專利名稱：含骺板軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)復(fù)方微膠囊制劑及其制備和 骺板損傷早閉的治療。
特別涉及的載體包括海藻酸鈉、膠原蛋白、聚賴氨酸、氯化鈣、檸檬酸鈉溶液。 將所分離的骺板軟骨細(xì)胞或永生化細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)在上述載體的作用下， 通過高壓靜電微囊發(fā)生器根據(jù)需要而制得100 y m 1000 nm的微膠囊(可做成大小 不等規(guī)格的微膠囊如100um 200 um， 300 y ni 500 " m等)，保存在培養(yǎng)液或生理 鹽水中待注射移植用，此方法目前國(guó)內(nèi)外還沒見報(bào)道。本發(fā)明所用原料具有良好的 生物相容性，較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，是一種安全、有效、新型細(xì)胞微囊化制劑?？捎糜?治療人或動(dòng)物的骺板損傷早閉。
背景技術(shù)：
衝板(又稱生長(zhǎng)板)是位于長(zhǎng)骨骺與干骺端之間一層具有縱向生長(zhǎng)能力的透明 軟骨。負(fù)責(zé)骨的生長(zhǎng)，其組織結(jié)構(gòu)和基質(zhì)成份呈梯級(jí)變化。生理活動(dòng)和生物學(xué)行為 復(fù)雜，受全身分泌(包括激素、生長(zhǎng)因子)和局部旁分泌及自分泌(多種生長(zhǎng)因子) 的調(diào)控，內(nèi)分泌障礙，基質(zhì)蛋白基因突變，營(yíng)養(yǎng)代謝障礙，毒性物質(zhì)，物理因素等 均會(huì)導(dǎo)致多種骺板生長(zhǎng)發(fā)育性疾病，如軟骨發(fā)育不良，侏儒癥等，骺板損傷和感染 會(huì)導(dǎo)致骺板部分或全部早閉，畸型發(fā)育，嚴(yán)重影響肢體功能和勞動(dòng)力。
骺板軟骨是骨生長(zhǎng)最活躍的部位，其發(fā)育直接關(guān)系到長(zhǎng)管狀骨的生長(zhǎng)發(fā)育。正 常時(shí)軟骨內(nèi)化必須通過軟骨細(xì)胞的增殖、肥大、基質(zhì)鈣化以及破骨細(xì)胞的清除，吸 收。隨著血管和骨母細(xì)胞的侵入形成類骨組織，進(jìn)而鈣化骨化形成骨組織。
骺板從解剖上分為三部分①.由不同軟骨細(xì)胞組成的軟骨骺板；②.骨化的干 骺端；③.骺板周圍的Rarwier軟骨膜骨化溝，其中軟骨骺板分三層，從骨骺端起 依次為儲(chǔ)存帶，增殖帶和肥大細(xì)胞帶。增殖帶是骺板縱向生長(zhǎng)的所在，而Ranvier 軟骨膜骨化溝則是骺板橫向生長(zhǎng)的所在，骺板是血供豐富的組織，到了新生兒期骺 板就逐漸形成血運(yùn)屏障，如果由于骨折、炎癥等原因損傷軟骨骺板，最終導(dǎo)致血運(yùn) 屏障的破壞，此時(shí)骨骺和干骺端血運(yùn)侵入骺板。吻合交通，這是骨板形成的基礎(chǔ)條件，首先形成的是纖維血管橋，然后慢慢骨化，如果骺板損傷足夠大，允許下是骨 的沉積，骨橋最終形成。
骺板損傷是小兒骨損傷中非常嚴(yán)重的一種，由于生長(zhǎng)板的受損而導(dǎo)致肢體進(jìn)行 性生長(zhǎng)停滯及畸形。骺板是兒童骨骼發(fā)育的基礎(chǔ)，具有特殊的結(jié)構(gòu)和功能，多種原 因可以導(dǎo)致骺板部分或全部的提前閉合。使肢體出現(xiàn)畸形以及引起相應(yīng)的關(guān)節(jié)功能 障礙，且隨著兒童的生長(zhǎng)發(fā)育，畸形會(huì)逐漸加重。治療骺板損傷部分早閉的方法很 多，但每一種方法都有其局限性和治療的不徹底性，目前臨床中應(yīng)用的填充物有自 體脂肪，骨臘，軟骨，骨水泥，醫(yī)用硅膠，明膠海綿以及自體骺板(包括游離帶血 管蒂和帶肌瓣者)而骺板細(xì)胞外培養(yǎng)移植雖有可能解決該問題，但目前仍存在許多 問題。例如最佳種子細(xì)胞，生物環(huán)境與骺板軟骨細(xì)胞之間的關(guān)系問題等都有待解 決。當(dāng)前分子生物學(xué)和基因工程的迅猛發(fā)展，為骨誘導(dǎo)研究提供了廣闊的平臺(tái)，骨 形態(tài)蛋白以及生長(zhǎng)因子的研究日益深入，為治療骺板損傷早閉提供了新的思路，成 人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有分化潛能，而為人們競(jìng)相研究的熱點(diǎn)。骺板損傷早閉會(huì)導(dǎo)致 肢體嚴(yán)重的畸形和功能障礙，是常見的小兒骨傷病，目前尚缺少能修復(fù)損傷薪板組 織結(jié)構(gòu)和恢復(fù)其生長(zhǎng)功能的理想材料，微囊化細(xì)胞技術(shù)為骺板缺損早閉提供了新的 治療手段。
裸露的細(xì)胞移植入體內(nèi)又將遇到強(qiáng)烈的機(jī)體免疫排斥反應(yīng)，微囊則可以依靠膜 的隔離保護(hù)功能和選擇通透作用，保證生物活性物質(zhì)擴(kuò)散通過，抗體或免疫細(xì)胞被 載留隔離，從而在生理上避免了個(gè)體的免疫排斥，成為解決細(xì)胞移植過程免疫排斥
問題的理想手段，因而引起眾多研究者的興趣。1997年，日本0kada等人提出"細(xì) 胞制劑" 一詞，即利用微囊化細(xì)胞在生物體內(nèi)能抵御免疫系統(tǒng)的攻擊，維持正常生 理功能，持續(xù)不斷地釋放具有治療作用的細(xì)胞產(chǎn)物一一生物活性因子；可形成細(xì)胞 性體內(nèi)長(zhǎng)期藥物釋放系統(tǒng)。至此，微囊化細(xì)胞首先在藥學(xué)方面作為藥物釋放系統(tǒng)概 念提出。
海藻酸鈉凝膠具有與軟骨基質(zhì)成份蛋白多糖相似的結(jié)構(gòu)，可使軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)在 一種類似生理狀態(tài)的環(huán)境中，同時(shí)凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可完全包裹軟骨細(xì)胞，是完全在三 維結(jié)構(gòu)中生長(zhǎng)，有利于細(xì)胞保持表型穩(wěn)定和分泌大量的基質(zhì)，是較為理想的軟骨細(xì) 胞培養(yǎng)材料。用無毒的高分子聚合物制成具有半透膜功能的微膠囊，將特定的細(xì)胞 包裹于微囊中，其原理是利用微囊膜的半透性，氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等小分子可透過供給細(xì)胞，使之保持生理活性，而細(xì)胞分泌的生物活性產(chǎn)物也可從微囊中透出，起 到特定作用，同時(shí)具有免疫活性的大分子物質(zhì)，細(xì)胞等不能通過微囊膜作用于囊內(nèi) 細(xì)胞，從而起到免疫隔離的作用。
膠原蛋白家族里一系列密切相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，廣泛存在于哺乳動(dòng)物體
內(nèi)，占人體蛋白總量的25.33%，膠原是骨骼、肌腱、骨間膜、皮膚、軟骨及韌帶 等器官的基本結(jié)構(gòu)物質(zhì)，使其具有很高的抗張強(qiáng)度，并且同細(xì)胞相互作用，為細(xì)胞 的附著、移植、增殖、分化和生存提供重要信號(hào)。膠原分子有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和氨基酸
序列使其具有兩個(gè)顯著特點(diǎn)(1)每3個(gè)氨基酸殘基就有一個(gè)甘氨酸殘基形成
Gly-X-Y重復(fù)序列，(2)高含量的哺氨酸和羥哺氨酸殘基。膠原作為一種天然細(xì)胞 外基質(zhì)生物高分子是一種良好的組織工程支架材料，膠原有許多優(yōu)點(diǎn)(1)來源廣 泛，很容易從活組織中分離純化，因此膠原制品的價(jià)格相對(duì)便宜，并且供應(yīng)穩(wěn)定；
(2)容易被機(jī)體吸收，并且具有很低的抗原性；(3)優(yōu)良的機(jī)械性能，天然的膠 原纖維具有較好的強(qiáng)度和黏彈性，最重要的是，作為一種生物材料，其具有良好的 生物相容性和無毒性，良好的生物塑性和抗疲勞能力，是軟骨的必需成分。
因此，如何將海藻酸鈉和膠原蛋白共同作為載體包裹骺板軟骨細(xì)胞就成為該技 術(shù)領(lǐng)域急需要解決的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種生物相容性好，機(jī)械強(qiáng)度高，毒副作用小，具 有填充和分泌生物活性因子的，可持續(xù)不斷地釋放具有治療作用的細(xì)胞產(chǎn)物(微囊 化細(xì)胞制劑)。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案達(dá)到的
一種含骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)復(fù)方微膠囊制劑，其特征在于包括 新鮮骺板軟骨細(xì)胞或永生化骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)；包括混合載體海藻酸 鹽一膠原蛋白一聚賴氨酸；包括液化劑檸檬酸鈉；包括固化劑氯化鈣。
所述含新鮮骺板軟骨細(xì)胞或永生化骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)數(shù)為2 8
所述混合載體的組成為海藻酸鹽50到600重量份，膠原蛋白10到100重量 份，聚賴氨酸1到10重量份。
所述液化劑檸檬酸鈉的組成為擰檬酸鈉2到20重量份。所述固化劑氯化鈣的組成為1到10重量份。
所述含骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)復(fù)方微膠囊可以是儲(chǔ)存在培養(yǎng)液當(dāng) 中或生理鹽水中的微膠囊。
所述儲(chǔ)存在培養(yǎng)液中的微膠囊或儲(chǔ)存在生理鹽水中的微膠囊粒徑范圍在100 lOOOHm。
所述微膠囊的粒徑范圍也可根據(jù)需要做成不同大小范圍，如100 200陶；200 300Mm; 300 550陶；500 750Mm或700 950陶等。
所述純化的骺板軟骨細(xì)胞為新鮮分離的骺板軟骨細(xì)胞或凍存復(fù)蘇骺板軟骨細(xì)胞 或永生化骺板軟骨細(xì)胞。
本發(fā)明的目的之二是提供一種骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊的制 備方法。
一種含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑的制備方法，其步驟如
下
(1) 將50到600重量份的海藻酸鈉稱重，溶解；得微膠囊溶液；
(2) 將10到100重量份的膠原蛋白稱重，溶解，得另一種微膠囊溶液；
(3) 將1到IO重量份的聚賴氨酸稱重，溶解，得另一種微膠囊溶液；
(4) 將2到20重量份的檸檬酸鈉稱重，溶解，得另一種微膠囊液化溶液；
(5) 將1到10重量份的氯化鈣或氯化鋇稱重，溶解，得另一種微膠囊固液化
溶液；
(6) 將純化的骺板軟骨細(xì)胞按2 8X1(T數(shù)量，得細(xì)胞液；
(7) 將所得細(xì)胞液和海藻酸鈉和膠原蛋白溶液混合，并通過高壓靜電多頭微 囊液滴發(fā)生裝置與所述固化液反應(yīng)，固化成圓形或類圓形的微膠珠，微膠珠于步驟
(3)所得聚賴氨酸溶液作用得強(qiáng)化的微膠珠，微膠珠再于步驟(4)所得擰檬酸鈉 作用，液化后得含骺板軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑。 '
所述高壓靜電多頭微囊液滴發(fā)生裝置包括 一個(gè)靜電發(fā)生裝置，所述靜電發(fā)生
裝置上有正負(fù)兩極，正極與微量注射裝置的針頭相連，負(fù)極與浸在所述固化液中的 不銹鋼鋼圈相連接，注射裝置內(nèi)裝有混合載體溶液和骺板軟骨細(xì)胞，滴入所述固化 液中形成微膠珠，所得骺板軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠珠沉降到容器的下部(各步驟均在無 菌下操作)，再經(jīng)聚賴氨酸固化一檸檬酸鈉溶液液化后得含骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)復(fù)方微膠囊，可以是儲(chǔ)存在培養(yǎng)液當(dāng)中或生理鹽水中的微膠囊。
所述純化的骺板軟骨細(xì)胞為新鮮分離的骺板軟骨細(xì)胞或凍存復(fù)蘇骺板軟骨細(xì)胞
或永生化骺板軟骨細(xì)胞。
所述骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)的純化(擴(kuò)增)取自志愿節(jié)育者4個(gè)月
齡引產(chǎn)胎兒(或幼年兔)，在無菌條件下取股骨遠(yuǎn)端骺板軟骨塊，剪成l隱XlmmX lmm大小的塊，姨酶消化后，離心、洗滌，透明質(zhì)酸酶消化；離心、洗滌，I型膠原 酶消化；離心、洗滌，提取骺板軟骨細(xì)胞.DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，用姨酶 把原代細(xì)胞再消化，培養(yǎng)到使細(xì)胞融合率70%左右，用SV40LTAg基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 陽性細(xì)胞克隆，培養(yǎng)及傳代。
所述儲(chǔ)存在培養(yǎng)液中的微膠囊或儲(chǔ)存在生理鹽水中的微膠囊粒徑范圍在100 1000pm之間。所述微膠囊的粒徑范圍可根據(jù)需要做成不同大小范圍。(如100 200)Lim; 200 300nm; 300 55C^m; 500 750pm;或700 950|im等)。所得薪板 軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑用于骺板損傷早閉治療。
本發(fā)明的目的之三是提供含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑的 應(yīng)用，用于治療骺板損傷，用于骺板切除后的填充和有效分泌。
免疫隔離是微囊技術(shù)的核心，采用無毒的高分子聚合物制成具有半透膜功能的 小球囊，將待移植細(xì)胞包裹于此球囊內(nèi)，囊內(nèi)細(xì)胞可以透過此微囊膜獲得營(yíng)養(yǎng)，所 分泌的生物活性物質(zhì)也可通過微囊排出，同時(shí)具有免疫活性的大分子物質(zhì)如免疫細(xì) 胞、免疫球蛋白等不能通過此膜，因而起到免疫屏障作用。將這種人工細(xì)胞移植到 宿主體內(nèi)，可防止宿主免疫系統(tǒng)攻擊而長(zhǎng)期存活。
由于膠原蛋白具有防止骨化的能力并為軟骨細(xì)胞的再生提供基質(zhì)，從而進(jìn)一步 合成II型膠原使骺板恢復(fù)并保持開放。骺板軟骨細(xì)胞于海藻酸鹽一膠原蛋白一聚賴 氨酸一檸檬酸鈉和氯化鈣包裹后，不經(jīng)體外培養(yǎng)立即可植入骺板缺損區(qū)，應(yīng)更適于 骺板缺損區(qū)充填和修復(fù)，并更有效地阻止血管長(zhǎng)入和防止骨橋形成。在局部生理環(huán) 境下改建為正常的骺板組織結(jié)構(gòu)，并能較好地恢復(fù)骺板的生長(zhǎng)功能，為骺板病損及 早閉的治療提供所需的具有良好功能活性的移植物。
由于骺板損傷部分早閉成因較多，骺板損傷的治療一直是骨科臨床的一道難 題，臨床處理方法多樣，骨缺損發(fā)生后，骨的生理連續(xù)遭到嚴(yán)重破壞，在利用外源 性細(xì)胞治療時(shí)，必須有適合的載體，通過載體使細(xì)胞產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子釋放到骨質(zhì)缺損部位，誘導(dǎo)新骨形成達(dá)到治療目的?？赏ㄟ^自體或同種異體獲取細(xì)胞來源及永生化細(xì)胞的方法建立凍存儲(chǔ)備細(xì)胞庫，得到理想的細(xì)胞來源，增加臨床上的應(yīng)用前景。
有了好的細(xì)胞后選擇海藻酸鹽和膠原蛋白作為主要載體，采用高壓靜電微囊發(fā)生器將骺板軟骨細(xì)胞包裹在微囊中，植入到骨橋缺損區(qū)后細(xì)胞可以得到長(zhǎng)期有效生存，分泌生長(zhǎng)因子，促進(jìn)軟骨生長(zhǎng)，解決目前國(guó)內(nèi)外對(duì)移植后的組織細(xì)胞容易老化，效果不好等難題。利用移植后微囊化骺板軟骨細(xì)胞作為骨橋切除后的填充物，并可有效地克服免疫排斥反應(yīng)，骨橋切除后通過植入具有生理特性的微囊化骺板軟骨細(xì)胞延長(zhǎng)骺板開放時(shí)間，解決骨橋切除后患肢生長(zhǎng)能力仍然低于正常則及嬌正小于20度成角畸形的難題。根據(jù)骺板缺損區(qū)的大小決定微囊化細(xì)胞量的多少，控制植入微囊化細(xì)胞量，達(dá)到掌握骺板生長(zhǎng)速度。
可注射性微囊化人工細(xì)胞是一種微創(chuàng)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便，塑型隨意，創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)。由于微囊化骺板軟骨細(xì)胞本身與天然骺板軟骨組織極為相似，因此移植后能夠代替原來的骺板軟骨，成為修復(fù)骺板損傷較理想的移植物，有極大的臨床應(yīng)用潛能。
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不意味著對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
新鮮分離的骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)復(fù)方微膠囊的制備1、包裹前的準(zhǔn)備工作
① 玻璃器皿和不銹鋼用具的處理
將清洗干凈的玻璃器皿和不銹鋼用具涼干，放在高溫烤箱內(nèi)在180 260攝氏
度下烘烤3小時(shí)(除菌去熱源)。
② 骺板軟骨細(xì)胞分離溶液的配制
A. 姨蛋白酶溶液的配制
稱取5克市售姨蛋白酶，置于上述玻璃器皿內(nèi)，加無菌注射用水直到全部溶解為止，得姨蛋白酶溶液。
B. 透明質(zhì)酸酶溶液的配制
稱取2克市售透明質(zhì)酸酶，置于上述玻璃器皿內(nèi)，加無菌注射用水直到全部溶解為止，得透明質(zhì)酸酶溶液。
C. I型膠原酶的配制
稱取1克市售I型膠原酶，置于上述玻璃器皿內(nèi)，加無菌注射用水直到全部溶解為止；得I型膠原酶溶液。
D. DMEM/Ham F12 培養(yǎng)液，胎牛血清，均購(gòu)于美國(guó)Gibico公司。所述骺板軟骨新鮮細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)的純化取自志愿節(jié)育者4個(gè)月齡
引產(chǎn)胎兒(或幼年兔)，在無菌條件下取股骨遠(yuǎn)端骺板軟骨塊，剪成lmmXlmmXlmm大小的塊，姨酶消化后，離心、洗滌，透明質(zhì)酸酶消化，離心、洗滌，I型膠原酶消化，離心、洗滌，提取骺板軟骨細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)及傳代。
③ 海藻酸鈉溶液的制備
稱取2千克市售海藻酸鈉，置于玻璃器皿內(nèi)， 一邊攪拌， 一邊加入生理鹽水，直至海藻酸鈉全部溶解，得海藻酸鈉溶液。
④ 膠原蛋白溶液的配制
稱取0.5克市售膠原蛋白，置于玻璃器皿內(nèi)，加入生理鹽水至全部溶解，得膠原蛋白溶液。
⑤ 氯化鈣溶液的配制
稱取l千克市售氯化鈣，置于玻璃器皿內(nèi)，加入無菌注射用水至全部溶解，得氯化鈣溶液；
⑥ 聚賴氨酸溶液的配制
稱取1克市售進(jìn)口聚賴氨酸，置于玻璃器皿內(nèi)，加入無菌注射用水至全部溶解，得聚賴氨酸溶液；
⑦ 檸檬酸鈉溶液的配制
稱取2克市售檸檬酸鈉，置于玻璃器皿內(nèi)，加入無菌注射用水至全部溶解，得檸檬酸鈉溶液；
⑧ 將上述膠原蛋白溶液、海藻酸鈉溶液和新鮮分離的骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)混合，得混合溶液；用一次性無菌注射器吸取上述混合液，通過高壓靜電多頭微囊液滴發(fā)生裝置滴入上述氯化鈣溶液中，與Ca2+迅速交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的海藻酸鈣膠原型微膠囊，固化液中Na+可與海藻酸鈣中Ca2+交聯(lián)，使海藻酸鈣膠原微膠囊表面始終帶有相當(dāng)數(shù)量的負(fù)電荷，加入帶正電荷的聚賴氨酸溶液，再發(fā)生分子間交聯(lián)，這種分子間交聯(lián)所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較海藻酸鈣分子內(nèi)交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為密切。所得微膠囊沉入容器下面，吸上清液后加入聚賴氨酸溶液使強(qiáng)化，然后再經(jīng)擰檬酸鈉液化，得需要范圍的微膠囊。將微膠囊加入培養(yǎng)液或生理鹽水待用。
將上述容器的上層溶液傾析，將下面的微膠囊用生理鹽水洗三遍，用大號(hào)針頭注射器吸帶少量生理鹽水的微膠囊，換合適針頭直接注射到骺板損傷部位。
(D幼兔脛骨上端骺板內(nèi)側(cè)部分缺損模型的制備
選用5周齡健康的大耳白兔，1%的戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，常規(guī)無菌操作，手術(shù)取雙側(cè)脛骨上端內(nèi)側(cè)切口，顯露脛骨上端骺板軟骨，切除骺板內(nèi)側(cè)部分約1/3 1/2，逐層縫合骨膜、皮下及皮膚。然后將制備的骺板軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊注入左側(cè)骺板損傷處，右側(cè)脛骨近端骺板損傷處不進(jìn)行移植作為對(duì)照組，術(shù)后籠內(nèi)飼養(yǎng)，定期觀察。
實(shí)施例2
凍存復(fù)蘇骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)復(fù)方微膠囊的制備1、包裹前的準(zhǔn)備工作
① 玻璃器皿的處理
將清洗干凈的玻璃器皿涼干，放在高溫烤箱內(nèi)在180 260攝氏度下烘烤3小時(shí)(除菌去熱源)。
② 復(fù)蘇骺板軟骨細(xì)胞的處理
從液氮罐中取出凍存管，迅速投入37t:溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)，令其盡快融化。
從水浴中取出凍存管，吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上的培養(yǎng)液，混合后低速離心，洗滌3次，用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率，將純化的骺板軟骨細(xì)胞按2 8X1()6細(xì)胞數(shù)進(jìn)行包裹，制得復(fù)蘇后骺板軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊待用。
③ 海藻酸鈉溶液的制備
稱取2千克巿售海藻酸鈉，置于玻璃器皿內(nèi)， 一邊攪拌， 一邊加入生理鹽水，直至海藻酸鈉全部溶解，得海藻酸鈉溶液。
④ 膠原蛋白溶液的配制
稱取0.5克市售膠原蛋白，置于玻璃器皿內(nèi)，加入生理鹽水至全部溶解，得膠
原蛋白溶液。
⑤ 氯化鈣溶液的配制稱取l千克市售氯化鈣，置于玻璃器皿內(nèi)，加入無菌注射用水至全部溶解，得氯化鈣溶液；
⑥ 聚賴氨酸溶液的配制
稱取1克市售進(jìn)口聚賴氨酸，置于玻璃器皿內(nèi)，加入無菌注射用水至全部溶解，得聚賴氨酸溶液；
⑦ 檸檬酸鈉溶液的配制
稱取2克市售檸檬酸鈉，置于玻璃器皿內(nèi)，加入無菌注射用水至全部溶解，得檸檬酸鈉溶液；
⑧ 將上述膠原蛋白溶液、海藻酸鈉溶液和骺板軟骨細(xì)胞混合，得混合溶液；用一次性無菌注射器吸取上述混合液，通過高壓靜電多頭微囊液滴發(fā)生裝置滴入上述氯化鈣溶液中，所得微膠囊沉入容器下面，吸上清液后加入聚賴氨酸溶液使強(qiáng)化，然后再經(jīng)檸檬酸鈉液化，得需要范圍的微膠囊。將微膠囊加入培養(yǎng)液或生理鹽水待用。
將上述容器的上層溶液傾析，將下面的微膠囊用生理鹽水洗三遍，用大號(hào)針頭注射器吸帶少量生理鹽水的微膠囊，換合適針頭直接注射到骺板損傷部位。
⑨ 幼兔脛骨上端骺板內(nèi)側(cè)部分缺損模型的制備
選用5周齡健康的大耳白兔，1%的戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，常規(guī)無菌操作，手術(shù)取雙側(cè)脛骨上端內(nèi)側(cè)切口，顯露脛骨上端骺板軟骨，切除衝板內(nèi)側(cè)部分約1/3 1/2，逐層縫合骨膜、皮下及皮膚。然后將制備的骺板軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊注入左
側(cè)骺板損傷處，右側(cè)脛骨近端骺板損傷處不進(jìn)行移植作為對(duì)照組，術(shù)后籠內(nèi)飼養(yǎng)，定期觀察。
實(shí)施例3
永生化骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)復(fù)方微膠囊的制備1、包裹前的準(zhǔn)備工作
① 玻璃器皿的處理
將清洗干凈的玻璃器皿涼干，放在高溫烤箱內(nèi)在180 260攝氏度下烘烤3小時(shí)(除菌去熱源)。
② 永生化骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)的擴(kuò)增及凍存處理所述永生化骺板軟骨細(xì)胞的擴(kuò)增取自志愿節(jié)育者4個(gè)月齡引產(chǎn)胎兒(或幼年兔)，在無菌條件下取股骨遠(yuǎn)端骺板軟骨塊一剪成lmmX 1薩X l隱大小的塊一姨酶消化后一離心、洗滌一透明質(zhì)酸酶消化一離心、洗滌一I型膠原酶消化一離心、洗滌—提取骺板軟骨細(xì)胞一DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)一用姨酶把原代細(xì)胞再消化一培養(yǎng)到使細(xì)胞融合率70%左右一用SV40LTAg基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞一陽性細(xì)胞克隆一培養(yǎng)及傳代(或凍存)。
從液氮罐中取出凍存管，迅速投入37t:溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)，令其盡快融化。從水浴中取出凍存管，吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上的培養(yǎng)液，混合后低速離心，洗滌3次，用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率，將純化的骺板軟骨細(xì)胞按2 8Xl(f進(jìn)行包裹，制得永生化骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)復(fù)方微膠囊待用。
③ 海藻酸鈉溶液的制備
稱取2千克市售海藻酸鈉，置于玻璃器皿內(nèi)， 一邊攪拌， 一邊加入生理鹽水，直至海藻酸鈉全部溶解，得海藻酸鈉溶液。
④ 膠原蛋白溶液的配制
稱取0.5克市售膠原蛋白，置于玻璃器皿內(nèi)，加入無菌注射用水至全部溶解，得膠原蛋白溶液。
⑤ 氯化鈣溶液的配制
稱取l千克市售氯化鈣，置于玻璃器皿內(nèi)，加入無菌注射用水至全部溶解，得氯化鈣溶液；
⑥ 聚賴氨酸溶液的配制
稱取1克市售進(jìn)口聚賴氨酸，置于玻璃器皿內(nèi)，加入無菌注射用水至全部溶解，得聚賴氨酸溶液；
檸檬酸鈉溶液的配制.-
稱取2克市售檸檬酸鈉，置于玻璃器皿內(nèi)，加入無菌注射用水至全部溶解，得檸檬酸鈉溶液；
⑧將上述膠原蛋白溶液、海藻酸鈉溶液和永生化骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)混合，得混合溶液；用一次性無菌注射器吸取上述混合液，通過高壓靜電多頭微囊液滴發(fā)生裝置滴入上述氯化鈣溶液中，所得微膠囊沉入容器下面，吸上清液后加入聚賴氨酸溶液使強(qiáng)化，然后再經(jīng)檸檬酸鈉液化，得需要范圍的微膠囊。將微膠囊加入培養(yǎng)液或生理鹽水待用。
將上述容器的上層溶液傾析，將下面的微膠囊用生理鹽水洗三遍，用大號(hào)針頭注射器吸帶少量生理鹽水的微膠囊，換合適針頭直接注射到骺板損傷部位。
⑨幼兔脛骨上端骺板內(nèi)側(cè)部分缺損模型的制備
選用5周齡健康的大耳白兔，1%的戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，常規(guī)無菌操作，手術(shù)取雙側(cè)脛骨上端內(nèi)側(cè)切口，顯露脛骨上端骺板軟骨，切除骺板內(nèi)側(cè)部分約1/3 1/2，逐層縫合骨膜、皮下及皮膚。然后將制備的永生化骺板軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊注入左側(cè)骺板損傷處，右側(cè)脛骨近端骺板損傷處不進(jìn)行移植作為對(duì)照組，術(shù)后籠內(nèi)飼養(yǎng)，定期觀察。
權(quán)利要求
1、一種含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑，其特征在于包括新鮮骺板軟骨細(xì)胞或永生化骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞；包括混合載體海藻酸鹽-膠原蛋白-聚賴氨酸；包括液化劑檸檬酸鈉；包括固化劑氯化鈣；所述含新鮮骺板軟骨細(xì)胞或永生化骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)數(shù)2×106～8×106；所述混合載體海藻酸鹽-膠原蛋白-聚賴氨酸的組成為海藻酸鹽50到600重量份，膠原蛋白10到100重量份，聚賴氨酸1到10重量份；所述液化劑檸檬酸鈉的量為2到20重量份；所述固化劑氯化鈣為1到10重量份。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑，其 特征在于所述含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊儲(chǔ)存在培養(yǎng)液當(dāng)中或生 理鹽水中。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑，其 特征在于所述骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞為新鮮分離的骺板軟骨細(xì)胞或其他軟 骨細(xì)胞，或者是凍存復(fù)蘇骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞，或者是永生化薪板軟骨細(xì) 胞或其他軟骨細(xì)胞。
4、 一種含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑的制備方法，其步驟 如下(1 )將50到600重量份的海藻酸鈉稱重，溶解；得微膠囊溶液；(2) 將10至U00重量份的膠原蛋白稱重，溶解，得另一種微膠囊溶液；(3) 將1到10重量份的聚賴氨酸稱重，溶解，得另一種微膠囊溶液；(4) 將2到20重量份的檸檬酸鈉稱重，溶解，得另一種微膠囊液化溶液；(5) 將1到10重量份的氯化鈣或氯化鋇稱重，溶解，得固化液；(6) 將純化的骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞按2X 106 8X 106數(shù)量，得細(xì)胞液；(7) 將所得細(xì)胞液和海藻酸鈉和膠原蛋白溶液混合，并通過高壓靜電多頭微 囊液滴發(fā)生裝置與所述固化液混合，固化成圓形或類圓形的微膠珠，微膠珠于步驟(3)所得聚賴氨酸溶液作用得強(qiáng)化的微膠珠，微膠珠再于步驟(4)所得檸檬酸鈉 作用，液化后得含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑的制 備方法，其特征在于所述高壓靜電多頭微囊液滴發(fā)生裝置包括 一個(gè)靜電發(fā)生裝置，所述靜電發(fā)生裝置上有正負(fù)兩極，正極與微量注射裝置的針頭相連，負(fù)極與浸 在所述固化液中的不銹鋼鋼圈相連接，注射裝置內(nèi)裝有混合載體溶液和骺板軟骨細(xì) 胞，滴入所述固化液中形成微膠珠，所得骺板軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠珠沉降到容器的下 部，再經(jīng)聚賴氨酸固化，檸檬酸鈉溶液液化后得含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù) 方微膠囊，所述含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊儲(chǔ)存在培養(yǎng)液當(dāng)中或生 理鹽水中。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑的制 備方法，其特征在于所述骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞為新鮮分離的骺板軟骨細(xì) 胞或其他軟骨細(xì)胞，或者是凍存復(fù)蘇骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞，或者是永生化 骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑的制 備方法，其特征在于所述永生化骺板軟骨細(xì)胞的制備方法為取自志愿節(jié)育者4個(gè)月齡引產(chǎn)胎兒(或幼年兔)，在無菌條件下取股骨遠(yuǎn)端骺板軟骨塊，剪成lmmXl扁 Xlmm大小的塊，姨酶消化后，離心、洗滌，透明質(zhì)酸酶消化，離心、洗滌，I型 膠原酶消化，離心、洗滌，提取骺板軟骨細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基中迸行原代細(xì)胞培養(yǎng)， 用姨酶把原代細(xì)胞再消化，培養(yǎng)到使細(xì)胞融合率70%左右，用SV40LTAg基因轉(zhuǎn)染 細(xì)胞，陽性細(xì)胞克隆，培養(yǎng)及傳代。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑的制 備方法，其特征在于所述凍存復(fù)蘇骺板軟骨細(xì)胞的制備方法為從液氮罐中取出 凍存管，迅速投入37。C溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)，令其盡快融化。從水浴中取出凍存管， 吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加IO倍以上的培養(yǎng)液，混合后低速離心，洗滌3 次，用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率，將純化的骺板軟骨細(xì)胞按2X1(T 8X106進(jìn)行 包裹，制得復(fù)蘇后骺板軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊待用。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑的制 備方法，其特征在于所述新鮮骺板軟骨細(xì)胞的制備方法為取自志愿節(jié)育者4個(gè) 月齡引產(chǎn)胎兒(或幼年兔)，在無菌條件下取股骨遠(yuǎn)端骺板軟骨塊，剪成lmmXl腿 Xlmm大小的塊，姨酶消化后，離心、洗滌，透明質(zhì)酸酶消化，離心、洗滌，I型 膠原酶消化，離心、洗滌，提取骺板軟骨細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。
10、 根據(jù)權(quán)利要求l一3中任一項(xiàng)所述含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑在治療骺板損傷或用于骺板切除后的填充和有效分泌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞復(fù)方微膠囊制劑，其特征在于包括新鮮骺板軟骨細(xì)胞或永生化骺板軟骨細(xì)胞或其他軟骨細(xì)胞；包括混合載體海藻酸鹽-膠原蛋白-聚賴氨酸；包括液化劑檸檬酸鈉；包括固化劑氯化鈣；所述含新鮮骺板軟骨細(xì)胞或永生化骺板軟骨細(xì)胞(或其他軟骨細(xì)胞)數(shù)2×10⁶～8×10⁶；所述混合載體海藻酸鹽-膠原蛋白-聚賴氨酸的組成為海藻酸鹽50到600重量份，膠原蛋白10到100重量份，聚賴氨酸1到10重量份；所述液化劑檸檬酸鈉的量為2到20重量份；所述固化劑氯化鈣為1到10重量份。本發(fā)明的復(fù)方微膠囊制劑載體材料為天然提取物，具有很好的生物相容性，較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，副作用少，適用于骺板損傷早閉的治療。
文檔編號(hào)A61K35/32GK101537016SQ20091008327
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者李新建, 宏 洪 申請(qǐng)人:北京宏醫(yī)耀科技發(fā)展有限公司