專利名稱：納米銀脊髓、周圍神經(jīng)修復(fù)材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于使用組織工程方法修復(fù)人體或動物脊髓及外周神經(jīng)損傷。主要涉及一
種使用納米銀、膠原及殼聚糖制得的具有同損傷部位神經(jīng)組織相同方向的微管結(jié)構(gòu)支架的 制備工藝。
背景技術(shù)：
細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)成分如膠原等在細(xì)胞的粘附和移行過程中 發(fā)揮重要的作用。膠原是細(xì)胞外最重要的水不溶性纖維蛋白，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的骨架。膠 原在細(xì)胞外基質(zhì)中形成半晶體的纖維，給細(xì)胞提供抗張力和彈性，并在細(xì)胞的遷移和發(fā)育 中起作用。膠原在各種動物中都有存在。脊椎動物中腱、軟骨和骨中的膠原非常豐富，幾乎 占了蛋白總重的一半。 殼聚糖是甲殼質(zhì)經(jīng)脫乙酰反應(yīng)后的產(chǎn)品。殼聚糖的生物相容性良好，在生物醫(yī)學(xué) 及制藥等方面的應(yīng)用極其廣泛，可用作燒傷敷料及傷口愈合劑，包扎紗布用殼聚糖處理后， 傷口愈合速度可提高75%。用殼聚糖制成的可吸收性手術(shù)縫線，機(jī)械強(qiáng)度高，可長期貯存， 能用常規(guī)方法消毒，可染色，可摻入藥劑，能被組織降解吸收，免除患者拆線的痛苦。
納米銀的安全性是國際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的，對人體細(xì)胞沒有負(fù)面影響。美國毒物與疾 病登記處(Toxicological Profile Information Sheet, ATSDR)和美國衛(wèi)生及公共服務(wù) 部(United States D印artment of Health and Human Services,HHS)對銀的毒性進(jìn)行調(diào) 查，內(nèi)容涉及銀的吸收、分布、代謝、排泄以及其他對健康的影響，至今未發(fā)現(xiàn)銀對人毒性反 應(yīng)或影響免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的功能以及發(fā)育和遺傳毒性的報(bào)道。其次，納米 銀顆粒性質(zhì)穩(wěn)定，可以很容易以不同濃度加入支架材料中。由于其表面帶有正二價(jià)電荷，顆 粒之間因靜電排斥作用而不易聚積，所以分布均勻。再其次，納米銀顆粒大小穩(wěn)定，直徑大 小介于3-30納米，不能被免疫系統(tǒng)識別，所以不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)?？梢噪S材料降解而 緩慢釋放，不易在體內(nèi)蓄積。最后，納米銀的抗菌性已經(jīng)為醫(yī)學(xué)界所承認(rèn)，那么使用納米銀 顆粒制作的支架材料在損傷處可以起到很好的抗菌性。特別是在外傷后可以有效減少炎性 細(xì)胞的浸潤，對神經(jīng)的再生可以起到進(jìn)一步的促進(jìn)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是使用組織工程方法制備一種具有軸向微管結(jié)構(gòu)的組織工程化人 工神經(jīng)以修復(fù)脊髓及外周神經(jīng)的缺損。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是使用納米銀、膠原蛋白及殼聚糖為材料按照一定比例 混合后注入硅膠管中，在一定的低溫條件下，改變注有納米銀、膠原及殼聚糖混合物硅膠管 降入冷淋液中的速度和/或冷淋液溫度使脊髓、周圍神經(jīng)組織工程修復(fù)材料在內(nèi)部結(jié)構(gòu)上 具有軸向微管矩陣排列且微管內(nèi)表面均勻分布正電荷特性。將初步形成的支架使用交聯(lián)劑 交聯(lián)，即可形成具有軸向微管結(jié)構(gòu)并具有一定機(jī)械強(qiáng)度的組織工程支架。具體制作步驟如 下
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1)在制作中稱取膠原蛋白150毫克和殼聚糖75毫克，溶于0. 05摩爾/升醋酸溶 液。在4攝氏度恒溫環(huán)境中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌30分鐘，制成膠原懸濁液； 2)將o. oi-o. i毫克/升濃度納米銀溶液按i:8-i: 12體積比加入膠原懸濁
液。同樣在4攝氏度恒溫環(huán)境中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌30分鐘，制成納米銀、膠原及殼聚 糖懸濁液； 3)將納米銀、膠原及殼聚糖懸濁液注入內(nèi)徑2-15毫米的硅膠管中，密封兩端，按 2 X 10—5米/秒速度順軸向浸入冷凝劑中； 4)將懸濁液與硅膠管冰凍物按照應(yīng)用切成相應(yīng)長度，冰凍干燥機(jī)中(-40攝氏度， 100毫托)凍干48小時(shí)； 5)取出干燥的納米銀、膠原及殼聚糖支架，浸入濃度為5-15克/升京尼平 (Genipin)溶液中交聯(lián)48小時(shí)后，冰凍干燥機(jī)中(-40攝氏度，100毫托)凍干24小時(shí)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :按照本發(fā)明技術(shù)方案，以I型膠原蛋白、納米銀和殼聚糖為例，其制作方 法按以下步驟進(jìn)行 1.稱取I型膠原蛋白150毫克和殼聚糖75毫克，溶于0. 05摩爾/升醋酸溶液。 在4攝氏度恒溫環(huán)境中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌30分鐘，制成膠原懸濁液；
2.將0. 01毫克/升濃度納米銀溶液按1 : 8體積比加入到膠原懸濁液。同樣在 4攝氏度恒溫環(huán)境中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌30分鐘，制成納米銀、膠原及殼聚糖懸濁液；
3.將納米銀、膠原及殼聚糖懸濁液注入內(nèi)徑2-15毫米的硅膠管中，密封兩端，按 2 X 10—5米/秒速度順軸向浸入冷凝劑中； 4.將懸濁液與硅膠管冰凍物按照應(yīng)用切成相應(yīng)長度，冰凍干燥機(jī)中(-40攝氏度， 100毫托)凍干48小時(shí)； 5.取出干燥的納米銀、膠原及殼聚糖支架，浸入濃度為5-15克/升京尼平溶液中 交聯(lián)48小時(shí)后，冰凍干燥機(jī)中(-40攝氏度，100毫托)凍干24小時(shí)。
本發(fā)明所制備的脊髓、周圍神經(jīng)修復(fù)材料具有以下特點(diǎn) 1.本脊髓、周圍神經(jīng)修復(fù)材料的制備主要使用納米銀、膠原及殼聚糖為主要原料， 支架材料在體內(nèi)可為神經(jīng)再生提供仿生臨時(shí)結(jié)構(gòu)，且可自然降解。無免疫排斥及體內(nèi)蓄積 毒性。 2.支架內(nèi)部微管具有軸向矩陣排列的結(jié)構(gòu)特征，微管直徑可控制在20微米 300
微米，有利于再生軸突定向生長，也使移植的種子細(xì)胞可順微管壁軸向排列、遷移，從而最
大限度的使損傷的神經(jīng)獲得有效的修復(fù)再生。材料的外表面為致密結(jié)構(gòu)，可有效阻止體內(nèi)
纖維結(jié)締組織的長入。在生物體內(nèi)可長期保持一定外形，4個(gè)月后仍能保持較好的空間結(jié)
構(gòu)，該材料既可直接植入橋接神經(jīng)缺損，也可作為種子細(xì)胞種植的載體。 3.支架微管內(nèi)表面均勻分布大量納米銀顆粒。由于納米銀顆粒遇水電離出正二價(jià)
銀離子的特點(diǎn)使得支架微管內(nèi)表面在生物體內(nèi)均勻且大量分布著正二價(jià)電荷。均勻分布正
電荷的內(nèi)表面可以直接和神經(jīng)細(xì)胞表面的分子帶負(fù)電的基團(tuán)相互作用，與細(xì)胞膜發(fā)生非特
異性吸附，有助于神經(jīng)的再生。 4.使用植物提取成分京尼平作為交聯(lián)劑，可增強(qiáng)支架材料機(jī)械強(qiáng)度，且無細(xì)胞毒性。 5.支架材料中的納米銀顆粒在損傷處可以起到很好的抗菌性。
以下實(shí)例2 12。 實(shí)施例2 :采用I型膠原蛋白、納米銀溶液(1 : 12體積比，0.01毫克/升濃度) 和殼聚糖作為原始材料制備，其實(shí)施過程同實(shí)施例1。 實(shí)施例3 :采用I型膠原蛋白、納米銀溶液(1 : 8體積比，O. 1毫克/升濃度)和
殼聚糖作為原始材料制備，其實(shí)施過程同實(shí)施例1。 實(shí)施例4:采用I型膠原蛋白、納米銀溶液(1 : 12體積比，0. l毫克/升濃度)和
殼聚糖作為原始材料制備，其實(shí)施過程同實(shí)施例1。
實(shí)施例5 :采用III型膠原蛋白、納米銀溶液(1
和殼聚糖作為原始材料制備，其實(shí)施過程同實(shí)施例1。
實(shí)施例6 :采用III型膠原蛋白、納米銀溶液(1 和殼聚糖作為原始材料制備，其實(shí)施過程同實(shí)施例1。
實(shí)施例7 :采用III型膠原蛋白、納米銀溶液(1 和殼聚糖作為原始材料制備，其實(shí)施過程同實(shí)施例1。
實(shí)施例8 :采用III型膠原蛋白、納米銀溶液(1 和殼聚糖作為原始材料制備，其實(shí)施過程同實(shí)施例1。
實(shí)施例9 :采用IV型膠原蛋白、納米銀溶液(1 : 和殼聚糖作為原始材料制備，其實(shí)施過程同實(shí)施例1。
實(shí)施例10 :采用IV型膠原蛋白、納米銀溶液(1 和殼聚糖作為原始材料制備，其實(shí)施過程同實(shí)施例1。
實(shí)施例11 :采用IV型膠原蛋白、納米銀溶液(1 和殼聚糖作為原始材料制備，其實(shí)施過程同實(shí)施例1。
實(shí)施例12 :采用IV型膠原蛋白、納米銀溶液(1 和殼聚糖作為原始材料制備，其實(shí)施過程同實(shí)施例1。
本專利制備的納米銀、膠原及殼聚糖支架具有微管軸向矩陣排列的結(jié)構(gòu)特征，微 管直徑可控制在30 ii m 300 ii m，材料的外表面為致密結(jié)構(gòu)，可有效阻止體內(nèi)纖維結(jié)締組 織的長入。在人體內(nèi)可長期保持一定外形，4個(gè)月后仍能保持較好的空間結(jié)構(gòu)，該材料既可 直接植入橋接神經(jīng)缺損，也可作為種子細(xì)胞種植的載體。 以上所述僅是本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉該技術(shù)的人在本發(fā)明所公開的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到進(jìn)行類似的變化和替換， 都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
:12體積比，o.oi毫克/升濃度) :12體積比，0. l毫克/升濃度) :s體積比，o. l毫克/升濃度) :8體積比，o.oi毫克/升濃度)
12體積比，0.01毫克/升濃度)
:12體積比，0. l毫克/升濃度) :s體積比，o. l毫克/升濃度) :8體積比，o.oi毫克/升濃度)
權(quán)利要求
一種脊髓、周圍神經(jīng)修復(fù)材料的制備方法，該脊髓、周圍神經(jīng)修復(fù)材料使用I、III與IV型膠原與殼聚糖以及納米銀混合制成，在一定的低溫條件下，改變注有納米銀、膠原及殼聚糖混合物硅膠管降入冷淋液中的速度和/或冷淋液溫度使脊髓、周圍神經(jīng)組織工程修復(fù)材料在內(nèi)部結(jié)構(gòu)上具有軸向微管矩陣排列且微管內(nèi)表面均勻分布正電荷特性，其制備方法按以下步驟進(jìn)行1)稱取膠原蛋白150毫克和殼聚糖75毫克，溶于0.05摩爾/升醋酸溶液，在4攝氏度恒溫環(huán)境中，以1000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?0分鐘，制成膠原懸濁液；2)將0.01-0.1毫克/升濃度納米銀溶液按照1∶8-1∶12體積比加入到膠原懸濁液，同樣在4攝氏度恒溫環(huán)境中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌30分鐘，制成納米銀-膠原-殼聚糖懸濁液；3)將納米銀-膠原-殼聚糖懸濁液注入內(nèi)徑2毫米-15毫米的硅膠管中，密封兩端，按2×10-5米/秒速度順軸向浸入冷凝劑中；4)將懸濁液與硅膠管冰凍物按照應(yīng)用切成相應(yīng)長度，在-40攝氏度，100毫托冰凍干燥機(jī)中凍干48小時(shí)；5)取出干燥的納米銀-膠原-殼聚糖支架，浸入濃度為5-15克/升京尼平溶液中交聯(lián)48小時(shí)后，在-40攝氏度，100毫托冰凍干燥機(jī)中凍干24小時(shí)。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，本脊髓、周圍神經(jīng)修復(fù)材料的制備主要使用I、III與iv型膠原與殼聚糖以及納米銀為主要原料，納米銀-膠原-殼聚糖支架在體內(nèi)可為神經(jīng)再生提供仿生臨時(shí)結(jié)構(gòu)，且可自然降解，無免疫排斥及體內(nèi)蓄積毒性。
3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，支架內(nèi)部微管具有軸向矩陣排列的結(jié) 構(gòu)特征，微管直徑可控制在20微米 300微米，有利于再生軸突定向生長，也使移植的種子 細(xì)胞可順微管壁軸向排列、遷移，從而最大限度的使損傷的神經(jīng)獲得有效的修復(fù)再生，材料 的外表面為致密結(jié)構(gòu)，可有效阻止體內(nèi)纖維結(jié)締組織的長入，在生物體內(nèi)可長期保持一定 外形，4個(gè)月后仍能保持較好的空間結(jié)構(gòu)，該材料既可直接植入橋接神經(jīng)缺損，也可作為種 子細(xì)胞種植的載體。
4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，支架微管內(nèi)表面均勻分布大量納米銀 顆粒，由于納米銀顆粒遇水電離出正二價(jià)銀離子的特點(diǎn)使得支架微管內(nèi)表面在生物體內(nèi)均 勻且大量分布著正二價(jià)電荷，均勻分布正電荷的內(nèi)表面可以直接和神經(jīng)細(xì)胞表面的分子帶 負(fù)電的基團(tuán)相互作用，與細(xì)胞膜發(fā)生非特異性吸附，有助于神經(jīng)的再生。
5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，使用植物提取成分京尼平作為交聯(lián)劑， 可增強(qiáng)支架材料機(jī)械強(qiáng)度，且無細(xì)胞毒性。
6. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，使用納米銀顆粒制備的支架材料在損 傷處具有良好抗菌性。
全文摘要
一種納米銀脊髓及外周神經(jīng)損傷修復(fù)材料的制備方法。本發(fā)明屬于使用組織工程方法修復(fù)人體或動物脊髓及外周神經(jīng)損傷。該修復(fù)材料使用膠原(I、III、IV型)與殼聚糖以及納米銀混合制成，改變注有納米銀、膠原及殼聚糖混合物硅膠管降入冷淋液中的速度和/或冷淋液溫度使該脊髓、周圍神經(jīng)組織工程修復(fù)材料在內(nèi)部結(jié)構(gòu)上具有軸向微管矩陣排列且微管內(nèi)表面均勻分布正電荷。使用組織工程化神經(jīng)修復(fù)材料能夠替代自體游離神經(jīng)移植的材料，避免對供區(qū)造成醫(yī)源性損害，加快外周神經(jīng)再生軸索生長的速度，縮短神經(jīng)修復(fù)的時(shí)間?？蓮V泛應(yīng)用于臨床脊髓外傷及長階段外周神經(jīng)缺損的外科手術(shù)修復(fù)。
文檔編號A61L27/26GK101766836SQ20091000107
公開日2010年7月7日 申請日期2009年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月21日
發(fā)明者丁坦, 羅卓荊 申請人:丁坦;羅卓荊