專利名稱：：益生菌與病毒偶聯(lián)生產(chǎn)藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種動物用藥物的生產(chǎn)方法，尤其是一種用益生菌與病毒偶聯(lián)生產(chǎn)可同時具有抗菌及免疫調(diào)節(jié)作用、同時治療病毒病和細(xì)菌病藥物的方法。
背景技術(shù)：
：目前，對于動物體內(nèi)病毒和細(xì)菌混合感染通常都是采用分別用藥且大多為肌肉注射給藥方式。如對于雞的新城疫病毒和大腸桿菌的混合感染，需要分別肌肉注射新城疫病毒高免血清及抗菌素，不僅成本高及給藥頻率高，所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)大，而且治愈率最高僅能達(dá)到65%，雞患病后的死亡率高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種用益生菌與病毒偶聯(lián)生產(chǎn)可同時具有抗菌及免疫調(diào)節(jié)作用、同時治療病毒病和細(xì)菌病藥物的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種益生菌與病毒偶聯(lián)生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行a.取益生菌蛋白；b.將益生菌蛋白與病毒蛋白按質(zhì)量比為46:l混合并加入與益生菌蛋白及病毒蛋白等質(zhì)量的EDC偶聯(lián)劑偶聯(lián)；c.將所得的偶聯(lián)物制成免疫原備用；d.用免疫原對個體較本原病毒宿主大的異種動物免疫二次；e.二次免疫后，每隔一周采集被免疫的異種動物血一次，分離血清，以HI試驗檢測抗此病毒和益生菌的抗體效價，待抗體效價達(dá)到8Lg2時，從免疫的異種動物靜脈采血并分離血清備用；f.將e步驟所得血清按每毫升血清與含20億的益生菌懸液混合，37t:作用1小時后，4"C保存。所述a步驟是取益生菌培養(yǎng)液離心、去上清，再用與益生菌培養(yǎng)液同體積的已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經(jīng)三次洗滌離心后去上清、取沉淀。所述d步驟免疫二次的用量分別為第一次0.5ml/kg、第二次0.7ml/kg。本發(fā)明是利用蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)，將益生菌菌體蛋白與病毒蛋白按比例偶聯(lián)在一起，通過免疫異種動物，獲得了抗此益生菌和病毒的抗體，其產(chǎn)量是本原病毒宿主的300500倍。所獲得的抗體與益生菌按比例混合作用后即能達(dá)到同時治療病毒和細(xì)菌混合感染且能通過口服給藥，治愈率達(dá)到了80%以上，降低了患病動物的死亡率，同時也降低了用藥成本，減少了對動物頻繁接種、多次用藥而產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。具體實施例方式實施例1:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化雞源糞鏈球菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結(jié)束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經(jīng)100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即雞源糞鏈球菌蛋白質(zhì)量。以分光光度計法測新城疫病毒的蛋白含量，將雞源糞鏈球菌蛋白與新城疫病毒蛋白按質(zhì)量比5:1比例混合，再加入雞源糞鏈球菌蛋白與新城疫病毒蛋白總量等質(zhì)量的EDC，緩慢攪拌避光反應(yīng)過夜。b.次日將偶聯(lián)物離心(10000r/min，離心5min)，棄上清以去掉未偶聯(lián)上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯(lián)物，并保存在4。C作為免疫原備用oc.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進(jìn)行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測新城疫抗體效價，待新城疫抗體效價達(dá)到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與雞源糞鏈球菌按每毫升血清與含20億的糞鏈球菌菌懸液混合后37匸作用1小時即可，4'C保存?zhèn)溆?。實驗?:取100只SPF雞，分別采用肌肉注射和口服途徑使其新城疫病毒和大腸桿菌混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現(xiàn)有技術(shù)以及本發(fā)明實施例1給藥，效果如表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>結(jié)果用實施例1的制劑作為新城疫病毒和大腸桿菌混合感染的治療用藥作用于患病雞體，治愈率為82%。實施例2:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化雞源糞鏈球菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h,培養(yǎng)結(jié)束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結(jié)束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經(jīng)100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即雞源糞鏈球菌蛋白質(zhì)量。以分光光度計法測傳染性支氣管炎病毒的蛋白含量，將雞源糞鏈球菌蛋白與傳染性支氣管炎病毒蛋白按質(zhì)量比5:1比例混合，再加入雞源糞鏈球菌蛋白與傳染性支氣管炎病毒蛋白總量等質(zhì)量的EDC，緩慢攪拌避光反應(yīng)過夜。b.次日將偶聯(lián)物離心(10000r/min，離心5min),棄上清以去掉未偶聯(lián)上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯(lián)物，并保存在4'C作為免疫原備用oc.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進(jìn)行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測傳染性支氣管炎病毒抗體效價，待傳染性支氣管炎病毒抗體效價達(dá)到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與雞源糞鏈球菌按每毫升血清與含20億的糞鏈球菌菌懸液混合后37'C作用1小時即可，4'C保存?zhèn)溆?。實驗?:取100只SPF雞，分別采用滴鼻和口服途徑使其傳染性支氣管炎和大腸桿菌混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現(xiàn)有技術(shù)以及本發(fā)明實施例2給藥，效果如表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結(jié)果用實施例2的制劑作為傳染性支氣管炎和大腸桿菌混合感染的治療用藥，作用于患病雞體，治愈率為88%。實施例3:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化雞源糞鏈球菌單菌落(V球)接種己滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結(jié)束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經(jīng)100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即雞源糞鏈球菌蛋白質(zhì)量。以分光光度計法測禽法氏囊病毒的蛋白含量，將雞源糞鏈球菌蛋白與禽法氏囊病毒蛋白按質(zhì)量比5:1比例混合，再加入雞源糞鏈球菌蛋白與禽法氏囊病毒蛋白總量等質(zhì)量的EDC，緩慢攪拌避光反應(yīng)過夜。b.次日將偶聯(lián)物離心(轉(zhuǎn)速10000r/min，離心5min)，棄上清以去掉未偶聯(lián)上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯(lián)物，并保存在4。C作為免疫原備用。c.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進(jìn)行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測禽法氏囊病毒抗體效價，待禽法氏囊病毒抗體效價達(dá)到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與雞源糞鏈球菌按每毫升血清與含20億的糞鏈球菌菌懸液混合后37匯作用1小時即可，4t:保存?zhèn)溆?。實驗?:取100只14日齡SPF雞，用點眼和口服途徑分別使其禽法氏囊病毒和大腸桿菌混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現(xiàn)有技術(shù)以及本發(fā)明實施例3給藥，效果如表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果用實施例3的制劑作為禽法氏囊病毒和大腸桿菌混合感染的治療用藥，作用于患病雞體，治愈率為84%。實施例4:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化雞源糞鏈球菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結(jié)束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經(jīng)100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即雞源糞鏈球菌蛋白質(zhì)量。以分光光度計法測馬立克病毒的蛋白含量，將雞源糞鏈球菌蛋白與馬立克病毒蛋白按質(zhì)量比5:1比例混合，再加入雞源糞鏈球菌蛋白與馬立克病毒蛋白總量等質(zhì)量的EDC,緩慢攪拌避光反應(yīng)過夜。b.次日將偶聯(lián)物離心(轉(zhuǎn)速10000r/min，離心5min)，棄上清以去掉未偶聯(lián)上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯(lián)物，并保存在4'C作為免疫原備用。c.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進(jìn)行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測馬立克病毒抗體效價，待馬立克病毒抗體效價達(dá)到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與雞源糞鏈球菌按每毫升血清與含20億的糞鏈球菌菌懸液混合后37'C作用1小時即可，4"C保存?zhèn)溆?。實驗?:取100只14日齡SPF雞，分別采用滴鼻和口服方式使其馬立克病毒和大腸桿菌混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現(xiàn)有技術(shù)以及本發(fā)明實施例4給藥，效果如表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)果:用實施例3的制劑作為馬立克病毒和大腸桿菌混合感染的治療用藥，作用于患病雞體，治愈率為82%。實施例5:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化雞源糞鏈球菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結(jié)束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經(jīng)100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即雞源糞鏈球菌蛋白質(zhì)量。以分光光度計法測禽腺病毒的蛋白含量，將雞源糞鏈球菌蛋白與禽腺病毒蛋白按質(zhì)量比5:1比例混合，再加入雞源糞鏈球菌蛋白與禽腺病毒蛋白總量等質(zhì)量的EDC，緩慢攪拌避光反應(yīng)過夜。b.次日將偶聯(lián)物離心(轉(zhuǎn)速10000r/min，離心5min)，棄上清以去掉未偶聯(lián)上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯(lián)物，并保存在4"C作為免疫原備用。c.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進(jìn)行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測禽腺病毒抗體效價，待禽腺病毒抗體效價達(dá)到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與雞源糞鏈球菌按每毫升血清與含20億的糞鏈球菌菌懸液混合后37r作用1小時即可，4'C保存?zhèn)溆?。實驗?:取100只SPF雞，分別采用滴鼻和口服途徑使其禽腺病毒和大腸桿菌混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現(xiàn)有技術(shù)以及本發(fā)明實施例5給藥，效果如表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)果用實施例3的制劑作為禽腺病毒和大腸桿菌混合感染的治療用藥，作用于患病雞體，治愈率為88%。實施例6:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化酵母菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結(jié)束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經(jīng)100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即酵母菌蛋白質(zhì)量。以分光光度計法測新城疫病毒的蛋白含量，將酵母菌蛋白與新城疫病毒蛋白按質(zhì)量比5:l比例混合，再加入酵母菌蛋白與新城疫病毒蛋白總量等質(zhì)量的EDC，緩慢攪拌避光反應(yīng)過夜。b.次日將偶聯(lián)物離心(轉(zhuǎn)速10000r/min，離心5min),棄上清以去掉未偶聯(lián)上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯(lián)物，并保存在4TM乍為免疫原備用。c.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原還是偶聯(lián)物0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進(jìn)行，每只羊按免疫原還是偶聯(lián)物0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測新城疫病毒抗體效價，待新城疫病毒抗體效價達(dá)到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與酵母菌按每毫升血清與含20億的酵母菌菌懸液混合后37'C作用1小時即可，4x:保存?zhèn)溆?。實驗?:取100只SPF雞，分別采用滴鼻和口服途徑使其新城疫疫病毒和支原體混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現(xiàn)有技術(shù)以及本發(fā)明實施例6給藥，效果如表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果:用實施例3的制劑作為新城疫病毒和沙門氏菌混合感染的治療用藥，用于患病雞體，治愈率為80%。實施例7:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化乳酸菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結(jié)束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經(jīng)100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即酵母菌蛋白質(zhì)量。以分光光度計法測新城疫病毒的蛋白含量，將乳酸菌蛋白與新城疫病毒蛋白按質(zhì)量比5:l比例混合，再加入乳酸菌蛋白與新城疫病毒蛋白總量等質(zhì)量的EDC，緩慢攪拌避光反應(yīng)過夜。b.次日將偶聯(lián)物離心(轉(zhuǎn)速10000r/min,離心5min)，棄上清以去掉未偶聯(lián)上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯(lián)物，并保存在4'C作為免疫原備用。c.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進(jìn)行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測新城疫病毒抗體效價，待新城疫病毒抗體效價達(dá)到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與乳酸菌按每毫升血清與含20億的乳酸菌菌懸液混合后37C作用1小時即可，4'C保存?zhèn)溆?。實驗?:取100只SPF雞，分別采用肌肉注射和口服途徑使其新疫病毒和沙門氏菌混合感染，50只為一組，分為兩組分別按現(xiàn)有技術(shù)以及本發(fā)明實施例6給藥，效果如表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)果用實施例3的制劑作為新城疫病毒和乳酸菌混合感染的治療用藥，用于患病雞體，治愈率為82%。除以上所列益生菌外，還可選用屎腸球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等。實施例中的益生菌糞鏈球菌(CICC20062)、屎腸球菌(CICC20420)、乳酸菌(CICC6002)、酵母菌(CICC1012)、蠟狀芽孢桿菌(CICC10040)、枯草芽孢桿菌(CICC10071)等菌種均購置于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。病毒新城疫病毒(cec20060254)、傳染性支氣管炎病毒(cec20060118)、傳染性喉氣管炎病毒(cvccAV22)、禽法氏囊病毒(cec20090904)、馬立克氏病毒(cvccAV26)、禽腺病毒(cvccAV176)等均購置于國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。偶聯(lián)劑選用的是EDC購置于合肥博美生物科技有限公司。權(quán)利要求1.一種益生菌與病毒偶聯(lián)生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行a.取益生菌蛋白；b.將益生菌蛋白與病毒蛋白按質(zhì)量比為4～6∶1混合并加入與益生菌蛋白及病毒蛋白等質(zhì)量的EDC偶聯(lián)劑偶聯(lián)；c.將所得的偶聯(lián)物制成免疫原備用；d.用免疫原對個體較本原病毒宿主大的異種動物免疫二次；e.二次免疫后，每隔一周采集被免疫的異種動物血一次，分離血清，以HI試驗檢測抗此病毒和益生菌的抗體效價，待抗體效價達(dá)到8Lg2時，從免疫的異種動物靜脈采血并分離血清備用；f.將e步驟所得血清按每毫升血清與含20億的益生菌懸液混合，37℃作用1小時后，4℃保存。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的益生菌與病毒偶聯(lián)生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于所述a步驟是取益生菌培養(yǎng)液離心、去上清，再用與益生菌培養(yǎng)液同體積的已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經(jīng)三次洗滌離心后去上清、取沉淀。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的益生菌與病毒偶聯(lián)生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于所述c步驟是將所得偶聯(lián)物離心去上清、留沉淀；加入生理鹽水溶解偶聯(lián)物。根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的益生菌與病毒偶聯(lián)生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于所述d步驟免疫二次的用量分別為第一次0.5ml/kg、第二次0.7ml/kg。全文摘要本發(fā)明公開一種益生菌與病毒偶聯(lián)生產(chǎn)藥物的方法，按以下步驟進(jìn)行a.取益生菌蛋白；b.將益生菌蛋白與病毒蛋白按質(zhì)量比為4～6∶1混合并加入與益生菌蛋白及病毒蛋白等質(zhì)量的EDC偶聯(lián)劑偶聯(lián)；c.將所得的偶聯(lián)物制成免疫原備用；d.用免疫原對個體較本原病毒宿主大的異種動物免疫二次；e.二次免疫后，每隔一周采集被免疫的異種動物血一次，分離血清，以HI試驗檢測抗此病毒和益生菌的抗體效價，待抗體效價達(dá)到8Lg2時，從免疫的異種動物靜脈采血并分離血清備用；f.將e步驟所得血清按每毫升血清與含20億的益生菌懸液混合，37℃作用1小時后，4℃保存。文檔編號A61P31/00GK101543513SQ20091001146公開日2009年9月30日申請日期2009年5月11日優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日發(fā)明者李鳳華,江國托,王效禹申請人:大連三儀動物藥品有限公司;江蘇三儀生物工程有限公司