專利名稱：小葉蓮提取物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小葉蓮提取物，以及該提取物及其中的有效成分在制備治療乳腺癌藥物 中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7~10%， 嚴(yán)重地威脅著女性的健康和生命。我國近年來乳腺癌發(fā)病率正以每年3%的速度遞增，成為城 市中死亡率增長最快的癌癥，發(fā)病年齡也呈逐漸年輕化的趨勢。中藥預(yù)防和治療乳腺癌具有 獨(dú)特的療效，被越來越多地用于乳腺癌圍手術(shù)期、術(shù)后抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、晚期乳腺癌的治療、對 放化療增效減毒、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥、延長患者生存期和提高生活質(zhì)量等方面。
小葉蓮(Fructus Podophylli)為常用藏藥，中國藥典2005年版收載其來源為小檗科植物 桃兒七Potfop/^Z/wm/^jca"^ww Royle的干燥成熟果實(shí)。具有活血調(diào)經(jīng)功能，常用于治療多種 婦科疾病。但是目前關(guān)于小葉蓮的研究卻少見報(bào)道。
化學(xué)研究表明，小葉蓮的主要成分為鬼臼毒素類木脂素和黃酮類成分。其中，前者具有 較強(qiáng)的抗腫瘤和抗病毒等活性。
尚明英(尚明英，徐珞珊，蔡少青等.鬼臼類中藥及其木脂素類成分的藥效學(xué)研究.中草 藥.2002;31(08):722 724.)通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小葉蓮乙醇提取物對小鼠移植性肝癌(HepA) 和艾氏腹水癌(EAC)具有抑制作用，并證明根和根莖提取物以及小葉蓮提取物的活性均明 顯高于單體化合物(鬼臼毒素和去氧鬼臼毒素)。宗玉英(宗玉英.110種藏藥抗腫瘤體外篩 選實(shí)驗(yàn)研究.藥學(xué)實(shí)踐雜志.2000;18(05):290 291.)利用110種藏藥乙醇提取物對體外培養(yǎng)的 5種人體腫瘤細(xì)胞乳腺癌(BC1)、肺癌(Lul)、直腸癌(Co12)、 口腔上皮癌(KB)、前 列腺癌(LNCaP)及一種大鼠神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞(ASK)進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示小葉蓮乙 醇提取物對人口腔上皮癌、前列腺癌及大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有抑制作用。
以小葉蓮為主藥的中成藥主要包括十一味能消丸、二十五味鬼臼丸和紅花如意丸等，"十 一味能消丸"是中國藥典2005版收載中成藥(藏族驗(yàn)方)，功能化瘀行血，通經(jīng)催產(chǎn)。用于經(jīng) 閉，月經(jīng)不調(diào)，難產(chǎn)，胎盤不下，產(chǎn)后瘀血腹痛。"二十五味鬼臼丸"是傳統(tǒng)的藏醫(yī)古驗(yàn)方， 是藏醫(yī)治療各種婦科疾病的首選藥物和經(jīng)典良方，用于經(jīng)期疼痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮肌瘤、卵 巢囊腫、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、附件炎、陰道炎等，并可補(bǔ)血養(yǎng)顏。
綜上所述，傳統(tǒng)藏藥小葉蓮能夠治療多種婦科病，具有抗腫瘤作用，且毒性較小，具有很好的研究前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種小葉蓮提取物，以及該提取物及其中的有效成分在制備治療 乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提出的小葉蓮提取物的制備方法如下將小葉蓮干燥粉碎，以80% 95%乙醇回 流提取2 4次，每次0.5 2小時(shí)，回收乙醇，濃縮至60 8(TC時(shí)相對密度為1.05 1.30的浸 膏，即為小葉蓮提取物。
從小葉蓮中分離有效成分的步驟如下將小葉蓮提取物浸膏均勻分散至水中，分別用石
油醚、乙酸乙酯和水飽和正丁醇萃取，回收溶劑得到不同極性的萃取物；乙酸乙酯萃取部分 經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜(石油醚-丙酮或氯仿-甲醇洗脫)分別得到含有鬼臼毒素類木脂素和含有 黃酮類成分的流分。含有鬼臼毒素類木脂素的流分經(jīng)過C-18半制備液相(甲醇-水)進(jìn)一步 純化，得到鬼臼毒素(podophyllotoxin)、去氧鬼臼毒素(desoxypodophyllotoxin)禾卩4'-去甲 去氧鬼臼毒素(4'-demethyldesoxypodophyllotoxin);含有黃酮類成分的流分以乙酸乙酯為溶 劑反復(fù)重結(jié)晶或通過Sephadex LH-20純化、氯仿-甲醇洗脫，得到8-異戊烯基山柰酚 (8-prenylkaempfero1)和一個(gè)新化合物8，2'-二異戊烯基槲皮素3-甲醚(8,2'-diprenylquercetin 3-methyl ether )<=
鬼臼毒素為無色針晶，該化合物的光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(廖矛川，王有為，肖培根等.西藏八 角蓮的化學(xué)成分研究.武漢植物學(xué)研究.2002;20(1):71 74.)報(bào)道一致，故確定其為鬼臼毒素。
去氧鬼臼毒素為白色粉末，該化合物的光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(廖矛川，王有為，肖培根等.西 藏八角蓮的化學(xué)成分研究.武漢植物學(xué)研究.2002;20(1):71 74.)報(bào)道一致，故確定其為去氧 鬼臼毒素。
4'-去甲去氧鬼臼毒素為白色粉末，該化合物的光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(尚明英，李萍，李軍等. 藏藥小葉蓮的化學(xué)成分研究.中草藥.2000;31(08):569 571.)報(bào)道一致，故確定其為4'-去甲去
氧鬼臼毒素。
8-異戊烯基山柰酚為黃色針晶，該化合物的光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(ShenCC, Chang YS，HoLK. Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids. 1993;34(3):843 845.)報(bào)道一致， 故確定其為8-異戊烯基山柰酚。
8,2'-二異戊烯基槲皮素3-甲醚為黃色粉末，鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽性。HR-ESI-MS: m/z 453.19118 [M+H]+，給出分子式C26H2807。 ^-NMR、 13C-NMR、 HSQC和HMBC數(shù)據(jù)見表1。 該化合物為一新化合物，命名 為8,2'-二異戊烯基槲皮素3-甲醚。表l8，2'-二異戊烯基槲皮素3-甲醚的核磁數(shù)據(jù)Position'H-畫R (50函Hz， methan0l-i/4)"C-NMR (125MHz， methanol-^)HSQC (13C-NMR,ppm)HMBC (!3C-NMR,卯m)
2-161.8
3-140.3
4-180.4
5-160.7
66.26(1H，s)99.399.3106.2,107.9，160.7,163.1
-163.1
8-107.9
9-156.2
10-106.2
r-123,2
2,-129.4
3,-144.7
4,-148.3
5,6.75(1H, d, 8.5)113.2113.2123.2,144.7,148.3
6,6.78(1H，d, 8.5)122.5122.5129.4,148.3,161.8
r'3.32(2H,d, 7.0)22.422.4107.9,123.3,132.3,156.2,163.1
2"5.08(1H，m)123.3123.3107.9
3"-132.3
4"1.30(3H，s)17.717.7124.1,132.1
5"L57(3H,d, 1.0)25.925.9123.3,132.3
r"3.42(2H,d， 7.0)26.626.6123.2，124.1，129.4,132.1，144.7
2'〃5.01(1H,m)124.1124.1129.4
^ ,〃-132.1
4〃，1.48(3H,s)17.717.7123.3,132.3
1.42(3H,d， 1.5)25.725.7124.1,132.1
-OCH33.56(3H,s)60,960.9140.3
6本發(fā)明所述的化合物結(jié)構(gòu)式如下
化合物
鬼臼毒素
去氧鬼臼毒素
Ri
-OH
-H
4'-去甲去氧鬼臼毒素-H
R2 -Me -Me -H
8-異戊烯基山柰酚
OH O
8,2'-二異戊烯基槲皮素3-甲醚
小葉蓮提取物對小鼠移植性乳腺癌的抑制作用實(shí)驗(yàn)表明，小葉蓮提取物對小鼠移植性乳 腺癌有明顯的抑制作用。
小葉蓮提取物和各化合物對人乳腺癌細(xì)胞的抑制作用實(shí)驗(yàn)表明，小葉蓮提取物和各化合 物均具有抑制乳腺癌細(xì)胞的作用，而鬼臼毒素類木脂素和異戊烯基黃酮類成分配伍使用具有
協(xié)同作用，能夠顯著提高其抑制乳腺癌細(xì)胞的效果。
因此，本發(fā)明提出含有所述鬼臼毒素類木脂素中的1-3個(gè)以及異戊烯基黃酮中的1-2個(gè) 的藥物組合物在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選該藥物組合物中鬼臼毒素類木脂素和異
戊烯基黃酮的總重量比為1: 1 1: 6。例如其選擇可以是去氧鬼臼毒素和8-異戊烯基山柰酚，其重量比為l:l;或4'-去甲去氧鬼臼毒素和8-異戊烯基山柰酚，其重量比為1:4;或鬼臼 毒素、去氧鬼臼毒素、4'-去甲去氧鬼臼毒素、8-異戊烯基山柰酚和8，2'-二異戊烯基槲皮素3-甲醚，其重量比為2:4:1:4:32。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體實(shí)施例，對本發(fā)明做出進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1
干燥小葉蓮藥材，粉碎后約18kg，以8倍量95%乙醇回流提取2次，提取時(shí)間分別為2 小時(shí)和1小時(shí)，回收乙醇，濃縮至7(TC時(shí)相對密度為1.10的浸膏約5.2kg，即為小葉蓮提取 物。
實(shí)施例2
干燥小葉蓮藥材，粉碎后以6倍量80%乙醇回流提取4次，提取時(shí)間為0.5，回收乙醇， 濃縮至60'C時(shí)相對密度為1.05的浸膏，即為小葉蓮提取物。
實(shí)施例3
將實(shí)施例1中所得提取物取約4.8kg，加IOL蒸餾水充分?jǐn)嚢柚镣耆珣腋『?，依次用石?醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇等體積萃取5次。萃取液減壓回收溶劑，得各萃取部位。取乙 酸乙酯部分274g，經(jīng)硅膠柱(100-200目)色譜進(jìn)行分離，氯仿-甲醇(10: 0~0: 10)梯度 洗脫，根據(jù)TLC檢測結(jié)果，在氯仿甲醇為25: 1 15: 1極性部位含有鬼臼毒素類木脂素
成分。該部位濃縮至干后繼續(xù)進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以體積比為10: 1 1: 5的石油醚丙
酮梯度洗脫，通過TLC檢測在2: l極性部位含有去氧鬼臼毒素和4'-去甲去氧鬼臼毒素，在 1: l極性部位含有鬼臼毒素。分別經(jīng)過C-18半制備液相分離純化，得到鬼臼毒素15mg，去 氧鬼臼毒素32mg， 4'-去甲去氧鬼臼毒素13mg。在氯仿甲醇為40: 1 30: 1極性部位含有 8,2'-二異戊烯基槲皮素3-甲醚和8-異戊烯基山柰酚，通過Sephadex LH-20純化、氯仿-甲醇(6: 4)洗脫，得到8，2'-二異戊烯基槲皮素3-甲醚60mg，經(jīng)過乙酸乙酯反復(fù)重結(jié)晶得到8-異戊烯 基山柰酚100mg。
實(shí)施例4
在正常喂養(yǎng)6天后，將共21只移植人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的裸小鼠隨機(jī)分為3組陰性
8對照組(生理鹽水)、給藥組(實(shí)施例1小葉蓮提取物水溶液)和陽性對照組(環(huán)磷酰胺水溶 液)，每組7只。接種后第二天給藥，持續(xù)21天。其中生理鹽水組灌胃給藥，500mg/kg，每 天給藥一次。小葉蓮組灌胃給藥，500mg/kg，每天給藥一次。環(huán)磷酰胺組腹腔注射，20mg/kg， 隔天給藥一次。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如表2所示，小葉蓮組和環(huán)磷酰胺組與陰性對照組的平均瘤重相比，均具有 顯著性差異，提示腫瘤生長受抑。其瘤重抑制率分別為48%和46%。小葉蓮組比環(huán)磷酰胺組 的抑瘤率稍高，提示小葉蓮提取物對小鼠移植性乳腺癌具有較強(qiáng)的抑瘤作用。 表2小葉蓮提取物對MCF-7移植性乳腺癌裸鼠的瘤重抑制率
體重(g)
組別 n_瘤重(g) 抑瘤率
給藥前 給藥后 增重
NS組 7 18.36±0.48 21.29±0.86 2.93±1.13~~0.61±0.18 ^
小葉蓮組7 18.07±1.13 21.57±1.34 3.50±0.76 0.32±0.14** 48%
CTX組7 18.57±1.37 20.93±1.54 2.36±1.68 0.33±0.08** 46%
與模型組比較，**P<0.01 實(shí)施例5
采用酸性磷酸酶法檢測實(shí)施例1小葉蓮提取物和實(shí)施例3各萃取部分對人乳腺癌細(xì)胞的 抑制作用。
人乳腺癌MDA-231細(xì)胞株和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株均用含體積分?jǐn)?shù)為10%新生牛血清、 100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，37°C， 95%濕度，5%<:02孵箱條 件；常規(guī)2.5g/L胰蛋白酶消化傳代。
取對數(shù)生長期細(xì)胞消化后，制成細(xì)胞懸液按1.5xl0"孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng) 24h細(xì)胞完全貼壁之后，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的小葉蓮提取物；空白對照組加入DMEM 培養(yǎng)液；不同濃度的順鉑溶液為陽性對照組。實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，作用24h、 48h、 72h后，棄去96孔板中的培養(yǎng)基，各孔用PBS 100pL洗2遍，棄PBS，加入10mmol/L 的硝基苯磷酸鹽溶液lOOpL (0.1mol/L醋酸緩沖液配制，含0.1。/。TritonX-100)，置于37。C孵 育2h后，每孔加入lmol/L氫氧化鈉10pL終止反應(yīng)。用酶聯(lián)免疫檢測儀在405nm處檢測光 吸收度(J值)記錄結(jié)果，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
結(jié)果表明，如表3所示，含有鬼臼毒素類木脂素和黃酮類成分的小葉蓮提取物以及乙酸 乙酯部分具有很強(qiáng)的抑制作用。表3小葉蓮提取物及各部分對兩種細(xì)胞株的ICso
提取物作用時(shí)間(h)MDA-231 IC50(pg/mL)MCF-7 IC50(ng/mL)
2424.3-
小葉蓮提取物4814.084.3
720.1592.65
2417.8-
石油醚部分480.8450.470
72-2.08
242.548.69
乙酸乙酯部分482.216.53
720.2001.26
2432.3-
正丁醇部分48-56.2
72-16.6
249.1814.9
順鉑486.387.80
722.913.50
實(shí)施例6
采用酸性磷酸酶法檢測各化合物對人乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。 實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例5。
結(jié)果表明，如表4所示，鬼臼毒素類木脂素和黃酮類成分均具有很強(qiáng)的抑制作用。 另外，還測定了鬼臼毒素類木脂素和異戊烯基黃酮類成分混合物的IC5()，結(jié)果表明，將
鬼臼毒素類木脂素中的一種或多種和異戊烯基黃酮中的一種或多種以混合具有協(xié)同作用，能
夠顯著提高其抑制乳腺癌細(xì)胞的效果。表4小葉蓮各化合物對MDA-231細(xì)胞株的ICSo
化合物(重量比)作用時(shí)間 MDA-231 (h) IQo(拜ol/L)
鬼臼毒素24 -48 6.46 72 -
去氧鬼臼毒素24 0.889 48 5.27 72 -
4'-去甲去氧鬼臼毒素24 2.01 48 0.718 72 2.22
8-異戊烯基山柰酚24 106 48 28.8 72 20.0
8,2'-二異戊烯基槲皮素3-甲醚24 18.0 48 25.4 72 13.7
去氧鬼臼毒素8-異戊烯基山柰酚 =1:124 3.50 48 7.23 72 3.81
4'-去甲去氧鬼臼毒素8-異戊烯基山柰酚 =1:424 4.20 48 3.52 72 3.89
鬼臼毒素去氧鬼臼毒素4'-去甲去氧鬼臼毒素 8-異戊烯基山柰酚8,2'-二異戊烯基槲皮素3-甲醚 =2:4:1:4:3224 0.660 48 -72 3.01
順鉬24 30.6 48 21.3 72 9.7
1權(quán)利要求
1.小葉蓮提取物在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的小葉蓮提取物中含有3種鬼臼毒素類木脂素鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素和4′-去甲去氧鬼臼毒素以及2種異戊烯基黃酮8-異戊烯基山柰酚和8，2′-二異戊烯基槲皮素3-甲醚。其結(jié)構(gòu)式如下
2. —種治療乳腺癌的藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求l所述的鬼臼毒素類木脂素中的 l-3個(gè)以及異戊烯基黃酮中的l-2個(gè)化合物，鬼臼毒素類木脂素和異戊烯基黃酮的總重量比為1: 1 1: 6。
3. —種如權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于所述的鬼臼毒素類木脂素和異戊烯基黃 酮分別為去氧鬼臼毒素和8-異戊烯基山柰酚，其重量比為1:1。
4. 一種如權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于所述的鬼臼毒素類木脂素和異戊烯基黃 酮分別為4'-去甲去氧鬼臼毒素和8-異戊烯基山柰酚，其重量比為1:4。
5. —種如權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于所述的鬼臼毒素類木脂素為鬼臼毒素、 去氧鬼臼毒素和4'-去甲去氧鬼臼毒素，所述的異戊烯基黃酮為8-異戊烯基山柰酚和8,2'-二異 戊烯基槲皮素3-甲醚，上述五種化合物的重量比為2:4:1:4:32。
6. —種藥物組合物在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于該藥物組合物含有權(quán)利要求 1所述的鬼臼毒素類木脂素中的1-3個(gè)以及異戊烯基黃酮中的1-2個(gè)化合物。
7. —種如權(quán)利要求3、 4或5所述的藥物組合物在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小葉蓮提取物，以及該提取物及其中的有效成分在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。所述的小葉蓮提取物中含有鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素、4′-去甲去氧鬼臼毒素、8-異戊烯基山柰酚和一個(gè)新化合物8，2′-二異戊烯基槲皮素3-甲醚。小葉蓮提取物和各化合物對人乳腺癌細(xì)胞的抑制作用實(shí)驗(yàn)表明，小葉蓮提取物和各化合物均具有抑制乳腺癌細(xì)胞的作用，而鬼臼毒素類木脂素和異戊烯基黃酮類成分配伍使用具有協(xié)同作用，能夠顯著提高其抑制乳腺癌細(xì)胞的效果。
文檔編號(hào)A61K36/185GK101647842SQ200910092769
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日
發(fā)明者越 孔, 尚明英, 肖軍軍, 葛躍偉, 蔡少青, 馬祥君 申請人:北京大學(xué)