專利名稱：抗炎癥肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有抗炎癥活性的肽和含有所述肽作為活性成分的抗炎癥組合物。
背景技術：
已知腫瘤壞死因子(TNF)、尤其是TNF-α是由炎癥細胞釋放的，并造成各種細胞毒性反應、免疫反應和炎癥反應。已知TNF-α參與許多炎癥和自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展， 并在釋放進血液和作用于全身時，進一步造成嚴重的敗血癥和膿毒性休克。因為TNF-α是與活體的免疫系統(tǒng)廣泛相關的因子，因此積極地進行抑制TNF-α的藥劑的開發(fā)。TNF-α以無活性形式被生物合成，并通過蛋白酶的切割變成活性形式；負責該活化的酶被稱作腫瘤壞死因子-轉(zhuǎn)化酶(TACE)。因而，抑制該TACE的物質(zhì)可以治療、改善或預防歸因于TNF-α 的疾病、病理學狀況、異常狀況、疼痛、不利征狀等。白介素-1 (IL-I)是刺激前列腺素、膠原酶和磷脂酶的生產(chǎn)、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞的去粒、和嗜中性粒細胞的活化的主要炎癥細胞因子。IL-I具有非常廣范圍的生理效應。它通過活化或促進免疫細胞的分化/增殖，引起局部的或全身的炎癥反應，并參與發(fā)燒、急性期蛋白的誘導、破骨細胞的活化等。因為IL-I是與活體的免疫系統(tǒng)廣泛相關的因子，因此積極地進行抑制IL-I的藥劑的開發(fā)。IL-I具有亞型IL-I α和IL-I β，二者都以無活性形式被生物合成，并通過蛋白酶的切割變成活性形式。負責IL-I β的活化的酶被稱作天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-I (也稱作白介素-1 β-轉(zhuǎn)化酶(ICE))。 因而，抑制該ICE的物質(zhì)可以治療、改善或預防歸因于IL-I的疾病、病理學狀況、異常狀況、 疼痛、不利征狀等?，F(xiàn)有技術公開了用作TACE抑制劑的源自海巴戟(Morinda citrifolia L)樹的成分(專利文件1)。也已知Cbz-Val-Ala-(OMe)-氟甲基酮作為ICE抑制劑(專利文件2)。 但是，這些成分不容易得到，且即使可得到，也具有攝取的容易性、安全性等問題。專利文件1:日本專利公開No. 2007-016015 A 專利文件2:日本專利公開No. 11-302192 A (1999)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是，提供抗炎癥組合物，其具有高效力、不會造成相關的副作用、容易攝取，且因為它的低成本和高安全性，也可以長時間給藥。作為對具有腫瘤壞死因子-轉(zhuǎn)化酶(TACE)-抑制作用的物質(zhì)和具有天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1 (ICE)-抑制作用的物質(zhì)的集中搜索的結(jié)果，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，具有特定序列的肽具有TACE-抑制活性和ICE-抑制活性，由此完成了本發(fā)明。因而，本發(fā)明包括下述發(fā)明
(1)包含由下式表示的氨基酸序列的肽
PyroGlu-(X)n-A或其鹽，其中X是相同的或不同的，且各自獨立地是Gin、Asn或ftx)； A 表示 Gin、Asn、Leu、lie、Met、Val 或 Phe ；且 η 表示 0-2 的整數(shù)；(2)根據(jù)(1)的肽或其鹽，其中X表示Gln或Pro；A是Gln、Leu、Met、Val或Phe ；且η 表示0或1 ；
(3)根據(jù)(2)的肽或其鹽，其中所述肽選自pyroGlu-Leu、pyroGlu-Val、pyroGlu-Met、 pyroGlu-Phe、pyroGlu-Gln-Gln 禾口 pyroGlu-Pro-Gln ；
(4)一種抗炎癥組合物，其包含根據(jù)(1)至(3)中任一項的至少一種肽或其鹽作為活性成分；
(5)根據(jù)的組合物，其中所述組合物通過抑制腫瘤壞死因子-轉(zhuǎn)化酶和/或天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1用來抑制炎癥；
(6)根據(jù)(4)或(5)的組合物，其中所述組合物用于預防、改善或治療其中涉及腫瘤壞死因子和/或白介素的炎癥疾病或病癥；和
(7)根據(jù)(4)至(6)中任一項的組合物，其中所述組合物是食物形式。根據(jù)本發(fā)明，提供了抗炎癥組合物，其具有比使用常規(guī)藥物制品的治療更高的安全性，且可以以簡單的方式攝取。
具體實施例方式下面具體描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含由PyroGlu-(X)n-A表示的氨基酸序列的肽或其鹽(該肽在下文中有時稱作本發(fā)明的肽)具有抑制腫瘤壞死因子-轉(zhuǎn)化酶和/或天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1的活性，且具有抗炎癥作用。在這里，pyroGlu表示焦谷氨酸；X獨立地是Gln (谷氨酰胺)、Asn (天冬酰胺)或ftx)(脯氨酸)、優(yōu)選Gln或ftx) ;A表示Gin、 Asn, Leu (亮氨酸)、Ile (異亮氨酸)、Met (甲硫氨酸)、Val (纈氨酸)或Wie (苯丙氨酸)、優(yōu)選Gin、Leu、Met、Val或Wie ；且η表示0、1或2、優(yōu)選O或1。由該式表示的肽的實例包括 pyroGlu-Leu、pyroGlu-Val、pyroGlu-Met、pyroGlu-Phe、pyroGlu-Gln-Gln 禾口 pyroGlu—Pro—Gln ο焦谷氨酸是它的Y-位酰胺基和α-位氨基被環(huán)化的谷氨酸。本發(fā)明的肽可以是天然或重組蛋白的部分水解物，通過化學合成方法或基因工程技術制備的肽，或它們的組
I=I O構(gòu)成本發(fā)明的肽的氨基酸可以是D-型、L-型或DL-型(外消旋形式)氨基酸； 但是，它們優(yōu)選地是L-型氨基酸。當通過天然蛋白的部分水解來制備本發(fā)明的肽時，組成氨基酸都是L-型氨基酸。當通過化學合成方法來制備本發(fā)明的肽時，可以制備這樣的肽， 它的組成氨基酸都是L-型或D-型氨基酸，或其中任意氨基酸是L-型氨基酸，且剩余氨基酸是D-型氨基酸；兩種肽都包括在本發(fā)明內(nèi)。通過氨基酸分析方法，可以測定本發(fā)明肽的組成。因為酸性水解方法被廣泛地用于將焦谷氨酸和谷氨酰胺兩者轉(zhuǎn)化成谷氨酸，優(yōu)選地使用這樣的方法，其包括，在使用對它們特異性的酶進行分解后，定量谷氨酰胺和焦谷氨酸。當所述肽是合成肽時，可以從在合成中使用的每種氨基酸的量、比例等，確定所述組成。本發(fā)明肽的鹽沒有特別限制，條件是，它是藥學上可接受的鹽或食物；其實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽的實例包括一個無機酸(諸如鹽酸、硫酸、硝酸和磷酸)的鹽和與有機酸(諸如醋酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸和檸檬酸)的鹽。堿加成鹽的實例包括與堿金屬(諸如鈉和鉀)的鹽、與堿土金屬(諸如鈣和鎂)的鹽和與胺(諸如銨和三乙胺)的鹽。當通過天然蛋白的部分水解來制備本發(fā)明的肽時，可以適當?shù)夭捎靡环N眾所周知的方法作為水解該蛋白的方法。其具體實例包括使用酸的水解方法和使用蛋白酶的水解方法。在水解中使用的天然蛋白可以是任意可得到的蛋白；但是，優(yōu)選地是已經(jīng)確認了安全性的蛋白。這樣的蛋白的實例包括源自動物的肉、皮膚、奶、血液等的動物性蛋白，和源自谷類(諸如稻谷和小麥)和水果(諸如美洲柿和桃子)的植物性蛋白。在它們中，已知諸如在小麥種子中所含的谷蛋白等蛋白富含谷氨酰胺，且優(yōu)選作為制備本發(fā)明的肽的原料。使用酸水解蛋白的方法可以采用常規(guī)方法。所述酸可以是諸如硫酸、鹽酸、硝酸、 磷酸和亞硫酸的無機酸，諸如草酸、檸檬酸、醋酸和甲酸等有機酸等的有機酸。當使用酸進行水解時，需要根據(jù)該酸的類型和當量濃度，適當?shù)卣{(diào)節(jié)水性介質(zhì)中的該蛋白的濃度；優(yōu)選地，通常在調(diào)節(jié)它的濃度至1. 0-80%(按質(zhì)量計算)之后，處理該蛋白。當使用蛋白酶水解該蛋白時，可以在水性介質(zhì)中使一種或多種蛋白酶作用于蛋白，以形成水解物。優(yōu)選的是使用單獨的酸性蛋白酶的方法，和可以有效地實施水解的使用酸性蛋白酶和中性蛋白酶或堿性蛋白酶的方法。當將植物性蛋白用作該蛋白時，在植物中包含的淀粉或纖維有時對蛋白酶作用或在純化中造成妨礙。在這樣的情況下，優(yōu)選地在使上述蛋白酶起作用之前和之后，或與所述蛋白酶一起，使諸如淀粉酶或纖維素酶的糖分解酶起作用。用于純化這樣得到的蛋白水解物的方法包括，過濾不溶物的方法，使用含水的醇等進行分級(萃取)的方法，和通過凝膠過濾色譜法、高效液相色譜法(HPLC)或自動聚焦進行純化的方法。當通過化學合成方法制備本發(fā)明的肽時，可以使用液相合成方法和固相合成方法中的任一種。優(yōu)選的是這樣的固相合成方法，其包括，將氨基酸或肽的C-末端通過連接基團固定到固相支持物上，并相繼向N-端延伸氨基酸。當采用固相合成方法時，肽合成儀(例如，來自Shimadzu的PSSM8，或來自ABI的433A型)也可以用于合成。用于固相合成的固相支持物可以是這樣的任意固相支持物，其具有結(jié)合作為本發(fā)明的肽的C-末端氨基酸的Gin、Asn、Leu、lie、Met、Val或Wie的羧基的性質(zhì)；其實例包括二苯甲基胺樹脂(BHA樹脂)，氯甲基樹脂、氧甲基樹脂、氨基甲基樹脂、甲基二苯甲基樹脂 (MBHA樹脂)、乙酰胺基甲基樹脂(PAM樹脂)、對-烷氧基芐基醇樹脂(Wang樹脂)、4_氨基甲基苯氧基甲基樹脂和4-羥甲基苯氧基甲基樹脂。作為合成的一個具體實例，下面將顯示制備pyroGlu-Gln-Gln作為本發(fā)明的肽的試驗。提供谷氨酰胺(Gln)作為C-末端氨基酸，其中羧基被保護，隨后與其縮合作為第二氨基酸的谷氨酰胺(Gln)，其中該氨基被諸如Boc (叔丁氧羰基)基團或Fmoc (9-芴基甲氧基羰基)基團等保護基保護，且羧基被活化。然后從得到的Gln-Gln 二肽去除N-末端谷氨酰胺的氨基的保護基，隨后與其縮合作為第三氨基酸的谷氨酰胺(Gln)，其中氨基被諸如Boc (叔丁氧羰基)基團或Fmoc (9-芴基甲氧基羰基)基團等保護基保護，且羧基被活化。當使用固相合成方法時，只需要使C-末端谷氨酰胺的羧基結(jié)合至固相支持物，以替代保護羧基。
可以如下進行羧基活化通過使羧基與多種試劑中的任一種反應，以形成對應的酰氯、酸酐或混合的酸酐、疊氮化物或活性酯諸如-ONp或-OBt。肽縮合反應也可以在縮合劑和外消旋化抑制劑(諸如碳二亞胺試劑(例如，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、水溶性的碳二亞胺(WSCD)或隊^-羰基二咪唑((^計0(1^1^(1￡12016))、四乙基焦磷酸鹽或1-羥基苯并三唑(HOBt))存在下進行。在合成反應結(jié)束后，對于該固相合成方法，可以從固相支持物分離得到的肽，去除所有保護基，隨后洗滌，以提供三肽Gln-Gln-Gln，它是粗肽形式。隨后，通過環(huán)化，可以將在 N-末端的谷氨酰胺轉(zhuǎn)化成焦谷氨酸，以提供本發(fā)明的肽。所述環(huán)化在水溶液中逐漸進行； 但是，通過升高溫度，可以加快它的速度。通過對作為N-末端氨基酸的焦谷氨酸進行縮合反應，也可以制備所述肽。當使用液相合成方法時，可以以與固相合成方法相同的方式合成該肽，例外是， C-末端氨基酸未結(jié)合至固相支持物。通過使用諸如高效液相色譜法(HPLC)等眾所周知的方法進行適當純化，可以將這樣得到的含有本發(fā)明的肽的粗肽制成高度純化的肽。如上所述，對于肽的化學合成方法，可以相繼使氨基酸進行縮合，并從C-末端向 N-末端延伸，以合成具有希望的氨基酸序列的本發(fā)明的肽。在這里，也可以使用L-或D-型氨基酸來合成肽，其中任意氨基酸是L-型氨基酸，且剩余氨基酸是D-型氨基酸。這樣得到的本發(fā)明的肽具有抑制腫瘤壞死因子-轉(zhuǎn)化酶(TACE)和/或天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1 (ICE)的活性。 可以通過下述方法測定TACE-抑制活性包括使TACE與無活性的TNF- α反應并測定得到的TNF- α的生成量和活性的方法，包括使TACE與TACE-特異性的底物反應并測定得到的產(chǎn)物的量的方法等。還可以使用可商業(yè)得到的測定試劑盒(來自Merck)?？梢酝ㄟ^下述方法測定ICE-抑制活性包括使ICE與無活性的IL-I β反應并測定得到的IL-I β的生成量和活性的方法，包括使ICE與ICE-特異性的底物反應并測定得到的產(chǎn)物的量的方法等。還可以使用可商業(yè)得到的測定試劑盒(來自R&D Systems) 0TACE參與腫瘤壞死因子(TNF)、尤其是TNF- α的活化，已知所述因子是由炎癥細胞釋放，并造成各種細胞毒性反應、免疫反應和炎癥反應。因而，具有抑制該TACE的活性的本發(fā)明的肽，具有抑制炎癥、尤其是歸因于腫瘤壞死因子(優(yōu)選TNF-α)的炎癥的活性。ICE 參與白介素、尤其是IL-I β的活化，白介素是刺激前列腺素、膠原酶和磷脂酶的生產(chǎn)、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞的去粒、和嗜中性粒細胞的活化的主要炎癥細胞因子，并引起局部的或全身的炎癥反應。因而，具有抑制該ICE的活性的本發(fā)明的肽，具有抑制炎癥、尤其是歸因于白介素(優(yōu)選11^-1、更優(yōu)選11^10)的炎癥的活性。為了本發(fā)明的目的，炎癥是由活體對損傷或刺激(歸因于物理的、化學的或生物的因素)的免疫應答引起的現(xiàn)象。它經(jīng)常造成發(fā)炎組織處的疼痛、熱覺、發(fā)紅、和腫脹，有時進一步導致發(fā)炎組織的功能減退或功能喪失。因而，本發(fā)明也涉及抗炎癥組合物，尤其是通過抑制TACE和/或ICE來抑制炎癥的抗炎癥組合物，其含有本發(fā)明的肽作為活性成分(在下文中有時稱作本發(fā)明的組合物)。本發(fā)明的組合物也可以用作用于預防、改善或治療其中涉及腫瘤壞死因子(尤其是 TNF-α)和/或白介素(尤其是IL-I β)的炎癥疾病或病癥的組合物。本發(fā)明的組合物可以僅含有一種或多種本發(fā)明的肽。本發(fā)明也涉及抑制炎癥的方法，尤其是通過抑制TACE和/或ICE來抑制炎癥的方法，所述方法包括，將本發(fā)明的肽或組合物給藥于哺乳動物。本發(fā)明也涉及用于預防、改善或治療其中涉及腫瘤壞死因子(尤其是TNF-α)和/或白介素 (尤其是IL-Ιβ)的炎癥疾病或病癥的方法，所述方法包括將本發(fā)明的肽或組合物給藥于哺乳動物。其中涉及腫瘤壞死因子和/或白介素的炎癥疾病或病癥的具體實例包括，關節(jié)炎、炎癥、風濕病、炎性腸病、克羅恩病、反流性食管炎、肺氣腫、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、阿爾茨海默病、干燥綜合征、惡病質(zhì)、花粉病、過敏性反應、食物過敏、變應性接觸性過敏、接觸性皮炎、癌癥、組織潰瘍形成、再狹窄、牙周疾病、大皰性表皮松解、骨質(zhì)疏松癥、移植排斥、 疼痛諸如植入疼痛、疼痛諸如人工關節(jié)痛、動脈硬化、主動脈/動脈瘤、充血性心力衰竭、心肌梗死、腦缺血、缺血再灌注癥狀、子宮內(nèi)膜異位癥、全身過敏、神經(jīng)退化性疾病、自身免疫性損傷、亨廷頓病、帕金森病、偏頭痛、抑郁、破骨細胞病、腦膜炎、神經(jīng)性疼痛、肌萎縮側(cè)索硬化癥、多發(fā)性硬化癥、皮肥厚、銀屑病、眼部血管生成、結(jié)膜疾病、角膜疾病、角膜愈合、鞏膜炎、黃斑變性、異常傷口愈合、燒傷、糖尿病、腫瘤浸潤、腫瘤增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移、AIDS、敗血癥和膿毒性休克。本發(fā)明的組合物可特別有效地預防、改善和治療風濕病。已知過勞、慢性疲勞綜合征、肌肉疼痛等是其中涉及腫瘤壞死因子和/或白介素的其它疾病或病理狀況。本發(fā)明對它們也是特別有效的。根據(jù)本發(fā)明，疾病或病癥的預防包括抑制和延遲疾病或病癥的發(fā)生，也包括在疾病或病癥發(fā)展之前阻止、以及在治療后對疾病或病癥的復發(fā)的阻止。根據(jù)本發(fā)明，疾病或病癥的治療包括治愈疾病或病癥，改善它們的癥狀，和抑制癥狀的進展?？寡装Y活性是指抑制炎癥的活性，炎癥的抑制包括炎癥的預防和治療，且包括抑制炎癥、抑制炎癥的進展、治愈炎癥和改善炎癥。為了本發(fā)明的目的，哺乳動物是指恒溫動物；其實例包括靈長類動物諸如人和猴， 嚙齒類動物諸如小鼠、大鼠和兔，寵物動物諸如狗和貓，和家養(yǎng)動物諸如牛、馬和豬。本發(fā)明的組合物適合給藥給靈長類動物，尤其是人。特別優(yōu)選地，將本發(fā)明的組合物給藥于具有炎癥的人、已經(jīng)診斷為具有炎癥的人、具有發(fā)展炎癥的可能性的人、和需要預防炎癥的人。在通常的情況下，按照肽質(zhì)量計，在0.01-20 g/天/成年人、優(yōu)選0. 1-10 g/天/ 成年人的范圍，施用本發(fā)明的組合物。當通過天然蛋白的部分水解來制備在本發(fā)明中使用的肽時，它的劑量也可以進一步增加，因為它是源自天然產(chǎn)物的、具有高安全性的肽。優(yōu)選地，適當增加或減小劑量，同時觀察其效力等。日劑量可以一次性給藥或攝取，但是優(yōu)選地分數(shù)份給藥。本發(fā)明的組合物的形式?jīng)]有特別限制；例如，它可以制成藥物組合物或食物(包括飼料)。當制成藥物組合物時，通常將本發(fā)明的組合物制成含有本發(fā)明的肽和藥學上可接受的載體的制劑。藥學上可接受的載體通常是指填充劑、稀釋劑、包封材料等，它們是無活性的、無毒的固體或液體，且不與作為活性成分的本發(fā)明的肽反應；其實例包括溶劑或分散介質(zhì)，諸如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)、它們的合適的混合物、 和植物油。藥物組合物的劑型沒有特別限制，且可以是任意劑型，包括用于口服給藥的劑型 (諸如片劑、丸劑、顆粒、粉塵制劑、細顆粒、粉劑、膠囊劑、糖漿劑、飲用制劑、溶液、栓劑和流食)和用于腸胃外給藥的劑型(諸如舌下片劑、噴鼻劑和注射溶液)。除口服給藥之外，本發(fā)明的組合物的給藥方法包括通常用于藥物給藥的給藥方法諸如靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥和皮下給藥。也可以采用包括經(jīng)除胃腸道之外的粘膜吸收的給藥方法，諸如直腸、舌下和鼻內(nèi)給藥。在這里，該藥物組合物可以以例如栓劑、舌下片劑或噴鼻劑的形式給藥。本發(fā)明的肽在藥物組合物中的含量隨其形式而變化；但是，它通常是0. 001%至 99% (按質(zhì)量計算)，優(yōu)選0. 01%至90% (按質(zhì)量計算)，更優(yōu)選1%至85% (按質(zhì)量計算)，甚至更優(yōu)選5%至80%(按質(zhì)量計算)，基于干重計算。優(yōu)選地，可以控制每日劑量，從而達到上述每個成年人的每日攝取劑量。當本發(fā)明的組合物制成食物時，其形式?jīng)]有特別限制。所述食物包括飲料，也包括保健食品和功能食品。保健食品和功能食品可以制成不同制劑的形式，諸如片劑、丸劑、顆粒、粉塵制劑、細顆粒、粉劑、膠囊劑、糖漿劑、飲用制劑、溶液和流食?？梢砸耘c上述藥物組合物相同的方式，生產(chǎn)制劑形式的食物。例如，在加入合適的賦形劑(例如，淀粉、加工過的淀粉、乳糖、葡萄糖或水)后，可以使用常規(guī)方式來生產(chǎn)。食物的具體實例進一步包括咖啡飲料、茶飲料、含有果汁的飲料、軟飲料、乳飲料、黃油、蛋黃醬、起酥油、人造黃油、各類沙拉醬、面包、面條、煮飯、面食、調(diào)味料、糕餅、餅干、巧克力、糖果、口香糖、各類調(diào)味料、以及各類飲食產(chǎn)品。通過將本發(fā)明的肽加入這樣的食物中，可以制備食物形式的本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的肽在本發(fā)明的食物中的含量隨食物形式而變化。它通常是0. 01%至80% (按質(zhì)量計算)，優(yōu)選0. 1%至75% (按質(zhì)量計算)，更優(yōu)選1%至70% (按質(zhì)量計算)，甚至更優(yōu)選5%至70% (按質(zhì)量計算)，基于干重計算。因為本發(fā)明的肽具有高安全性，也可以進一步增加它的含量。每日攝取量可以一次性攝取，也可以分數(shù)份攝取。優(yōu)選地，可以控制攝取量， 從而達到上述每個成年人的每日攝取量。攝取具有抗炎癥作用的本發(fā)明的肽或其鹽或含有其的本發(fā)明的組合物，可以抑制炎癥，且特別地期望具有預防、改善或治療其中涉及腫瘤壞死因子和/或白介素的炎癥疾病或病癥的作用。本發(fā)明的組合物可以含有用于生產(chǎn)藥品、食物和飼料的各種添加劑。另外可以共同存在各種活性物質(zhì)。這樣的添加劑和活性物質(zhì)的實例包括各種油脂、生藥、氨基酸、多元醇、天然產(chǎn)生的聚合物、維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維、表面活性劑、純凈水、賦形劑、穩(wěn)定劑、PH 調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、甜味劑、調(diào)味成分、酸化劑、著色劑和香料。本發(fā)明的肽可以與一種或多種具有抗炎癥活性的其它活性成分混合地或組合地給藥。因而，除本發(fā)明的肽之外，本發(fā)明的抗炎癥組合物可以包含具有抗炎癥活性的其它活性成分。各種油脂的實例包括植物油脂(諸如大豆油、紅花油和橄欖油)和動物油脂(諸如牛油和沙丁魚油)。生藥的實例包括牛黃、地黃、枸杞、蜂王漿、黨參和鹿茸。氨基酸的實例包括半胱氨酸、亮氨酸和精氨酸。多元醇的實例包括乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油和糖醇。糖醇的實例包括山梨糖醇、赤蘚醇、木糖醇、麥芽糖醇和甘露糖醇。天然產(chǎn)生的聚合物的實例包括阿拉伯樹膠、瓊脂、水溶性玉米纖維、明膠、黃原膠、 酪蛋白、谷蛋白或谷蛋白水解物、卵磷脂和糊精。
各種維生素的實例除了維生素C (抗壞血酸)、維生素B族和維生素E (生育酚) 之外，包括維生素A、D和K和核黃素丁酸酯，以及。維生素B族包括各種維生素B復合物， 諸如維生素Bi、維生素Bl衍生物、維生素B2、維生素B6、維生素B12、生物素、泛酸、煙酸和葉酸。維生素Bl及其衍生物包括具有維生素Bl的生理活性的所有化合物，諸如硫胺素或其鹽、二硫胺、呋喃硫胺或其鹽、地賽硫胺、雙丁硫胺、雙苯酰硫胺、苯磷硫胺、二硫化磷酸硫胺、賽內(nèi)酯硫胺、辛硫胺和丙硫硫胺、
礦物質(zhì)的實例包括鈣、鎂、鋅和鐵。膳食纖維的實例包括樹膠、甘露聚糖、果膠、半纖維素、木質(zhì)素、β -葡聚糖、木聚糖和阿拉伯木聚糖。表面活性劑的實例包括甘油脂肪酸酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯。賦形劑的實例包括蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、磷酸鈣、乳糖、糊精、淀粉、微晶纖維素和環(huán)糊精。具有抗炎癥活性的其它活性成分的實例包括海巴戟-衍生的成分、 Cbz-Val-Ala-(OMe)-氟甲基酮、甘草、甘草次酸、樺木醇、熊果酸、蜂膠、蘆薈、黃褥花果、桉樹提取物、母菊提取物、黃柏皮、樟腦、顛茄、吲哚美辛、布洛芬、吡羅昔康、水楊酸、雙氯芬酸、酮洛芬、萘普生和吡羅昔康。除了上述以外，可以摻混下述作為添加劑例如，?；撬帷⒐入赘孰?、肉堿、肌酸、輔酶Q、α-硫辛酸、葡萄糖醛酸、葡醛內(nèi)酯、茶氨酸、Y-氨基丁酸、辣椒素、各種有機酸類、黃酮類、多酚類、兒茶素類、黃嘌呤衍生物、不可消化的寡糖(諸如果糖-寡糖)或聚乙烯吡咯烷酮。根據(jù)添加劑類型和希望的攝取量，適當?shù)卮_定這些添加劑各自的摻混量；但是，它通常在0.01- 30% (按質(zhì)量計算)、優(yōu)選0. 1-10% (按質(zhì)量計算)的范圍。將參考下述實施例，具體描述本發(fā)明的肽和組合物的生產(chǎn)實施例和試驗實施例。 但是，本發(fā)明不限于這些實施例。
實施例生產(chǎn)實施例1: pyroGlu-Gln-Gln的合成
使用433A型肽合成儀(來自ABI)，通過固相方法，合成PyroGlu-Gln-Gln。使用2 g Boc-Gln-Pam樹脂作為原料，并采用受保護的氨基酸Boc-Gln和Boc-Glu (OBzl)，以下述方式進行自動合成。(1)從Boc-Gln-Pam樹脂去除Boc基團的反應
(2)洗滌
(3)活化Boc-Gln
(4)將活化的Boc-Gln加入Gln-Pam樹脂，進行縮合
(5)洗滌
(6)乙?；捶磻腘-末端氨基
(7)洗滌
(8)從Boc-Gln-Gln-Pam樹脂去除Boc基團的反應
(9)洗滌
(10)活化Boc-Glu (OBzl)(11)將活化的Boc-Glu(OBzl)加入Gln-Gln-Pam樹脂，進行縮合
(12)洗滌
(13)乙?；捶磻腘-末端氨基
(14)洗滌
(15)Boc-Glu (OBzl) -Gln-Gln-Pam 樹脂
通過用三氟醋酸-二氯甲烷(50:50)處理20分鐘，去除Boc基團。使用二氯甲烷，重復所有洗滌步驟各3次。通過如下進行縮合在DCC和HOBt存在下，以5倍當量的樹脂-結(jié)合的氨基，加入Boc-保護的氨基酸，隨后反應60分鐘。從肽合成儀移出得到的Boc-Glu(OBzl)-Gln-Gln-Pam樹脂，并轉(zhuǎn)移至另一個容器。向其中加入1 ml茴香硫醚和0.5 ml乙二硫醇/g樹脂，然后在室溫攪拌該混合物10 分鐘。然后，在冰冷卻下，緩慢加入10 ml氟化氫，然后將其攪拌30分鐘，隨后在減壓下蒸餾除去氟化氫。向該容器裝入100 ml冷的乙醚，將得到的物質(zhì)攪拌1分鐘，以沉淀出肽和樹脂。通過用Polyfron過濾器PF060 (來自Advantec)過濾，收集得到的物質(zhì)，并用冷乙醚(_40°C )洗滌。將肽溶于約30 ml三氟醋酸中，然后將它逐滴加入300 ml預先提供的冷乙醚中，以再次沉淀出肽。通過用3 μ m-孔PTFE膜(來自Advantec)過濾，收集得到的物質(zhì)，并用冷乙醚(_40°C)洗滌。將肽溶于2N醋酸中，然后凍干。從2. 35 g受保護的肽-Pam-樹脂，得到粗肽(1.21 g)。將粗肽溶于水中，并在60°C保持6小時以環(huán)化成焦谷氨酸，隨后凍干。在下述條件下，使用HPLC，純化得到的粗肽。柱Inertsil 0DS—3, Φ 20 X 250 mm (來自 GL Sciences) 流動相從0. 1%三氟醋酸至在0. 1%三氟醋酸中的35%乙腈的梯度流速10 mL/min
檢測器紫外線分光光度計，210 nm 溫度40°C
分離HPLC色譜圖的主峰，并使用肽測序儀，分析該分離產(chǎn)物的氨基酸序列。從1 g粗肽，得到 0. 88 g 純化的 pyroGlu-Gln-Gln 肽。生產(chǎn)實施例2: pyroGlu-Leu的合成
使用Boc方法，通過液相方法，合成PyroGlu-Leu。(1) Boc-pyroGlu 和 HCl Leu-OtBu 的縮合
將HCl Leu-OtBu (390 mg)導入茄形燒瓶中，溶于5 ml DMF中，并用冰冷卻，然后向其中加入0.124 ml三乙胺。隨后，向其中加入400 mg Boc-pyroGlu_0H、470 mg HOBt 和367 mg WS⑶HC1，然后在冰冷卻下，將它們攪拌12小時，進行縮合反應。在反應結(jié)束后，在減壓下蒸餾除去DMF，將殘余物溶于醋酸乙酯中。然后，用5%碳酸氫鈉水溶液、 10%檸檬酸水溶液、水和飽和鹽水依次洗滌醋酸乙酯，并將得到的物質(zhì)用無水硫酸鈉干燥。濾出硫酸鈉，并在減壓下濃縮濾液。向得到的殘余物中加入醚-己烷，以固化并收集 Boc-pyroGlu-Leu-O'Bu 產(chǎn)量是 609 mg (88%)。(2)去保護
將上面得到的B0c-Pyr0Glu-Leu-OtBu (600 mg)引入茄形燒瓶中，然后向其中加入5 ml三氟醋酸進行溶解，隨后在冰冷卻下進行去保護反應1小時。使用N2氣去除三氟醋酸，并通過加入醚，固化去保護的肽，然后通過過濾進行收集。將得到的固體溶于4N HCl/二嘴燒中，然后向其中加入醚，進行重新固化，然后通過過濾進行收集。產(chǎn)量是220 mg (53%)。生產(chǎn)實施例3: pyroGlu-Val的合成
使用209. 7 mg HCl H-Val-OtBu作為原料，以與生產(chǎn)實施例2相同的方式，合成 PyroGlu-Val0縮合反應的產(chǎn)量是326. 6 mg (85%)，去保護的肽的產(chǎn)量是205. O mg (91%)。生產(chǎn)實施例4: pyroGlu-Met的合成
使用Ml. 8 mg HCl H-Met-OtBu作為原料，以與生產(chǎn)實施例2相同的方式，合成 PyroGlu-Met0縮合反應的產(chǎn)量是208. 3 mg (50%)，去保護的肽的產(chǎn)量是90. 3 mg (60%)。生產(chǎn)實施例5: pyroGlu-Phe的合成
使用257. 8 mg HCl H-Phe-OtBu作為原料，以與生產(chǎn)實施例2相同的方式，合成 PyroGlu-Phe?？s合反應的產(chǎn)量是M2. 9 mg (56%)，去保護的肽的產(chǎn)量是103. 1 mg (59%)。生產(chǎn)實施例6: pyroGlu-Gln-Gln的合成
使用Fmoc方法，通過液相方法，合成PyroGlu-Gln-Gln。(1) Rnoc-Gln (Trt)-Gln-C^Bu 的合成
將HCl Gln-OtBu (1.15 g)導入茄形燒瓶中，溶于5 ml DMF中，并用冰冷卻，然后向其中加入0.74 ml三乙胺。隨后，向其中加入2. 94 g Fmoc-Gln(Trt)-OHU. 3 g HOBt和1.01 g WSCD HC1，然后在冰冷卻下，將它們攪拌12小時，進行縮合反應。在反應結(jié)束后，在減壓下蒸餾除去DMF，將殘余物溶于醋酸乙酯中。然后，用5%碳酸氫鈉水溶液、10%檸檬酸水溶液、 水和飽和鹽水依次洗滌醋酸乙酯，并將得到的物質(zhì)用無水硫酸鈉干燥。濾出硫酸鈉，并在減壓下濃縮濾液。向得到的殘余物中加入醚-己烷，以固化并收集Fmoc-Gln (Trt)-Gln-OtBut5 產(chǎn)量是 3. 51 g (92%)。(2)從 Rnoc-Gln (Trt)-Gln-OtBu 去除 Fmoc 基團
將Fmoc-Gln(Trt)-Gln-OtBu (1.12 g)引入茄形燒瓶中，然后在冰冷卻下向其中加入7 ml IM NaOH水溶液。由于該混合物形成白色渾濁，向其中加入甲醇進行溶解，使溶液在0°C 下反應2小時。加入檸檬酸進行中和后，將水加入真空濃縮得到的白色固體中，然后攪拌， 以得到樹膠狀固體。將該固體上硅膠柱，使用氯仿作為溶劑，分離希望的成分，并使用醚固化。產(chǎn)量是590 mg (73%)。(3) Boc-pyroGlu-Gln (Trt) -Gln-OtBu 的合成
將H-Gln(Trt)-Gln-OtBu (580 mg)引入茄形燒瓶中，溶于5 ml DMF中，并用冰冷卻， 然后向其中加入156 μ L三乙胺。隨后，向其中加入232 mg Boc-pyroGlu-0H、273 mg HOBt 和213 mg WSCD HC1，然后在冰冷卻下將其攪拌12小時，進行縮合反應。在減壓下蒸餾除去 DMF，將殘余物溶于醋酸乙酯中。然后，用5%碳酸氫鈉水溶液、10%檸檬酸水溶液、水和飽和鹽水依次洗滌醋酸乙酯，并將得到的物質(zhì)用無水硫酸鈉干燥。濾出硫酸鈉，并在減壓下濃縮濾液。使用真空泵將得到的殘余物減壓，以去除溶劑。產(chǎn)量是509. 3 mg (64%)。(4)去保護
將Boc-pyroGlu-Gln (Trt)-Gln-OtBu (760 mg)引入茄形燒瓶中，然后向其中加入10 ml三氟醋酸進行溶解，隨后在冰冷卻下反應4小時。使用N2氣去除三氟醋酸，并通過加入醚，固化去保護的肽。通過離心收集固體，并通過再次加入醚來懸浮。離心懸浮液，以收集固體。重復該操作3次，以得到粗肽。產(chǎn)量是445 mg (100%)。
(5) pyroGlu-Gln-Gln 的純化
上面得到的粗肽含有水不溶性的雜質(zhì)。因而，將粗肽懸浮于水中，通過過濾器收集濾液。向濾液中引入2 ml IM鹽酸，然后將其凍干。將醚加入凍干產(chǎn)物，以固化本發(fā)明的肽， 收集固體，然后干燥。終產(chǎn)量是256 mg (63%)。生產(chǎn)實施例7: pyroGlu-Pro-Gln的合成
使用生產(chǎn)實施例6的Fmoc方法，通過液相方法，合成PyroGlu-Pro-Gln。產(chǎn)量是174 mg (49%)。生產(chǎn)實施例8:從天然蛋白提取 pyroGlu-Gln-Gln、pyroGlu-Gln、pyroGlu-Leu 禾口 pyroGlu-Ile
(1)將離子交換水(9, 700 kg)、無水檸檬酸(38 kg)和小麥谷蛋白(1,500 kg)(活性谷蛋白，來自Weston Foods Limited)裝入反應器中，并在45°C下溫熱。然后，向其中加 A 2. 2 kg 胃白8| ("Protease M Amanog Amano Pharmaceutical Co.， Ltd.)禾口 1· 1 kg 淀粉酶("Liquefying Enzyme T”，來自 Hankyu Bioindustry Co. , Ltd.)，在 45°C下水解5小時。隨后，使用25%氫氧化鈉水溶液，將該液體調(diào)節(jié)至pH 4. 4-4. 5，并在該狀態(tài)保持7小時，進行酶處理。(2)隨后，在80°C維持液體20分鐘，以滅活蛋白酶。此后，將液體冷卻至65°C，然后向其中加入 0.5 kg 淀粉酶(‘‘Liquefying Enzyme T”，來自 Hankyu Bioindustry Co., Ltd.)，以水解在小麥谷蛋白中含有的淀粉和纖維，隨后通過在90°C維持液體20分鐘，滅活淀粉酶。(3)接著，將液體冷卻至10°C或更低，然后再次加熱至55°C。向其中加入活性炭 ("Takecoal[=| Takeda Pharmaceutical Company Limited) (100 kg), ^jp^ 55°CT" 攪拌30分鐘。(4)將液體溫度調(diào)至45°C，加入助濾劑(ladiolite，，，來自Showa Chemical Industry Co., LTD·)。使用加壓過濾裝置進行過濾，回收7，000升(7 m3)濾液。(5)在減壓下濃縮在上面中回收的濾液，通過使用板式加熱器在110°C下加熱20秒，進行滅菌，然后冷卻至55°C。(6)在160°C的鼓風溫度和80°C的排氣溫度的條件下，使用噴霧干燥器噴霧干燥在上面(5)中得到的液體，得到約1，000 kg粉末狀小麥谷蛋白水解物。(7)使用凝膠過濾方法，從在上面(6)中得到的粉末分離分子量為1，000或更小的級分，并使用HPLC進一步純化。通過HPLC，基于以與生產(chǎn)實施例1相同的方式得到的合成的 pyroGlu-Gln-Gln、pyroGlu-Gln、pyroGlu-Leu 和 pyroGlu-Ile，收集在相同條件下表現(xiàn)出相同保留時間的部分。結(jié)果，從800 kg粉末狀小麥谷蛋白水解物，分別得到4. 5 kg、 1. 6 kg、0. 9 kg 和 0· 7 kg 肽。(8)使用肽測序儀，分析純化的肽的氨基酸序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該肽具有序列 pyroGlu-Gln-Gln>pyroGlu-Gln、pyroGlu-Leu 禾口 pyroGlu-Ile。實施例1:片劑的生產(chǎn)
混合在生產(chǎn)實施例8中得到的pyroGlu-Leu肽(84 g)、10 g微晶纖維素(來自Asahi Kasei Corporation)、和5 g聚乙烯吡咯烷酮(來自BASF)，然后向其中加入3 ml乙醇， 隨后根據(jù)常規(guī)方法，通過濕法生產(chǎn)顆粒。干燥得到的顆粒，然后向其中加入1.1 g硬脂酸鎂，制備用于壓片的顆粒粉末。使用壓片機壓制粉末，生產(chǎn)100片，各自的重量是1 g (每片的 pyroGlu-Gln 含量是 0. 84 g)。實施例2:糖漿劑制劑的生產(chǎn)
煮沸凈化水GOO g)，然后在攪拌下向其中加入750 g蔗糖和100 g在生產(chǎn)實施例8 中得到的pyroGlu-Leu肽，進行溶解。然后在熱狀態(tài)期間，將該溶液滲濾。向產(chǎn)物中加入凈化水至1，000 mL總量，生成糖漿劑制劑(每100 ml糖漿劑制劑的pyroGlu-Leu含量是10 g) °實施例3:顆粒制劑的生產(chǎn)
混合在生產(chǎn)實施例8中得到的PyroGlu-Leu肽(76 g)、13. 3 g乳糖(來自DMV)、6. 7 g微晶纖維素(來自Asahi Kasei Corporation)和4 g聚乙烯吡咯烷酮(來自BASF)， 然后向其中加入30 ml乙醇，隨后根據(jù)常規(guī)方法，通過濕法生產(chǎn)顆粒。干燥后，調(diào)整顆粒尺寸，得到顆粒制劑(每10 g顆粒制劑的？71~06111-116含量是7.6 g)。實施例4:流食的生產(chǎn)
將酪蛋白酸鈉(來自DMV) (40 g)、160 g麥芽糊精(來自Sanwa Cornstarch Co., Ltd.)和25 g在生產(chǎn)實施例8中得到的pyroGlu-Leu肽加入在約65°C的750 ml凈化水， 進行溶解。隨后，向其中加入5 g維生素混合物和5 g礦物混合溶液(其包含鈉、鉀、鈣、鎂、 氯、鐵、磷、銅、鋅、錳和硫)。將混合物裝入均質(zhì)混合器(來自Tokushu Kika Kogyo Co., Ltd.)，并在約8，000 rpm大致乳化15分鐘。將得到的乳劑冷卻至約20°C，然后向其中加入香料，隨后在量筒中稀釋至終量1，000 mL。將乳劑Q30 g)裝入小袋，并在用氮氣排空的同時密封。在121°C滅菌液體15分鐘，得到濃縮的流食(每230 g流食的pyroGlu-Ile 含量是約5. 8 g)。實施例5: 面包的生產(chǎn)
將小麥粉(高筋粉)(150 g)與2 g干酵母混合。單獨地，將20 g在生產(chǎn)實施例8 中得到的pyroGlu-Gln-Gln肽、20 g糖、3 g鹽和6 g脫脂奶粉溶于70 g溫水中，向其中加入1個雞蛋，然后將其充分混合。將得到的物質(zhì)加入小麥粉中，然后用手充分揉捏。然后， 向其中加入約40 g黃油，進一步揉捏，制成20個面包的生面團。隨后，在發(fā)酵該生面團后， 將打散的雞蛋施加到其表面，然后在180°C烘箱中烘烤約15分鐘，制成面包(每個面包的 pyroGlu-Gln-Gln 含量是約 1 g)。實施例6:意大利面用肉醬的生產(chǎn)
將一份意大利面用肉醬(150 g)引入平鍋中，同時向其中加入5 g在生產(chǎn)實施例8中得到的pyroGlu-Gln-Gln肽，然后加熱，制成意大利面用肉醬。將得到的醬裝入小袋，并在用氮氣排空的同時密封，在121°C滅菌15分鐘，得到含有pyroGlu-Gln-Gln肽的意大利面用肉醬。實施例7:日本小麥面條的生產(chǎn)
將15 g在生產(chǎn)實施例8中得到的pyroGlu-Leu肽和15 g鹽在150 g水中的分散系， 加入300 g小麥粉(普通面粉)，然后將其充分揉捏，并靜置。此后，拉伸該生面團，并切成約5 mm的寬度，制成日本小麥面條。在沸水中煮該面條約10分鐘。結(jié)果，面條表現(xiàn)出良好的外觀、味道和質(zhì)地。每份日本小麥面條含有約5 g pyroGlu-Gln肽。試驗實施例1: TACE-抑制活性的測定制備1 mg/mL的在上述生產(chǎn)實施例中合成的每種焦谷氨酰肽(pyroGlu-Leu、 pyroGlu-Val>pyroGlu-Met>pyroGlu-Phe>pyroGlu-Gln-Gln 禾口 pyroGlu-Pro-Gln)的樣品， 并如下評價TACE-抑制活性。將每個樣品(10 μ L)力口入10 μ L 1 μ mol/L反應底物(TACE 底物 (Mac-PLAQAV-Dpa-RSSSR-ME)，來自 Biomol. International LP)、10 μ L 10 ng/10 μ L 酶溶液(重組人TACE，來自 R&D Systems),50 μ L緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 9. 0,5 μ M ZnCl2，0. 01%Brij35)、和20 μ L蒸餾水，在37°C下反應20分鐘。向其中加入10%三氟醋酸至1%終濃度，以終止反應。使用反相高效液相色譜，在下述條件下，分離底物和產(chǎn)物。 在320 nm的激發(fā)波長和405 nm的測定波長下，熒光測定底物和產(chǎn)物，進行定量。(色譜條件)
溶液 A: 10% 乙腈(0. 1%TFA) / 溶液 B: 80% 乙腈(0. 1%TFA) 梯度從50%至100%的溶液B 柱5C18 AR-II； 4. 6 Φ X 150 爐溫30°C 測定波長230 nm
結(jié)果如下面的表1所示，表示為產(chǎn)物熒光強度與產(chǎn)物和底物的熒光強度之比。[表 1]
權(quán)利要求
1.包含由下式表示的氨基酸序列的肽或其鹽pyroGlu-(X) η-A,其中X是相同的或不同的，且各自獨立地是GlruAsn或ftx) ；A表示Gln、Asn、Leu、lie、 Met、Val或Phe ；且η表示0-2的整數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽或其鹽，其中X表示Gln或ftx)；A是Gln、Leu、Met、Val或Wie ； 且η表示0或1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的肽或其鹽，其中所述肽選自pyr0Glu-Leu、pyroGlu-Val、 pyroGlu-Met、pyroGlu-Phe、pyroGlu-Gln-Gln 禾口 pyroGlu-Pro-Gln。
4.一種抗炎癥組合物，其包含權(quán)利要求1-3中任一項的至少一種肽或其鹽作為活性成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中所述組合物通過抑制腫瘤壞死因子-轉(zhuǎn)化酶和/或天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1用于抑制炎癥。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的組合物，其中所述組合物用于預防、改善或治療其中涉及腫瘤壞死因子和/或白介素的炎癥疾病或病癥。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項的組合物，其中所述組合物是食物形式。
全文摘要
本發(fā)明提供了抗炎癥組合物，其具有高效力、不會造成相關的副作用、容易攝取，且因為它的低成本和高安全性，也可以長時間施用。本發(fā)明涉及包含由pyroGlu-(X)n-A表示的氨基酸序列的肽或其鹽，其中X獨立地是Gln、Asn或Pro；A表示Gln、Asn、Leu、Ile、Met、Val或Phe；且n表示0-2的整數(shù)，以及包含它們的抗炎癥組合物。
文檔編號A61K38/00GK102224161SQ20088013204
公開日2011年10月19日 申請日期2008年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月22日
發(fā)明者佐藤健司, 小野慎, 鈴木良雄 申請人:日清藥業(yè)股份有限公司