專利名稱：一種材料表面制備殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微圖形的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種材料表面制備殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微圖形的方 法。此復(fù)合微圖形具有抗菌性，并促進成骨細胞定位吸附及生長等作 用。
背景技術(shù)：
很多材料可以指導(dǎo)細胞的生長，但一些特定的組織如神經(jīng)、骨、 血管和角膜等組織在體內(nèi)再生時要求細胞得到更多的特異信號的指 導(dǎo)。因此，理想的材料應(yīng)能選擇性地參與修復(fù)組織中目標細胞的表達 的特異黏附和生長因子受體相互作用。研究表明，多種細胞可以響應(yīng) 微米尺度，甚至于納米尺度的材料表面拓撲結(jié)構(gòu)，細胞的形態(tài)、取向、 生長和分化亦受到表面結(jié)構(gòu)的影響，為了能研究生物分子與基底材料 相互作用的過程，希望這些分子在特定的基底上能有明確的定位并按 照預(yù)定的方式呈現(xiàn)，則需要先對基底進行表面處理或在基底表面構(gòu)建 微加工圖形，以達到引導(dǎo)細胞定位吸附以及控制細胞定向生長的目 的。
微圖形化是指空間上每個確定的區(qū)域或位點含有已知微量濃度 與結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)，并且利用這樣的微圖形來獲取它們與被分析物以
及周圍環(huán)境之間相互作用的信息。哈佛大學(xué)Whitesides教授研究小組 發(fā)明了包括微接觸印刷、復(fù)制模塑、微轉(zhuǎn)移模塑、納米壓印技術(shù)等多 項微圖形轉(zhuǎn)移技術(shù)在內(nèi)的"軟刻蝕"技術(shù)。將軟刻蝕技術(shù)與吸附技術(shù)二 者相結(jié)合，可以在材料基底上接枝不同的基團或不同的化學(xué)物質(zhì)，并 得到不同圖案化的基底。這種基底不僅能靈活的調(diào)整所吸附物質(zhì)的種 類和數(shù)量，還能對在表面化學(xué)物質(zhì)的吸附沉積過程加以控制。目前， 已經(jīng)研究出了許多微加工工藝來實現(xiàn)蛋白質(zhì)與材料表面基團反應(yīng)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的圖形化或陣列化。
復(fù)合微圖形是指將兩種或多種類型的分子共同結(jié)合在同一塊基 底上，利用其不同的化學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)生不同的化學(xué)作用，進而在生物體 內(nèi)尋找不同的作用標靶，達到利用同一塊材料能產(chǎn)生不同功效目的。 殼聚糖是甲殼素脫乙?；频玫奶烊痪坳栯x子多糖，作為自然界中唯 一的堿性多糖，具有良好的生物降解性、可再生性和抗菌防腐性等性 能，其衍生物有良好的抗凝血性，殼聚糖已被廣泛的運用于醫(yī)藥、食 品、農(nóng)業(yè)、保健等多個領(lǐng)域。白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)， 牛血清白蛋白己被證明具有良好的生物相容性。
近年來，已有采用"軟刻蝕"技術(shù)在材料表面制備有微圖形形貌的
生物分子陣列的研究。Feng等采用了微接觸印刷法把殼聚糖和牛血清 白蛋白自組裝到充滿醛基的玻璃基片表面，得到二者的復(fù)合微圖形。 該方法的不足是在于在前處理基底的過程中，引入了額外的醛基官能 團，增加了材料的潛在毒性，且微接解印刷法僅僅是將待組裝的生物 分子溶液印刷在模板的表面，模板的承載量小，制備所得的生物分子 偏少，發(fā)揮的生物作用也相應(yīng)較弱。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的以上缺點，本發(fā)明的目的是提供一種在材料表面 制備兩種物質(zhì)的復(fù)合微圖形的方法，即采用微加工技術(shù)與表面吸附相 結(jié)合的方法，制備殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微圖形。具體手段為
一種材料表面制備殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微圖形的方法，以殼聚糖
CS和牛血清白蛋白BSA為原料采用微轉(zhuǎn)移模塑法使CS和BSA兩種 物質(zhì)在硅表面均勻吸附得到復(fù)合微圖形，包括如下步驟
(1) 硅基片的制備將純硅片采用干氧氧化處理，以獲得表面 有均勻致密氧化層硅基片；所述表面均勻致密氧化層硅基片經(jīng)清洗后 經(jīng)堿處理，最后用蒸餾水清洗干凈干燥后得到表面充滿羥基的硅片。
(2) 溶液的配制CS溶于CH3COOH中，配制成2 mg/ml CS 的CH3COOH溶液；BSA溶于pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液中，配
5制成2mg/ml的BSA溶液。
(3) 彈性印章制備按質(zhì)量比10:1的比例充分混合聚二甲基硅 氧烷PDMS與硅橡膠固化劑，所得混合物澆鑄在表面具有微米尺寸 溝槽結(jié)構(gòu)的硅模板上；于8(TC下固化后將固化物從硅模板上剝離， 經(jīng)親水性改善處理后再經(jīng)蒸餾水清洗、干燥得到有溝槽表面結(jié)構(gòu)的彈 性印章。
(4) 微圖形的拓制分別用(2)得到的CS溶液和BSA溶液分 別滴加在二個(3)得到的有溝槽表面結(jié)構(gòu)的彈性印章上，靜置并刮 除表面多余的溶液，得到二個分別具有CS微圖形和BSA微圖形的彈 性印章，即完成微圖形的分別拓制；。
(5) 將(4)得到的具有CS微圖形的彈性印章反扣在(1)步 驟制得的硅基片表面，保持二者的完全緊密接觸，于2(TC下干燥后 剝離彈性印章，再于0.0125 mol/L的NaOH中浸泡1 min，以中和CS 的酸性；硅基片表面吸附留下CS的溝槽微圖形。
(6) 將(4)得到的具有BSA微圖形的彈性印章反扣在(5) 得到的具有CS的溝槽微圖形的硅基片上；在已吸附有CS的硅基片 表面，交叉地吸附上BSA微圖形，得到材料表面形狀規(guī)則的殼聚糖/ 蛋白質(zhì)復(fù)合微圖形。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點，在材料表 面制備了物質(zhì)承載量大的微米結(jié)構(gòu)，且反應(yīng)過程中不需要引入其它有 潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。其有益效果具體表現(xiàn)為
首先，本發(fā)明在材料表面制備了物質(zhì)承載量較大的殼聚糖與牛血 清白蛋白復(fù)合微圖形，可以較好利用殼聚糖的抗菌性和牛血清白蛋白 的良好生物相容性。
其次，在基底與殼聚糖和牛血清白蛋白相互作用的過程中，除了 對基底進行堿處理時引入羥基基團外，不再使用別的有機試劑處理， 避免引入額外的化學(xué)物質(zhì)，進而減少了對細胞的潛在毒性。
再次，本發(fā)明方法實現(xiàn)了殼聚糖與蛋白質(zhì)共同吸附在同一材料表面，能夠同時且充分地利用殼聚糖的抗菌作用與蛋白質(zhì)的促細胞定位 吸附及生長作用，從而在微觀尺度上實現(xiàn)了殼聚糖和蛋白質(zhì)的均勻復(fù) 合，有利于在微米級調(diào)控細胞的黏附與生長。
最后，微圖形的尺寸大小及復(fù)合圖形間的角度可以根據(jù)需要進行 適當?shù)恼{(diào)整，僅僅通過調(diào)整圖形模板的尺寸就可得到，從而制備工藝 簡單易行，制品周期短，能靈活地運用于各種微米級的人體組織中。


如下
圖1本發(fā)明實施例1殼聚糖/牛血清白蛋白復(fù)合微圖形的制備工 藝流程。
圖2本發(fā)明實施例1殼聚糖/牛血清白蛋白復(fù)合微圖形的紅外圖 譜。(a) CS/BSA復(fù)合微圖形；(b) BSA; (c) CS。
圖3本發(fā)明實施例1殼聚糖/牛血清白蛋白復(fù)合微圖形的光鏡圖。 圖4本發(fā)明實施例1殼聚糖/牛血清白蛋白復(fù)合微圖形的AFM圖。
圖5本發(fā)明實施例1殼聚糖/牛血清白蛋白復(fù)合微圖形的細胞形 態(tài)的光鏡圖。
圖6本發(fā)明實施例1殼聚糖/牛血清白蛋白復(fù)合微圖形的抗菌實 驗裝置圖。
圖7本發(fā)明實施例1殼聚糖/牛血清白蛋白復(fù)合微圖形抗菌率數(shù)據(jù)。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的描述。 實施例1
(1) 取純硅片作為基底材料，在100(TC下燒結(jié)4小時，以得到 硅表面致密均勻的氧化層，經(jīng)乙醇、水超聲；
(2) 取40 g NaOH溶于500 ml蒸餾水，配制成5 mol/L堿溶液， 將(1)制得的硅片在6(TC水浴中堿處理3小時，用蒸餾水清洗 干凈，干燥，以得到表面充足的羥基；
7(3) 取0.4 g乙酸溶于19.6 g蒸餾水，配制成質(zhì)量分數(shù)為2%的 20ml乙酸溶液，再稱取40mgCS加入乙酸溶液中，攪拌均勻， 得到2mg/ml的CS溶液；
(4) 取0.087 gNaH2P04， 0.135 gNa2HPO^B 0.085 gNaCl溶于 20ml蒸餾水中，并以HCl或Tris調(diào)節(jié)pH值為6.6，配制成磷酸 鹽緩沖液；取40mgBSA溶于磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻，得到 2mg/ml的BSA溶液；
(5) 取70g聚二甲基硅氧烷(PDMS)，硅橡膠固化劑7g，充 分攪拌，靜置至氣泡完全消失，把混合物澆鑄在表面具有微米尺 寸溝槽結(jié)構(gòu)的硅模板上，減壓抽真空除氣泡后，于8(TC下固化2 小時。固化完全后將PDMS從硅模板上剝離，即得到有圖形的彈 性印章；
(6) 先將PDMS印章浸泡在1 mol/L鹽酸溶液中12 h，改善其 親水性，用蒸餾水清洗干凈，干燥。在PDMS印章表面滴加配制 好的步驟(3) CS溶液，靜置10min，刮除表面多余的溶液，將 彈性印章反扣在基片表面，保持二者的完全緊密接觸，于2(TC下 干燥2 h后剝離PDMS印章，即得硅表面吸附CS的溝槽微圖形 樣品，將樣品于0.0125 mol/L的NaOH中浸泡lmin，以中和CS 的酸性；
(7) 將配制好的步驟(4) BSA溶液滴加到PDMS表面，靜置 10min，用步驟(6)的方法，在已吸附有CS的硅基片表面，交 叉地制備BSA微圖形，以得到二者的復(fù)合微圖形。
圖1中可看到本發(fā)明的微圖形拓制及材料表面復(fù)合微圖形吸附 的基本工藝流程。
圖2是CS/BSA復(fù)合微圖形的紅外圖譜。(a) CS/BSA復(fù)合微圖
形；(b) BSA; (c) CS。通過比對CS和BSA特征峰可知，復(fù)合
微圖形由CS和BSA 二者組成。圖3是CS/BSA復(fù)合微圖形的光鏡圖。可以看出，二者在硅表面
組成了溝槽交叉狀復(fù)合微圖形結(jié)構(gòu)。
圖4是CS/BSA復(fù)合微圖形的AFM圖。
圖5是MC3T3-E成骨細胞在CS/BSA復(fù)合微圖形表面生長1天 的光鏡圖a,X200; b.X400?？捎^察得知，MC3T3-E成骨細胞1天 時在CA/BSA復(fù)合微圖形的表面黏附較好，可觀察到細胞的偽足，明 顯可以看到細胞在溝槽交叉狀的微圖形表面產(chǎn)生了定位吸附，能夠沿 著相互垂直的微圖形生長，排列出相對應(yīng)的交叉狀圖案，說明微圖形 對于成骨細胞在材料表面的生長方向有很強的誘導(dǎo)性。從細胞形態(tài)及 鋪展情況可知，細胞生長良好，CS/BSA復(fù)合微圖形具有較好的生物 相容性。
圖7為本發(fā)明實施例1CS/BSA復(fù)合微圖形的抗菌率數(shù)據(jù)，菌落數(shù) 測定法測定樣品對大腸桿菌、白色葡萄球菌的抑菌率(n=3)
根據(jù)圖7中的抗菌率數(shù)據(jù)可以看出，同濃度的菌液在CS/BSA復(fù) 合微圖形表面作用一段時間后，復(fù)合微圖形對大腸桿菌的抑菌率達到 了34.3%，對白色葡萄球菌的抑菌率達到30.5%。證明CS/BSA復(fù)合 微圖形對這兩個菌種都具有殺菌能力，對大腸桿菌的殺菌能力高于白
色葡萄球菌?？咕鷮嶒灥牟襟E
(1) 菌體的活化
在無菌工作臺上，將適量的己滅菌的胰蛋白胨(LB)培養(yǎng)基
倒入平板中，然后取50 的菌種接種于培養(yǎng)基上，用涂布器將 細菌涂布均勻，放入恒溫培養(yǎng)箱中37。C下，在恒溫培養(yǎng)12h。
(2) 菌懸液的制備
用接種環(huán)取適量的步驟1培養(yǎng)12小時(h)后活化好的菌體， 放入盛有IO ml液體LB培養(yǎng)基的試管中。然后，將接種好的試 管放入37"C， 200 rmp的搖床中，培養(yǎng)12 h。隨后采用梯度稀釋 法測試菌液的濃度，并調(diào)節(jié)濃度為lxl()S個/ml。
(3) 加入樣品
用步驟2中配制好的lxl()S個/ml的菌液，分別稀釋10M咅。將被
9測樣品放置在載玻i片上，放在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部加入無菌水，
以防止菌液蒸發(fā)，如圖6所示(1)無菌水(2)玻片(3)樣品(4)菌 液。選用CS/BSA復(fù)合微圖形樣品、純硅片樣品共2個實驗組，每組 3個平行樣。取50 pL菌液滴于樣品表面，37'C培養(yǎng)12h后將菌液 移至500jliLPBS溶液中，搖勻。
(4) 觀察計數(shù)
用移液槍吸取50 ^步驟3的液體，涂布于固體培養(yǎng)基上， 放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，觀察細菌的生長情況，記錄，并對 觀察到的菌落數(shù)進行計數(shù)。
(5) 抑菌率計算 樣品的抗菌作用可以通過計算樣品的抗菌率來表示，抗菌率
的計算方法如式l所示。每個實驗組用3個平行樣，進行三次平行 試驗，以得到抗菌率。抗菌率由以下公式計算。
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乂 (式l)
結(jié)論與純Si片的對比可以看出
(1) 白色葡萄球菌細菌量為100(_il，細菌濃度lxl()S個/ml的條 件下，培養(yǎng)12h后，CS/BSA復(fù)合微圖形對白色葡萄球菌的抑菌率達 到30.5%，具有一定的殺菌效果。
(2) 大腸桿菌細菌量為100 pl，細菌濃度lxl()S個/ml的條件下， 培養(yǎng)12 h后，CS/BSA復(fù)合微圖形對大腸桿菌的抑菌率達到34.3%, 具有一定的殺菌效果，且CS/BSA復(fù)合微圖形對大腸桿菌的抑菌效果 要稍微優(yōu)于對白色葡萄球菌的抑菌效果。
綜合以上實驗結(jié)果可知，微轉(zhuǎn)移模塑法已成功制備出CS和BSA 均勻吸附的CS/BSA復(fù)合微圖形。同時CS/BSA復(fù)合微圖形具有較好 的抗菌性能和良好的生物相容性。 實施例2
將實施例1的牛血清白蛋白換成膠原蛋白，取膠原蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中，配制成2mg/ml膠原蛋白溶液，其他條件不變，運用本
發(fā)明的實驗方法，制備殼聚糖/膠原蛋白的復(fù)合微圖形。
實施例3
將實施例1中的純硅片換成純鈦片，將純鈦片用丙酮、水超聲后，放在5mol/L的NaOH溶液中，于6(TC下堿處理3h，用蒸餾水清洗干凈，干燥，即得到鈦表面充足且均勻的羥基，其他條件不變，運用本發(fā)明的實驗方法，制備鈦基底表面的殼聚糖/牛血清白蛋白的復(fù)合微圖形。實施例4
將實施例1中的純硅片換成鈦合金(如Ti6A14V)，將鈦合金片用丙酮、水超聲后，放在5mol/L的NaOH溶液中，于60。C下堿處理3h，用蒸餾水清洗干凈，干燥，即得到鈦合金表面充足且均勻的羥基，其他條件不變，運用本發(fā)明的實驗方法，制備鈦合金基底表面的殼聚糖/牛血清白蛋白的復(fù)合微圖形。
本發(fā)明提供的制備CS/BSA復(fù)合微圖形，在整個制備過程中，基底前處理時僅采用堿處理，除了引入羥基基團外就不再引入額外的基團，進而減少了其它化學(xué)基團對人體細胞作用的潛在毒性。另外微軟移模塑法所能承載的物質(zhì)的量要多于其它微加工方法，故能提高制備樣品的含量，增強其生物活性。能根據(jù)需要調(diào)整微圖形尺寸大小及二者復(fù)合圖形角度，從而適用面更廣。復(fù)合微圖形制備工藝簡單易行，而且制品周期短，能夠得到綜合性能好的抗菌及生物相容性好的復(fù)合微圖形。
權(quán)利要求
1、一種材料表面制備殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微圖形的方法，以殼聚糖CS和牛血清白蛋白BSA為原料采用微轉(zhuǎn)移模塑法使CS和BSA兩種物質(zhì)在硅表面均勻吸附得到復(fù)合微圖形，包括如下步驟(1)硅基片的制備將純硅片采用干氧氧化處理，以獲得表面有均勻致密氧化層的硅基片；所述表面均勻致密氧化層的硅基片經(jīng)清洗后再經(jīng)堿處理，最后用蒸餾水清洗干凈，干燥后得到表面充滿羥基的硅片；(2)溶液的配制CS溶于CH3COOH中，配制成2mg/ml CS的CH3COOH溶液；BSA溶于pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液中，配制成2mg/ml的BSA溶液；(3)彈性印章制備按質(zhì)量比10∶1的比例充分混合聚二甲基硅氧烷PDMS與硅橡膠固化劑，所得混合物澆鑄在表面具有微米尺寸溝槽結(jié)構(gòu)的硅模板上；于80℃下固化后將固化物從硅模板上剝離，經(jīng)親水性改善處理后再經(jīng)蒸餾水清洗、干燥得到有溝槽表面結(jié)構(gòu)的彈性印章；(4)微圖形的拓制分別用(2)得到的CS溶液和BSA溶液分別滴加在二個(3)得到的有溝槽表面結(jié)構(gòu)的彈性印章上，靜置并刮除表面多余的溶液，得到二個分別具有CS微圖形和BSA微圖形的彈性印章，即完成微圖形的分別拓制；(5)將(4)得到的具有CS微圖形的彈性印章反扣在(1)步驟制得的硅基片表面，保持二者的完全緊密接觸，于20℃下干燥后剝離彈性印章，再于0.0125mol/L的NaOH中浸泡1min，以中和CS的酸性；硅基片表面吸附留下CS的溝槽微圖形；(6)將(4)得到的具有BSA微圖形的彈性印章反扣在(5)得到的具有CS的溝槽微圖形的硅基片上，在已吸附有CS的硅基片表面，交叉地吸附上BSA微圖形，得到材料表面形狀規(guī)則的殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微圖形。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種材料表面制備殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微圖 形的方法,其特征在于，所述純硅片采用干氧氧化處理，采用在IOO(TC下燒結(jié)4小時。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種材料表面制備殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微圖 形的方法，其特征在于，所述彈性印章表面親水性改善處理采用1 mol/L鹽酸溶液中浸泡12小時處理。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述殼的一種材料表面制備殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微 圖形的方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白可由膠原蛋白替代。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種材料表面制備殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微圖 形的方法，其特征在于，基底材料純硅至少可為以下一種物質(zhì)替代 純鈦，鈦合金。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種材料表面制備殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微圖形的方法。選用硅作為基底，在1000℃下干氧氧化，硅表面得到一層致密均勻的氧化膜，再用堿處理，清洗干燥，以得到表面充滿羥基的硅片。將牛血清白蛋白與磷酸鹽緩沖液、殼聚糖與乙酸分別配制一定濃度的溶液，采用微轉(zhuǎn)移模塑法在羥基化的硅表面先制備殼聚糖的溝糟狀微圖形，再在此涂層上相叉地制備蛋白質(zhì)的溝槽狀微圖形，最終制得材料表面形狀規(guī)則的殼聚糖/蛋白質(zhì)復(fù)合微圖形。
文檔編號A61L31/04GK101461965SQ200910058128
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月14日
發(fā)明者波 馮, 周先禮, 姜麗麗, 屈樹新, 張紅平, 汪建新, 杰 翁, 佳 謝, 雄 魯 申請人:西南交通大學(xué)