大潛力。內(nèi)源性siRNA首先使 用表達(dá)載體(質(zhì)?；蛘卟《据d體)表達(dá)成小的發(fā)卡RNA(shRNA)，接著被Dicer切割成功能 性siRNA。通常認(rèn)為siRNA對(duì)于治療人類(lèi)疾病特別是病毒感染性疾病方面大有希望。目前， 不大可能利用生物信息學(xué)手段高度可信的分析針對(duì)病毒基因組序列(siRNA的靶序列一般 長(zhǎng)度為16-30個(gè)堿基)的每一個(gè)siRNA。每一個(gè)候選的siRNA都需要合成并通過(guò)功能性試 驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，確保取得預(yù)期的靶基因沉默效果。相應(yīng)的，不存在一種通用的設(shè)計(jì)siRNA寡聚 核苷酸分子的方法能夠確保特異性改變給定的mRNA的表達(dá)。siRNA體內(nèi)運(yùn)載盡管siRNA雙鏈具有相對(duì)穩(wěn)定的化學(xué)特性，但是所帶負(fù)電荷使 得其難以自身進(jìn)入細(xì)胞并達(dá)到有效治療劑量。而且siRNA的分子量小，在給藥后將很快從 體循環(huán)中被清除。如何盡快解決系統(tǒng)給藥這一產(chǎn)業(yè)瓶頸難題已成為小干擾核酸藥物能否 在臨床廣泛使用的關(guān)鍵所在。目前就核酸體內(nèi)傳輸常用的方法分病毒和非病毒兩大類(lèi)。 核酸干擾產(chǎn)業(yè)界則大多著重于非病毒運(yùn)載工具的研發(fā)。這包括各種納米顆粒liposome、 Dendrimers, Polymer, Quantum dots等等。盡管陽(yáng)離子脂質(zhì)體仍然是目前最為常用的非 病毒運(yùn)載系統(tǒng)，其他納米顆粒的應(yīng)用也日益廣泛。在比較了眾多非病毒運(yùn)載系統(tǒng)后，HK Polymer(聚合物)運(yùn)載系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢(shì)。(1)可生物化降解，(2)因此毒性低，(3)活性 受血清干擾的程度低，(4)容易打破內(nèi)質(zhì)體(組氨酸的近中性緩沖能力)。綜上所述，如果能夠在RNA水平通過(guò)siRNA抑制一個(gè)或多個(gè)與乳腺癌發(fā)生密切相 關(guān)基因的表達(dá)，例如通過(guò)siRNA抑制EGFR、Raf-I激酶和mTOR激酶這三個(gè)靶標(biāo)中的一個(gè)或 多個(gè)，或者抑制EGFR、Raf-l和mTOR信號(hào)途徑中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)，這將會(huì)是一種極具吸引力的癌癥治療方法，不僅對(duì)乳腺癌的治療領(lǐng)域產(chǎn)生更大的影響，甚至還有可能對(duì)治療乳腺 癌以外的其他相關(guān)疾病產(chǎn)生影響。進(jìn)一步的，通過(guò)siRNA抑制EGFR、Raf-I激酶和mTOR激酶這三個(gè)靶標(biāo)中的一個(gè)或 多個(gè)，或者在mRNA水平抑制EGFR、Raf-I和mTOR信號(hào)途徑中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)，聯(lián) 合使用一些不同的抗癌試劑，這種新的癌癥治療方法可能將會(huì)更加有效。另外，如果能夠通過(guò)siRNA同時(shí)抑制EGFR、Raf_l激酶和mTOR激酶這三個(gè)靶標(biāo)，或 者在mRNA水平同時(shí)抑制EGFR、Raf-l和mTOR信號(hào)途徑中的所有靶標(biāo)，治療癌癥的效果可能 也會(huì)更好。本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其中包含了至少一種能夠與單鏈RNA分子結(jié)合的 siRNA (小干擾雙鏈寡核苷酸)分子，所述的單鏈RNA分子為mRNA分子或micro-RNA (miRNA) 分子，這些mRNA分子編碼的是能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤發(fā)生、抗細(xì)胞凋亡的多肽 或蛋白質(zhì)，而miRNA分子是能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成和腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)分子。優(yōu)選的，所述的mRNA分子所對(duì)應(yīng)的編碼基因選自促癌發(fā)生途徑的基因、促血管 生成通路的基因、促細(xì)胞增殖路徑的基因或抗細(xì)胞凋亡路徑的基因。更優(yōu)選的，本發(fā)明的藥物組合物為包含了至少三種siRNA分子的siRNA雞尾酒藥 物組合物。更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的至少三種siRNA分子所結(jié)合的mRNA對(duì)應(yīng)的編碼基因包括 了促癌發(fā)生途徑基因、促血管生成通路基因、促細(xì)胞增殖路徑基因或抗細(xì)胞凋亡路徑基因 中的至少任意三種。例如，這些siRNA分子所結(jié)合的mRNA對(duì)應(yīng)的編碼基因包括了 Raf-I通 路基因、EGF受體途徑基因、mTOR途徑基因。上述的siRNA雞尾酒藥物組合物中，至少包括三種siRNA分子，每種siRNA分子至 少能與一種mRNA分子相結(jié)合，且每種mRNA分子至少能編碼一種蛋白。可以根據(jù)需要調(diào)整上述的siRNA雞尾酒藥物組合物中的各種siRNA分子的比例， 例如可以根據(jù)患者病情的需要、各種siRNA分子的作用及效力來(lái)決定合適的siRNA分子組 成比例。若由三種siRNA組成，組成比例可以是1 1 1，也可以是1 1.5 0. 5或 0. 5 0. 5 2。上述的siRNA雞尾酒藥物組合物中，至少包含三種siRNA分子，每種siRNA分子既 能夠與人mRNA分子結(jié)合，又能夠與鼠mRNA分子結(jié)合，所述的鼠mRNA分子與人mRNA分子編 碼相同或相似的蛋白。上述的既能夠與人mRNA分子結(jié)合，又能夠與鼠mRNA分子結(jié)合的siRNA分子選自能夠與編碼VEGF蛋白的mRNA分子結(jié)合的siRNA分子(正義鏈 5，-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3，，反義鏈5，-UGUAUGUGGGUGGGUGUGUCUACAG-3，；)、能夠與編碼EGFR蛋白的mRNA分子結(jié)合的siRNA分子(正義鏈 5，-CCAUCGAUGUCUACAUGAUCAUG⑶-3，，反義鏈5，-ACCAUGAUCAUGUAGACAUCGAUGG-3，；)、能夠與編碼Cox-2蛋白的mRNA分子結(jié)合的siRNA分子(正義鏈 5，-G⑶CUGGUGCCUG⑶CUGAUGAU⑶-3，，反義鏈5，-ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC-3，；)、能夠與編碼mTOR蛋白的mRNA分子結(jié)合的siRNA分子(正義鏈 5，-CAGGCCAUCACCUUCAUCUUCAA⑶-3，，反義鏈5，-ACUUGAAGAUGAAG⑶GAUGGCCUG-3，；)、能夠與編碼Raf-I蛋白的mRNA分子結(jié)合的siRNA分子(正義鏈
65，-GGCUACAA⑶UCCACCAGCAUUGUU-3，，反義鏈5，-AACAAUGCUGGUGGAACUUGUAGCC-3，；)、能夠與編碼HIF-I蛋白的mRNA分子結(jié)合的siRNA分子、或能夠與編碼Her-2蛋白的mRNA分子結(jié)合siRNA分子。優(yōu)選的，上述的既能夠與人mRNA分子結(jié)合，又能夠與鼠mRNA分子結(jié)合的siRNA分 子選自能夠與編碼EGFR蛋白的mRNA分子結(jié)合的siRNA分子(正義鏈5，CCAUCGAUGUCUACAUGAUCAUG⑶-3，，反義鏈5，-ACCAUGAUCAUGUAGACAU CGAUGG-3’ ；)、能夠與編碼mTOR蛋白的mRNA分子結(jié)合的siRNA分子(正義鏈 5，CAGGCCAUCACCUUCAUCUUCAA⑶-3，，反義鏈5，-ACUUGAAGAUGAAG⑶GAUGGCCUG-3，；)、能夠與編碼Raf-I蛋白的mRNA分子結(jié)合的siRNA分子(正義鏈 5，GGCUACAA⑶UCCACCAGCAUUGUU-3，，反義鏈5，AACAAUGCUGGUGGAACUUGUAGCC-3，；)、能夠與編碼HIF-I蛋白的mRNA分子結(jié)合的siRNA分子、或能夠與編碼Her-2蛋白的mRNA分子結(jié)合siRNA分子。上述的既能夠與人mRNA分子結(jié)合，又能夠與鼠mRNA分子結(jié)合的siRNA分子也可 以選自能夠抑制 VEGF、EGFR、Raf-I、mTOR、Her-2, HIF-U Cox_2、PDGFa, ΜΜΡ-2 或 ΜΜΡ-9 基 因的表達(dá)的序列。優(yōu)選表1至表6中的序列。上述的能夠與單鏈RNA分子結(jié)合的siRNA分子優(yōu)選長(zhǎng)度為25個(gè)堿基對(duì)的 dsRNA(雙鏈寡聚核苷酸)。優(yōu)選的，其兩端均為平末端或均為粘末端?；蛘咂湟欢藶槠侥?端，另一端為粘末端。上述的能夠與單鏈RNA分子結(jié)合的siRNA分子，其可以是沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的，也 可以是在個(gè)別核苷酸水平或主鏈核苷酸水平上經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的。上述的能夠與單鏈RNA分子結(jié)合的siRNA分子，其中可以含有免疫激活結(jié)構(gòu)域的 序列。所述的免疫激活結(jié)構(gòu)域的序列，可以為序列5’ -UGUGU-3’或序列5’ -GUCCUUCAA-3’。 進(jìn)一步優(yōu)選，可以誘導(dǎo)THl途徑的免疫反應(yīng)的免疫激活結(jié)構(gòu)域的序列。上述的能夠與單鏈RNA分子結(jié)合的siRNA分子，其中可以包含有DNA免疫激活結(jié) 構(gòu)域序列。所述的DNA免疫激活結(jié)構(gòu)域序列，可以為序列5’ -GGGxGG-3’(χ可以為A、Τ、G 或C)或CpG序列5 ‘ -GTCGTT-3 ‘。進(jìn)一步優(yōu)選，可以誘導(dǎo)THl途徑的免疫反應(yīng)的DNA免 疫激活結(jié)構(gòu)域的序列。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其中包含了至少一種上述的能夠與單鏈RNA分 子結(jié)合的siRNA分子以及藥學(xué)上可以接受的載體。所述的藥學(xué)上可以接受的載體選自鹽溶液、葡萄糖溶液、多聚陽(yáng)離子結(jié)合劑、陽(yáng) 離子脂質(zhì)體、陽(yáng)離子膠束、陽(yáng)離子多肽、親水性高分子聚合物、非天然陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子 聚縮醛、親水性高分子聚合醛、配體功能性陽(yáng)離子聚合物、配體功能親水聚合物、多肽聚合 體、脂類(lèi)化合物、乳劑、凝膠體、膠囊材料或金屬納米微粒。所述的這些載體可根據(jù)具體病患 情況來(lái)選擇。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的siRNA分子被載體包裹。例如，當(dāng)siRNA藥物被納米微粒包 裹后，抗癌活性大大增強(qiáng)。所述的載體優(yōu)選鹽溶液、葡萄糖溶液、多肽聚合體、多聚陽(yáng)離子結(jié)合劑、陽(yáng)離子脂質(zhì)體、陽(yáng)離子膠束、陽(yáng)離子多肽、親水性高分子聚合物、非天然陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子聚縮 醛、親水性高分子聚合醛、配體功能性陽(yáng)離子聚合物或配體功能親水聚合物中任意一種。所述的載體可以為可生物降解聚酯，如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚(乳 酸_乙醇酸)(PLGA)、聚酰胺(PAMAM)樹(shù)枝狀聚合物、聚乙二醇化的PEI。所述的多肽聚合體為可生物降解的組氨酸_賴氨酸聚合物，可以與SiRNA分子結(jié) 合形成直徑大約為100-400納米微粒。所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體優(yōu)選DOTAP, DOPE、DC-Chol/DOPE, DOTMA, D0TMA/D0PE 等。上述的本發(fā)明的藥物組合物可以治療或預(yù)防乳腺癌、頭頸部癌、非小細(xì)胞型肺癌、 宮頸癌、肝細(xì)胞癌等，也可以抑制這些癌癥腫瘤的發(fā)生?？梢栽趧?dòng)物模型上進(jìn)行檢測(cè)本發(fā)明的藥物組合物，例如在鼠移植瘤模型上。本發(fā)明還提供了一種給藥方法，將包含了至少一種上述的能夠與單鏈RNA分子結(jié) 合的siRNA分子以及藥學(xué)上可以接受的載體的藥物組合物給需要的個(gè)體使用。優(yōu)選的，在將上述的藥物組合物給需要的個(gè)體使用之前、同時(shí)或之后，給所述個(gè) 體聯(lián)合使用其他的抗癌藥物。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物與 Avastin聯(lián)合使用。本發(fā)明的siRNA藥物組合物還可以為包括至少一種能夠與單鏈RNA分子結(jié)合的 siRNA分子，每種所述的siRNA分子能夠抑制促炎基因、促血管生成基因、促細(xì)胞分裂途徑 基因、病毒感染基因組RNA或病毒感染基因中至少一種的表達(dá)。優(yōu)選的，抑制促血管生成基 因、促炎基因、抗細(xì)胞凋亡基因中至少一種的表達(dá)。綜上所述，本發(fā)明提供了在同一治療中靶向多個(gè)疾病控制基因的siRNA雞尾酒治 療方法。本發(fā)明使用的RNAi試劑，如siRNA寡聚核苷酸，是具有相同的來(lái)源和化學(xué)制備過(guò) 程而有相似的化學(xué)性質(zhì)，由四種類(lèi)型的核苷酸構(gòu)成不同序列。我們已經(jīng)研究出一種治療乳 腺癌的多靶標(biāo)RNA干擾(RNAi)雞尾酒療法。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，所設(shè)計(jì)的siRNA雞尾酒通過(guò) 對(duì)三個(gè)靶基因，EGFR、Raf-I和mTOR進(jìn)行同時(shí)抑制的作用方式來(lái)達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療 目的。當(dāng)siRNA雞尾酒在被納米微粒包裹后使用，其抗癌活性大大增強(qiáng)。此外，siRNA雞尾 酒在與其它藥物聯(lián)合使用時(shí)，表現(xiàn)出提高傳統(tǒng)癌癥療法的治療效果，譬如與Avastin聯(lián)合 使用。本發(fā)明提供的siRNA雞尾酒藥物還可用于其它類(lèi)型的治療，包括腦癌、頭頸部癌、非 小細(xì)胞型肺癌、宮頸癌、肝細(xì)胞癌和乳腺癌等。通過(guò)同時(shí)作用于這些疾病的多個(gè)方面，從而 有效地達(dá)到治療目的。發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明使用多靶標(biāo)RNA干擾(RNAi)雞尾酒治療癌癥。首先在細(xì)胞水平通過(guò)RT-PCR 和ELISA分析多靶標(biāo)siRNA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的基因下調(diào)效率，檢測(cè)(TUNEL試驗(yàn))其他 的細(xì)胞表型變化(例如凋亡情況)，確定不同細(xì)胞系之間的可能差異。一旦針對(duì)EGFR、Raf-l 和mTOR的siRNA確定，我們將著重分析作為醫(yī)藥活性中間體(API)的siRNA的聯(lián)合應(yīng)用方 式，并在鼠模型中進(jìn)行測(cè)定。此處所討論的例子和優(yōu)點(diǎn)并不一定為首次出現(xiàn)。選擇靶向EGFR、Raf-I和mTOR的最有效的siRNA研究表明EGFR、Raf-I對(duì)于乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)非常重要，大量文獻(xiàn)研究還表明mTOR 是另外一個(gè)促進(jìn)乳腺癌發(fā)生的重要因子，因而也是siRNA治療的有效靶標(biāo)。為了確保每一 siRNA能有效抑制靶基因的表達(dá)，在使用電子計(jì)算機(jī)(in silico)設(shè)計(jì)用于體外體內(nèi)試驗(yàn)的SiRNA必須考慮下例關(guān)鍵因素(1)與靶序列有最佳的動(dòng)力學(xué)結(jié)合，(2)留有足夠的長(zhǎng)度 結(jié)合RISC，(3)具有人鼠同源特征，⑷通過(guò)blast搜索避免“脫靶”效應(yīng)，(5)能夠形成多 靶標(biāo)siRNA雞尾酒。在本發(fā)明中，我們根據(jù)人鼠同源的保守區(qū)域設(shè)計(jì)siRNA。這一方法確 保siRNA在鼠移植瘤模型產(chǎn)生效果時(shí)，也能應(yīng)用于人類(lèi)。這樣的siRNA能避免種群特異性 和細(xì)胞因子交叉反應(yīng)的困擾。此外，初步研究發(fā)現(xiàn)25個(gè)堿基對(duì)siRNA比21個(gè)堿基對(duì)siRNA 更有效，在未來(lái)的siRNA雞尾酒設(shè)計(jì)中，我們將使用25個(gè)堿基對(duì)的siRNA同時(shí)靶向EGFR、 Raf-I 禾口 mTORosiRNA分子序列的設(shè)計(jì)根據(jù)前述的基本規(guī)則設(shè)計(jì)siRNA，我們已經(jīng)建立了確定siRNA復(fù)合物的算法，即 (1)最佳的動(dòng)力學(xué)，(2)加強(qiáng)RISC結(jié)合活性，(3)人鼠同源，(4)在已有的知識(shí)產(chǎn)權(quán)數(shù)據(jù)庫(kù) 中搜索，(5) “脫靶”效應(yīng)最小化，以及(6)使用21、23、25、27個(gè)堿基長(zhǎng)度的序列。以這種網(wǎng) 頁(yè)為基礎(chǔ)的方式，我們能夠選出針對(duì)諸如EGFR、Raf-I和mTOR特定基因的最有效的siRNA 序列。以下列出針對(duì)EGFR、Raf-I和mTOR三個(gè)靶基因的siRNA的有義序列。表1 針對(duì)EGFR模板的s iRNA序列 表2 針對(duì)Raf-1模板的s iRNA序列 表3 針對(duì)mTOR模板的siRNA序列表5 針對(duì)HIF-Ialpha模板的siRNA序列 表6 針對(duì)HER2模板的s iRNA序列 體外檢測(cè)以下SiRNA的沉默活性。有義鏈序列如下hmEGFR-siRNA :5’ -GAUCAUG⑶CAA⑶GCUGGAUGAUA-3’hmVEGF-siRNA 5' -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’hmMMP9-siRNA 5' -CCAGUUUG⑶⑶CGCGGAGCACGGA-3’hmCox-2-siRNA :5，-G⑶CUGGUGCCUG⑶CUGAUGAUGU-3，hmPDGF-siRNA :5’ -GCCUGCUGCUCCUCGGCUGCGGAUA-3’對(duì)照組SiRNA序列來(lái)源于一種細(xì)菌基因組，與人和鼠基因組沒(méi)有同源性，其正義 鏈序列如下Cont-25-A 5‘ -gaggagccuucaggauuacaagauu-3‘。siRNA 雞尾酒(Cocktail)本發(fā)明的核心內(nèi)容是將設(shè)計(jì)好的并經(jīng)體外篩選的針對(duì)各種基因的siRNA以一定 的比例組合成siRNA雞尾酒。根據(jù)前述各基因在乳腺癌發(fā)生中的作用，每個(gè)基因都可能扮 演不同的角色，單獨(dú)抑制某一個(gè)基因的表達(dá)不一定能切斷乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，如果同時(shí)利用三種針對(duì)不同基因的SiRNA抑制相應(yīng)基因表達(dá)，理論上不但能具有協(xié)同效應(yīng)，使藥物更 有效果，同時(shí)還能在單獨(dú)某個(gè)SiRNA失效的情形下確保藥物療效。其中部分雞尾酒列舉如 下 雞尾酒1 hmEGFR-siRNA 5，-GAUCAUG⑶CAA⑶GCUGGAUGAUA-3，hmVEGF-siRNA 5' -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’hmMMP9-siRNA 5' -CCAGUUUG⑶⑶CGCGGAGCACGGA-3’雞尾酒2 hmEGFR-siRNA 5' -GAUCAUG⑶CAA⑶GCUGGAUGAUA-3’hmVEGF-siRNA 5' -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’hmCox-2-siRNA 5' -G⑶CUGGUGCCUG⑶CUGAUGAUGU-3，雞尾酒3 hmEGFR-siRNA 5' -GAUCAUG⑶CAA⑶GCUGGAUGAUA-3’hmVEGF-siRNA 5 ’ -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3 ’hmPDGF-siRNA :5，-GCCUGCUGCUCCUCGGCUGCGGAUA-3，H^mwmmm sirna雙鏈作為SIRNA雞尾酒的一部分有些SiRNA結(jié)構(gòu)域與陽(yáng)離子脂質(zhì)體或聚合物載體合用時(shí)，可能成為免疫刺激物 質(zhì)，這些結(jié)構(gòu)域包括(1)5’ -UGUGU-3’；(2)5’ -GUCCUUCAA-3’ 一種方法是使用包含這些結(jié)構(gòu) 域的25個(gè)堿基對(duì)的siRNA來(lái)介導(dǎo)的基因沉默，同時(shí)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。這些結(jié)構(gòu)域可以是靶標(biāo) mRNA序列的同源序列，或直接加到19個(gè)堿基對(duì)siRNA雙鏈上。將含免疫刺激結(jié)構(gòu)域的DNA寡核苷酸添加到siRNA雞尾酒一種不同的做法，是采取含有這些免疫刺激結(jié)構(gòu)域的DNA寡核苷酸，如CpG結(jié)構(gòu) 域5' -GTCGTT-3'等，或非CpG結(jié)構(gòu)域5' _GGGxGG_3'(其中χ是可以是A、C、G或Τ)。 這些DNA寡核苷酸可以添加至具有靶基因沉默和免疫刺激雙重功能的核苷酸雞尾酒中。這 種類(lèi)型的核酸雞尾酒裝入脂質(zhì)體或聚合物為基礎(chǔ)的納米微粒治療各類(lèi)疾病，包括乳腺癌。使用納米高分子微粒作為藥物載體系統(tǒng)導(dǎo)入靶組織SiRNA治療中最大的問(wèn)題就是導(dǎo)入障礙，在乳腺癌的治療中同樣如此。為此，我們 通過(guò)預(yù)篩選試驗(yàn)，從多種醫(yī)藥載體中選擇了 HKP多肽多聚體作為siRNA雞尾酒導(dǎo)入載體。選 定HKP是由HKP形成的納米顆粒具有增強(qiáng)滲透、滯留的能力，而且其中的組氨酸所具有的近 中性ρΗ等電點(diǎn)，當(dāng)經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞噬作用進(jìn)入內(nèi)涵體后，能通過(guò)ρΗ梯度效應(yīng)瓦解內(nèi)涵體，使所 攜帶的siRNA得以釋放。在初步研究中HKP-siRNA納米微粒的系統(tǒng)導(dǎo)入取得了顯著的抗腫 瘤效果。25個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度siRNA比21個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度siRNA更有效傳統(tǒng)的siRNA是19-23個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的粘性末端雙鏈RNA，導(dǎo)入體內(nèi)后不經(jīng)過(guò) Dicer作用直接啟動(dòng)RNA干擾過(guò)程，抑制基因表達(dá)。我們?cè)O(shè)計(jì)的siRNA為25個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度 的平末端的雙鏈結(jié)果，目的是進(jìn)一步模擬雙鏈RNA在體內(nèi)被Dicer處理的過(guò)程，更接近天然 RNA機(jī)制。本發(fā)明規(guī)定siRNA雞尾酒在實(shí)驗(yàn)和治療應(yīng)用中的下列重要特征(1) siRNA雞尾酒必須包含至少三種siRNA雙鏈，針對(duì)至少三個(gè)基因(不是同一基因的三種序列)按照治療所需的比率而組合。(2)設(shè)計(jì)SiRNA雞尾酒組合時(shí)，必須了解每個(gè)基因在系統(tǒng)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)組織中的背 景和作用，例如這些基因是在相同或不同的傳導(dǎo)通路中起作用。(3)雞尾酒中每個(gè)SiRNA雙鏈的化學(xué)性質(zhì)，從來(lái)源供給、生產(chǎn)過(guò)程、化學(xué)修飾、貯藏 條件和設(shè)計(jì)規(guī)程來(lái)說(shuō)，必須是相同的。(4)雞尾酒中每個(gè)SiRNA雙鏈都是25個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度。(5)因?yàn)镾iRNA雞尾酒針對(duì)多個(gè)基因，而單個(gè)細(xì)胞類(lèi)型通常不表達(dá)所有因子，所以 在細(xì)胞水平確定單個(gè)siRNA雙鏈的效用之后，必須在一個(gè)相關(guān)疾病模型中測(cè)試siRNA雞尾 酒的效果，這個(gè)模式可以是一個(gè)多細(xì)胞模型、一個(gè)組織模型或者一個(gè)動(dòng)物模型。(6)每個(gè)確定過(guò)的siRNA雞尾酒可以對(duì)付一種或更多的病理?xiàng)l件，治療一種或多 種類(lèi)型的疾病，如siRNA雞尾酒抑制炎癥、siRNA雞尾酒抗血管生成和siRNA雞尾酒針對(duì)自 身免疫，因?yàn)檫@些相同病理過(guò)程牽涉到不同的疾病發(fā)生。(7)盡管每個(gè)雞尾酒的定量給藥方案要根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或者治療要求來(lái)定，但 siRNA雞尾酒必須通過(guò)相同方式和路徑給藥。(8)每個(gè)siRNA雞尾酒可以單獨(dú)使用，或者是結(jié)合其他藥物，如小分子抑制劑、單 克隆抗體、蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)藥物、以及其他siRNA雞尾酒藥物。


圖1 分別比較兩種短小抑制核酸(siRNA)在結(jié)腸癌(DLD-I)和乳腺癌 (MDA-MB-435)細(xì)胞系敲低VEGF mRNA的活性。圖中示出了人VEGF的表達(dá)水平，左側(cè)為DLD-I 細(xì)胞(黑色素瘤)的結(jié)果，右側(cè)為MDA-MB-435細(xì)胞(乳腺癌)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中使用的不同 長(zhǎng)度siRNA及對(duì)照siRNA。首先在體外以RT-PCR從各自的6個(gè)候選siRNA中篩選出活性最 強(qiáng)的1個(gè)。然后再以各自活性最強(qiáng)的1個(gè)siRNA相互比較。結(jié)果表明平末端的25堿基對(duì) siRNA(25mer bluntend siRNA)的基因沉默效應(yīng)比粘末端的21堿基對(duì)siRNA(21mer blunt end siRNA)更好，尤其是當(dāng)siRNA用量在2. 0微克時(shí)。圖2 抗Raf-I的強(qiáng)效短小抑制核酸(siRNA)篩選結(jié)果。篩選抗Raf-I的 強(qiáng)效短小抑制核酸(siRNA)。用Q-RT-PCR在MDA-MB-231和鼠CT26細(xì)胞同時(shí)篩 選的結(jié)果顯示，在與對(duì)照基因Rigsl5標(biāo)準(zhǔn)化后，敲低活性最強(qiáng)的Raf-1-siRNA為 5，-GCCUGCUGCUCCUCGGCUGCGGAUA-3，。此后有關(guān)體外及體內(nèi)研究將都采用這一序列。圖3 抗mTOR的強(qiáng)效短小抑制核酸(siRNA)篩選結(jié)果。篩選抗mTOR的 強(qiáng)效短小抑制核酸(siRNA)。用Q-RT-PCR在MDA-MB-231和鼠CT26細(xì)胞同時(shí)篩 選的結(jié)果顯示，在與對(duì)照基因Rigsl5標(biāo)準(zhǔn)化后，敲低活性最強(qiáng)的mTOR-siRNA為 5，-G⑶CUGGUGCCUG⑶CUGAUGAUGU-3，.此后有關(guān)體外及體內(nèi)研究將都采用這一序列。圖4 抗EGFR的強(qiáng)效短小抑制核酸(siRNA)篩選結(jié)果。篩選抗EGFR的強(qiáng)效短小抑 制核酸(siRNA)。實(shí)驗(yàn)中使用的各種EGFR-siRNA。用Q-RT-PCR在MDA-MB-231和鼠CT26細(xì) 胞同時(shí)篩選的結(jié)果顯示，在與對(duì)照基因Rigsl5標(biāo)準(zhǔn)化后，敲低活性最強(qiáng)的EGFR-siRNA為 5，-GAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGAUA-3，。此后有關(guān)體外及體內(nèi)研究將都采用這一序列。圖5 抗VEGF的強(qiáng)效短小抑制核酸(siRNA)篩選結(jié)果。篩選抗VEGF的強(qiáng)效短小抑 制核酸(siRNA)。實(shí)驗(yàn)中使用的各種VEGF-siRNA。用Q-RT-PCR在MDA-MB-231和鼠CT26細(xì)胞同時(shí)篩選的結(jié)果顯示，在與對(duì)照基因Rigsl5標(biāo)準(zhǔn)化后，敲低活性最強(qiáng)的VEGF-siRNA為 5，-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3，。此后有關(guān)體外及體內(nèi)研究將都采用這一序列。圖6 =HKP多聚體與SiRNA在水溶液中混合后所形成之納米顆粒的掃描電鏡照片。 用于體內(nèi)siRNA傳輸?shù)膬深?lèi)HKP多聚體分別為H3K4b和HK73b。四分支的HK聚合多肽 H3K4b :R = [KHHHKHHHKHHHKHHHK] ；HK73b :R = [KHHHKHHHNHHHNHHHN] ；H =組氨酸；K =賴 氨酸；N=天門(mén)冬酰胺。圖7 熒光顯微鏡圖顯示的是Alexa Fluor 555熒光素標(biāo)記的siRNA的體內(nèi)分布 圖。靜脈注射后HKP-siRNA在體內(nèi)的分布情況。經(jīng)鱗狀細(xì)胞癌(1483)移植瘤模型小鼠的 尾靜脈注入熒光素標(biāo)記的HKP-siRNA(CT-2)之后，于不同時(shí)段采集各種組織，并制成新鮮 冰凍切片，然后用熒光顯微鏡觀察分析。放大倍數(shù)為400X。圖8 經(jīng)靜脈注入的HKP-siRNA納米微粒在小鼠鱗狀細(xì)胞癌(1483)移植瘤中的集 聚情況。靜脈注射HKP包裹得siRNA分子在頭頸鱗癌1483移植瘤中的集聚情況。經(jīng)鱗狀細(xì) 胞癌(1483)移植瘤模型小鼠的尾靜脈注入熒光素標(biāo)記的HKP-siRNA(CT-2)之后，于設(shè)計(jì)的 不同時(shí)段采集腫瘤組織，并制成新鮮冰凍切片，然后將熒光顯微鏡所得圖像進(jìn)行觀察分析。 放大倍數(shù)為400X。插入圖熒光素標(biāo)記的HKP-siRNA在腫瘤組織中的放大細(xì)節(jié)。圖9 靶向Raf-I的HKP-siRNA納米微粒的抗腫瘤效應(yīng)。HKP_siRNA(Raf-I)對(duì) MDA-MB-435移植瘤生長(zhǎng)的抑制。對(duì)荷有MBA-MD-435移植瘤的無(wú)胸腺裸鼠經(jīng)由尾靜脈注射 靶向Raf-I的HKP-siRNA納米顆粒。各組腫瘤體積大小(mm3)以平均值(η = 6)表示實(shí) 環(huán)為無(wú)處理組；倒置實(shí)三角為對(duì)照組(對(duì)照-siRNA)；空環(huán)為處理組(Raf-1-siRNA)。每次 測(cè)量在尾靜脈注射之前進(jìn)行。200克HKP與50克siRNA混合后經(jīng)尾靜脈注射，每4天注射 一次，共7次。經(jīng)比較Raf-I siRNA組與對(duì)照siRNA組的區(qū)別顯著。*號(hào)表示PD 0.01。 (單向方差分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與無(wú)處理組，Bonferroni' s t-test)。圖10 靶向EGFR的HKP_s iRNA納米微粒的抗腫瘤效應(yīng)。HKP_s iRNA (EGFR)對(duì) MDA-MB-435移植瘤生長(zhǎng)的抑制。對(duì)荷有MBA-MD-435移植瘤的無(wú)胸腺裸鼠經(jīng)由尾靜脈注射 靶向EGFR的HKP-siRNA納米微粒。各組腫瘤體積大小(mm3)以平均值(η = 6)表示菱形 為無(wú)處理組；方形為對(duì)照組(對(duì)照-siRNA)；三角形為處理組(EGFR-siRNA)。尾靜脈注射從 第10天起，每5天一次，共7次。*號(hào)表示PD 0.01。圖11 移植瘤中⑶31和Raf-I含量的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果。對(duì)經(jīng)過(guò)各種治療 處理的鼠移植瘤.樣本進(jìn)行如下組織化學(xué)研究1(上).蘇木精和伊紅染色:A-未治療組； B-對(duì)照組siRNA ；C-Raf-I siRNA治療組。2 (中).用HRP酶標(biāo)記Raf-I抗體對(duì)Raf-I表 達(dá)情況的免疫組化染色檢測(cè)D-未治療組；E-對(duì)照組siRNA ；F-Raf-I siRNA。3 (下).抗 ⑶31抗體對(duì)⑶31表達(dá)情況的免疫組化染色檢測(cè)(用于確定組織中血管數(shù)量)G-未治療 組；H-對(duì)照組siRNA; I-Raf-I siRNA。結(jié)果表明經(jīng)HKP-Raf-I siRNA處理后，腫瘤組織中 的Raf-I表達(dá)受到顯著抑制(圖F)；而且⑶31的表達(dá)也同時(shí)被顯著敲低。圖12 腫瘤增殖與凋亡狀態(tài)的研究結(jié)果。對(duì)經(jīng)過(guò)各種治療處理的鼠移植瘤樣本進(jìn) 行TUNEL試驗(yàn)1 (上).未染色對(duì)照A-未治療組；B-對(duì)照組siRNA ；C-Raf-I siRNA治療 組。2(下).細(xì)胞增殖標(biāo)志物的染色D-未治療組；E-對(duì)照siRNA ;F-Raf-1 siRNA。放大 倍數(shù)為100倍。所有樣本切片中隨機(jī)選取四個(gè)區(qū)域?qū)罴?xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。將治療組與對(duì)照 組和未治療組比較后進(jìn)行單因素方差分析(Bonferroni t檢測(cè))以說(shuō)明增殖和凋亡情況。經(jīng)分析，P < 0. 01。圖13 在CpG-OND誘導(dǎo)的小鼠眼結(jié)膜血管增生模型中單個(gè)siRNA與siRNA雞尾酒 治療功效的比較。siRNA雞尾酒療效的比較。SiLacZ-為靶向LacZ的siRNA、SiVEGF_為靶 向 VEGF 的 siRNA、SiVEGFRl-為靶向 VEGFRl 的 siRNA、Si VEGFR2-為靶向 VEGF R2 的 siRNA、 Mix-siRNA-為靶向 SiVEGF 加 SiVEGFRl 和 SiVEGFR2 的 siRNA 雞尾酒。結(jié)果顯示 siRNA 雞 尾酒的抗血管增生活性比靶向單個(gè)血管生成因子的siRNA更強(qiáng)。
具體實(shí)施例實(shí)驗(yàn)方法體外篩詵強(qiáng)效siRNAsiRNA的體外轉(zhuǎn)染體外細(xì)胞學(xué)方法是目前檢測(cè)siRNA抑制靶基因的活性的通 用初篩手段。兩株人細(xì)胞系MBA-MD-435、MBA-MD-231和兩株鼠細(xì)胞系NIH 3T3、C166將 培養(yǎng)于含10%胎牛血清和20mM谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基。使用LP2000 (LipofecAmine 2000，Invitrogen, CA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，簡(jiǎn)要步驟如下接種細(xì)胞于6孔板1 X IO5個(gè)/孔/2ml DMEM，培養(yǎng)過(guò)夜；使用0. 2ml無(wú)血清培養(yǎng)基(OptiMEM)分別稀釋siRNA (2 μ g)和轉(zhuǎn)染試劑 (Lipofectamine2000, 3 μ 1),兩者混勻后室溫靜置30分鐘，然后滴加到培養(yǎng)的細(xì)胞中。繼 續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后用RT-PCR和ELISA分別檢測(cè)分析靶基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況。RT-PCR 和 ELISA 檢測(cè)使用 RNeasy mini kit(Qiagen, Valencia, CA)，根據(jù)說(shuō)明 書(shū)進(jìn)行操作，從培養(yǎng)的細(xì)胞或腫瘤組織中抽提出總RNA。對(duì)于RT-PCR來(lái)說(shuō)，首先用cDNA合 成試劑盒(GE Healthcare, Chicago, IL)逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。然后用 BioRad 的 Real-time PCR System進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)EGFR、Raf-I和mTOR基因的轉(zhuǎn)錄情況的測(cè)定和分析。所用試劑均 來(lái)自BioRad，并根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。為了進(jìn)一步闡明EGFR、Raf-l和mTOR在蛋白質(zhì)水平 也被相應(yīng)的siRNA下調(diào)表達(dá)，對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞分別使用特定抗血清進(jìn)行ELISA來(lái) 分析靶蛋白下調(diào)表達(dá)情況。抗EGFR、Raf-l和mTOR的抗體分別從CalBiochem(San Diego, CA)、Abeam (Cambridge，ΜΑ)和 R&D (Minneapolis，MN)購(gòu)買(mǎi)。檢測(cè)siRNA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響細(xì)胞凋亡、自噬作用及增殖的分析使用Lipo2000試劑將針對(duì)EGFR、Raf-I和 mTOR的特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，收集細(xì)胞進(jìn)行TUNEL檢測(cè)、細(xì)胞自噬檢測(cè)和Ki_67檢測(cè)。 TUNEL檢測(cè)使用4%的多聚甲醛將細(xì)胞固定在蓋玻片上，加入0. 的Triton X-100溫 育，然后力口入 TUNEL 反應(yīng)混合液(Roche,Molecular Biochemicals, Penzberg, Germany), Hf 處室溫放置1小時(shí)，以確保異硫氰光酶素(FITC)-dUTP進(jìn)入DNA片段。根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行完 成操作后，使用熒光顯微鏡(Nikon，Eclipse E800)分析。細(xì)胞自噬檢測(cè)收集細(xì)胞后使用 4%的多聚甲醛固定，加入0. 的Triton X-100孵育進(jìn)行細(xì)胞自噬檢測(cè)，5% BSA(牛血清 白蛋白)封閉 1 小時(shí),GFP 抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)孵育 1 小時(shí) 后，加入 AlexaFluor 488 共價(jià)連接的二抗(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 Texas Red 共價(jià) 連接的鬼筆環(huán)肽，密封蓋玻片使用熒光顯微鏡檢測(cè)。Κ -67檢測(cè)對(duì)于細(xì)胞增殖分析，蓋玻 片收集細(xì)胞后加入0. 的Triton X_100溫育，5% BSA封閉1小時(shí)后使用抗增殖細(xì)胞核標(biāo) 志物Ki-67的多克隆抗體ab833(Abcam，Cambridge，·)孵育，接著使用Texas Red標(biāo)記的 抗兔抗體(VectorLaboratories，Burlingame, CA)孵育，密封后進(jìn)行熒光顯微鏡分析。配制組氨酸-賴氨酸共聚合物(HKP) -siRNA納米微粒
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HK聚合物的生物高分子聚合物由Ranin Voyager合成儀合成(馬里蘭大 學(xué))。在本研究中使用三種運(yùn)送siRNA的聚合物H3K8b、H3K(+H)4b、H3K(+G)4b。H3K8b 有8個(gè)末端分支，分子量為22922 ；H3K(+H)4b和H3K(+G)4b有4個(gè)末端分支，分子量 分別為10191和10539。這些HK聚合物結(jié)構(gòu)為R-K (R) -K (R) -K (R)，其中H3K8b的R = [HHHKHHHKHHHKHHH]2KH4NH4] ；H3K(+H)4b 的 R = [KHHHKHHHHKHH-HKHHH] ；H3K(+G)4b 的 R = [KHHHKHHHKGHHHKHHHG]。HK聚合物的命名法為1)對(duì)于H3K4b來(lái)說(shuō)，其主要的重復(fù)序列是末 端分支-HHHK-，因而此部分名為H3K，4b是指其分支數(shù)量；2)H3K(+H)4b中，4分支的H3K4b 末端插入了一個(gè)額外的組氨酸；3)H3K(+G)4b中，兩個(gè)甘氨酸散布在H3K4b末端分支主要結(jié) 構(gòu)域中；4)H3K8b，含有8個(gè)末端分支，主要末端序列為-HHHK-。為簡(jiǎn)單化我們將使用組氨 酸_賴氨酸聚合物H3K4b進(jìn)行重點(diǎn)研究。HKP =SiRNA 納米微粒的制備及檢測(cè):H3K4b (300 μ g)與 siRNA (75 μ g)混合(4 1 質(zhì)量比，聚合物siRNA)，用于荷瘤鼠的體內(nèi)導(dǎo)入。HKP載體置于D5W(5% Dextrose ； 375μ1)30 分鐘后，力口 7Κ 625μ1。 Ν4 Submicron Particle Size Analyzer(Beckman Coulter,Hialeah,FL)在90度角通過(guò)光散射檢測(cè)微粒直徑，使用儀器制造商提供的軟件通 過(guò)單峰分析得到平均直徑。每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)測(cè)定3次，并以“平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(mean士SD) ”的 方式表示。HK(100、200、300 或 400μ g，溶于 125μ 1 D5W)加入到 siRNA (50 μ g 溶于 125 μ 1 D5W)中，使用Vortex mixer快速混合。室溫靜置30分鐘后，通過(guò)尾靜脈注射250 μ 1入每 只鼠中。已有充足證據(jù)支持HKP和siRNA對(duì)于體內(nèi)導(dǎo)入最有效的混合比例是4 1(質(zhì)量 比，wt/wt)，我們將在整個(gè)研究中始終采用這一比例。使用MBA-MD-435和MBA-MD-231細(xì)胞移植瘤模型驗(yàn)證最有效的siRNA 在成年雌 性裸鼠的雙側(cè)乳腺脂肪墊注射7X IO5個(gè)MBA-MD-435和MBA-MD-231細(xì)胞。用這些模型代替 MCF-7細(xì)胞等雌激素依賴模型是因?yàn)檫@些模型腫瘤細(xì)胞融合后移植瘤更具均一性。這些鼠 被分成8-10只一組，分別用于檢測(cè)經(jīng)HK聚合物傳遞后，EGFR、Raf-I和mTOR siRNA抑制腫 瘤生長(zhǎng)的效率。HKP-siRNA復(fù)合物(50 μ g的siRNA/腫瘤/注射，不同量的HK)將通過(guò)每隔 3-5天一次、總共4-5次的靜脈注射進(jìn)入鼠體內(nèi)。每次注射前以及最后一次注射后3天，使 用測(cè)徑儀在二維尺度測(cè)定腫瘤大小，體積計(jì)算公式為1/2X長(zhǎng)度X寬度2。HK聚合物可以介導(dǎo)siRNA的體內(nèi)傳遞由于增強(qiáng)了滲透、滯留能力或者pH梯度效 應(yīng)，在初步研究中HKP-siRNA納米微粒的系統(tǒng)傳輸取得了顯著的抗腫瘤效果。當(dāng)HKP水溶 液與siRNA水溶液以質(zhì)量比為4 1的比例混合后，會(huì)自動(dòng)形成100-200nm的微粒，形成的 HKP-siRNA溶液可用于靜脈注射。采用熒光(AlexaAFluor 555)標(biāo)記的siRNA來(lái)評(píng)估在系 統(tǒng)導(dǎo)入HKP-siRNA后，siRNA在體內(nèi)的分布情況。當(dāng)接種的MBA-MD-435腫瘤達(dá)到50mm3后， 靜脈注射導(dǎo)入HKP-AlexaFluor-555 siRNA。將鼠無(wú)痛致死后，準(zhǔn)備一些器官(肺、肝、脾、腎 和腦)及腫瘤的冷凍切片，這些切片的照片使用配置Z-馬達(dá)和3-D Velocity Restoration 分析軟件的Diaphot-TMD熒光顯微鏡獲得。測(cè)定腫瘤和其他組織中HKP-siRNA的半衰期， 在所有的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)每一組織樣品中siRNA的分布進(jìn)行監(jiān)測(cè)。針對(duì)EGFR、Raf-I和mTOR基因組合的siRNA雞尾酒的一些特性基本原理一旦確定了靶向EGFR、Raf-I和mTOR單個(gè)基因的最有效siRNA，我們 將在移植瘤模型中進(jìn)一步確定雞尾酒siRNA的聯(lián)合使用方式。實(shí)驗(yàn)分成幾條線路進(jìn)行，首 先在鼠模型中確定每種siRNA的抑制基線水平，無(wú)關(guān)序列的siRNA作為陰性對(duì)照。其次，每個(gè)靶基因(EGFR、Raf-I和mTOR)的siRNA聯(lián)合注射相同模型。這些實(shí)驗(yàn)中siRNA的體 內(nèi)傳遞均使用之前已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室建立的HK聚合物技術(shù)。在同樣的劑量和同樣的試驗(yàn)方 案(50 μ gsiRNA/200 μ g HKP/每劑量)下，通過(guò)與單個(gè)siRNA比較評(píng)估雞尾酒siRNA在 MBA-MD-435和MBA-MD-231細(xì)胞移植瘤中的協(xié)同作用效果。通過(guò)測(cè)定腫瘤體積反映腫瘤生 長(zhǎng)，收集組織樣品通過(guò)real-time PCR分析mRNA水平反映靶基因沉默效果。對(duì)單個(gè)siRNA 組和對(duì)照組、單個(gè)siRNA組和雞尾酒siRNA組進(jìn)行比較。用抗EGFR、Raf_l和mTOR的抗體， 以Western blot或ELISA檢測(cè)分析蛋白水平表達(dá)下調(diào)情況。siRNA雞尾酒的組分比例和劑量反應(yīng)曲線很明顯，在確定7 siRNA雞尾酒在移植 瘤模型中最有效的聯(lián)合使用方式，我們將繪制出治療的劑量曲線。首先要做的就是確定每 種siRNA在雞尾酒中的份量，這樣做的目的是使我們能夠明確在特定腫瘤模型中每個(gè)靶基 因的作用。類(lèi)似的，我們確定雞尾酒組分的最佳比例有利于我們更好的理解乳腺癌發(fā)生和 治療中這些關(guān)鍵因子的相互作用關(guān)系。其次，我們?cè)跀U(kuò)大劑量的過(guò)程中記錄劑量范圍和治 療結(jié)果。此外，確定siRNA雞尾酒每一組分含量和給藥劑量后，我們更需要在MBA-MD-435 和MBA-MD-231移植瘤模型中研究?jī)纱谓o藥的時(shí)間間隔。除了 mRNA和蛋白質(zhì)各自的半衰期 不一樣外，EGFR、Raf-l和mTOR三個(gè)基因的作用機(jī)制也不盡相同，因而1 1 1的比例不 一定是最好的選擇。因此，我們將以總量50yg的劑量、3天的給藥間隔，檢測(cè)2 1 1、 1 2 1和1 2 2三種比例。在實(shí)驗(yàn)程序段落描述的條件下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制劑量 曲線，劑量的上限和下限通過(guò)反應(yīng)曲線來(lái)描述，這將決定用于下一具體目標(biāo)的最有效劑量。 確定了每一 siRNA組分的最佳比例后，進(jìn)一步根據(jù)每次30、60、90、120或者是150 μ g的給 藥劑量確定劑量范圍。每次給藥時(shí)，制備足量的HKP-siRNA納米微粒和HKP-siRNA雞尾酒 納米微粒。每一劑量可能需進(jìn)一步稀釋，從而使所有注射量為相同的250μ1。注射的合適 劑量由此時(shí)的腫瘤生長(zhǎng)曲線作為主要指標(biāo)。siRNA雞尾酒的給藥方案在乳腺癌模型中確定了 siRNA雞尾酒最有效的劑量后， 下一步則是探討最佳的給藥時(shí)間表，以便為后續(xù)研究定下一個(gè)基礎(chǔ)，目標(biāo)是在乳腺癌鼠模 型中確定能夠維持抑制效果的最佳給藥時(shí)間間隔(以天為單位)。我們對(duì)每一實(shí)驗(yàn)組設(shè)定 三天、五天和七天的間隔，每組用足量的動(dòng)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。通過(guò)前述方法監(jiān)測(cè)抑制 效果，及時(shí)分析腫瘤體積，比較各組治療的結(jié)果，根據(jù)腫瘤抑制效果和siRNA半衰期為準(zhǔn)計(jì) 算最合適的給藥時(shí)間表。siRNA雞尾酒模式的安全性因?yàn)樵谏鲜龃_定給藥劑量范圍的實(shí)驗(yàn)中已使用了高 劑量(150 μ g)的藥物，所以我們將利用移植瘤模型，結(jié)合幾個(gè)毒性指標(biāo)來(lái)探討HKP包裹 siRNA的毒性。分別檢測(cè)每種siRNA藥物(EGFR、Raf-I和mTOR)在以各自的最小劑量與 HKP混合后的毒性。監(jiān)測(cè)動(dòng)物的幾個(gè)毒性指標(biāo)存活率、體重和一般行為。siRNA藥物導(dǎo)入 前以及導(dǎo)入后，一周兩次稱量體重，持續(xù)35天。體重減輕被認(rèn)為是中毒的癥狀，如果在導(dǎo)入 siRNA5天內(nèi)觀察到體重減輕20%，則實(shí)驗(yàn)終止。每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物的非正常行為，如緊張和焦 慮等。siRNA給藥后的第4、第10和第35天，從每組中取出5只進(jìn)行尸體解剖，解剖時(shí)，除 了一般觀察，還需要對(duì)組織的部分或者全部進(jìn)行病理學(xué)分析，應(yīng)用臨床化學(xué)檢測(cè)手段來(lái)分 析血細(xì)胞和肝臟酶的水平。在兩個(gè)不同動(dòng)物模型中，siRNA雞尾酒藥物治療與單克隆抗體藥物Avastin的聯(lián) 合使用
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^Ml^已有研究表明不同的抗癌藥物聯(lián)合使用能夠更有效治療乳腺癌，對(duì)于 已經(jīng)擴(kuò)散的晚期乳腺癌更是如此。國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute)和東部 腫瘤協(xié)作組織(Eastern Cooperative Oncology Group,EC0G)聯(lián)合開(kāi)展了一項(xiàng)名為 E2100 的研究，以確定聯(lián)合治療是否對(duì)乳腺病人有益。為了確定siRNA抗腫瘤治療與已有抗腫瘤 藥物的協(xié)同效應(yīng)，初步研究中VEGFR2-siRNA與Avastin的聯(lián)合使用在DLD-I結(jié)腸癌模型中 取得了明顯的協(xié)同效果，我們將使用同樣的方案檢測(cè)包含EGFR、Raf-I和mTOR基因的雞尾 酒siRNA與Avastin的聯(lián)合應(yīng)用情況。值得期待的關(guān)鍵性一點(diǎn)是，Avastin是封閉VEGF的 拮抗劑藥物，而siRNA是基因表達(dá)抑制劑，這為兩者產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)奠定了理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)移棺荷瘤鼠分成5組，每組8-10只。80-90只鼠用來(lái)建立腫瘤模型以確 保有70只可用于試驗(yàn)。A組為程序?qū)φ战M，B組為HKP-對(duì)照siRNA組，C組只使用Avastin， D組只使用HKP-siRNA雞尾酒，而E組聯(lián)合使用Avastin和HKP-siRNA雞尾酒，F(xiàn)組只使用 Here印tin，G組聯(lián)合使用Here印tin和HKP-siRNA雞尾酒。為了避免注射給藥造成動(dòng)物創(chuàng) 傷，不在同一天同時(shí)注射Avastin和HKP-siRNA。HKP-siRNA的最佳劑量根據(jù)之前的研究確 定，而Avastin 5mg/kg的劑量也是根據(jù)之前的研究確定的。在與siRNA雞尾酒聯(lián)合使用時(shí) 可能會(huì)采用不同劑量的Avastin，這也將在預(yù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究。而本研究目的之一就是通 過(guò)聯(lián)合治療降低Avastin用量。給藥方案將建立在之前的給藥間隔和頻率基礎(chǔ)上，對(duì)鼠的 腫瘤體積連續(xù)監(jiān)測(cè)一個(gè)月，計(jì)算體積并對(duì)時(shí)間作圖。靶基因沉默后mRNA和蛋白質(zhì)水平使用 RT-PCR和Westernblot測(cè)定，收集血液樣品后檢測(cè)細(xì)胞因子誘導(dǎo)和其他生物標(biāo)志物改變情 況，同時(shí)進(jìn)行一系列組織學(xué)和免疫組化染色分析。免疫組化染餼分析為了評(píng)價(jià)治療效果和抗腫瘤活性，無(wú)論是MBA-MD-435還是 MBA-MD-231來(lái)源的腫瘤樣品，均使用Streck固定48小時(shí)后植入石蠟中，并對(duì)玻片上的腫 瘤切片脫蠟。對(duì)腫瘤切片進(jìn)行EGFR、Raf-I和mTOR的免疫組化分析，使用無(wú)水乙醇溶解的 3%的過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，接著在3%的山羊血清中室溫孵育30分鐘。 Biotin標(biāo)記的抗EGFR、Raf-l和mTOR的單克隆抗體(Santa Cruz)以1 100稀釋后加入 腫瘤部分，41°C孵育過(guò)夜，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Sti^ptavidin復(fù)合物(Vector， Burlingame,CA)孵育30分鐘。加入Chromagen的對(duì)苯二胺(DAB) 10分鐘，腫瘤切片脫水后 并使用網(wǎng)格蓋玻片計(jì)數(shù)。將單個(gè)siRNA治療組和對(duì)照組、單個(gè)siRNA治療組和雞尾酒siRNA 治療組進(jìn)行比較。為進(jìn)一步檢測(cè)siRNA雞尾酒和Avastin聯(lián)合方案的抗腫瘤效果，腫瘤切片(5 μ m) 二甲苯脫蠟和乙醇脫水后使用4%的福爾馬林固定過(guò)夜。使用IOmM的檸檬酸(pH = 6. 0) 煮沸抗原20分鐘后冷卻至室溫。使用無(wú)水乙醇溶解的3%的過(guò)氧化氫處理腫瘤切片10分 鐘，以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，接著在3%的山羊血清中室溫孵育30分鐘?？筀i-67 抗體 Ab-259 (Chemicon) 1 200 稀釋，CD31 (Cell Signal)以 1 100 稀釋后加入其中，室 溫放置1小時(shí)。接著加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(Histoscan HRP universal rabbit kit ；Biomeda, cat. No. 06-602)，室溫放置 30 分鐘，接著加入 Chromagen 的對(duì)苯二胺(DAB) 溫育10分鐘使顏色呈現(xiàn)，對(duì)腫瘤脫水后并使用網(wǎng)格蓋玻片計(jì)數(shù)，棕色代表陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)例及有益效果實(shí)施例一，25堿基對(duì)siRNA的基因敲低活性比同源21堿基對(duì)siRNA之更強(qiáng)。為了使siRNA引發(fā)RNA干擾過(guò)程更接近天然RNA干擾過(guò)程，我們?cè)O(shè)計(jì)了 25個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度平末端的siRNA，并在一株乳腺癌細(xì)胞和一株結(jié)腸癌細(xì)胞中進(jìn)行了檢測(cè)對(duì)比。從圖1所顯示的對(duì)比結(jié)果可知，25堿基對(duì)siRNA比21堿基對(duì)siRNA具有更強(qiáng)的基 因沉默活性。圖中用來(lái)比較的兩個(gè)siRNA是分別從各自6個(gè)候選siRNA中選擇出的最有效 者。然后利用Lipo2000試劑(Invitrogen，CA)體外轉(zhuǎn)染表達(dá)人VEGF的兩株細(xì)胞系(DLD-1， 結(jié)腸癌；MBA-MD-435,乳腺癌)，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)。無(wú)論是0. 3 μ g或2. 0 μ g劑量下，25 堿基對(duì)siRNA都比21堿基對(duì)siRNA表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制活性，特別是2. 0 μ g劑量下。這一實(shí)例證明我們?cè)O(shè)計(jì)的25堿基siRNA比傳統(tǒng)長(zhǎng)度的21堿基對(duì)siRNA活性更強(qiáng)， 也會(huì)更具治療效果。在下述實(shí)例所采用siRNA皆為25堿基對(duì)者。實(shí)施例二，選擇靶向EGFR、VEGF和Raf_l、mTOR的強(qiáng)效的siRNA。靶基因mRNA在細(xì)胞內(nèi)往往是以三級(jí)結(jié)構(gòu)的形式存在的。這就決定其序列上并非 任何部位都能與siRNA有效結(jié)合，而成為siRNA攻擊的靶點(diǎn)。因而快速地篩選出強(qiáng)效候選 siRNA成為siRNA藥物開(kāi)發(fā)的第一步。與其它核酸藥物同樣會(huì)遭遇的另一個(gè)潛在問(wèn)題是 由于種系區(qū)別，根據(jù)人類(lèi)基因順序設(shè)計(jì)并在體外測(cè)試所得到的侯選siRNA，其基因敲低活 性在后續(xù)臨床前小鼠疾病模型的檢測(cè)中未能得到驗(yàn)證。因此，如果能在siRNA設(shè)計(jì)時(shí)就考 慮到這一點(diǎn)，首先選擇人鼠同源序列作為設(shè)計(jì)模板，則可以避免這一沖突。圖2-圖3顯示了按照上述方法選擇靶向Raf-I，mTOR的強(qiáng)效siRNA的結(jié)果。8個(gè) siRNA轉(zhuǎn)染人乳腺癌腫瘤細(xì)胞系MDA-MB-431和CT26 (圖2、3)，24小時(shí)后，收集mRNA進(jìn)行 RT-PCR分析。根據(jù)基因沉默效果的定量分析(下半部的直方圖)選定作為未來(lái)體內(nèi)外研究 的siRNA雞尾酒的siRNA組分。圖4顯示，按同樣方法選擇的siRNA (抗EGFR)，都具有不同程度的基因敲低活性， 這不但反映在mRNA水平，而且也表現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平。圖5所顯示的結(jié)果表明，篩選既能在鼠F3細(xì)胞也能在人293細(xì)胞敲低VEGF表達(dá) 的siRNA，不僅理論上可行，而且得到實(shí)例操作的證實(shí)。同時(shí)沉默人和鼠VEGF的最有效的 VEGF-siRNA將作為siRNA雞尾酒的組分。上述實(shí)例說(shuō)明我們的體外siRNA篩選程序有效可行。實(shí)施例三，siRNA與HKP配制形成的納米微?？梢栽隗w內(nèi)抑制移植瘤的生長(zhǎng)。藥物運(yùn)輸歷來(lái)是一個(gè)難題，包括小分子藥物、單克隆抗體均是如此，而siRNA因?yàn)?更容易受到各種體內(nèi)因素的影響，所以這一個(gè)難題更成為臨床應(yīng)用開(kāi)發(fā)的最大障礙。為了 有效導(dǎo)入siRNA到靶組織，選擇合適的載體將是非常重要的一環(huán)。為此，我們選擇了雞尾酒 中的任意兩個(gè)siRNA進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)，在兩個(gè)動(dòng)物模型驗(yàn)證siRNA能否經(jīng)HKP等納米材料運(yùn) 載抵達(dá)腫瘤組織局部，并保持對(duì)腫瘤的抑制作用。為了排除HKP載體本身引起的抑制腫瘤 效果或者任意siRNA均可阻止腫瘤生長(zhǎng)這些可能性，設(shè)置了空載體對(duì)照和非特異性siRNA 對(duì)照組。圖9顯示系統(tǒng)注射HKP-Raf-I siRNA復(fù)合物入無(wú)胸腺M(fèi)BA_MD_435荷瘤鼠后，能顯 著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，P值小于0. 01。(未治療組-實(shí)心圓，對(duì)照組SiRNA-正三角形，Raf-I siRNA-空?qǐng)A環(huán)，*號(hào)表示P < 0. 01，統(tǒng)計(jì)處理采用將治療組與對(duì)照組或未治療組比較后進(jìn) 行單因素方差分析，Bonferroni t檢測(cè))。圖10顯示靜脈注射HKP-EGFR siRNA對(duì)無(wú)胸腺鼠人乳腺癌MBA-MD-435移植瘤生 長(zhǎng)的抑制效應(yīng)。試驗(yàn)在同樣條件下重復(fù)一次，結(jié)果重復(fù)性良好。通過(guò)方差分析(ANOVA)，ρ值小于0. 01。這一結(jié)果表明，靜脈注射HKP-EGFR-siRNA能抑制MBA-MD-435細(xì)胞誘導(dǎo)的移 植瘤生長(zhǎng)。上述兩個(gè)實(shí)例充分說(shuō)明，HKP多聚體是一種體內(nèi)運(yùn)載SiRNA有效的藥用載體。而 且通過(guò)我們的方法篩選得到的siRNA能在體內(nèi)有效的抑制腫瘤生長(zhǎng)。實(shí)施例四，組織學(xué)和免疫化學(xué)測(cè)試結(jié)果表明變化HKP-Raf-I siRNA納米微粒能明 顯地抑制Raf-I的表達(dá)以及腫瘤內(nèi)新生血管的生成。為了證明Raf-I siRNA體內(nèi)治療腫瘤的作用機(jī)制，我們利用組織學(xué)和免疫學(xué)手段 檢測(cè)我們?cè)O(shè)計(jì)的siRNA是否通過(guò)有效抑制靶標(biāo)，以及新生血管形成來(lái)阻止腫瘤生長(zhǎng)。圖11顯示的是移植瘤中⑶31和Raf-I含量的組織學(xué)和免疫化學(xué)分析結(jié)果。對(duì) 經(jīng)過(guò)各種處理的鼠腫瘤進(jìn)行蘇木精和伊紅染色(A 未治療組；B 對(duì)照組siRNA ；C =Raf-I siRNA)。免疫組化染色檢測(cè)Raf-I的表達(dá)情況(D 未治療組；E 對(duì)照組siRNA ；F =Raf-I siRNA)。二氨基聯(lián)苯底物與結(jié)合Raf-I的抗體顯示深褐色沉積。⑶31免疫組化染色確定各 組中血管數(shù)量(G 未治療組；H 對(duì)照組siRNA ；I =Raf-I siRNA)。圖12的TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果及Ki67染色結(jié)果顯示，在給予不同處理后腫瘤的增 殖與凋亡的狀況。比較不同的處理Raf-I SiRNA(C)、對(duì)照siRNA⑶以及未治療組誘導(dǎo)腫 瘤凋亡情況。鏡下可見(jiàn)經(jīng)Raf-I siRNA處理后，腫瘤組織中細(xì)胞凋亡明顯。同時(shí)對(duì)腫瘤增 殖的標(biāo)志物(Ki67，染成棕色)的檢測(cè)顯示Raf-I siRNA能顯著地抑制細(xì)胞增殖(D，未治療 組；E，對(duì)照siRNA ；F, Raf-I siRNA)。放大倍數(shù)為100倍。未治療組(黑色)、對(duì)照siRNA組 (紅色)及Raf-I siRNA組(綠色)鼠腫瘤中隨機(jī)選取四個(gè)區(qū)域計(jì)算活細(xì)胞數(shù)代表增殖和凋 亡情況。P < 0. 01，將治療組與對(duì)照組和未治療組比較后進(jìn)行單因素方差分析(Bonferroni t檢測(cè))。以上實(shí)例結(jié)果表明，通過(guò)上述方法篩選出的siRNA不僅能敲低特異mRNA和蛋白質(zhì) 的表達(dá)量，而且這些靶點(diǎn)基因可能是影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。實(shí)施例五，HKP-siRNA納米微粒能將具有活性的Raf-l_siRNA傳遞到達(dá)腫瘤局部 并行使其抑制新生血管生成的功能。為了盡量減少藥物副作用，藥物的靶向?qū)雽?duì)于腫瘤的治療是非常重要的。為了 驗(yàn)證我們使用的HKP能夠?qū)iRNA分子靶向特異性導(dǎo)入腫瘤組織，我們使用頭頸鱗癌移植 瘤檢測(cè)了 HKP-siRNA靜脈注射給藥后藥物的分布情況。圖8顯示靜脈注射HKP包裹的siRNA分子在頭頸鱗癌1483移植瘤中的聚集情 況。圖像表明Alexa Fluor 555熒光素標(biāo)記的siRNA(CT-2)沉積在鼠組織和腫瘤中。這些 組織在指定時(shí)間收集，新鮮冷凍切片并使用熒光顯微鏡分析。放大倍數(shù)為400X。B:熒光 CT-2 (箭頭所指紅色沉積)在腫瘤中聚集在血管附近(棕色，CD31免疫標(biāo)記)。放大倍數(shù) 為400 X，嵌入框顯示siRNA細(xì)節(jié)。這一實(shí)例結(jié)果表明，除了在一些代謝活躍的器官外，siRNA能夠有效到達(dá)靶組織， 并且隨著時(shí)間而有所集聚。因此，HKP多聚體具備將siRNA有效傳遞到腫瘤局部的作用。實(shí)施例六，免疫刺激結(jié)構(gòu)域可以有效增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，增加對(duì)腫瘤的抵抗能 力。免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂也是腫瘤發(fā)生的因素之一，因而如果能夠在抑制腫瘤致病基因 的同時(shí)，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)、增強(qiáng)機(jī)體的抵抗能力，對(duì)于治療癌癥是非常有幫助的。為此，我們?cè)谠O(shè)計(jì)的SiRNA中特別加入了免疫激活結(jié)構(gòu)，并在動(dòng)物模型中驗(yàn)證這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ跈C(jī)體 免疫系統(tǒng)的影響。實(shí)施例七，siRNA雞尾酒比單個(gè)siRNA治療效果更好。前述已經(jīng)說(shuō)明，理論上多個(gè)siRNA混合的雞尾酒將會(huì)取得比其中單獨(dú)一個(gè)更好的 治療效果，為了更進(jìn)一步證實(shí)這一理論成立，我們使用眼部血管增生鼠模型進(jìn)行了驗(yàn)證。將 三種 siRNA (siVEGFA、siVEGFRl 和 siVEGFR2)以1 1 1 比例混合，每個(gè) 3. 3 μ g。植入 CpG小顆粒后，給小鼠上述siRNA的治療，10微克單次尾靜脈給藥。給藥后第4天和第7天， 鏡下監(jiān)測(cè)角膜緣處的新血管形成情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。圖13表明，在CpG-OND誘導(dǎo)的小鼠角膜血管增生模型中，盡管所有三個(gè)單靶標(biāo) siRNA均可明顯抑制角膜血管增生，同時(shí)靶向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的多靶標(biāo)siRNA雞尾 酒的抗血管增生活性比靶向單個(gè)血管生成因子的siRNA更強(qiáng)。在植入CpG小顆粒后第4天， 與對(duì)照siRNA相比，三個(gè)單靶標(biāo)的siRNA均能夠顯著抑制角膜血管增生(P < 0. 05)，而含有 三種siRNA的雞尾酒抑制效果更好，相同劑量下新生血管減少60% (P < 0. 01)。在這一眼 部血管增生模型中我們觀察到了多靶標(biāo)雞尾酒siRNA的協(xié)同(累積)效應(yīng)。這一結(jié)果雖然在眼部血管模型中進(jìn)行，但為我們采用多靶標(biāo)siRNA雞尾酒治療乳 腺癌提供了間接的證據(jù)多靶標(biāo)雞尾酒siRNA比單一靶標(biāo)siRNA會(huì)更有效。
2權(quán)利要求
一種藥物組合物，其特征在于其中包含了至少一種能夠與單鏈RNA分子結(jié)合的siRNA(小干擾雙鏈寡核苷酸)分子，所述的單鏈RNA分子為mRNA分子或micro RNA(miRNA)分子，所述的mRNA分子編碼至少部分能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤發(fā)生、抗細(xì)胞凋亡的多肽或蛋白質(zhì)，所述的miRNA分子能夠作為調(diào)節(jié)分子來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成和腫瘤發(fā)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述的mRNA分子所對(duì)應(yīng)的編碼基 因選自促癌發(fā)生途徑的基因、促血管生成通路的基因、促細(xì)胞增殖路徑的基因或抗細(xì)胞凋 亡路徑的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物為包含了至少三種 siRNA分子的siRNA雞尾酒藥物組合物，所述的siRNA分子與mRNA分子結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的藥物組合物，其特征在于所述的mRNA分子所對(duì)應(yīng)的編 碼基因選自Raf-I通路基因、EGF受體途徑基因、mTOR途徑基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的至少三種siRNA分子所結(jié) 合的mRNA對(duì)應(yīng)的編碼基因包括了 Raf-I通路基因、EGF受體途徑基因、mTOR途徑基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于其中還包括藥學(xué)上可以接受的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述的載體為納米微粒，所述的 siRNA分子被載體包裹。
8.權(quán)利要求1、2、3、6中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物可以用于制備治療或預(yù)防乳腺癌、 頭頸部癌、非小細(xì)胞型肺癌、宮頸癌、肝細(xì)胞癌等的藥物或抑制這些癌癥發(fā)生的藥物。
9.一種給藥方法，其特征在于該方法包括將權(quán)利要求1所述的藥物組合物給需要的 個(gè)體使用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的給藥方法，其特征在于在將權(quán)利要求1所述的藥物組合物 給需要的個(gè)體使用之前、同時(shí)或之后，給所述個(gè)體聯(lián)合使用其他的抗癌藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療癌癥的多靶標(biāo)siRNA雞尾酒藥物組合物、及其給藥方法。該藥物組合物中包含至少一種siRNA分子，這些siRNA分子能夠與作為藥靶的單鏈RNA分子結(jié)合，這些單鏈RNA分子為mRNA分子或micro-RNA(miRNA)分子，這些mRNA分子所編碼的物質(zhì)可以是能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤發(fā)生、或抗細(xì)胞凋亡的多肽或蛋白質(zhì)，而miRNA分子是能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成和腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)分子。該藥物組合物可以用于治療或預(yù)防乳腺癌、腦癌、頭頸部癌、非小細(xì)胞型肺癌、宮頸癌、肝細(xì)胞癌等，也可以抑制這些癌癥腫瘤的發(fā)生。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101897982SQ200910115478
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2009年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月31日
發(fā)明者唐盛高, 徐軍, 楊宏鈞, 陸陽(yáng) 申請(qǐng)人:蘇州圣諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司