專利名稱：可逆轉(zhuǎn)水蛭素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體的說，涉及改造后的水蛭素突變體，該水蛭素突變體與 凝血酶結(jié)合后可被凝血酶酶解逆轉(zhuǎn)；還涉及該水蛭素突變體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水蛭素是醫(yī)用水蛭Hirudo medicinal s分泌至其唾液腺的一種活性多肽，由 Markwardt. F 于 1955 年最先發(fā)現(xiàn)并命名(Markwardt F. Naturwissenschaften. 1955. 42. 53 7-538.)。水蛭素有多種異構(gòu)體，其中三種主要異構(gòu)體HV1、HV2、HV3都有明顯的抗凝血酶活 性，占總異構(gòu)體的85%以上。HV1-3都含有65 66個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約7000 ； pI3 3. 5為酸性多肽；一級結(jié)構(gòu)中含有6個半胱氨酸，形成三對鏈內(nèi)二硫鍵(Cys6-Cysl4， Cysl6-Cys28, Cys22-Cys39)，位于肽鍵N端，對分子構(gòu)型起穩(wěn)定作用；酸性氨基酸集中在C 端區(qū)域，在C端的最后九個氨基酸殘基中有五個酸性氨基酸，并在第63位有一個硫酸化的 酪氨酸，肽鍵中無Arg、Met、Trp ；肽鍵中部有一個由Pro-LyS47-Pro組成的特殊結(jié)構(gòu)，其在 水蛭素與凝血酶相互作用中起較重要作用。水蛭素對凝血酶具有高度親和性和抑制性作用，對凝血酶的抑制作用以1 1摩 爾比方式進(jìn)行，是目前已知的自然界中最強(qiáng)的抗凝血酶抑制物。根據(jù)這一特性，人們開始了 大規(guī)模的臨床應(yīng)用研究，研究發(fā)現(xiàn)水蛭素可用于抗凝抗栓、治療不穩(wěn)定性心絞痛、急性心肌 梗塞、血管成形術(shù)后血栓形成、血液透析、體外循環(huán)、彌散性血管內(nèi)凝血等等。其抗凝效果明 顯優(yōu)于肝素，且無肝素誘導(dǎo)的血小板減小癥和血栓復(fù)形成、腎衰等并發(fā)癥。雖然用生物化學(xué)分離純化技術(shù)可以從大量醫(yī)用水蛭中分離純化出天然水蛭素， 但是應(yīng)用這種技術(shù)產(chǎn)率低，且飼養(yǎng)困難，故不能滿足臨床需求。1984年，Harvey等人 (Haycraft JB. et al. , Arch Exp Pathol PHarmakol 1884. 18. 209—17)構(gòu)建了水蛭素的 cDNA文庫，分離出編碼水蛭素HV2的cDNA并在大腸桿菌中表達(dá)，從而拉開了利用基因工程 方法大規(guī)模生產(chǎn)重組水蛭素的序幕(Dodt J.et al, [J]. FEBS Lett. 1986. 202 (2). 373.； 畢群等[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).1997. 33(6) :737-742;吳潔等，中國生物化 學(xué)與分子生物學(xué)報(bào).2005. 21 (3). 287-291. ；G. Loison, etal [J]. Biotechnology. 1988.6 72-77. ；M. -D. Kim. et al, Appl Microbiol Biotechnol. 2004. 65 :259_262· ；Stuart A. et al,Protein expression and purification. 1996. 8 476-482. ；Anfeng Xiao et al,Appl Microbiol Biotechnol. 2006. 72. 837-844)。重組水蛭素構(gòu)型與天然產(chǎn)物基本一致，僅63 位Tyr無硫酸酯化。FDA和歐洲分別批準(zhǔn)重組水蛭素1印irudin(Refludan，Schering)和 desirudin(Revasc, Aventis)上市，分別用于肝素誘發(fā)的血小板減少癥(HIT)和預(yù)防髖關(guān) 節(jié)置換(術(shù))深部靜脈血栓形成。由于水蛭素與凝血酶結(jié)全后具有不可逆轉(zhuǎn)性，在臨床研究中，發(fā)現(xiàn)有出血的副作 用。文獻(xiàn) 艮道(Greinacher A. . New York =Marcel Dekker, Inc. ,2004, pp 397-436..； Greinacher H et al. Blood 2000 ；96 846-851. ；Eichler P et al, . Blood 2002 ； 100 (supplement 1) :704a. ；Lubenow N etal. Blood 2002 ； 100 (supplement 1) :502a.Tardy B et al, Blood. 2006 Sep 1 ； 108 (5) 1492-6. Epub2006May 11.)在治療 HIT 病人 中，出血率為18. 8-20.4%，而出血死亡率為2.5%。該副作用限制了重組水蛭素在臨床上 的廣泛應(yīng)用。為此本專利通過對水蛭素的結(jié)構(gòu)改造，使改造后的水蛭素與凝血酶的結(jié)合具 可逆轉(zhuǎn)性，能逐步恢復(fù)被抑制凝血酶的活性。從而有效克服水蛭素的出血風(fēng)險(xiǎn)，增加其抗凝 作用的適用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對水蛭素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，使改造后的水蛭素突變體與凝血 酶結(jié)合后可被凝血酶酶解逆轉(zhuǎn)。同時，該改造后的水蛭素突變體可作為治療或預(yù)防的抗凝 藥物，該藥物能有效克服水蛭素在臨床應(yīng)用中導(dǎo)致出血的風(fēng)險(xiǎn)。天然水蛭素有多種異構(gòu)體，其中三種主要異構(gòu)體分別為Hirudin variant 1 (HVl)、Hirudinvariant 2 (HV2)、Hirudin variant 3 (HV3)，其相應(yīng)的天然氨基酸序列為
權(quán)利要求
水蛭素改造成具有可逆轉(zhuǎn)功能的水蛭素突變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可逆轉(zhuǎn)水蛭素突變體，其特征在于，所述水蛭素突變體與凝 血酶結(jié)合后可被凝血酶酶解逆轉(zhuǎn)，逐漸失去對凝血酶的抑制作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭素，其特征在于，所述水蛭素包括其不同變異體(HV1、 HV2.HV3)或其相應(yīng)N末端缺失四個氨基酸的變異體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭素突變體，其特征在于，所述水蛭素突變體具有如下特征a)將權(quán)利要求3的水蛭素變異體的第45位至第52位氨基酸被苯丙氨酸-脯氨酸-精 氨酸_脯氨酸_甘氨酸_甘氨酸_甘氨酸_甘氨酸取代，或；b)將權(quán)利要求3的水蛭素變異體的第41位至第52位氨基酸被甘氨酸-甘氨酸-甘氨 酸_甘氨酸_苯丙氨酸_脯氨酸_精氨酸_脯氨酸_甘氨酸_甘氨酸_甘氨酸_甘氨酸取 代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4任一項(xiàng)所述的水蛭素突變體，其特征在于，所述水蛭素突變體 是通過重組cDNA技術(shù)，由酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)所得。
6.權(quán)利要求1所述的水蛭素突變體的應(yīng)用，其特征在于，所述水蛭素突變體可用于制 備治療或預(yù)防的抗凝藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類可逆轉(zhuǎn)的水蛭素，其特征為，將野生型水蛭素的氨基酸進(jìn)行改造突變，改造后的水蛭素突變體與凝血酶結(jié)合后可被凝血酶酶解逆轉(zhuǎn)而逐漸失去抑制凝血酶活性的功能。同時，這一類可逆轉(zhuǎn)水蛭素可用于制備抗凝藥物。
文檔編號C07K14/815GK101993489SQ20091010465
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者張?zhí)m, 張益 , 范開, 陳勇, 陳海容 申請人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司