專利名稱：：靶向血小板的水蛭素聚離子膠束組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于注射的靶向血小板的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-聚乙二醇-殼聚糖(RGD-PEG-CS)包載水蛭素的聚離子膠束組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：心腦血管疾病是三大致死性疾病之一，其中血栓栓塞是多種心腦血管疾病發(fā)病的原因。由于動脈硬化、血管內(nèi)皮損傷、內(nèi)外凝血系統(tǒng)異?；蜓鲃恿W(xué)異常等原因的誘發(fā)，血液流動過程中的成分，在血管或心臟內(nèi)膜表面形成半凝塊狀物質(zhì)，該物質(zhì)即為血栓。針對血栓形成的多種機(jī)制，多種抗血栓藥物相繼問世，其中既有抑制血栓形成(抗凝防栓)和血小板聚集(抗血小板)的藥物，又有溶栓的藥物?？鼓浪翱寡“逅幬镌谘ㄐ纬傻某跏茧A段，以及溶栓治療后的二次血栓預(yù)防過程中使用。針對血栓形成前和溶栓后，臨床主要使用肝素、華發(fā)林等抗凝劑聯(lián)合阿司匹林等抗血小板藥物。但上述藥物多具有誘發(fā)出血等副作用，臨床安全性受到質(zhì)疑。水蛭素是由65個氨基酸構(gòu)成的分子量為6950Da的單鏈多肽，具酸性氨基酸，等電點為3.8。上世紀(jì)中期由markwardt從水蛭的唾液腺中提取出來，是迄今為止最強(qiáng)的凝血酶抑制劑，具有直接抗凝、間接抗血小板和間接促纖溶的作用。并以其高效性、專一性、無抗原性、低毒性、出血副作用小等贏得廣泛關(guān)注。1986年，基因發(fā)酵工程所得重組水蛭素的成功問世，以其相對較低的成本和相對較高的產(chǎn)率，標(biāo)志著水蛭素進(jìn)入臨床應(yīng)用的可能。該藥物可用于急性冠脈綜合征、鏈激酶溶栓的輔助治療、深靜脈血栓血管形成術(shù)、肝素誘發(fā)的血小板減少、血液透析、彌散性血管內(nèi)凝血等。但水蛭素的血漿半衰期短，缺乏組織特異性，不能選擇性地作用于病變部位，因此，臨床上需要大劑量連續(xù)用藥，易出現(xiàn)出血等嚴(yán)重并發(fā)癥，從而限制了其臨床應(yīng)用。增強(qiáng)溶栓劑的特異靶向性，是減少藥物用量、延長藥物在體內(nèi)作用時間和避免血栓再形成等的關(guān)鍵措施。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp，RGD)短肽是細(xì)胞膜整合素受體與活化的血小板上Ilb/IIIa球蛋白(GPIlb/IIIa)或其他細(xì)胞外配體相結(jié)合的識別位點。靜息血小板上，GPIlb/IIIa處于無活性狀態(tài)，并不能與黏附蛋白的R⑶片段結(jié)合。然而一旦內(nèi)皮受損，血小板黏附其上時，誘導(dǎo)劑(如凝血酶，膠原，凝血酶敏感蛋白，ADP，血栓素A2等)與其相應(yīng)受體結(jié)合后，通過不同的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)GPIIb/IIIa的立體構(gòu)型活化狀態(tài)使之激活，提高GPIlb/IIIa與纖維蛋白原的粘附能力，加速血小板的黏附與聚集。RGD三肽作為導(dǎo)向激活血小板的靶分子，將抗凝防栓藥物帶到血栓附近，并競爭性結(jié)合激活血小板上的GPIIb/IIIa，拮抗血小板與纖維蛋白的結(jié)合，降低血小板的黏附與聚集。因此，R⑶肽可作為血栓靶向制劑的導(dǎo)向彈頭。CN101176785公開了一種重組雙功能水蛭素口服制劑及其制備方法，該專利對水蛭素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，將RGD基因重組到水蛭素的基因上，通過發(fā)酵得到的抗凝、抗血小板雙功能重組水蛭素。但上述方法生產(chǎn)成本極高，并且改變了藥物原有的化學(xué)組成。因此，仍需要研制一種不改變原藥的化學(xué)組成、制備工藝簡單、體內(nèi)循環(huán)時間長且靶向作用于血小板的水蛭素組合物。聚乙二醇接枝殼聚糖是殼聚糖的改良產(chǎn)物，在殼聚糖的氨基上引入親水性長鏈聚乙二醇，有效地提高了殼聚糖的水溶性和生物相容性，在聚離子引發(fā)劑的作用下可在水溶液中自組裝形成聚離子膠束。聚乙二醇接枝殼聚糖聚離子膠束作為一種新型的藥物載體，除具有傳統(tǒng)聚合物膠束的特點結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、粒徑小且分布均勻；安全性好；制備工藝簡單；易于貯存外，還具有自身的獨(dú)特優(yōu)勢殼聚糖上大量的游離氨基在酸性環(huán)境下質(zhì)子化，依靠靜電作用與負(fù)電性藥物結(jié)合，形成膠束的疏水端，其上接枝的聚乙二醇在疏水內(nèi)芯外形成致密的水化外殼，可避免膠束被免疫系統(tǒng)攝取，延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間，達(dá)到長循環(huán)的目的。除此之外，聚離子膠束載藥系統(tǒng)還具有包封率高、載藥范圍廣泛，載藥過程基本在水溶液中進(jìn)行，避免有機(jī)溶劑的使用，可消除溶劑殘留引發(fā)的毒副作用等優(yōu)點。如果將RGD通過聚乙二醇與殼聚糖連接，可同時起到長循環(huán)和靶向血小板兩方面的作用。
發(fā)明內(nèi)容一方面，本發(fā)明提供一種靶向血小板的聚乙二醇接枝殼聚糖包載水蛭素的聚離子膠束組合物。另一方面，本發(fā)明提供靶向血小板的聚乙二醇接枝殼聚糖包載水蛭素的聚離子膠束組合物用于注射給藥的用途。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，其提供一種用于注射給藥的靶向血小板的RGD-PEG-CS包載水蛭素的聚離子膠束組合物，其含有水蛭素，及RGD-PEG-CS、聚離子引發(fā)劑等藥用輔料。本發(fā)明還涉及制備靶向血小板的聚離子膠束組合物的方法。包括用醋酸-醋酸鈉緩沖液配制RGD-PEG-CS溶液，電磁攪拌下加入水蛭素溶液，攪拌反應(yīng)后滴加聚離子引發(fā)劑水溶液，密封攪拌并用濾器過濾，即得包載水蛭素的RGD-PEG-CS聚離子膠束。其中的醋酸-醋酸鈉緩沖液的PH范圍為4.0-5.4，優(yōu)選4.6-5.2，更優(yōu)選4.8-5.0。RGD-PEG-CS與水蛭素重量比為52-202，優(yōu)選102-162。RGD-PEG-CS與TPP的重量比為101-0.51，優(yōu)選41-31。其中膠束的平均粒徑在200nm以下，包封率高于80%。本發(fā)明的組合物可根據(jù)任何常規(guī)方法配制成注射制劑，例如注射液、凍干粉針等。本發(fā)明組合物可用于制備治療急性冠脈綜合征、鏈激酶溶栓的輔助治療、深靜脈血栓血管形成術(shù)、肝素誘發(fā)的血小板減少、血液透析、彌散性血管內(nèi)凝血等相關(guān)疾病的藥物。本發(fā)明組合物用于治療上述疾病的藥物可通過注射途徑給藥。本發(fā)明的組合物含有作為活性成分的水蛭素，還包括由RGD-PEG-CS、TPP構(gòu)成的聚離子膠束。本發(fā)明的組合物經(jīng)注射給藥后，水蛭素的抗凝防栓活性增強(qiáng)，有效地抑制血小板聚集，同時顯著提高血漿的部分凝血活酶時間。本發(fā)明組合物中的水蛭素的代表性例子是天然水蛭素、基因工程發(fā)酵所得的重組水蛭素，及其變異體。本發(fā)明組合物中的水蛭素至少是其中的一種，組合物中水蛭素的含量為0.1-50%，優(yōu)選0.3-40%，更優(yōu)選0.5-20%，以組合物的總重量計。RGD-PEG-CS是構(gòu)成本發(fā)明組合物中膠束的主要成分，是精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸-聚乙二醇與殼聚糖的接枝產(chǎn)物，其中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)為具有RGD-Y結(jié)構(gòu)的短肽，Y可以不為任何氨基酸，也可為纈氨酸(V)、絲氨酸(S)、苯丙氨酸(F)等氨基酸。所述聚乙二醇具有400-20000Da的分子量，優(yōu)選2000Da-6000Da。所述的殼聚糖為殼聚糖或其衍生物，具有5-2000kDa的分子量，優(yōu)選IO-IOOOkDa,更優(yōu)選10_600kDa。所述的殼聚糖或其衍生物具有70%-95%的脫乙酰度，優(yōu)選75%-90%。所述的RGD-PEG與殼聚糖上氨基的摩爾比例為14-130，優(yōu)選110-120。聚離子引發(fā)劑也是本發(fā)明組合物的成分，優(yōu)選三聚磷酸鈉。另外，本發(fā)明的組合物還包括任選的藥學(xué)上可接受的添加劑。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明進(jìn)行了本發(fā)明組合物的部分凝血活酶時間和血小板聚集率的測定，以評價本發(fā)明組合物的靶向性。參考附圖1、2和表1，通過本發(fā)明的以下描述，本發(fā)明的上述及其它目的和特征將是顯而易見的。附圖1顯示了本發(fā)明實施例1的粒徑分布。附圖2顯示了本發(fā)明的實施例1和市售水蛭素注射劑的部分凝血活酶時間(APTT)。如上所述，本發(fā)明的組合物可有效地抑制血小板聚集，同時顯著提高血漿的APTT，增強(qiáng)水蛭素的抗凝防栓活性。以下實施例用于進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但絕對不是對本發(fā)明范圍的限制。具體實施方案實施例1注射液的制備將16mgRGD-PEG-CS溶于IOmlpH4.9的醋酸-醋酸鈉緩沖液，電磁攪拌下加入IOml濃度為0.2mg/mL水蛭素溶液，攪拌反應(yīng)30min后滴加5ml濃度為1.lmg/mL三聚磷酸鈉水溶液，密封攪拌30min。用0.45μm的濾器過濾，即得靶向血小板的水蛭素的聚乙二醇接枝殼聚糖聚離子膠束組合物。向所得組合物中加入適量的抑菌劑苯甲醇水溶液，混合均勻，過濾，灌封，輻射滅菌即得。實施例2凍干粉針的制備將32mgRGD-聚乙二醇接枝殼聚糖溶于IOmlpH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，電磁攪拌下加入IOml濃度為0.5mg水蛭素溶液，攪拌反應(yīng)45min后滴加4mL濃度為1.5mg/mL三聚磷酸鈉水溶液，密封攪拌40min。用0.45μm的濾器過濾，即得靶向血小板的水蛭素的聚乙二醇接枝殼聚糖聚離子膠束組合物。在所得的膠束組合物中加入適量的葡萄糖和甘露醇，混合均勻，凍干，密封，輻射滅菌即得。試驗例1聚離子膠束的APTT測定將15只SD大鼠隨機(jī)分為三組，分別為水蛭素溶液組、水蛭素普通膠束組(PEG-CS)、水蛭素靶向膠束組(RGD-PEG-CS)(實施例1)。眼眶靜脈叢取血1.6mL(檸檬酸鈉抗凝，全血抗凝劑=8.751.25)，吸取300μ1抗凝后的全血，加入30μ1不同濃度各溶液，蝸旋振蕩Imin混勻，4000rpm離心lOmin，吸取上清100μ1，_20°C冷凍待測。在37°C水浴上測定APTT。以濃度為橫坐標(biāo)，測定的時間與空白樣品血漿APTT的比值為縱坐標(biāo)得到量效關(guān)系圖。結(jié)果如圖2。圖2的結(jié)果表明，與市售水蛭素注射劑相比，實施例1可顯著提高血漿的APTT。和普通PEG-CS膠束相比，實施例1延長APTT的作用更強(qiáng)，說明R⑶起到了靶向作用，將膠束導(dǎo)向至由外源性凝血激活并聚集的血小板上，并與其結(jié)合，同時達(dá)到抗血小板和增強(qiáng)水蛭素的抗凝防栓活性的作用。試驗例2聚離子膠束血小板聚集率的測定新西蘭大耳兔耳緣靜脈取血，檸檬酸鈉19抗凝，分別向血液中加入等濃度的水蛭素溶液、水蛭素普通膠束(PEG-CS)、水蛭素靶向膠束(RGD-PEG-CS)(實施例1)，混合5min后比濁法測定最大血小板聚集率。結(jié)果見表1。表1的結(jié)果表明，實施例1的最大血小板聚集率低于同濃度的普通膠束和市售注射劑，說明實施例1可有效地抑制血小板聚集，增強(qiáng)水蛭素的抗凝防栓活性。表1最大血小板聚集率的測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>雖然已利用上述具體的實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)認(rèn)識到，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可進(jìn)行各種的改進(jìn)和改變，而且它們也應(yīng)在如權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求一種組合物，其含有水蛭素，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-聚乙二醇接枝殼聚糖(RGD-PEG-CS)和聚離子引發(fā)劑。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中RGD-PEG-CS與水蛭素的重量比為52-202，優(yōu)選102-162。3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的水蛭素選自天然水蛭素、基因工程發(fā)酵所得的重組水蛭素，及其變異體。4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)為具有RGD-Y結(jié)構(gòu)的短肽，Y可以不為任何氨基酸，也可為纈氨酸(V)、絲氨酸(S)、苯丙氨酸(F)。5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的聚乙二醇的分子量為400-20000Da，優(yōu)選2000-6000Da。6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的殼聚糖為殼聚糖或其衍生物，具有70%-95%的脫乙酰度，優(yōu)選75%-90%。7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的殼聚糖為殼聚糖或其衍生物，分子量為5-2000kDa，優(yōu)選IO-IOOOkDa08.如權(quán)利要求1所述的組合物，聚乙二醇與殼聚糖上氨基的摩爾比例為14-130，優(yōu)選110-120。9.如權(quán)利要求1-8任一項所述的組合物，其中聚離子引發(fā)劑為三聚磷酸鈉。10.如權(quán)利要求1-9任一項所述的組合物的制備方法，包括用醋酸-醋酸鈉緩沖液配制RGD-PEG-CS溶液，攪拌下滴入水蛭素溶液，攪拌反應(yīng)后滴加聚離子引發(fā)劑水溶液，攪拌并過濾ο11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中的醋酸_醋酸鈉緩沖液的pH范圍為4.0-5.4，優(yōu)選4.6-5.2，更優(yōu)選4.8-5.0。12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中RGD-PEG-CS與TPP的重量比為101-0.51，優(yōu)選41-31。13.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-9任一項的組合物和藥用的輔料。14.如權(quán)利要求1-9任一項的組合物用于制備治療急性冠脈綜合征、鏈激酶溶栓的輔助治療、深靜脈血栓血管形成術(shù)、肝素誘發(fā)的血小板減少、血液透析、彌散性血管內(nèi)凝血等相關(guān)疾病的藥物的用途。15.如權(quán)利要求14所述的用途，其特征在于所述藥物通過注射途徑給藥。全文摘要本發(fā)明涉及靶向血小板的水蛭素聚離子膠束組合物。該組合物含有水蛭素，及精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-聚乙二醇接枝殼聚糖和聚離子引發(fā)劑。該聚離子膠束組合物的制備方法簡單，具有血小板靶向性，增強(qiáng)水蛭素抗凝防栓活性，有效地抑制血小板聚集，同時顯著提高血漿的部分凝血活酶時間。文檔編號A61K47/36GK101810559SQ200910078179公開日2010年8月25日申請日期2009年2月20日優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日發(fā)明者劉艷,周艷霞,李馨儒,王菲申請人:北京大學(xué)