專利名稱：：一種囊泡類給藥系統(tǒng)及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及藥物制劑領域，具體涉及一種囊泡類給藥系統(tǒng)及其應用。
背景技術：
：某些兩親性分子，如許多天然的或合成的表面活性物質，可以在一定條件下制備成為具有內室的囊泡(vesicle)(如脂質體(liposome)、類脂質體(niosorae)等)。如果所釆用的表面活性物質為磷脂類物質，則形成一類具有封閉雙層結構的分子有序組合體，稱為脂質體(liposome)。由二嚢泡的獨特封閉結構，可以采用適當方法在內室與外水相之間建Z梯度，從而主動裝載(activeloading)化合物，提高該化合物的包封率與穩(wěn)定性。下面以脂質體與阿霉素為例做進一步闡釋和說明。脂質體是由單個或多個脂質雙層包裹親水內核組成的。與其他的藥物載體系統(tǒng)相比，脂質體具有獨特的優(yōu)勢(l)脂質體的主要成分是磷脂和膽固醇，為哺乳動物細胞膜的天然成分，具有生物相容性，可生物降解、無毒性和無免疫原性；(2)脂質體的大小、成分、表面電荷等有很大的選擇空間；(3)脂質體能包裹親水性和親脂性藥物，將藥物包封入脂質體中，可保護藥物在體內不被降解，同時避免藥物對受體識別配體的千擾；(4)易獲得適宜的藥物-載體比，制備簡單。脂質體作為藥物載體臨床應用較早，發(fā)展較為完善。目前已有產品上巿，如阿霉素脂質體(Doxil、Caeb^^Myocet)、柔紅霉素脂質體(DaunoXome)和阿糖胞苷脂質體(DepoCyt)等。鹽酸阿霉素(DoxorubicinHydrochloride,以下簡稱DOX)是蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥，由FarmitiliaResearLaboratories從一種鏈霉(Strepto-ir:ycespeucetiusv-ar.Caesius)的發(fā)酵液中提煉出來的。DOX對機體可產生廣泛的生物化學效應，具有強烈的細胞毒性。臨床上用于急性白血病(淋巴細胞性和粒細胞性)、霍奇金病及惡性淋巴瘤、乳腺癌、支氣管肺癌、卵巢癌、軟組織肉瘤、成骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、尤文肉瘤、腎'母細胞瘤、神經母細胞瘤、膀胱癌、甲狀腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗癌、睪丸癌、胃癌、肝癌等，是肝癌化療的一線藥物。一般認為，DOX的抗腫瘤機理是DOX能直接嵌入DNA核堿對之間，干擾轉錄過程，阻止mRNA的形成，起到抗腫瘤作用。DOX既能抑制DNA的合成又抑制RNA的合成，對S期作用最強，對M、G1和G2期也有作用，為細胞周期非特異性藥物。此外，DOX還可導致自由基的生成，誘導DNA和細胞膜破壞，還能抑制拓撲異構酶II,使得DNA的復制效率低。對乏氧細胞也有作用。DOX對腫瘤細胞具有強烈細胞毒性，對全身其他組織也可以造成嚴重損傷。目前臨床上使用的DOX主要不良反應是常見脫發(fā)、骨髓抑制(白細胞約于用藥后1014曰下降至最低點)和心肌毒性(發(fā)生率630%，可導致各種心律失常、心肌不可逆損傷乃至充血性心衰并且心肌毒性的發(fā)生率和嚴重程度與阿霉素累積量成正比，遲發(fā)的嚴重噴射性心力衰竭大多在用藥半年后或總劑量逾700mg時發(fā)生。常見惡心、嘔吐、口腔炎、食道炎、注射位點的毒性(CancerInvestigation,19(4):424-436(2001))及白細胞減少、脫發(fā)，并應警惕充血性心力衰竭的可能，有時可發(fā)生猝死。亦可出現(xiàn)胃痛、腹瀉或全胃腸炎、高尿酸血癥和腎臟損害等。靜脈外溢可出現(xiàn)疼痛、組織壞死甚至蜂窩組織炎。嚴逢一的不良反應，尤其是心臟毒性嚴重制約了DOX的臨床應用和劑量提咼。多年來藥學工作者一直致力于尋找降低DOX毒性的有效方法，如購整給藥方案，研發(fā)減輕DOX心臟毒性的藥物，研制心臟毒性較低的l-)()X類似物(如表阿霉素)，通過合并用藥來減輕其心臟毒性及研制DOX新劑型(例如脂質體、微球、磁性微球、毫微粒、乳劑)等，其中最為成功的是DOX脂質體的研制成功。上世紀70年代末開始研究用脂質體作為蒽環(huán)類抗癌藥載體，脂質體主要分布于網狀內皮系統(tǒng)，可'以有效減少藥物在心臟中的分布，降低毒性。80年代末期開始進行臨床試驗，初步結果表明DOX經脂質體包封后，劑量可以加大，毒性作用減少，半衰期明顯延長。由于DOX屬水溶性，傳統(tǒng)的脂質體制備方法包封率很低，因而無法達到降低毒性的目的。釆用建立pH梯度、(NH4)2S04梯度等方法來制備DOX脂質體，可以提高DOX的包封率。"質子池"是經典(NH4)2S04梯度法主動裝載DOX進入脂質體的機理之一，要求陽離子與陰離子有足夠的跨膜速率差異，例如，NH3跨膜速率遠遠大于S042、且NH3和SO^的滲透系數(shù)(P)也有很大的差異(S042:P<0.01em's-1;NH3:P:::0.13CH1S-1)，這樣才能制造質子足夠豐富的酸性脂質體內部環(huán)境，為DOX質子化提供條件。另外，DOX可以與陰離子在脂質體內部形成低溶解性的復合物也是保證藥物有效包封的必要條件之一。
發(fā)明內容針對現(xiàn)有技術中的(NH4)，S04梯度法等存在的諸如載藥范圍不廣，需要(NH4)2SO4的濃度與梯度大，藥物的包封率與穩(wěn)定性均有待改善等問題，本發(fā)明的目的是提供一種嚢泡類給藥系統(tǒng)的制備方法，能快速建立囊泡跨膜梯度，實現(xiàn)主動載藥，并有效提高藥物的包封率和穩(wěn)定性本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明所"k的囊泡類給藥系統(tǒng)是通過如包括下述歩驟(1)以表面活性物質為基本膜材、以含為水相(即水化介質)制備獲得空白囊泡；-(2)空白囊泡建立跨膜梯度即可，下方法的制備的，該方法依次氮原子的多陰離子化合物溶液其中，所述含氮原子的多陰離子化合物為一類分子結構中含有氮原子及下述兩個以上陰離子的化合物羧基、硫酸基、磺酸基、磷酸基、枸櫞酸基或膦酸基'^i述的"i泡類是指具有內室囊狀結構的物質，如囊泡、脂質體，等本發(fā)明囊泡膜材以表面活性物質為基本膜材，包括適宜的離子型與非離子型表面活性劑、大分子物質，如各種磷脂及其衍生物，脫水山梨醇脂肪酸酯類、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯類、還可4甾醇類及其衍生物，以及其它必要膜材。上述跨膜梯度為本專業(yè)領域中概念，即囊泡內外水相的成分、濃度梯度；空白嚢泡水化介質中含有可交換的各種陽離子或者陰離子或者陰陽兩種離子，離子種類可以是一種或者兩種或者兩種以上，以任意比例混合的任意濃度。建立跨膜梯度的方法可按照現(xiàn)有的常規(guī)方法操作，如透析法、葡聚糖凝膠分子篩法、大孔樹脂法或高速離心法等等。也可按照離子交換法建立跨膜梯度，所謂離子交換法即采用適宜的離子交換劑去除囊泡外水相中的陰離子、陽離子，或者陰陽離子同時除去，而內水相中的陰陽離子來被除去/或者除去很少，從而建立膜內外梯度，實現(xiàn)主動載藥。本發(fā)明的方法中，在囊泡建立跨膜梯度之前根據需要可以做均質化處理，以獲得粒徑適宜的囊泡，比如粒徑在50-200nm之間的囊泡，更有利于l作為優(yōu)選，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述含氮原子多陰離子化合物為氨基酸及其衍生物、氨基羧酸螯合劑、氨基膦酸衍生物、氨基酸聚合物及可快速跨膜運轉的堿與跨膜速度慢的酸生成的鹽等等。作為優(yōu)選，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述含氮原子的多陰離子化合物溶液濃度為100-400mM。作為更優(yōu)選，所述含氮原子的多陰離子化合物溶液濃度為120-250mM。作為最優(yōu)逸，所述含氮原子的多陰離子化合物溶液濃度為150-200mM。令人欣喜的發(fā)現(xiàn)是，本發(fā)明的含氮原子的多陰離子化合物與其他多陰離子化合物(如肝素)或與硫酸銨梯度等方法聯(lián)合用于制備脂質體時，所述含氮原子的多陰離子化合物溶液濃度為可低至30mM或更低。作為優(yōu)逸.，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述含氮原子的多陰離子化合物溶液的p.H值在3.0-9.0之間。作為更優(yōu)選，所述含氮原子的多陰離子化合物溶液的pH值在5-8之間。作為優(yōu)選，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述氨基酸及其衍生物選自下列物質賴氨酸衍生物、天冬氨酸及其衍生物、精氨酸衍生物、谷氨酸及其衍生物、聚谷氨酸、丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、S-羧甲基-L-半胱氨酸及其衍生物、精氨酰琥珀酸或鳥氨酸及其衍生物等。作為優(yōu)選，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述氨基羧酸螯合劑選自下列物質EDTA及其鹽、HEDTA及其鹽、NTA及其鹽、DTPA及其鹽、[)TPA-BMA及其鹽或乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸及其鹽。作為優(yōu)選，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述氨基膦酸衍生物選自下列物質乙二胺四亞甲基膦酸及其鹽類、DETPMP及其鹽類、DTPMPA及其鹽類、己二胺四亞甲基膦酸及其鹽類、氨基三亞甲基膦酸及其鹽類、PAPEMP及其鹽類或二己烯三胺五亞甲基膦酸及其鹽類。作為優(yōu)選，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述可快速跨膜運轉的堿選自下列物質中的至少一種氨水、三乙胺、乙二胺、乙醇胺、三乙醇胺、葡甲胺或三羥甲基氨基甲烷。作為更優(yōu)選，所述可快速跨膜運轉的堿選自下列物質中的至少一種氨水、三乙胺、乙二胺、乙醇胺、三乙醇胺或三羥甲基氨基甲烷。作為優(yōu)逸，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述跨膜速度慢的酸選自下列物質中的至少一種乙二胺四乙酸、六偏磷酸、三聚磷酸、六偏磷酸、三偏磷酸、焦磷酸、甘油磷酸、果糖二磷酸或三磷酸腺苷。作為更優(yōu)選，所述跨膜速度慢的酸為乙二胺四乙酸。本發(fā)明的基本膜材選用兩親性分子，即能夠形成囊泡/或者泡囊的表面活性物質，如適宜的離子型表面活性物質、非離子型表面活性物質、大分子物質，包括各種磷脂及其衍生物，脫水山梨醇脂肪酸酯類、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯類、還可選甾醇類及其衍生物，一般選用磷脂。作為優(yōu)選，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述膜材選用磷脂與膽固醇為基本膜材時，磷脂與膽固醇的質量比為2-10:1。'作為更優(yōu)選，其中所述基本膜材中磷脂與膽固醇質量比為2-6:1。作為最優(yōu)選，其中所述基本膜材中磷脂與膽固醇質量比為3-5:1。作為優(yōu)選，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述膜材中磷脂可選自下列物質中的至少一種天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酸、心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵嫌脂、二硬'脂酰磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二癸酰磷脂酰膽堿、二辛酰磷脂酰膽堿、二己酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰甘油及其鹽，二棕櫚酰磷脂酰甘油及其鹽，L-ot-二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其鹽，二月桂酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二辛酰磷脂酰甘油、二己酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷'脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、雙二硬脂酰磷脂酰甘油及其鹽、雙二棕櫚酰磷脂酰甘油及其鹽、雙二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其鹽、雙二月桂賴。磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰亞油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰亞油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰油酰磷脂酰膽堿、硬脂?；ㄉ南Ａ字Ｄ憠A或各種磷脂PEG衍生物，々口'DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE畫PEG,其中PEG的分子作為優(yōu)選,根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述膜材還包括加入PEG衍生物，其用量<脂質相原料總質量的50%且不為0。作為更優(yōu)選，膜材中加入的PEG衍生物占脂質相原料總質量的2-50%。作為更更優(yōu)選，膜材中加入的PEG衍生物占脂質相原料總質量的5-4()%。作為最優(yōu)選，膜材中加入的PEG衍生物占脂質相原料總質量的5-20%。其中，上述PEG衍生物包括但不限于各種磷脂PEG衍生物，如DSPE陽PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG,其中PEG的分子量為100~100000;也包括其他各種PEG脂質衍生物，如PEG甾醇類衍生物、PFG脂肪酸衍生物、PEG脂肪醇類衍生物，具體講如膽固醇半琥祐酸酯PEG衍生物、SolulanC-24(PEG-24cholesterolether)、吐溫類、Brij(節(jié)澤)、維生素類的PEG衍生物(如TPGS)、PEG脂肪酸酯衍生物(賣澤)，聚甘油脂質衍生物，如聚甘油磷脂衍生物、聚甘油單(雙)油酸酯、硬脂酸酯等；聚丙二醇脂質衍生物；聚氨基酸脂質衍生物；甾醇類衍生物；蔗糖脂質衍生物；氧乙烯-氧丙烯共聚物(HO(C2H40)a(C3H60)b(C2H40)aH),如F68;聚乙二醇-二酸甘油脂(或者單酯)等等。i入，白囊泡中各種膜材之間的比例可根據具體實驗結果和實際需要有技"i,為優(yōu)逸，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述膜材還包括酸敏、溫敏、光敏或靶向性物質。具體如何添加可根據載藥的種類和需要來確定，按照本領域行業(yè)的常用技術手段操作即可。作為優(yōu)選，根據本發(fā)明所述的制備方法，其中所述給藥系統(tǒng)用于包括但并不限于下述藥物蒽環(huán)類/蒽二酮類抗腫瘤抗生素、長春花屬生物堿、喜樹堿類藥物、喹諾酮類抗生素、羅丹明B或其類似物、依沙吖嗖或其類似物、吖P定橙或其,似物；5-羥色胺受體拮抗劑、茶堿類物質、局部麻醉藥、噻嗎洛爾及其鹽、美托洛爾及其鹽、比索洛爾及其鹽、普萘洛爾及其鹽、索他洛爾及其鹽、伏立康唑及其鹽、曲馬多及其鹽、芬太尼及其鹽、舒芬太尼及其鹽、拿L溴索及其鹽、氯諾昔康及其鹽、甲磺酸二氫麥角堿、鹽酸川丁特羅(特羅類)、多巴酚丁胺、鹽酸洛哌丁胺、阿替洛爾酒石酸美托洛爾、氯苯丁胺、菱角胺、蜂毒肽和生物堿。上述給藥系統(tǒng)可按下述方法進行載藥將已建立梯度的空白嚢泡(包括各種脂質體)與藥物溶液混勻，在20-7(TC下孵育，即可制得載藥囊泡。發(fā)明詳述發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，由于氨基酸分子中含有氮原子，可以利用該氮原子進行結構衍生化，制備衍生物，如與氯乙酸反應，與各種酸酐反應，從而獲得"含氮原子多陰離子化合物"。以賴氨酸為例說明，賴氨酸為堿性氨基酸，分子結構中僅有一個羧基，不屬于多陰離子化合物(分子中含有兩個或者兩個以上的陰離子才屬于"多陰離子化合物")，但賴氨酸可以與琥珀酸酐反應制備"含氮原子多陰離子化合物"，其方法為，在吡啶環(huán)境中，充,可以獲4氨酸與琥珀酸酐的反應屬于常',按照不同摩爾比例投料，進()、、Z、、〇:\》oH〇、〇吉構式的衍生物:HNHO\Q。A0H'衍生物中的任意一種化合物進行梯度載藥，均可獲得滿意其他氨基酸包括天冬氨酸及其衍生物、精氨酸衍生物、谷氨酸及其衍生物、聚谷氨酸、丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、S-羧甲基-L-半胱氨酸及其衍生物、精氨酰琥珀酸、鳥氨酸及其衍生物等，均可以制備各種銨鹽梯度，如氨水、三乙胺、三乙醇胺、TRIS等，從而實現(xiàn)主動載藥。含氮原子的多陰離子類化合物有許多，對于本發(fā)明來說下述的含氣原f的多陰離子化合物皆是適宜的。一、氨基羧酸螯合劑類，如EDTA及其鹽，其中EDTA的結構式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>HEDTA及其鹽，其中HEDTA的結構式如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>基三乙酸(又稱次氮基三乙酸，NTA)及其鹽，其中NTA結構式如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>DTPA及其鹽，其中DTPA的結構式如下0「人。hHCl、-AW'N、,N"\r0H0L丫。hho.-000DTPA-BMA及其鹽，其中DTPA-BMA的結構式如下:n人HO、.'廠丫乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(即3，6-二氧雜-1，8-辛二胺四乙酸)其'鹽，乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸的結構式如下人h。.^|0hq、，、r,r'。-、,、(〕a、，N、,Aohc''-、.丄:'h0'二、氨基膦酸衍生物類，如乙二胺四亞甲基膦酸及其各種鹽類，乙二胺四亞甲基膦酸的結構式如(H〇)2I——CH2、,'N—-CH——CH;——N(HC')化——CH2——P(OH)2CH2——P(O勤式如下:乙烯三胺五亞甲基膦酸(DETPMP)及其各種鹽類，DETPMP結構cp——CH2、,》一(CHA-(H;;C^——CH2'，—(CH^00II,CH2—P(OH》、CH「p('〕H^二乙烯三胺五甲叉膦酸(DTPMPA)及其各種鹽類，DTPMPA結構式如下uri^uHO—P—OHH0-P;0H、OHOH〕廣NI1HOHOHO—P—OHii0己二胺四亞甲基膦酸及其各種鹽類，己二胺四亞甲基膦酸的結構式如下:、h"〕,p—c6，、ch、一po,h、,基三亞甲基膦酸及其各種鹽類，氨基三亞甲基膦酸的結構式如下:oHO——P——CH2——N、OH,ch廠,)2ch2—(0h)2Opapemp及其鹽類，papemp的結構式:(H0)f——CH2ch3/ch2——p,2N一hc—ch2——(CiCH，n——h'(H。)2p——(:H2CH2——P(OH)2二己烯三胺五亞甲基膦酸及其鹽類，結構式如下:POHOH,OHA1o卜、、OHcoohh2n—(!h—ch2聚合物，如聚天冬氨酸，其結構式為oCCOHoO—-NH—CH—CH廣(-NH~CH-NHCCOHH——CHj—COOH應用膦l另夕卜，"如硫蹈COOH氮原子的多陰離子化合物"尚可以與其他陰離子及其鹽組合:鹽、檸檬酸銨鹽、磷酸及其銨鹽、多元醇磷酸酯及其銨鹽、,基羥基乙酸及其銨鹽、羥基亞乙基二膦酸及其銨鹽、聚馬來酸及其銨鹽、聚丙烯酸及其銨鹽、水解聚馬來酸酐及其銨鹽、馬來酸-丙烯酸共聚物及其銨鹽、丙烯酸-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸及其銨鹽、丙烯酸-丙烯酸酯-膦酸-磺酸及其銨鹽、膦?；人峁簿畚锛捌滗@鹽、聚環(huán)氧琥珀酸及其銨鹽、聚羧酸系及其銨鹽、八硫酸基蔗糖(SucroseOctasulfate;SOS)及其銨鹽、肝素及其銨鹽、蛋白及其銨鹽、植酸及其銨鹽、二巰基丁二酸及其銨鹽或2,3-二巰基丙磺酸及其銨鹽等，也包括其他陰離子，如hpo42—、h2po4-、cr、蘋果酸根、酒石酸根、醋酸根、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油'磷酸根、果糖二磷酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、鄰苯二甲酸根、間苯11二甲酸根、對苯二甲酸根、磺酸基、對苯二甲酸、苯甲酸、間苯二甲酸、間苯三甲酸、乳糖酸、2,5-二羥基苯磺酸、羥基苯磺酸、DNA、RNA、siRNA,RNAi、蛋白質、琥珀明膠、酶、荷電多糖或琥珀酰甲殼胺等。也可以與各種膦酸類藥物(衍生物)及其鹽類組合，如噻唑磷、替魯膦酸、氯屈膦酸二鈉、磷霉素氨基丁三醇、乙二胺四甲叉膦酸、依替膦酸鈉;二亞乙基三胺五亞甲基膦酸七鈉鹽、2-膦酸基丁烷-l,2,4-三羧酸四鈉、氨基三亞甲基膦酸、帕米膦酸鈉、(3-氨基苯基)膦酸、己二胺四亞甲基膦酸鉀鹽、苯膦酸鈉、阿t喊酸及其鹽類、甲基膦酸(5-乙基-2-甲基-2-氧代-1，3,2-二氧磷雜環(huán)己-5-基)甲基甲基酯、帕米膦酸、2-膦酸丁烷-l，2，4-三羧酸鈉鹽、己二胺四甲叉膦酸六鉀鹽、2-膦酸丁烷-1，2,4-三羧酸、羥基亞乙基二膦酸四鈉、二己烯三胺五甲叉膦酸、利塞膦，、氨甲基膦酸、伊班膦酸、利賽膦酸鈉、唑來膦酸、帕米膦酸鈉、西多福韋；(l-(4-氨基-2-氧代嘧啶-l-基)-3-羥基丙烷-2-基)氧甲基膦酸、(R)-((1-(((甲基磺酰)氧)甲基)-2-節(jié)氧基乙氧基)甲基)膦酸二乙酯、替魯膦酸二鈉、乙烯基膦酸、(3-((羥甲基)氨基)-3-羰基丙基)-膦酸二甲酯、2-氨基乙基膦酸、氨基三甲叉膦酸鈉、福沙卩比坦；(.H((2R，3S)-2-((lR)-l-(3,5-雙(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-嗎啉基)甲基)-2，5-二氫-5-氧代-1H-1,2,4-三唑-1-基)膦酸。上述化合物在建立梯度時，可以是酸梯度，也可以是其他離子梯度，在說銨鹽梯度時，主要為氨水、三乙胺、乙二胺、乙醇胺、三乙醇胺、三羥甲基氨基甲烷或葡甲胺的銨鹽。對本發(fā)明來說，可以是上述一種或者兩種以上物質組合建立梯度。發(fā)明人以EDTA銨鹽為例，脂質體為代表.'，做了一系列如下的考察。實驗例1對不同水化介質的考察所考察的不同水化介質的結構式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage13</image><image>imageseeoriginaldocumentpage13</image>上述結構式所示物質分別為A,(NH4)2S04(硫酸銨、硫酸根)；B,NH4BS(2,5-二羥基苯磺酸銨、磺酸根)；C,NH4NCTD(去甲斑蝥酸銨、羧酸根)；D,NH4CA(檸檬酸銨、羧酸根)；E,NH4EDTA(含有氮原子的陰離子化合物)；F,NH4SGP(甘油磷酸銨、磷酸根)；G,NH4ATP(三磷酸腺苷銨鹽、含有氮原子的陰離子化合物)；H，NH4PA(植酸銨、磷酸根);I,NH4P2(二聚磷酸銨、磷酸根);J,NH4P3(三聚磷酸銨、磷酸根);K,NH4P6(六粲磷酸銨、磷酸根)。將上述不同的水化介質用于阿霉素脂質體制備，其原料的基本處方見表.l。制備方法如下65。C下，用10%乙醇(v/v)溶解處方量膜材，揮去大部分乙醇后即得脂質相；然后將預熱至相同溫度的水相(即水化介質)，按照常規(guī)的方法注入脂質相，孵育30min,制得脂質體初品，經200W超聲初歩混合2min后，400W超聲分散6min(工作3s,間歇3s),依次通過0.8、0.45、0.22^m的微孔濾膜，即得空白脂質體。釆用透析法建立脂質體跨膜梯度，得到的梯度脂質體與藥物溶液(藥脂比，1:10,w/w)混勻，于.60'C孵育20min,得到不同水化介質制備的阿霉素脂質體。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>汪的濃度均為200mmol.U1(HSPC為氫化大豆卵磷脂；CH為膽固醇；PEG-CHS為分子量2000的PEG單甲醚與膽固醇半琥珀酸酯反應所得產物，即膽固醇半琥珀酸酯PEG酯)。測定不同阿霉素脂質體的平均粒徑、包封率，同時亦考察其在4。C放置穩(wěn)定性，結果見表2。表2不同水化介質對阿霉素脂質體包封率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表2可知，含有氮原子的陰離子化合物，EDTA與ATP體包封率均大于90%,其他的脂質體包封率最低者僅有4.5%,雖然檸檬酸銨的包封率高，但制得脂質體4"C放置穩(wěn)定性均不及含有氮原子陰離子化合物水化介質。實驗例2pH調節(jié)劑的選擇采用"實驗例l"的脂質體膜材料、配比及工藝，選擇EDTA進行pH調'二節(jié)刑考祭。分別以氨水、乙二胺、三乙胺、乙醇胺、Tris、葡甲胺配制不同EDTA鹽溶液(pH7.0)。制備阿霉素脂質體，即建立不同的跨膜梯度主裝載DOX,考察了制劑的粒徑、包封率，結果見表3。表3不同銨鹽對阿霉素脂質體的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表3可知，以氨水、乙二胺、三乙胺、乙醇胺、三羥曱基氨基甲烷(THs)制備不同的EDTA鹽溶液，均可以獲得較高的包封率，大于90%。實驗例3pH值的影響組方組成同"實驗例1"。以氨水調節(jié)pH至5.03、6.00、7.01,配制200mmol七-'h:DTA銨鹽溶液作為水化介質，制備阿霉素脂質體，考察了包封率，結果見表4。表4不同pH對阿霉素脂質休包封率的影響pH5.036.007.01包封率/%97.2197.6697.39由表4可知，pH在5-7范圍內，阿霉素脂質體包封率無明顯變化，均大于90%。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于本發(fā)明所述的含氮原子的多陰離子化合物而并非必須所有的陰離子都成鹽，可以是部分成鹽，剩佘部分陰離子不成鹽，為游離酸形式，同樣也可以獲得高包封率。實驗例4水化介質濃度的影響組方及工藝同"實施例1"。配制濃度分別為100、120、150、200、300mmol七"EDTA銨鹽溶液作為水化介質，制備阿霉素脂質體，結果見表5。表5不冋濃度ED1A銨鹽刈阿霉桌脂質體包封率的說響濃設/mmol丄"—f均粒徑/nm包封率/%10071.575.0512085.496.6915085.696.8620076.997.3930086.897.22由表5可知，水化介質濃度，即(NH4)4EDTA濃度，達到120mmol丄"時，包封率即可超過95%。而采用現(xiàn)有技術中常規(guī)的硫酸銨、磷酸銨、檸檬酸銨作水化介質時，當其濃度為120mmol'L/1時,包封率均小于70%。實驗例5磷脂種類組方組成磷脂/膽固醇/DSPE-PEG的重量比例為3:1:1，工藝同"實驗例1"。嫌脂種類為HSPC、EPC和S100(Lipoid大豆磷脂)，主動裝載阿霉素，制得阿霉素脂質體，結果見表6。表6不同磷脂對阿霉素脂質體包封率的影響磷脂種類HSPCEPCS100平均粒徑/nm76.985,288.715<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>上述表6的實驗結果;lL相同工藝條件下，采用不同磷脂，脂質體包封率均大于90%。同樣，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)釆用鞘磷脂、磷脂酰甘油、心肌磷脂、PEG磷脂衍生物、PEG膽固醇衍生物、多聚甘油脂質衍生物(包括磷脂衍生物)、各種表面活性劑，如吐溫、司盤、PEG脂肪酸酯、PEG脂肪酸醚、雙子(Gemini)表面活性劑等等，制備囊泡，建立梯度，均可以獲得良好包封率。實驗例6PEG脂質衍生物PEG-CHS加入量對包封率的影響PEG水化層不僅影響脂質體的體內行為，還會影響制劑穩(wěn)定性和包封效率。在"實驗例l"基礎上考察PEG-CHS加入量，分別為0%、0.5%、1.0%、1.5%，制備阿霉素脂質體，考察了制劑的粒徑、包封率及4t:放置穩(wěn)定性，結果見表7。農7不同PEG-CHS加入量對DOX脂質體的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表7可知，釆用EDTA梯度，無論是否加入PEG-CHS，其包封率均大于90%。同樣釆用本發(fā)明的方法，可以建立其它各種囊泡(如，膽固醇半琥珀酸酯三羥甲基氨基甲烷、生育酚半琥珀酸酯三羥甲基氨基甲烷、吐溫20/膽固醇囊泡、吐溫80/膽固醇囊泡、SOULAN及聚硼酸酯表面活性劑囊泡)梯度，實現(xiàn)主動裝載鹽酸拓撲替康或其它藥物。本發(fā)明方法提供的囊泡類給藥系統(tǒng)適用于包封難度大的水溶性藥物，包括但不局限于蒽環(huán)類/蒽二酮類抗腫瘤抗生素(如鹽酸阿霉素、阿霉素、鹽酸表阿霉素、表阿霉素、鹽酸吡柔比星、吡柔比星、柔紅霉素、伊達比星或鹽酸米托蒽醌)，長春花屬生物堿(如長春瑞濱、長春新堿、長春花堿或長春地辛)，喹諾酮類抗生素(如環(huán)丙沙星、氟哌酸、氧氟沙星、依諾沙星、甲氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、克林沙星和吉米沙星)，喜樹堿類藥物(如羥基喜樹堿鈉鹽、托泊替康、依立替康、9-氨基喜樹堿、10,11-亞甲二氧基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、TAS103、7-(4-甲基-哌嗪基-亞甲基)-10,11-亞甲二氧基-20(S)喜樹堿或7-(2-N-異丙胺基)乙基-20(S)喜樹堿)。本發(fā)明方法提供的給藥系統(tǒng)適用于所有可釆用離子梯度法進行包封的如羅丹明B或其類似物、依沙吖P定(利凡諾)或其類似物、吖P定橙(堿性橙14、3，6-雙(二甲基氨基)吖啶氯化鋅鹽酸鹽)或其類似物；5-羥色胺受體拮抗劑，包括昂丹司瓊、托烷司瓊、格拉司瓊、帕洛諾司瓊、雷莫司瓊等。如茶堿類物質；兒茶酚胺等。如局部麻醉藥包括鹽酸阿替卡因、普魯卡因(procaine)..可卡因(cocaine)、利多卡因(lidocaine)、麻卡因(marcaine)、卡波卡因(carbocaine)、丙胺卡因(prilocahie)等；大環(huán)內酯類藥物，如阿奇霉素及其鹽八如噻嗎洛爾及其鹽、美托洛爾及其鹽、比索洛爾及其鹽、普萘洛爾及其鹽、索他洛爾及其鹽、伏立康唑及其鹽等。其它藥物如曲馬多及其鹽、芬太尼及其鹽、舒芬太尼及其鹽、氨溴索及其鹽、氯諾昔康及其鹽、甲磺酸二氫麥角堿、鹽酸川丁特羅(特羅類)、多巴酚丁胺、鹽酸洛哌丁胺、阿替洛爾酒石酸美托洛爾、氯苯丁胺、麥角胺、蜂毒肽等。如生物堿，包括植物、海洋生物、微生物、真菌及昆蟲來源。這類物質常?？梢圆捎锰荻容d藥技術提高包封率。生物堿一般按化合物結構類型或生物合成途徑進行分類。一些常見的生物堿結構類型如下1、異喹啉類生物堿異喹啉類生物堿是生物堿中最大的一類，以異喹啉或四氫異喹啉為母核，根據連接基團的不同，又可分為九類(l)單異喹啉類生物堿，如鹿尾草中的降血壓成分鹿尾草堿；(2)芐基異喹啉類生物堿，異喹啉核的l位接有節(jié)基，如阿片中的解痙成分罌粟堿；(3)雙芐基異喹啉類生物堿，兩個節(jié)基異喹啉在酚羥基位置以醚鍵方式相連，如蓮子芯中的蓮心堿；(4)阿撲芬類生物堿，節(jié)基異喹啉類生物堿的兩個苯環(huán)相連組成的四環(huán)化合物，如千金藤堿；(5)原小蘗堿類生物堿，為兩個異喹啉的稠合，如黃連中所含的抗菌成分黃連素；(6)普魯托品類生物堿，含羰基的小蘗堿開環(huán)化合物，如延胡索中的普魯托品；(7)吐根堿類生物堿，異喹啉環(huán)帶苯駢喹啉啶環(huán)，如吐根中治療阿米巴痢疾的有效成分吐根堿；(8)a-萘菲啶類生物堿，如搏落回中的血根堿；:(9)嗎啡類生物堿。2、喹啉類生物堿喹啉類生物堿的母核是喹啉環(huán)，其中最重要的一類是金雞納生物堿。3、吡咯烷類生物堿U)簡單的吡咯烷生物堿，如古柯葉中分離出的液體生物堿古豆堿、(2)雙稠吡咯烷類生物堿，由叔氮稠合兩個吡略烷而成，如闊葉千里光中分得的闊葉千里光堿；(3)吲哚里西定類生物堿，以叔氮稠合吡咯烷與哌嚏環(huán)而組成的丐l噪里西定環(huán)，如白牽牛堿；(4)莨菪烷類生物堿，由吡咯烷與哌啶駢合而成的雜環(huán)，常見的是與有機酸成酯的阿托品類生物堿；,,(5)^部，物堿，、百部根中分離得到的生物堿大多含有吡咯環(huán)，因此4、吲噪生物堿以吲哚環(huán)為母核的生物堿，如治療白血病的高效藥物長春新堿等。相對明確的生物堿包括"馬錢子堿"、"麥角胺和麥角毒"、"左金總生物堿"、"雷公藤總生物堿"、"草烏甲素及其類似生物堿"、"含雙喹諾里西嚏結構生物堿"、"八氫吲嗪二醇生物堿卣化物鹽"、"吡嗖并吖嚏類生物堿"、"雙節(jié)基異喹啉類生物堿及其鹽"、"口卡唑生物堿類"、"異喹啉生物堿"、"伊.貝總生物堿"、"海綿分離的細胞毒性生物堿衍生物"、"P卡唑類生物堿衍生物及其"、"石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法"、"苯并[C]菲嚏和原托品類生物堿"、"吳茱萸生物堿"、"馬齒莧酰胺類生物堿"、"金不換總生物堿"、"異喹啉生物堿"、"夏天無總生物堿"、"辛可寧類生物堿配體"、"鉤吻總生物堿"、"喹諾里西啶類生物堿"、"蠶沙總生物堿"、"吡咯雜環(huán)生物堿aldisin的'溴代衍生物"、"雪上一枝蒿總生物堿"、"季胺白屈菜生物堿硫代磷酸衍生物"、"烏藥生物堿"、"黃楊寧"、"環(huán)維黃楊星D"、"黃楊生物堿"、"粉防己生物堿"、"雙節(jié)基異喹啉類生物堿"、"紫金龍總生物堿"、"罌粟殼生物堿"、"小檗堿型生物堿"、"兩面針總生物堿"、"赫替新型二萜生物堿"、"百部生物堿"、"荷葉總生物堿"、"麥角生物堿"、"胡椒堿"、"檳榔堿"、"檳榔堿次"、"利血平"、"青藤堿"、"馬錢子堿"、"駱駝蓬總堿及其單體與衍生物"、"去氫駱駝蓬堿衍生物類化合物"、"貝母素乙素"、"貝母素甲素"、"延胡索乙素"、"海洋生物堿類物質"。上述藥物并不成為限制本發(fā)明的條件，正如本領域的任何技術人員所知，可采用某種離子梯度法進行包封的藥物都在本發(fā)明保護范圍內。本發(fā)明優(yōu)選實施例通常按照下述步驟進行操作a)以磷脂月巨固醇比例為2~10:1(w/w)的混合物為基本膜材；.b)加入PEG衍生物以增加脂質體穩(wěn)定性，延長體內循環(huán)時間；c)釆用適當?shù)乃橘|(如適當pH的乙二胺四乙酸(EDTA)的銨鹽或胺鹽)，制備脂質體初品，均質化處理得到的空白脂質體，通過適當方法建立脂質體跨膜梯度；d)將已建立梯度的空白脂質體與藥物(如鹽酸阿霉素)溶液混勻，在20~70°C下孵育，制得包封率295%的載藥脂質體。進一步，加入海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化鈉或蛋白質等物質后的載藥脂質體可進行凍干處理，得到可以室溫儲存的前體脂質體，加水復溶后，包封率大于80%。18與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明申請具有以下優(yōu)點現(xiàn)有的梯度載藥技術，主要是pH梯度(檸檬酸)、硫酸銨、磷酸銨、金屬離子梯度、pH梯度、肌醇六磷酸酯及蔗糖磷酸酯等。與現(xiàn)有的梯度載藥技術相比，本發(fā)明采用含有氮原子的多陰離子化合物梯度載藥，具有的特點包括，1)、在囊泡內的滯留性好，從而可以長期保留所建立梯度；2)、載藥范圍廣，對于采用常規(guī)梯度，如硫酸銨梯度，不易獲得髙包封率的藥物，本發(fā)明技術可以大大提高包封率,大于90%;3)、所制備的載藥制劑的儲存穩(wěn)定性高，藥物泄漏少，可以長期貯存；4)、不易長菌；5)、制備工藝簡單，在采用離子交換樹脂建立梯度時，僅需陰離子交換樹脂或者陽離子交換樹脂即可'；也可以通過簡單的稀釋建立梯度，獲得高包封率；6)、主動載藥時所需梯度值小，如內外水相的梯度大于5即可，而硫酸銨梯度需要大于500;7)、所制備的制劑毒性降低；8)、腫瘤中藥物保留時間長，提高療效。圖1#實施例3阿霉素脂質體的體外釋放度曲線圖，+表示pH-7.4;表示pH=6.5;圖2是實施例4阿霉素脂質體稀釋后包封率曲線圖，+是5%葡萄糖注射液；是0.9%NaCl注射液。具體實施例方式下面結合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內容。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。實施例1阿霉素脂質體其原料的基本處方見表l。制備方法如下65。C下，用10。/。乙醇(v/v)溶解處方量膜材，揮去大部分乙醇后即得脂質相；然后將預熱至相同溫度的水相(即水化介質)，以現(xiàn)有技術中常規(guī)的方法注入脂質相，孵育30min,制得脂質體初品，經200W超聲初步混合2min后，400W超聲分散6min(工作3s，間歇3s),依次通過0.8、0.45、0.22pm的微孔濾膜，即得空白脂質體。采用透析法建立脂質體跨膜梯度，得到的梯度脂質體與藥物溶液(藥脂比，1:10,w/w)混勻，于6(TC孵育20min,即得阿霉素脂質體。表8脂質體膜材料組成<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>水化介質濃度均為200mmol七'1。實施例2釋放度試驗采用"實施例l"制備的阿霉素脂質體。精密移取脂質體2.0mL,加至預處理過的透析袋(截留分子量為0.8-1.4萬)中，兩端夾緊后置于盛有198mL釋放介質的溶出杯內，溶出儀避光處理，于37±1。C條件下以75rpm恒速攪拌，進行體外釋放試驗。取透析液測定熒光強度，計算透析液中的藥物濃度和累計釋放率。實驗結果表明，(NH4)4EDTA梯度裝載阿霉素脂質體在24h內的釋放白一分率為15.1%，而經典的(NH4)2，04梯度法所制備的阿霉素脂質體，如參考AndreasFritze、FelicitasHens等在《Remoteloadingofdoxorubicinintoliposomesdrivenbyatransmembranephosphategradient》一文中報道的方法〔參-見BiochimicaetBiophysicaActa[J]，2006，(1758):1633—1640)所制備的阿霉素脂質體在24h內釋放百分率為21.6%,即EDTA梯度載藥體現(xiàn)了良好的藥物滯留能力。本實施例釋放介質組成為80mmol.L"氯化銨、10mmol.L"組氨酸鹽酸鹽為緩沖鹽，以鹽酸調節(jié)釋放介質pH至7.4。同時加入100(ig'mL"青霉素、鏈霉素作為防腐劑。實施例3不同pH的釋放介質對DOX脂質體釋放行為的影響按照實施例2的方法，pH值分別取7.4、6.5進行釋放度測定，測定結果見圖1。由圖1可知，實施例1制備的DOX脂質體不存在突釋現(xiàn)象，符合藥典要求。不同pH的釋放介質對DOX脂質體的釋放行為無顯著影響。實施例4阿霉素脂質體稀釋穩(wěn)定性本實驗以包封率為指標，分別考察"實施例l"阿霉素脂質體在5。/。(w/v)葡萄糖注射液和0.9%(w/v)氯化鈉注射液中的稀釋穩(wěn)定性。設定稀釋倍數(shù)為5倍。方法取3批阿霉素脂質體，精密移取2.0mL至10.0mL容量瓶內，分別以0.9%(w/v)氯化鈉注射液和5%(w/v)葡萄糖注射液稀釋至刻度，分別于0、0.5、1、4、8、24h取上述各溶液進行包封率測定。以包封率對時間作圖，結果見圖2。由圖2可見，釆用0.9%(w/v)氯化鈉注射液、5%(w/v)葡萄糖注射液作為稀釋介質，24h內DOX脂質體包封率無顯著差異(P〉0.05),說明DOX脂質體稀釋穩(wěn)定性良好，能夠確保臨床應用的安全性。實施例5阿霉素脂質體長期穩(wěn)定性試驗'取3批實施例1阿霉素脂質體液體分裝于西林瓶中，充氮、密封，在4士2。C條件下，避光放置，分別于0、30、60、90d取樣，考察制劑外觀、粒度、包封率變化，結果見表9。表9長期穩(wěn)定性試驗結果批次時間/天外觀粒徑/nm包封率/%]0+71.795.卯30+74.298.7820<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>K中+:櫻桃復1色、均勻、無沉淀、無相分離、未長菌由表10可知，實施例1的DOX脂質體在25i2。C下，在60天內平:粒徑保持穩(wěn)定，包封率無明顯變化。實施例740"C加速試驗按實施例1的方法制的建立梯度的空白脂質體液體和阿霉素脂質體,取已建立梯度的空白脂質體液體與阿霉素脂質體，分裝于西林瓶中，充夷;惑封，在40土2。C條件下，避光放置，分別于0、1、4、7、14d取樣，(白脂質體溶液主動裝載DOX,考察制劑外觀、粒度、包封率變化，結果'表11。表ll4(TC加速試驗結果Day/ct阿'fV森脂質休空白脂質體外觀包封率/%外觀粒徑/nm包封率*/%0櫻桃紅狀75.995.70半透明乳狀75.995.70櫻桃紅狀83.097.23半透明乳狀84.193.954機桃會L狀82.198.53半透明乳狀82.794.707樓桃紅狀81.598.63半透明乳狀80.694.4214櫻桃紅狀82.098.31半透明乳狀81.795.02;丄包封率:*-—個卞1脂質休t動裝載阿霉素的包封率由表ll可知，優(yōu)化的阿霉素脂質體在40士2"C條件下，避光放置14d內，平均粒徑和包封率無明顯變化。實施例8空白脂質體跨膜梯度穩(wěn)定性試驗考察4士2。C下長期穩(wěn)定性試驗。分別以200mmol'L"(NH4)EDTA、(NH4)2S04為水化介質，處方為"實施例l"脂質組成，制得已建立梯度的空白脂質體。取上述空白脂質體分裝于西林瓶中，充氮、密封，4土2。C條件下，避光放置。分別于0、15、30、60、90、210、240、270d(天)取樣，55。C孵育20分鐘主動裝載阿霉素，考察制劑外觀、粒度、包封率變化，結果見表12。表12跨膜梯度長期試驗結果時(NH4)EDTA(NH4)2SQ422<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>!4-j在12可以^出，很顯然，(NH4)2S04梯度不穩(wěn)定，W(NH4)4EDTA梯度穩(wěn)定。實施例9抗腫瘤試驗將60只接種H22腫瘤的小鼠隨機分為6組，即生理鹽水對照組(NS)、阿.霉素溶液組(DOX溶液，5mg'kg")、NH4EDTA-DOX脂質體組(NH4EDTA-L,低劑量組(2.5mg'kg-1)、中劑量組(5mg'kg")、高劑量組(10mg.kg-]))、(NH4)2S04-DOX脂質體組((NH4)2S04-L)(5mg.kg.1)，每組JO只動物。第O天接種，接種后分別于第6、9、12、15天尾靜脈注射給藥。給藥后動物正常飼養(yǎng)，每曰稱量小鼠體重，同時觀察小鼠的生長狀態(tài)。接種后第16天，處死動物，完整剝離皮下腫瘤，同時取出小鼠臟器，包括心、肝、脾、肺、腎、腦(用于測定阿霉素濃度)。取腫瘤稱重，按下述公式計算抑瘤率。重量抑:'g，〔。。-對照新平均瘤匿(g)一試驗組平均瘤亞(g):doo對照幼平均瘤歪(g)，均瘤重及抑瘤率見表13。表13不同DOX脂質體抑瘤效果<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>(NH4)2S04-L,5mg.kg-120,74065.6由此可知，DOX的各種劑型均有極顯著的抑瘤效果，NEUEDTA-L低劑量組U.Smg.kg-1)的抑瘤效果達到(NH4)2S04-L中劑量組(5mg-kg")瘤:弔,口、脂小鼠的生存狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，第二次給藥后第3天(H22腫瘤接種后12天)，DOX溶液組出現(xiàn)4只小鼠死亡，NH4EDTA-L高劑量組出現(xiàn)3據、:l匕J曰.死亡，(NH4)2S04-L組出現(xiàn)2只小鼠死亡，即同等劑量下，EDTA毒性低于(NH4)2S04脂質體梯度組。實施例10多次給藥的組織發(fā)布研究由于臨床用藥過程中，脂質體往往需要多次給藥，因此本實驗對阿霉次給藥后在荷瘤小鼠體內組織分布情況進行了考察，可以更確描迷阿霉素脂質體在靶組織內維持較高藥物濃度的能力，同時阿霉素在非靶組織內的累積也可更貼切地反映DOX脂質體的毒性。將"實施例9"(即本實施例中的各組織是"實施例9"的小鼠組織)的在多次給藥結束后的各組織取出，測定各組織臟器內分布濃度，發(fā)現(xiàn)阿霉素溶液組織的血漿濃度為負值，即完全被代謝；而脂質體組隊血漿濃度還很高。最重要的是心臟與腫瘤組織中藥物濃度，結果表明，在相同劑量下，(NH4)2S04-L(5mg七g-')(硫酸銨梯度)心'組織中的阿霉素濃度是NH4EDTA-L(EDTA銨鹽梯度)中劑量組(5mg'kg'1)的近2倍，與NH4EDTA-L高劑量組(10mg'kg")相近，說明NH4EDTA-L心毒性作用更小。更為重要的是，在腫瘤中，與溶液組相比，所有脂質體組的分布量均超過20倍，且同等劑量下，NH4EDTA-L是(NH4)2S04-L組隊2倍，(NH4)2S04-L(5mg.kg-')與NH4EDTA-L低劑量組(2,5mg.kg")相近，說明NH4EDTA跨膜梯度制得的阿霉素脂質體緩釋效果更佳，可以較長時間在腫瘤組織內維持更高的藥物濃度，從而增加抗腫瘤效果。實施例11簡單稀釋方法制備阿霉素脂質體膜材處方HS.PC2500mgCH833mgCHS隱PEG833mg水相1:200mMNH4EDTA(pH7.0)水相2:200mM(NH4)2S04制備方法65。C下，用10%乙醇(v/V)溶解處方量膜；'至相同溫度的水相按現(xiàn)有技術的常規(guī)方法注入脂質相，高壓均質處理，降低粒徑，依次通過0.8、0.45、0.22pm即得空白脂質體(50ml)。水相l(xiāng)"制備的空白脂質體記為"脂質體1";采用"水相2"空白脂質體記為"脂質體2"。l辱到脂質相，-育30min，in靡.分別用蒸餾水稀辨0、4、10、20倍，并立即取適量稀釋旨質體與阿霉素溶液(4mg/mL)按藥脂比1:10(w/w)混合，于60°C孵'育20min。測定包封率，檢測結果見表14、表15。表14脂質體1稀釋倍數(shù)及其裝載阿霉素的能力<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>通過表]4和15可以看出，很顯然，釆用硫酸銨梯度法時，需要稀釋50.0倍以上才具有可載藥性，且包封率不高。而采用EDTA銨鹽載藥，僅需要稀釋IO倍即可獲得質量穩(wěn)定，包封率高度脂質體。實施例12-14采用HEDTA、NTA或DTPA銨鹽來載藥，其他操作同實施例ll。結果顯示，其都能達到與EDTA銨鹽載藥的相同效果。實施例15,膜材處方HSPC250mgCH83.3mgCHS-PEG83.3mg水相1:150mMNH4EDTA水相2:150mM(NH4)2S04制備方法65。C下，用10%乙醇(v/v)溶解處方量膜材，揮去大部分乙醇后得到脂質相，將預熱至相同溫度的水相按現(xiàn)有技術的常規(guī)方法注入脂質相，孵育30min，制得脂質體初品，經200W超聲初步混合2min后，400W超聲分散6min(工作3s,間歇3s),依次通過0.8、0.45、0.22jim的微孔濾膜，即得空白脂質體。采用"水相l(xiāng)"制備的空白脂質體記為"脂質體l";采用"水相2"制備的空白脂質體記為"脂質體2"。釆用離子交換樹脂建立梯度(即按照離子交換樹脂的交換容量的20%上樣/或者混合處理，除去離子交換樹脂，所得脂質體的外水相中離子被交換，從而建立脂質體內外水相梯度，得到梯度脂質體。)，梯度脂質體與阿霉素溶液(4mg/mL)按藥脂比1:10(w/w)混合，于6CTC孵育20min。包封率測定結果見表16。表16離子交換樹脂處理的差異比較陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂陰陽混合交換樹脂脂質體197.8%94.6%96.9%胎質體2沉淀，不能測定包封率沉淀，不能測定包封率46.6%很顯然，采用E:DTA銨鹽所制備脂質體，完全可以采用單一離子交換樹脂，如陽離子、陰離子，也可以釆用混合樹脂，且包封率均大于90%。如果以經典的硫酸銨梯度，單純除去外水相的陽離子(銨離子)，或者陰離子(硫酸根離子)，均不可能進行載藥，即使采用混合樹脂，包封率也低于50,%。實施例16-18采用HEDTA、NTA或DTPA銨鹽來載藥，.采用聚甘油酯(甘油聚合度大于等于2)或者其它PEG脂質衍生物代替PEG-CHS。其他搡作同實施例15。結果顯示，其都能達到與EDTA銨鹽載藥的相同效果。實施例19快速建立梯度處方、工藝同實施例15。EDTA銨鹽為水化介質。采用單一陽離子交換樹脂處理，可以建立內外水相EDTA梯度為25倍。采用單一陰離子交換樹脂處理，可以建立內外水相EDTA梯度為45倍。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于含氮多陰離子化合物分子中含有氮原子"N",即使采用單一的陽離子樹脂，也能夠部分除去此化合物，建立梯度，如實施例15所示。而硫酸銨、磷酸銨、檸檬酸銨等化合物，必須采用混合樹脂，即陰、陽.離子交換樹脂混合使用，才能除去外水相的鹽，建立裝載阿霉素等藥物的有效梯度。實施例20長春瑞濱脂質體膜材處方制備工藝同實施例1來制備空白脂質體。水相分別選用硫酸銨，EDTA銨鹽來載藥。以200mM硫酸銨梯度載藥時，其包封率為56.3%,即使釆用300mM硫酸銨梯度載藥，其包封率也小于70%。而采用200mMEDTA銨鹽梯度載藥，包封率可以達到93.63%,大于90%。實施例21制備200raMEDTA2Na溶液，以氨水調節(jié)pH至7.8，制備脂質體，釆用"實施例15"方法建立梯度，阿霉素包封率大于95%。實施例22EDTA銨鹽與硫酸銨的組合水化介質分別為EDTA銨鹽與硫酸銨的不同組合，組合比如下處方1、OmMEDTA銨鹽與200mM硫酸銨組合；處方2、50mMEDTA銨鹽與150mM硫酸銨組合；處方3、100mMEDTA銨鹽與100mM硫酸銨組合；處方4、200mMEDTA銨鹽與OmM硫酸銨組合。按照實施例1方法制備阿霉素脂質體，包封率均大于95%，但放置60^后，"處方1"產生沉淀，而"處方2"、"處方3"、"處方4"均未產生沉淀。實施例23拓撲替康脂質體1000ml含有鹽酸拓撲替康0.5gHEPC20g膽固醇lg吐溫202g甘油10g制備方法.1、脂質體制備取處方量的HEPC(氫化蛋黃卵磷脂)、膽固醇、吐溫20，以適量乙醇溶解，加入200mMEDTA銨溶液，水化，并進行均質處理，獲得小于500nm的脂質體。將此脂質體用陽離子交換樹脂進行交換，除去外水相的EDTA銨，建立梯,。將處方量的鹽酸拓撲替康以適量水溶解，加入上述梯度脂質體中，5(TC孵育30分鐘，得包封率大于90%的脂質體。加入余下的物料，混勻，制備得到1000ml的拓撲替康脂質體?？梢愿鶕嶋H情況加入防腐劑、甜味劑等。也可以加入適當?shù)谋Ｗo劑如海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、蛋白質等物質，進行冷凍干燥或者噴霧干燥后，將獲得的前體脂質體于室溫下儲存(也可以在冰箱中儲存)，加水復溶后，測得包封率大于80%。'實驗結果顯示，該脂質體小鼠灌胃吸收優(yōu)于拓撲替康水溶液劑。實施例24-25將實施例23的吐溫20換成TPGS(聚乙二醇IOOO維生素E琥珀酸酯)，或者吐溫20與TPGS組合物，其他搡作同實施例23,結果顯示能達到同樣目的。實施例26脂質囊泡凝膠(VPG)的制備采用150mM的EDTA銨鹽水化DLPC(二月桂酰磷脂酰膽堿)，制備50%DLPC(g/ml)的囊泡凝膠(VPG),以"實施例ll"的稀釋法，將VPG稀釋10]00倍，即可以裝載各種生物堿、阿霉素、博安霉素、米托蒽醌、拓撲替康、長春瑞濱、長春新堿、酒石酸卡巴拉汀、馬來酸噻嗎洛爾、利27多卡因等化合物。其包封率均大于80%。所得脂質體可以胃腸道給藥、粘膜給藥、注射給藥、呼吸系統(tǒng)給藥、皮膚給藥等。加入海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、蛋白質等物質進行凍干，得到可以室溫儲存的前體脂質體,加水復溶后，包封率大于80%。實施例27柔紅霉素脂質體處方DPPC(二棕櫚酸磷脂酰膽堿)3g200mM(NH4)EDTA(pH7)加至100ml制備方法如下取處方量的DPPC,以適量氯仿溶解，制備DPPC氯:'方溶液。減壓除去氯仿，制備脂質膜；于60。C加入水化介質(NH4)EDTA溶液，攪拌分散30min，制得脂質體初品，高壓均質處理，并依次通過0.8、0.45、0.22pn的微孔濾膜，即得空白脂質體。以10%蔗糖為透析介質，釆用透析法建立脂質體跨膜梯度(內水相的EDTA濃度為外水相的46倍)。將所得梯度脂質體與柔紅霉素藥物溶液(10mg/ml)按照藥脂比1:10(w/w)混勻，于60。C孵育20min,即得柔紅霉素脂質體。包封率大于90%。實施例28與肝素聯(lián)合處方HSPC2.5g膽固醇0.5gPEG頻-DPPElg低分子量肝素100mg3OmM(NH4)EDTA(pH7)加至1OOml制備方法如下取處方量的HSPC、膽固醇、PEG5,-DPPE,55°C下，用10%乙醇(v/v)溶解，得到脂質相；處方量的低分子量肝素溶于30mM(NH4)EDTA(pH7)溶液中，得到水相。將預熱至55。C的水相(即水化介質)加入至脂質相，攪拌分散30min，制得脂質體初品。在20000psiE力下均質處理脂質體，降低粒徑至50nm,通過0.22^im微孔濾膜過濾，即得空白脂質體。采用陰陽離子混合交換樹脂除去外水相的低分子量肝素與(NH4)EDTA,建立梯度。將所得梯度脂質體與阿霉素藥物溶液(藥脂比，1:10，w/w)混勻，于60。C孵育20min，即得阿霉素脂質體。包封率大于90%。而單獨釆用30mM(NH4)EDTA(pH7)為水化介質時，包封率小于，0。也可以將肝素替換為DNA、RNA、siRNA,RNAi、蛋白質、琥珀明膠、酶、荷電多糖或琥珀酰甲殼胺等。'實施例29混合磷脂脂質體處方DSPG0.5gDPPC2.5g吐溫20O.lg蔗糖10g八硫酸基蔗糖銨鹽lg28200mMDTPA銨鹽(pH6)加至1OOml制備方法如下取處方量的DSPG、DPPC、吐溫20,6(TC下，用叔丁醇溶解，凍干，得到脂質相；將蔗糖、八硫酸基蔗糖銨鹽與DTPA銨鹽溶解于注射用水中，配置含有蔗糖與八硫酸基應糖銨的200mMDTPA銨鹽溶液，預熱至60。C,得到水相(即水化介質)，加入至脂質相，攪拌分散30min，制得脂質體初品。在30000psi壓力下均質處理脂質體，降低粒徑至56醒，通過0.22阿微孔濾膜過濾，即得空白脂質體。釆用陰陽離子混會交換樹脂(732陽離子交換樹脂/717陰離子交換樹脂)除去外水相的MDTPA銨鹽，建立梯度。將所得梯度脂質體與硫酸長春新堿和鹽酸米托蒽醌藥物溶液混勻，于55。C孵育10min,即得裝載兩種藥物脂質體。兩種藥物的包封率均大于90%。同樣可以采用DTPA-BMA銨鹽、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸銨鹽代替MDTPA銨鹽，獲得包封率大于90%的脂質體。也可以將八硫酸基蔗糖銨鹽替換為植酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、三聚磷酸鹽、甘油磷酸鹽、果糖二磷酸鹽、噻唑磷鹽、乙二胺四甲叉膦酸鹽、依替膦酸鹽、氨基三亞甲基膦酸鹽、阿侖膦酸鹽等。實施例30以氨基膦酸衍生物類或者氨基酸聚合物制備脂質體T白脂質體處方HSPC3gCH0.5gPEG-DSPE1.5g水化介質為200mmol.L-l乙二胺四亞甲基膦酸銨鹽，總體積為100ml。制備取處方量的HSPC、CH(膽固醇)、PEG-DSPE,加入8ml乙醇，50。C溶解得到脂質乙醇溶液，即脂質相；將200mmol'L-l乙二胺四亞甲基膦酸銨預熱至50°C,加入至脂質相，攪拌分散20min,制得脂質體初品.在20000psi壓力下均質處理脂質體，降低粒徑至80nm，通過0,22jim微孔濾膜過濾，即得空白脂質體。釆用陰陽離子混合交換樹脂(732陽離子交換樹脂/717陰離子交換樹脂)除去外水相的乙二胺四亞甲基膦酸銨鹽，建立梯度。得到的梯度脂質體與藥物溶液(藥脂比，1:10，w/w)混勻，于60。C孵育]Omin,即得阿霉素脂質體。包封率大于90%。同樣可以釆用二乙烯三胺五亞甲基膦酸(DETPMP)銨鹽、二乙烯三胺五甲叉膦酸(DTPMPA.)銨鹽、己二胺四亞甲基膦酸銨鹽、氨基三亞甲基膦酸銨鹽、PAPEMP銨鹽、二己烯三胺五亞甲基膦酸銨鹽代替乙二胺四T甲基膦酸銨鹽，獲得包封率大于90%的脂質體。以聚天冬氨酸銨鹽代替乙二胺四亞甲基膦酸銨鹽，也可獲得包封率大于90%的脂質體。權利要求1、一種囊泡類給藥系統(tǒng)，其特征在于其通過如下方法制備，所述方法依次包括下述步驟(1)以表面活性物質為基本膜材、以含氮原子的多陰離子化合物溶液為水化介質制備獲得空白囊泡；(2)空白囊泡建立跨膜梯度即可；其中，所述含氮原子的多陰離子化合物為一類分子結構中含有氮原子及下述兩個以上陰離子的化合物羧基、硫酸基、磺酸基、磷酸基、枸櫞酸基或膦酸基。2、如權》j要求l所述的囊泡類給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述含氣原子的多陰離子化合物為氨基酸及其衍生物、氨基羧酸螯合劑、氨基膦酸衍生物、氨基酸聚合物及可快速跨膜運轉的堿與跨膜速度慢的酸形成的鹽。3、如權利要求2所述的囊泡類給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述氨基酸及其衍生物選自下列物質賴氨酸衍生物、天冬氨酸及其衍生物、精氨酸衍生物、谷氨酸及其衍生物、聚谷氨酸、丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、S-羧甲基-L-半胱氨酸及其衍生物、精氨酰琥珀酸或鳥氨酸及其衍生物。4、如權利要求2所述的囊泡類給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述氨基羧酸螯合劑選自下列物質EDTA及其鹽、HEDTA及其鹽、NTA及其鹽、DTPA及其鹽、DTPA-BMA及其鹽或乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸及其鹽。5、如權利要求2所述的囊泡類給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述氨基膦酸衍生物選自下列物質乙二胺四亞甲基膦酸及其鹽類、DETPMP及其鹽類、DTPMPA及其鹽類、己二胺四亞甲基膦酸及其鹽類、氨基三亞甲基膦酸及其鹽類、PAPEMP及其鹽類或二己烯三胺五亞甲基膦酸及其鹽類。6、如權利要求2所述的囊泡類給藥系統(tǒng)，，其特征在于，所述可快速跨膜運轉的堿選自下列物質中的至少一種氨水、三乙胺、乙二胺、乙醇胺、三乙醇胺、葡甲胺或三羥甲基氨基甲烷；所述跨膜速度慢的酸選自下列物質中的至少一種乙二胺四乙酸、六偏磷酸、三聚磷酸、六偏磷酸、三偏磷酸、焦磷酸、甘油磷酸、果糖二磷酸或三磷酸腺苷。7、如權利要求l所述的囊泡類給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述含氮原子的多陰離子化合物溶液濃度為100-400mM。8、如權利要求l所述的囊泡類給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述含氮原子的多陰離子化合物溶液的pH值在3.0-9.0之間。9、如權利要求1所述的囊泡類給藥系統(tǒng)，其特征在于，基本膜材選用能夠形成囊泡/或者泡囊的兩親性分子，也可以在膜材中加入酸敏、溫敏、光敏或靶向性物質。10、如權利要求l所述的囊泡類給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述基本膜材選用磷脂和膽固醇時，磷脂與膽固醇質量比為2-10:1。11、如權利要求1所述的囊泡類給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述膜材還加入PEG衍生物時，其用量^脂質相原料總質量的50%且不等于0。12、權利要求1所述的嚢泡類給藥系統(tǒng)在制備藥物制劑中的應用，其特征在于，所述藥物包括下列物質中的一種蒽環(huán)類/蒽二酮類抗腫瘤抗生素、長春花屬生物堿、喜樹堿類藥物、喹諾酮類抗生素、羅丹明B或其類似物、依沙吖啶或其類似物、吖啶橙或其類似物；5-羥色胺受體拮抗劑、茶堿類物質、局部麻醉藥、噻嗎洛爾及其鹽.，美托洛爾及其鹽、比索洛爾及其鹽、普萘洛爾及其鹽、索他洛爾及其鹽、伏立康唑及其鹽、曲馬多及其鹽、芬太尼及其鹽、舒芬太尼及其鹽、氨溴索及其鹽、氯諾昔康及其鹽、甲磺酸二氫麥角堿、鹽酸川丁特羅(特羅類)、多巴酚丁胺、鹽酸洛哌丁胺、阿替洛爾酒石酸美托洛爾、氯苯丁胺、麥角胺、蜂毒肽和生物堿。全文摘要本發(fā)明屬于藥物制劑領域，公開一種囊泡類給藥系統(tǒng)，其采用下述方法制備，所述方法依次包括(1)以表面活性物質為基本膜材、以含氮原子的多陰離子化合物溶液為水化介質制備獲得空白囊泡；(2)空白囊泡建立跨膜梯度即可，其中，所述含氮原子的多陰離子化合物為一類分子結構中含有氮原子及下述兩個以上陰離子的化合物羧基、硫酸基、磺酸基、磷酸基、枸櫞酸基或膦酸基。本發(fā)明方法建立的給藥系統(tǒng)具有載藥范圍廣、藥物包封率高及穩(wěn)定性好的特點，并可降低藥物毒性。文檔編號A61K9/00GK101601642SQ20091001231公開日2009年12月16日申請日期2009年6月30日優(yōu)先權日2009年6月30日發(fā)明者陽宋,玲張,張小飛,張艷晶,鄧意輝,馬艷鈴,黃微葳申請人:沈陽藥科大學