專利名稱：用于預(yù)防和抑制人紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激與溶血的從棕櫚油研磨過程所得的液體植物提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和抑制紅細(xì)胞溶解的成分，更具體而言，本發(fā)明涉及用 于預(yù)防和抑制人紅細(xì)胞(RBC)的氧化應(yīng)激與溶血的一種從棕櫚油研磨過程所得的液體提 取物(棕櫚油植物提取液)。
背景技術(shù)：
溶血被視為由于人紅細(xì)胞受到氧化應(yīng)激的影響而損壞，最終導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)事件。 在這種情形下，人體紅血球或紅細(xì)胞(RBC)被破壞分解，血紅蛋白隨后被釋放進(jìn)入血漿里。經(jīng)由任意氧化劑所引發(fā)在人體紅血球或紅細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)事件可包括細(xì)胞形態(tài)變 化或轉(zhuǎn)變、酶的修飾、細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)的耗盡以及溶血。具有理解地，預(yù)防氧化應(yīng)激 有利于抑制紅血細(xì)胞潛在的損傷。從進(jìn)行了數(shù)年的一貫性關(guān)于人紅細(xì)胞(RBC)變形或受損的醫(yī)藥研究與調(diào)查中已 經(jīng)認(rèn)識到除了缺乏葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)，超量的活性氧種類，包括自由基的產(chǎn)生 和自由基生成物質(zhì)的增加都是導(dǎo)致人類紅細(xì)胞(RBC)溶解的主要因素。那些間接過剩的自由基和氧化劑是由環(huán)境因素導(dǎo)致或者是由受破壞的生理過程 所產(chǎn)生的，一個最常見的生理過程并發(fā)癥包括人體生物系統(tǒng)發(fā)生能力故障，而不能解除活 性中間體的毒性或減輕所引起的耗損。這種情況將逐步導(dǎo)致血細(xì)胞受到氧化應(yīng)激。在人血液細(xì)胞受氧化應(yīng)激達(dá)到臨界水平時，將會由細(xì)胞組織損耗而引起相關(guān)疾 病，包括心血管疾病或神經(jīng)退變性疾病，而且，溶血可導(dǎo)致溶血性貧血，而在這種情形下，骨 髓再生活性也不能彌補(bǔ)大量受損的紅細(xì)胞。防止或保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，可減少溶血的形成。在這方面，其中一個有效的 改善方法是自由基防御的存在。自由基防御可包括抗氧化補(bǔ)充劑，其主要起到減輕過度氧化劑和自由基所造成的 破壞性影響的作用，無論是以細(xì)胞形式或補(bǔ)充形式。細(xì)胞抗氧化劑的例子有超氧化物歧化 酶(SOD)、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶，其中，這些酶具有作為自由基清除劑和連鎖 反應(yīng)終端的功能。然而，化學(xué)抗氧化劑通過供電子給自由基，從而將自由基轉(zhuǎn)換為非自由基 形式。另一個廣為人知的涉及抗氧化劑或自由基清除劑的醫(yī)療應(yīng)用是從植物基礎(chǔ)來源 的。目前的證據(jù)表明，基于植物提取物的具有顯著藥效的主要成分包括酚類物質(zhì)形式和黃 酮類化合物形式的抗氧化劑。相比于化學(xué)抗氧化劑，這些抗氧化劑更為適宜，因為它們只有 較低的風(fēng)險會釋放或形成它們自己的自由基，當(dāng)在清除自由基的過程中。因此，利用化學(xué)性 抗氧化劑將取代合成的或化學(xué)的抗氧化劑而應(yīng)用于治療多種疾病，目前正蓄勢待發(fā)。兩個 主要植物化學(xué)物質(zhì)維生素E(生育酚與生育三烯酚)和類胡蘿卜素(它們都是脂溶性的) 的一個極佳來源是棕櫚果實。據(jù)報道，棕櫚維生素E可作為一種潛在的生物抗氧化劑，它保 護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和避免動脈粥樣硬化的進(jìn)程。
有報道指出，棕櫚果(Elaeis guineensis)的提取物能通過供氫和供電子機(jī)制來 表現(xiàn)出清除活性氧的活性。本發(fā)明的首要目的在于提供一種用于制備藥物的基于植物提取物的成分，用于防 止人紅細(xì)胞(RBC)的氧化應(yīng)激與溶血。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于制備安全的藥物的成分，用于預(yù)防人紅細(xì) 胞因氧化應(yīng)激和溶血的影響而受損，所述成分含有棕櫚油酚類。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和抑制人紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激與溶血的從棕櫚油研磨過 程所得的液體提取成分，該成分包括酚類和黃酮類。本發(fā)明還涉及一種有效治療量的含有所述棕櫚油提取物的成分在制備用于預(yù)防 和抑制人紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激與溶血的藥物的用途，通過按個體所需的量施藥于個體內(nèi)。本發(fā)明詳述本發(fā)明涉及以油棕酚和維生素E為基礎(chǔ)而鑒定的極好的藥劑成分，用于預(yù)防人紅 細(xì)胞(RBC)的氧化應(yīng)激與溶血，以及涉及該成分的生產(chǎn)。紅細(xì)胞是作為研究氧化應(yīng)激的合適模型。人紅細(xì)胞已被用作為研究源自紅茶、姜 黃的天然提取物以及富含多酚類的茶、初榨橄欖油以及紅酒的抗氧化活性的模型系統(tǒng)。以下進(jìn)行的實驗證明，棕櫚果具有抗氧化活性并以通過供氫和供電子機(jī)制作為活 性氧清除劑。以下實驗還評估棕櫚果粗提物的抗氧化性，在這里，棕櫚果粗提取物被稱為 CE，而乙醇提取物被稱為EE。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述實驗是利用人紅細(xì)胞(RBC)在體外模型系統(tǒng)中進(jìn)行 的。血液樣本是由健康志愿者捐贈的，通過肝素管收集。這里將基于各自的化驗的辦法及結(jié)果進(jìn)行描述，用于確定棕櫚油植物液中所取得 的化合物的效力。本發(fā)明的優(yōu)選實施例將通過一個工作例的方式來說明。本發(fā)明最佳實施方式工作例材料2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)是從Wako Pure化工有限公司獲得的。 所用的其他試劑均為分析純。本發(fā)明所用的棕櫚植物溶液的生物活性提取物可通過任何一種能從植物溶液 中采用標(biāo)準(zhǔn)提取技術(shù)或者在美國專利申請?zhí)?0030031740 (Sambanthamurthi，Tan和 Simdram，2004年)所公開的技術(shù)提取酚類化合物的方法來制備。這樣的提取物包括但不限 于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇。正如上述專利中所描述的提取物(這里稱為粗提取物CE)和乙醇提取物(EE)，已 被制備，其中，所述提取物已成功地從取自油棕櫚果實的研磨中所得的植物液中獲得。以靜脈穿刺從健康志愿者取得新鮮血液，所取得的血液隨后收集在肝素化試管。方法與結(jié)果方法I.紅細(xì)胞的溶血
血液在3000轉(zhuǎn)速離心20分鐘。隨后，隔離血漿和血沉棕黃層。用10mM、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗紅細(xì)胞三次，再以所述緩沖液懸浮已被沖洗的紅細(xì)胞。當(dāng)該懸 浮液與50nM 2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)在37°C保溫時，產(chǎn)生10%的血細(xì)胞 比容(Hct)，不含提取物(在這里作為對照)，或者含最終濃度的CE或EE。相應(yīng)地，在PBS中的棕櫚果粗提取物被添加到終濃度為0. 025至0. lOmMGAE中，然 后在PBS中加入50mM AAPH。對于對照組，加入同等體積的PBS，然后加入AAPH。隨后，樣品 保溫在37°C的搖床水浴中，在確定的時間隔取得等分部分。所得等分部分用于測定溶血程 度、GSH濃度以及MetHB含量。溶血程度按照Zou等人的常規(guī)方法來測定。GSH的濃度是根 據(jù)Buetler的方法，GSH濃度的檢測是通過與5，5_ 二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)所引 起作用反應(yīng)來測定的。MetHb是通過分光光度法來測定的。II.在溶血產(chǎn)物中形成的高鐵血紅蛋白溶血產(chǎn)物通過以10mL磷酸鹽緩沖液(15mM，pH 7. 2)懸浮40 i L密集的紅細(xì)胞而 制備的。懸浮液隨后被漩渦，再以4000RPM離心10分鐘。接著，以磷酸緩沖液(PB)將懸浮 液的血紅蛋白(Hb)含量調(diào)整到lOOmg Hb/dL。在PB中的總量為100 y L的提取液被加入 裝有0. 8mL溶血產(chǎn)物的微量透明小容器內(nèi)。通過添加100 u L 18mM的NaN02以啟動氧化作 用，并連續(xù)監(jiān)視波長為630nm的光吸收。采用100 u L的磷酸鹽緩沖液代替提取液，作為對 照樣品。結(jié)果

圖1 本發(fā)明所述的提取物對于溶血的影響的結(jié)果 上述結(jié)果(圖1)描繪了本發(fā)明所述的提取物對于溶血的影響。AAPH在第一系列的實驗中，紅細(xì)胞(RBC)懸液(10% Hct)與AAPH(50mM)單獨(dú)或在 0. ImM CE和EE的存在下保溫。該圖描述了由AAPH誘導(dǎo)的人紅細(xì)胞溶血的進(jìn)展，其溶血率 隨著時間的推移而增加。結(jié)果還顯示，在本發(fā)明所述的CE和EE存在時，溶血的程度會降低， 而在溶血爆發(fā)前需經(jīng)過一段長期滯后時間。這表明，這兩種提取物都有效地保護(hù)RBCs(紅
a寸間(分)
5 參考上述繪制的圖，(圖2)顯示了 本發(fā)明所述的CE與EE對紅細(xì)胞的保護(hù)作用 是劑量依賴性的，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)取物在低濃度為25 yM GAE時已有顯著的保護(hù)作用。如圖所示， 親水的清除自由基抗氧化劑也被發(fā)現(xiàn)能有效地預(yù)防AAPH誘導(dǎo)的氧化作用。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，本發(fā)明所述的提取物的保護(hù)作用可能是由于它們 能及時在自由基氧化及損傷紅細(xì)胞的細(xì)胞膜之前，有效地清除在水相中所產(chǎn)生的過氧化氧 自由基。NaN02為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，第二系列的實驗涉及評估提取物對于抑制由血紅蛋白受 到亞硝酸鹽誘導(dǎo)而氧化產(chǎn)生的高鐵血紅蛋白(MetHb)的效果。亞硝酸鹽是一種眾所周知的 氧化劑和MetHb形成劑。
-種組合共同保溫
在此試驗中，溶血產(chǎn)物(100mg/dL)與以下其中-
A.對于粗提取物(CE)
a)添加NaN02(1. 8mM)，不加提取物(作為對照)；
b)添加0. 05 至 0. 10mM GAE 的 CE。
B.對于乙醇提取物(EE)
a)添加NaN02(1. 8mM)，不加提取物(作為對照)；
b)添加0. 05 至 0. 10mM GAE 的 EE。
結(jié)果顯示，兩種形式的提取物抑制了 MetHb在溶血產(chǎn)物中的形成。如下面的表1 所示，其影響被認(rèn)為是劑量依賴性的。圖3 粗提取物(CE)對MetHb在溶血產(chǎn)物中的形成的影響
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CN 101873863 A說明書4/6 頁
細(xì)胞)免受由R0S(活性氧)誘導(dǎo)而引起的細(xì)胞毒性。圖2 本發(fā)明對紅細(xì)胞的保護(hù)作用的結(jié)果
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6 乙醇提取物(EE)對MetHb在溶血產(chǎn)物中的形成的影響 g 1.與NaN02(l. 8mM)保溫10分鐘后在溶血產(chǎn)物中形成的MetHb。值為平均值 4)；
士 SD(n = 根據(jù)第一個系列的實驗以及如圖2所示，對照組的RBC溶血程度為64. 3 士 14. 6 %， 以CE處理的RBC溶血程度為25. 9士 11. 7%，以EE處理的RBC溶血程度為24. 38士 12. 9%。 超過6小時，觀察到GSH和MetHb的濃度沒有協(xié)同效應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的第二個系列實驗以及所列附圖(圖3和圖4)，形成的MetHb量的變 化與在不同提取物濃度的時間有關(guān)。在亞硝酸鹽的影響下，Hb氧化成為MetHb，包括兩個階 段的反應(yīng)，第一階段是起始的停滯階段，其后是快速自身催化階段。在該停滯階段，形成的 MetHb可能與H202反應(yīng)，以致產(chǎn)生轉(zhuǎn)運(yùn)血紅蛋白自由基，從而完成了自身催化階段。然而，當(dāng)具有本發(fā)明所述的提取物時，該自身催化過程放緩。因此，得到這樣的結(jié)論本發(fā)明所述的提取物可保護(hù)RBCs免受氧化應(yīng)激，這樣，通 過抑制MetHb形成的迅速進(jìn)程而保護(hù)RBCs免受溶血，是由于清除了所產(chǎn)生的H202，作為在 停滯階段的證據(jù)。此外，該結(jié)果還表明，棕櫚果提取物能延緩在人紅細(xì)胞內(nèi)的AAPH誘導(dǎo)的 溶血。然而，該工作的例子并非試圖以任何方式來限制本發(fā)明的范圍，并且不應(yīng)該被解 釋為必須專門提供的條件、參數(shù)、試劑或者起始原料以便實施本發(fā)明。
權(quán)利要求
一種成分，其特征在于，所述成分包括酚酸和黃酮類，來自棕櫚油研磨過程所得的液體植物提取物，即棕櫚油植物提取液，用于預(yù)防與抑制人紅血細(xì)胞的氧化應(yīng)激和溶血。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成分，其特征在于所述成分用于預(yù)防因氧化應(yīng)激和溶血所 引起人紅細(xì)胞受到的氧化損傷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成分，其特征在于所述成分通過清除所產(chǎn)生的H202而抑制 MetHb形成的迅速進(jìn)程來防止和抑制氧化應(yīng)激，所述清除是由該成分內(nèi)的酚酸和黃酮類來 實施的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成分，其特征在于所述成分能夠延緩在人紅細(xì)胞即RBCs內(nèi) 由AAPH誘導(dǎo)的溶血。
5.有效治療劑量的如權(quán)利要求1所述的成分用于制備用于預(yù)防人紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激 與溶血的按個體所需施藥于個體的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和抑制人紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激與溶血的成分，其中所述成分包括來自棕櫚油研磨過程所得的液體植物提取物(棕櫚油植物提取液)，尤其是來自油棕櫚果實研磨中所得的植物提取液。
文檔編號A61K36/18GK101873863SQ200880113471
公開日2010年10月27日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日
發(fā)明者尼哈爾·S·阿噶, 森馬·薩曼, 瑞維佳德維·薩姆本覃穆爾斯, 穆赫德·巴斯里·瓦希德, 迦耶那·桑德蘭, 那根德讓·巴拉森達(dá)蘭, 陳·有愛 申請人:馬來西亞棕櫚油總署