專利名稱：藍(lán)萼甲素酸酯衍生物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藍(lán)萼甲素(GLA)衍生物，特別涉及藍(lán)萼甲素酸酯衍生物。本發(fā)明還涉 及所述藍(lán)萼甲素酸酯衍生物的制備方法及其在治療癌癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
唇形科香茶菜屬植物。在亞洲東部和非洲西部廣為分布，全世界約有150種，我國 約有90種25個(gè)變種。其中約有30種民間作為藥用，作為清熱解毒、抗癌消炎、健脾、活血、 杭菌藥來使用。人們對該屬植物的-菇類成分作了研究，已從中提取了百余種藥類成分。經(jīng) 藥理篩選發(fā)現(xiàn)許多二萜化合物具有細(xì)胞毒、抗腫瘤、杭炎活性作用。藍(lán)萼香茶菜是唇形科香茶菜屬植物，分布在我國的東北、華北，朝鮮.日本，原蘇 聯(lián)遠(yuǎn)東地區(qū)，吉林省資源尤其豐富。藍(lán)萼香茶菜具有健胃、清熱解毒、活血、抗菌消炎和抗癌 活性，用于胃炎、肝炎初起、感冒發(fā)熱、乳腺炎、關(guān)節(jié)痛等疾病?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)全草對心血管 有一定的作用，而其中的有效成分對血小板聚集及癌癥有一定的影響。1981年許云龍等人從藍(lán)萼香茶菜中提取出藍(lán)萼甲素(glaucocalyxinA)和藍(lán)萼乙 素(glaucocalyxinB)，從光譜中推斷藍(lán)萼甲素具有香茶菜屬二萜典型的巧一氧_16 —貝殼 杉烯(ent-15-OXO-16-kaurene)骨架，而藍(lán)萼乙素是藍(lán)萼甲素的14 一乙?；?，把兩者分 別乙酰化，得到相同的乙?；?，從而證實(shí)了兩者的相互關(guān)系。隨后趙全成也從吉林產(chǎn)藍(lán)萼 香茶菜中分得這兩種二萜。1988年劉晨江等從北京地區(qū)產(chǎn)藍(lán)萼香茶菜中分得甲素和乙素外，還分得藍(lán)萼丙素 (glaucocalyxinC)，結(jié)構(gòu)為對映 _7p，14a, 15a-三羥基-16-貝殼杉 酮。Dongsa kimls, 除了從中分出藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素和藍(lán)萼丙素，還分出了兩種新二萜glaucocalyxinD和 glaucocalyxinE并列出了這五種化合物的結(jié)構(gòu)紅外紫外吸收值、最主要的1H—核磁共振、 13C 一核磁共振化學(xué)位移值及質(zhì)譜數(shù)據(jù)值。金永日等從藍(lán)萼香茶菜根中分得了藍(lán)萼甲素，另外王先榮等從安徽產(chǎn)王棗子 (lsodonamethystoides (Benth) CyffuetHsuan)中也分得藍(lán)萼甲素。王慧芬等人用反相高效 液相色譜法外標(biāo)法對不同部位及不同采集期的藍(lán)萼香茶菜中藍(lán)萼甲素的含量進(jìn)行了測定， 結(jié)果表明葉中藍(lán)萼甲素遠(yuǎn)高于根、莖。不同采集期以7-8月份含量高，9月末含量下降。張 元桐等也采用反相HPLC測定藍(lán)萼甲素含量，測得藍(lán)萼甲素含量為1.03%，平均回收率為 99. 2%。從藍(lán)萼甲素體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，其具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，且抗瘤譜較廣，能抑 制Lewis肺癌、5180實(shí)體型以及HCA實(shí)體型等實(shí)體瘤的生長，明顯增加荷腹水型5180腹水 型和荷HCA腹水型小鼠的生命延長率，其抗腫瘤作用的強(qiáng)弱呈劑量依賴性?？蒲腥藛T用MTT法對從毛葉香茶菜葉中分離鑒定的14個(gè)己知對映-貝殼杉烯類 二萜化合物進(jìn)行了人早幼粒白血病細(xì)胞、人卵巢癌細(xì)胞和人肺癌細(xì)胞的抗癌活性研究，其 中具有a _亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)的化合物對上述3種腫瘤細(xì)胞株均表現(xiàn)出不同程度的抑制 活性。從藍(lán)萼香茶菜葉分離的化合物如藍(lán)尊香茶菜甲素(GLA)和乙素(GLB)結(jié)構(gòu)中具有a -亞甲基環(huán)戊酮，因而顯示出較強(qiáng)的生物活性。對若干天然及化學(xué)修飾后的貝克杉烯類化合物進(jìn)行了系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性篩 選及構(gòu)效關(guān)系研究表明，應(yīng)用化學(xué)手段破壞分子中a-亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)單元，會顯著降 低貝克杉烯類化合物的抗腫瘤活性。由于藍(lán)萼甲素為對映-貝殼杉烯類二萜化合物，其化合物極性小，易溶于氯仿等 非極性溶劑，在水中不溶，因此不適合直接作為藥物進(jìn)行給藥；藍(lán)萼甲素體外具有明顯的抗 癌作用，但在體內(nèi)需大劑量長時(shí)間用藥才能產(chǎn)生藥效。藥物在體內(nèi)消除很快，半衰期短，尚 不能直接作為藥物使用。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于藍(lán)萼甲素(GLA)特別是其a -亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)對腫瘤細(xì)胞株活性具有良好 的抑制作用，然而由于其極性小、半衰期短等特點(diǎn)，其不適于直接作為藥物進(jìn)行給藥，故現(xiàn) 在需要以藍(lán)萼甲素(GLA)為先導(dǎo)化合物，通過對先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)改造，來獲得藍(lán)萼甲素 的衍生物，從而使其按照已知的代謝途徑失活或不代謝，而由原形排出體外，從而提高藥物 的安全性，增加藥效。本發(fā)明的目的之一在于提供具有對腫瘤細(xì)胞株良好的抑制作用的、結(jié)構(gòu)改良的藍(lán) 萼甲素酸酯衍生物，從而解決GLA極性小、不易溶于水、半衰期短、在體內(nèi)消除過快等缺陷， 從而作為治療癌癥的藥物使用。本發(fā)明的目的之二在于提供所述藍(lán)萼甲素酸酯衍生物的制備方法，避免單純的采 用有機(jī)合成所帶來的毒副作用較大的缺陷，并且避免單純的采用原料提純多帶來的藥效較 低、無法針對性治療某一特定癌癥的缺陷。本發(fā)明所公開的藍(lán)萼甲素酸酯衍生物是一種貝殼杉烷型四環(huán)二萜類物質(zhì)，具有貝 殼杉烷型結(jié)構(gòu)、羰基和羥基，是藍(lán)萼甲素與羧酸的酯化物，其分子結(jié)構(gòu)的通式如下
權(quán)利要求
一種藍(lán)萼甲素酸酯衍生物，其特征在于，是一種貝殼杉烷型四環(huán)二萜類物質(zhì)，具有貝殼杉烷型結(jié)構(gòu)、羰基和羥基，是藍(lán)萼甲素與羧酸的酯化物，其分子結(jié)構(gòu)的通式如下其中，R1為丁二酸取代基 C4H5O4、戊二酸取代基 C5H7O4、丁二酸的甘氨酸衍生物取代基 C6H8NO5、戊二酸的甘氨酸衍生物取代基 C7H10NO5或 OH，R2為丁二酸取代基 C4H5O4、戊二酸取代基 C5H7O4、丁二酸的甘氨酸衍生物取代基 C6H8NO5、戊二酸的甘氨酸衍生物取代基 C7H10NO5或 OH，R1和R2中至少有一個(gè)為 OH。F2009100564573C0000011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的藍(lán)萼甲素酸酯衍生物，其特征在于，所述Rl為-C4H504、所述R2 為-0H,或者所述Rl為-0H、所述R2為-C4H504，其分子結(jié)構(gòu)分別如下
3.如權(quán)利要求1所述的藍(lán)萼甲素酸酯衍生物，其特征在于，所述Rl為-C5H704、所述R2
4.如權(quán)利要求1所述的藍(lán)萼甲素酸酯衍生物，其特征在于，所述Rl為-C6H8N05、所述
5.如權(quán)利要求1所述的藍(lán)萼甲素酸酯衍生物，其特征在于，所述Rl為-C7H10N05、所述R2為-0H，或者所述Rl為-0H、所述R2為-C7H10N05，其分子結(jié)構(gòu)分別如下
6. 一種如權(quán)利要求1所述的藍(lán)萼甲素酸酯衍生物的制備方法，其特征在于，包含以下步驟步驟1 提取步驟1. 1 取香茶菜藥材(地上部分)粉碎至20目 50目；步驟1. 2 將所得的粉碎物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 5 1 15混合，加熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時(shí)，提取、過濾，得到提取液和剩余物；步驟1. 3 將步驟1. 2所得的剩余物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 5 1 15 混合，加熱，在80°C 90°C溫度條件下回流1 2小時(shí)，提取、過濾，得到提取液和剩余物， 重復(fù)該步驟1 3次；步驟1. 4 合并步驟1. 2和1. 3所得的提取液； 步驟2 溶劑處理步驟2. 1 將步驟1所得的提取液加熱，在55°C 65°C溫度條件下加熱減壓濃縮，回收 乙醇并得到粘稠的初級濃縮物；步驟2. 2:將步驟2.1所得的初級濃縮物與水按照體積比1 8 1 10混合，在室 溫條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌10分鐘，隨后靜置6 12小時(shí)，棄去上清液得到 下層固體；步驟2. 3:將步驟2. 2所得的固體與乙酸乙酯(A.R.)按照體積比1 4 1 6混合， 在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時(shí)，過濾得到 濾液和不溶物；步驟2. 4 將步驟2. 3所得的不溶物與乙酸乙酯(A. R.)按照體積比1 4 1 6混 合，在25°C 35°C溫度條件下以60 120轉(zhuǎn)/分的速度攪拌溶解，靜置1 3小時(shí)，過濾 得到濾液和不溶物，重復(fù)該步驟1 3次；步驟2. 5 合并步驟2. 3和2. 4所得的濾液；步驟2. 6 將步驟2. 5所得的濾液加熱，在35°C 45°C溫度條件下加熱減壓濃縮，回收 乙酸乙酯(A. R.)，得到固體濃縮物； 步驟3 樹脂處理步驟3. 1 將步驟2所得的固體濃縮物與95%乙醇(A. R.)按照體積比1 4 1 6 混合溶解，得到溶液；步驟3. 2 將步驟3. 1所得的溶液緩慢加到7號樹脂柱中，起觀察樹脂的顏色，在樹脂 柱有2/3變色時(shí)，停止加樣，并采用200ml 400ml的95%乙醇(A. R.)沖洗該樹脂柱，收集 所有流出液，所述樹脂柱的填充物為強(qiáng)堿性陰離子樹脂并用氫氧化鈉飽和至PH值中性；步驟3. 3 將步驟3. 2所得流出液加熱，并在55°C 65°C溫度條件下加熱減壓回流，直 至溶劑干，得到固體殘留物；步驟4:重結(jié)晶步驟4. 1 將上述殘留物與30°C 40°C的極性溶劑按照體積比1 4 1 6混合， 得到初級溶液，加熱，在30°C的 40°C溫度條件下減壓濃縮，在_23°C _13°C溫度條件下 靜置析晶，過濾得到淺黃色針狀結(jié)晶；所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 2混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合 溶液；步驟4.2:將步驟4.1所得的結(jié)晶與極性溶劑按照體積比1 4 1 6混合， 在-23°C _13°C溫度條件下反復(fù)重結(jié)晶2 4次，每次12 24小時(shí)，得到中間產(chǎn)物藍(lán)萼 甲素；所述極性溶劑為按照體積比1 1 1 4混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合 溶液；步驟5 衍生化將步驟4所得藍(lán)萼甲素溶于四氫呋喃(THF)中，在室溫下，加入丁二酸或戊二酸和 4- 二甲氨基吡啶(DMAP)，室溫下攪拌，減壓蒸餾除去四氫呋喃，隨后采用乙酸乙酯萃取得 到有機(jī)相，蒸去溶劑干燥得到藍(lán)萼甲素酸酯及其衍生物。
7.如權(quán)利要求6所述的藍(lán)萼甲素酸酯衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟5進(jìn)一 步包含以下步驟步驟5. 1 將0. 96 1. 16g步驟4所得藍(lán)萼甲素溶于25 35ml四氫呋喃中，并在室 溫條件下，依次加入0. 857 1. 057g 丁二酸和0. 067 0. 087gDMAP,在室溫條件下攪拌反 應(yīng)10 14小時(shí)；步驟5. 2 將步驟5. 1的反應(yīng)溶液加熱至40°C 50°C并減壓蒸餾，除去四氫呋喃； 步驟5. 3 向步驟5. 2的反應(yīng)溶液中加入25 35ml水稀釋，隨后采用25 35ml乙酸 乙酯萃取2 4次，合并有機(jī)相并采用飽和食鹽水洗滌、無水硫酸鈉干燥；步驟5. 4 將步驟5. 3中經(jīng)洗滌干燥后的有機(jī)相加熱至40°C 50°C并減壓蒸餾，出去 溶劑，隨后在室溫條件下干燥，得到淡黃色油狀粗產(chǎn)物；步驟5. 5 采用硅膠柱層析分離步驟5. 4所得淡黃色油狀粗產(chǎn)物，隨后將所得餾分加熱 至30°C 40°C減壓濃縮蒸去溶劑，得到藍(lán)萼甲素的丁二酸酯的無色晶體；所述層析分離過程中，采用體積比為9 1 11 1的氯仿丙酮混合溶液作為洗脫液。
8.如權(quán)利要求6所述的藍(lán)萼甲素酸酯衍生物的制備方法，其特征在于，所述步驟5進(jìn)一 步包含以下步驟步驟5. 1 將0. 96 1. 16g步驟4所得藍(lán)萼甲素溶于25 35ml四氫呋喃中，并在室 溫條件下，依次加入1. 025 1. 225g戊二酸和0. 080 1. OOOgDMAP，在室溫條件下攪拌反 應(yīng)10 14小時(shí)；步驟5. 2將步驟5. 1的反應(yīng)溶液加熱至40°C 50°C并減壓蒸餾，除去四氫呋喃； 步驟5. 3 向步驟5. 2的反應(yīng)溶液中加入25 35ml水稀釋，隨后采用25 35ml乙酸 乙酯萃取2 4次，合并有機(jī)相并采用飽和食鹽水洗滌、無水硫酸鈉干燥；步驟5. 4 將步驟5. 3中經(jīng)洗滌干燥后的有機(jī)相加熱至40°C 50°C并減壓蒸餾，出去 溶劑，隨后在室溫條件下干燥，得到淡黃色油狀粗產(chǎn)物；步驟5. 5 采用硅膠柱層析分離步驟5. 4所得淡黃色油狀粗產(chǎn)物，隨后將所得餾分加熱至30°C 40°C減壓濃縮蒸去溶劑，得到藍(lán)萼甲素的戊二酸酯的無色晶體；所述層析分離過程中，采用體積比為9 1 11 1的氯仿丙酮混合溶液作為洗脫液。
9.如權(quán)利要求7所述的藍(lán)萼甲素酸酯衍生物的制備方法，其特征在于，進(jìn)一步包括步 驟6，所述步驟6包括以下步驟步驟6. 1 將113. 5 133. 5mg藍(lán)萼甲素的丁二酸酯溶于1 5ml四氫呋喃(THF)，將 19. 3 21. 3mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于3 7ml磷酸鹽緩沖溶液(PBS緩沖溶液)； 步驟6. 2 在室溫條件下，將所得NHS的PBS溶液滴加到藍(lán)萼甲素的丁二酸酯的THF溶 液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10 20分鐘，隨后將所得反應(yīng)溶液加熱至30°C 40°C減壓蒸餾，除去 THF，得到黃色油狀粗產(chǎn)物；步驟6. 3 采用0DS-C18填料反相中壓柱分離步驟6. 3的粗產(chǎn)物，得到中間產(chǎn)物； 步驟6. 4 將所得中間產(chǎn)物溶于0. 5 1. 5mlTHF,將15_20mg甘氨酸溶于4 6mlPBS 緩沖液；步驟6. 5 在室溫條件下，將所得中間產(chǎn)物的THF溶液滴加到甘氨酸的PBS溶液中，室 溫?cái)嚢璺磻?yīng)10 20分鐘，隨后將所得反應(yīng)溶液在30°C 40°C條件下減壓蒸餾，除去THF， 得到溶液；步驟6. 6 將所得溶液在-45°C _35°C條件下冷凍干燥20 28小時(shí)得到白色粉末狀 的藍(lán)萼甲素的丁二酸酯與甘氨酸的衍生物。
10.如權(quán)利要求8所述的藍(lán)萼甲素酸酯衍生物的制備方法，其特征在于，進(jìn)一步包括步 驟6，所述步驟6包括以下步驟步驟6. 1 將130 140mg藍(lán)萼甲素的戊二酸酯溶于1 5ml四氫呋喃(THF)，將19. 3 21. 3mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于3 7ml (PBS緩沖溶液)；步驟6. 2 在室溫條件下，將所得NHS的PBS溶液滴加到藍(lán)萼甲素的戊二酸酯的THF溶 液中，室溫?cái)嚢?0 20分鐘，隨后將所得反應(yīng)溶液加熱至30°C 40°C減壓蒸餾，除去THF， 得到黃色油狀粗產(chǎn)物；步驟6. 3 采用0DS-C18填料反相中壓柱分離步驟6. 3的粗產(chǎn)物，得到中間產(chǎn)物； 步驟6. 4 將所得中間產(chǎn)物溶于0. 5 1. 5mlTHF，將15_20mg甘氨酸溶于4 6mlPBS 緩沖液；步驟6. 5 在室溫條件下，將所得中間產(chǎn)物的THF溶液滴加到甘氨酸的PBS溶液中，室 溫?cái)嚢璺磻?yīng)10 20分鐘，隨后將所得反應(yīng)溶液在30°C 40°C條件下減壓蒸餾，除去THF， 得到溶液；步驟6. 6 將所得溶液在-45°C _35°C條件下冷凍干燥20 28小時(shí)得到白色粉末狀 的藍(lán)萼甲素的戊二酸酯與甘氨酸的衍生物。
11.如權(quán)利要求1 5所述的藍(lán)萼甲素酸酯衍生物在治療癌癥中的應(yīng)用，特別是在治療 肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、鼻咽癌、宮頸癌、結(jié)腸癌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藍(lán)萼甲素酸酯衍生物的結(jié)構(gòu)、制備方法及其在治療癌癥中的應(yīng)用。所述藍(lán)萼甲素酸酯衍生物的分子結(jié)構(gòu)的通式如下其中，R1、R2為丁二酸取代基-C4H5O4、戊二酸取代基-C5H7O4、丁二酸的甘氨酸衍生物取代基-C6H8NO5、戊二酸的甘氨酸衍生物取代基-C7H10NO5或-OH。本發(fā)明所公開的制備方式是在四氫呋喃和4-二甲氨基吡啶存在的條件下，將經(jīng)提取處理后的藍(lán)萼甲素與丁二酸或戊二酸反應(yīng)，得到本發(fā)明所公開的藍(lán)萼甲素的丁二酸酯或藍(lán)萼甲素的戊二酸酯，隨后在四氫呋喃和磷酸鹽緩沖溶液的條件下，將所得藍(lán)萼甲素的酸酯衍生物依次與N-羥基琥珀酰亞胺、甘氨酸反應(yīng)，得到本發(fā)明所公開的藍(lán)萼甲素的酸酯與甘氨酸的衍生物。
文檔編號A61P35/00GK101993370SQ20091005645
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日
發(fā)明者李云森, 程萍, 陳子珺, 雷啟福 申請人:上海金昊藥業(yè)開發(fā)有限公司