專(zhuān)利名稱(chēng)：抗cd20治療組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了使用CD20特異性結(jié)合分子用于治療涉及異常B細(xì)胞活性的疾病的材料和方法。本文公開(kāi)的組合物用于治療和診斷B細(xì)胞病癥，例如B細(xì)胞惡性腫瘤和自身 免疫疾病。
背景技術(shù)：
以其通常作用，人免疫系統(tǒng)保護(hù)機(jī)體不受外源物質(zhì)和病原體的損害。免疫系統(tǒng)保 護(hù)機(jī)體的一種方法是通過(guò)產(chǎn)生稱(chēng)為B淋巴細(xì)胞或B細(xì)胞的專(zhuān)門(mén)細(xì)胞。B細(xì)胞產(chǎn)生與外源物 質(zhì)或病原體結(jié)合并且在某些情況下介導(dǎo)外源物質(zhì)或病原體的破壞的抗體。然而，在某些情況下，人免疫系統(tǒng)和特別地人免疫系統(tǒng)的B淋巴細(xì)胞出錯(cuò)并且導(dǎo) 致疾病。存在涉及B細(xì)胞不受控制的增殖的眾多癌癥。還存在涉及B細(xì)胞抗體產(chǎn)生的眾多 自身免疫疾病，所述抗體不是與外源物質(zhì)和病原體結(jié)合而是與機(jī)體的部分結(jié)合。此外，存在 眾多自身免疫疾病和炎性疾病，在其病理學(xué)中涉及B細(xì)胞，例如通過(guò)不適當(dāng)?shù)腂細(xì)胞抗原 呈遞給T細(xì)胞或通過(guò)涉及B細(xì)胞的其他途徑。例如，在B細(xì)胞方面有缺陷的自身免疫傾向 小鼠不發(fā)展自身免疫腎疾病、脈管炎或自身抗體。(Shlomchik等人，J Exp. Med. 1994,180 1295-306)。有趣的是，當(dāng)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)時(shí)，具有B細(xì)胞但在免疫球蛋白產(chǎn)生方面有缺陷的這些 自身免疫傾向小鼠的確發(fā)展自身免疫疾病(Chan等人，J Exp. Med. 1999，189 1639-48)，指 出B細(xì)胞在自身免疫疾病發(fā)展中起整體所需的作用?？梢酝ㄟ^(guò)在其細(xì)胞表面上的分子鑒定B細(xì)胞。⑶20是通過(guò)單克隆抗體鑒定的第一 種人B細(xì)胞譜系特異性表面分子。它是非糖基化的、疏水性35kDa B細(xì)胞跨膜磷蛋白，其氨 基和羧基末端位于細(xì)胞內(nèi)。Einfeld等人，EMBO J. 1988，7 :711_17。CD20由所有正常成熟 的B細(xì)胞表達(dá)，但不由前體B細(xì)胞或漿細(xì)胞表達(dá)。CD20的天然配體仍未鑒定，并且仍未完全 了解⑶20在B細(xì)胞生物學(xué)中的作用。特定抗⑶20單克隆抗體可以影響B(tài)細(xì)胞的活力和生長(zhǎng)。(Clark等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986，83 :4494_98)。CD20的廣泛交聯(lián)可以在B淋巴瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo) 凋亡(Shan等人，Blood 1998，91 1644-52)，并且已報(bào)告CD20在細(xì)胞表面上的交聯(lián)增加 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的量級(jí)并且增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)，例如，如通過(guò)測(cè)量細(xì)胞基質(zhì)的酪氨酸磷酸化 所檢測(cè)出的。(Deans等人，J. Immunol. 1993，146 :846_53)。因此，除通過(guò)補(bǔ)體和ADCC機(jī) 制的細(xì)胞耗盡外，在體內(nèi)通過(guò)特定CD20單克隆抗體的Fc受體結(jié)合可以通過(guò)CD20交聯(lián)促 進(jìn)惡性B細(xì)胞的凋亡，與SCID小鼠模型中人淋巴瘤的⑶20治療的有效性可能依賴(lài)于通過(guò) CD20單克隆抗體的Fc受體結(jié)合的理論一致(Funakoshi等人，J. Immunotherapy 1996，19 93-101)。在CD20多肽中的多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的存在(Einfeld等人，EMBO J. 1988，7 :711-17 ； Stamenkovic 等人，J. Exp. Med. 1988，167 1975-80 ；Tedder 等人，J. Immunol. 1988，141 4388-4394)阻止抗體結(jié)合后的⑶20內(nèi)在化，并且這被認(rèn)為是關(guān)于B細(xì)胞惡性腫瘤治療的重 要特征，當(dāng)將鼠類(lèi)CD20單克隆抗體1F5注入具有B細(xì)胞淋巴瘤的患者內(nèi)時(shí)，導(dǎo)致惡性細(xì)胞 的顯著耗盡和部分臨床應(yīng)答(Press等人，Blood 1987，69 :584_91)。因?yàn)檎３墒霣細(xì)胞也表達(dá)⑶20，所以抗⑶20抗體療法耗盡正常B細(xì)胞(Ref f等人，Blood 1994,83:435-445)。然而，治療完成后，正常B細(xì)胞可以通過(guò)CD20陰性B細(xì)胞前體得到再生；因此，用抗CD20療法療法的患者不經(jīng)歷顯著的免疫抑制。⑶20由B細(xì)胞起源的惡性細(xì)胞表達(dá)，包括B細(xì)胞淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞性白血病 (CLL)。⑶20不由前B細(xì)胞的惡性腫瘤表達(dá)，例如急性成淋巴細(xì)胞性白血病。⑶20因此是 用于治療B細(xì)胞淋巴瘤、CLL和其中B細(xì)胞涉及疾病病因?qū)W的其他疾病的良好靶。其他B細(xì) 胞病癥包括其中自身抗體在B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞的過(guò)程中產(chǎn)生的自身免疫疾病。靶向優(yōu)先在腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的分子的單克隆抗體(mAb)的使用目前是良 好確定的治療策略，其中至少7種不同的mAb治療得到批準(zhǔn)并且目前用于癌癥療法中 Rituxan (RiTUXAN)、曲妥珠單抗、阿侖珠單抗、西妥昔單抗、帕木單抗、貝伐珠單抗和吉 妥珠單抗奧佐米星。此種HiAb治療經(jīng)由2種不同機(jī)制介導(dǎo)其抗腫瘤活性。第一種機(jī)制涉及 mAb介導(dǎo)的關(guān)鍵受體-配體/反受體(counter-receptor)相互作用的抑制，所述相互作用 促成腫瘤生長(zhǎng)，并且第二種機(jī)制依賴(lài)于宿主的免疫系統(tǒng)的效應(yīng)子組分(例如能夠介導(dǎo)抗體 依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)的FcR+效應(yīng)子細(xì)胞)和人因子(例如能夠介導(dǎo)補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒 性(CDC)的補(bǔ)體)的參與。在后面一種情況下，mAb治療必須具有與效應(yīng)子細(xì)胞和補(bǔ)體上 的Fc γ Rs相互作用的能力。除EGFR靶向的帕木單抗外，目前在癌癥療法中使用的5種免 疫治療mAb各自具有銜接免疫系統(tǒng)的效應(yīng)子組分的能力。RITUXAN是批準(zhǔn)在癌癥中臨床使用的第一種mAb。RITUXAN是重組小鼠人IgGl嵌 合mAb，其中鼠類(lèi)抗CD20mAb的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域與人IgGl的恒定區(qū)融合。此夕卜，⑶20也已被放射免疫治療試劑靶向以治療B細(xì)胞相關(guān)疾病。一種治療由以 用于治療B細(xì)胞淋巴瘤的放射性核素形式(例如，131I標(biāo)記的抗CD20抗體)以及用于減輕 由前列腺和乳腺癌轉(zhuǎn)移引起的骨痛的89Sr標(biāo)記形式制備的抗⑶20抗體組成(Endo，Gan To Kagaku Ryoho1999,26 744-748)。在一項(xiàng)研究中，RITUXAN就用于治療具有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的18個(gè)患者(其 為非免疫抑制患者)的安全性、耐受性和初步臨床功效進(jìn)行測(cè)試。在治療的18個(gè)患者中，6 個(gè)患者接受lOOmg/m2的RITUXAN的1次輸注(低劑量)，6個(gè)患者接受375mg/m2的RITUXAN 的1次輸注(中等劑量)，并且6個(gè)患者接受375mg/m2的RITUXAN的每周4次輸注(高劑 量)。即使在低或中等劑量下，12個(gè)患者中的3個(gè)(25%)在2個(gè)月時(shí)發(fā)展升高水平的人抗 嵌合抗體(HACA)。因此，需要發(fā)展用于治療的新型⑶20特異性結(jié)合分子，優(yōu)選地，當(dāng)施用于并非免 疫抑制的患者時(shí)，不引起HACA反應(yīng)或引起HACA反應(yīng)的潛力減少的新型CD20特異性結(jié)合分 子。此外，盡管已存在對(duì)基于抗體的療法進(jìn)行的廣泛研究，但本領(lǐng)域仍需要治療與異常B細(xì) 胞活性相關(guān)的疾病的組合物和方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及在有此需要的受試者中診斷和治療B細(xì)胞介導(dǎo)疾病和病狀中有用的 新型CD20結(jié)合分子，所述疾病和病狀包括但不限于B細(xì)胞癌癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼 瘡。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了新型重鏈CDR序列，輕鏈CDR序列，包含CDR序列的 新型可變結(jié)構(gòu)域序列和包含新型CDR或可變結(jié)構(gòu)域序列的CD20結(jié)合分子，包含CDR、含其 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或分子的核酸、載體、宿主細(xì)胞、組合物和試劑盒。在某些實(shí)施方案中，包含新 型CDR序列或可變結(jié)構(gòu)域的CD20結(jié)合分子是抗體或其抗原結(jié)合片段。在其他實(shí)施方案中，CD20結(jié)合分子是小分子免疫藥物SMIP。在某些實(shí)施方案中，抗體或SMIP是人源化的，并且 包含人序列構(gòu)架和恒定區(qū)序列。本發(fā)明的⑶20結(jié)合分子結(jié)合在細(xì)胞上的⑶20，顯示⑶C和 ADCC活性，耗盡血液、骨髓和淋巴結(jié)中的⑶19+B細(xì)胞，減少B細(xì)胞淋巴瘤腫瘤生長(zhǎng)，和/或 減少播散性淋巴瘤的進(jìn)展和作用。本發(fā)明的CD20結(jié)合分子還用于例如在來(lái)自受試者的生 物樣品中檢測(cè)和定量CD20或表達(dá)其的細(xì)胞的存在。附圖簡(jiǎn)述

圖1?？笴D20SMIP與原代B細(xì)胞的結(jié)合。如說(shuō)明的，將從血沉棕黃層(buffy coat) 中分離的原代B細(xì)胞與指示濃度的各種抗⑶20SMIP—起溫育。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(MFI)使 用標(biāo)記的抗人IgG-PE抗體(Fe特異性的)分析SMIP的結(jié)合。相應(yīng)地，計(jì)算每種SMIP的 Ec50。圖2。針對(duì)人B細(xì)胞淋巴瘤的018011 (也稱(chēng)為18011或011，這是相同分子)的體
外生長(zhǎng)抑制作用。圖3A-3B?？耿?0SMIP的補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性測(cè)定法。A 將RamosB細(xì)胞與抗 ⑶20SMIP在10%人血清(Quidel)的存在下一起于37°C溫育3. 5小時(shí)。通過(guò)由細(xì)胞釋放的 LDH(Promega試劑盒)測(cè)量細(xì)胞死亡。B 將從血沉棕黃層中分離的原代人B細(xì)胞(5X105) 與抗人⑶55抗體(2 μ g/ml) 一起于37°C溫育10分鐘。隨后添加指示濃度的抗⑶20SMIP 和血清(10% )。溫育3. 5小時(shí)后，通過(guò)7-AAD染色和流式細(xì)胞術(shù)分析評(píng)估細(xì)胞死亡。圖4A-4B。這些體外研究證實(shí)018011以劑量依賴(lài)性方式與⑶20+B細(xì)胞淋巴瘤細(xì) 胞結(jié)合，并且能夠造成針對(duì)CD20+B細(xì)胞淋巴瘤靶細(xì)胞的Fc介導(dǎo)的細(xì)胞毒性以及補(bǔ)體依賴(lài) 性細(xì)胞毒性。效應(yīng)子功能性能力的這種證實(shí)對(duì)于018011抑制人B細(xì)胞淋巴瘤生長(zhǎng)的能力 是重要的。A. 018011針對(duì)SU-DHL4B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性。B. 018011針 對(duì)BJAB B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性。圖5?？耿?0SMIP的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性測(cè)定法。BJAB淋巴瘤細(xì)胞用CFSE進(jìn)行 標(biāo)記，隨后與SMIP和活化的人PBMC —起溫育。細(xì)胞用PI進(jìn)行染色并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn) 行分析。僅CFSE+細(xì)胞就細(xì)胞死亡進(jìn)行評(píng)估。圖6A-6B。A. 018011針對(duì)SU-DHL4B細(xì)胞淋巴瘤的Fc介導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性。 B. 018011針對(duì)Ramos B細(xì)胞淋巴瘤的Fc介導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
圖 7。CD20-SMIP 針對(duì) Ramos B 細(xì)胞的 ADCC。圖8。在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中外周⑶19+B細(xì)胞的耗盡。2LM 20_4和2LM 20_4mut Fc都證實(shí)在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中至少與Rituxan相當(dāng)?shù)耐庵蹸D19+B細(xì)胞的有效耗盡。圖9。在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中骨髓CD19+B細(xì)胞的耗盡。2LM 20_4和2LM 20_4mut Fc都證實(shí)在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中至少與Rituxan相當(dāng)?shù)墓撬鐲D19+B細(xì)胞的有效耗盡。圖10。在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中淋巴結(jié)CD19+B細(xì)胞的耗盡。2LM 20_4和2LM 20_4mut Fc都證實(shí)在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中至少與Rituxan相當(dāng)?shù)牧馨徒Y(jié)⑶19+B細(xì)胞的有效耗盡。圖11。IV施用后，在食蟹猴中2LM 20-4和2LM 20_4mut Fc的藥代動(dòng)力學(xué)(PK) 分析。2LM 20-4和2LM 20_4mut Fc的PK曲線(xiàn)都與Rituxan的PK曲線(xiàn)相當(dāng)。圖12。018011和利妥昔單抗對(duì)Balb/c裸鼠中建立的Ramos皮下異種移植物的作 用。圖13。018011和利妥昔單抗對(duì)Balb/c裸鼠中建立的Ramos皮下異種移植物的存活分析。圖14。018011、TRU-015和利妥昔單抗對(duì)nu/nu裸鼠中建立的Ramos皮下異種移植物的作用。圖15。018011、TRU-015和利妥昔單抗對(duì)nu/nu裸鼠中建立的Ramos皮下異種移 植物的存活分析。圖16。018011、TRU-015和利妥昔單抗治療的具有播散性Ramos B細(xì)胞淋巴瘤的 Scid小鼠的存活分析。圖17。在具有播散性疾病的Scid小鼠的骨髓中對(duì)人B淋巴瘤細(xì)胞的檢測(cè)。圖18。018011、TRU-015和利妥昔單抗治療的具有播散性WSU-DLCL2彌漫性大細(xì) 胞淋巴瘤的Scid小鼠的存活分析。圖19。靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用018011對(duì)Ramos皮下異種移植物生長(zhǎng)的作用。圖20。018011和利妥昔單抗對(duì)未照射和照射的Ramos皮下異種移植物的作用。圖21A-21C。隨著時(shí)間的平均腫瘤體積。在研究第0天時(shí)，將具有可觸知Ramos腫 瘤的裸鼠分成處理組(η = 8只/組)，從而使得每個(gè)組的平均腫瘤體積是相當(dāng)?shù)?。在?、 2、4、6和8天時(shí)用100 μ g人IgG、TRU_015、018008 (也稱(chēng)為18008或008，這是相同分子)、 018011或2Lm20-4來(lái)I V處理小鼠。在指示天數(shù)時(shí)用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤，并且使用下式計(jì)算 腫瘤體積V= 1/2[長(zhǎng)度x(寬度)2]。一旦動(dòng)物由于腫瘤體積超過(guò)指定限制而從研究中 取出，就推進(jìn)關(guān)于最后一次腫瘤體積的值。結(jié)果僅顯示到最后一只對(duì)照小鼠處死時(shí)的第10 天。圖22A-22C。在早期時(shí)間點(diǎn)時(shí)個(gè)別小鼠的腫瘤體積。對(duì)小鼠進(jìn)行處理且監(jiān)控，并且 如關(guān)于圖21中的圖例所述測(cè)定腫瘤體積。就在第8天(其中所有小鼠都活著的最后時(shí)間 點(diǎn))時(shí)個(gè)別小鼠的腫瘤體積(i)或相對(duì)于第0天在第8天時(shí)個(gè)別小鼠的相對(duì)腫瘤體積(ii) 而言顯示結(jié)果。使用單向ANOVA用Durmett’ s多重比較事后檢驗(yàn)(用于與hulgG處理的對(duì) 照的比較)和Tukey's多重比較事后檢驗(yàn)(用于所有其他配對(duì)比較)測(cè)定組間的顯著性差 異；指出了關(guān)于所有配對(duì)比較的P值。圖23A-23C。用TRU-015或HuCD20SMIP處理的小鼠的存活百分比。小鼠進(jìn)行處理 且監(jiān)控，并且如關(guān)于圖21中的圖例所述測(cè)定腫瘤體積。每周至少3次測(cè)定腫瘤體積(MWF)， 除當(dāng)研究中剩余的所有小鼠都不具有可觸知腫瘤時(shí)的時(shí)間段期間監(jiān)控轉(zhuǎn)變成每周一次外。 當(dāng)腫瘤體積達(dá)到超過(guò)1500mm3(或在星期五時(shí)1200mm3)時(shí)，處死小鼠。未發(fā)現(xiàn)小鼠由于其他 原因而死亡或處死。圖24A-24C。隨著時(shí)間的無(wú)腫瘤小鼠百分比。小鼠進(jìn)行處理且監(jiān)控，并且如關(guān)于圖 21中的圖例所述測(cè)定腫瘤體積。如果小鼠不具有可觸知腫瘤，那么它視為“無(wú)腫瘤的”。每 周至少3次測(cè)定腫瘤體積(MWF)，除當(dāng)研究中剩余的所有小鼠都不具有可觸知腫瘤時(shí)的時(shí) 間段期間監(jiān)控轉(zhuǎn)變成每周一次外。圖25A-25C。隨著時(shí)間的小鼠平均體重。如關(guān)于圖21中的圖例所述處理且監(jiān)控小 鼠。在研究的指示天數(shù)時(shí)測(cè)定體重。圖26。與從Ramos B細(xì)胞淋巴瘤異種移植物中分離的細(xì)胞結(jié)合的018011或利妥 昔單抗的流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估。圖27。018011針對(duì)人B細(xì)胞淋巴瘤的體外生長(zhǎng)抑制作用。
圖28。018011的交聯(lián)對(duì)Ramos B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的活化誘導(dǎo)死亡的作用。圖29是概括示例性人源化SMIP的幾個(gè)關(guān)鍵位置處的氨基酸殘基的表。在“鉸鏈” 列下列出的殘基描述了關(guān)于SEQ ID NO :60的位置220、226、229和230的殘基。在“IgGlFc” 列中的殘基331指在SEQID NO 61中的殘基331。發(fā)明詳述I.定義為了本發(fā)明可以更容易理解，首先定義了特定術(shù)語(yǔ)。其他定義在詳述的說(shuō)明書(shū)中 闡述。根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方案的“CD20結(jié)合分子”是包含本文特別例示的人源化 CD20結(jié)合分子的CD20結(jié)合部分的分子。本發(fā)明所包括的CD20結(jié)合分子類(lèi)型是抗體或其 CD20結(jié)合片段。結(jié)合分子可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行修飾，例如以改善其結(jié) 合親和力、 改善其特異性、減少其免疫原性、改變其效應(yīng)子功能和/或改善其在個(gè)體體內(nèi)的可用性。此 種修飾可以包括例如氨基酸序列修飾或作為融合蛋白表達(dá)。此種融合蛋白也是根據(jù)本發(fā)明 的結(jié)合分子。本發(fā)明的示例性結(jié)合分子是小分子免疫藥物(SMIP)。術(shù)語(yǔ)“抗體”指免疫球蛋白或其片段，并且包括包含抗體的抗原結(jié)合片段的任何此 種多肽。該術(shù)語(yǔ)包括但不限于多克隆、單克隆、單特異性、多特異性、人源化、人、單鏈、嵌合、 合成、重組、雜交、突變、移植和體外產(chǎn)生的抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括抗體的抗原結(jié)合片段。抗原結(jié)合片段的例子包括但不限于Fab 片段(由Vl、Vh、Cl和ChI結(jié)構(gòu)域組成)；Fd片段(由Vh和ChI結(jié)構(gòu)域組成)；Fv片段(指以 緊密、非共價(jià)結(jié)合的1個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域和1個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體)；dAb片段(由 Vh結(jié)構(gòu)域組成)；分離的⑶R區(qū)；(Fab' )2片段、二價(jià)片段(包含通過(guò)在鉸鏈區(qū)處的二硫橋 連接的2個(gè)Fab片段)、scFv (指用短接頭連接在一起的\和Vh結(jié)構(gòu)域的融合物)和保留 抗原結(jié)合功能的其他抗體片段。由抗體特異性識(shí)別并結(jié)合的抗原部分稱(chēng)為“表位”。本發(fā)明的抗CD20抗體的抗原結(jié)合片段通過(guò)常規(guī)生物化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生，例如酶切割、 或本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)。這些片段可以如下產(chǎn)生通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法蛋白 酶解切割完整抗體，或通過(guò)使用定點(diǎn)誘變?cè)谳d體中的所需位置處插入終止密碼子，例如在 ChI后以產(chǎn)生Fab片段，或在鉸鏈區(qū)后以產(chǎn)生(Fab' )2片段。例如，抗體的木瓜蛋白酶消 化產(chǎn)生2個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱(chēng)為“Fab”片段，各自具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和殘留的 “Fe”片段?？贵w的胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab’)2片段，其具有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并且仍能夠 交聯(lián)抗原。單鏈抗體可以通過(guò)用DNA使\和Vh編碼區(qū)連接而產(chǎn)生，所述DNA編碼使\和 Vh蛋白質(zhì)片段連接的肽接頭?！绑w外產(chǎn)生的抗體”指其中所有或部分可變區(qū)(例如，至少一個(gè)CDR)在非免疫細(xì)胞 選擇中(例如，體外噬菌體展示、蛋白質(zhì)芯片或其中候選序列可以就其與抗原結(jié)合的能力 進(jìn)行測(cè)試的任何其他方法)產(chǎn)生的抗體。這個(gè)術(shù)語(yǔ)排除了在免疫細(xì)胞中通過(guò)基因組重排產(chǎn) 生的序列。抗原結(jié)合片段/結(jié)構(gòu)域可以包含抗體輕鏈可變區(qū)和抗體重鏈可變區(qū)(Vh) ’然 而，它不必包含兩者。例如，F(xiàn)d片段具有2個(gè)Vh區(qū)，并且通常保留完整抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 某些抗原結(jié)合功能?？贵w的抗原結(jié)合片段的例子包括(I)Fab片段，具有\(zhòng)、VH、(^ 結(jié) 構(gòu)域的單價(jià)片段；(2) (Fab' )2片段，具有通過(guò)在鉸鏈區(qū)處的二硫橋連接的2個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；⑶具有2個(gè)Vh和ChI結(jié)構(gòu)域的Fd片段；(4)具有抗體單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域的Fv 片段，(5)具有 Vh 結(jié)構(gòu)域的 dAb 片段(Ward 等人，(1989) Nature 341 :544_546) ； (6)分 離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(7)單鏈Fv(SCFV)。盡管Fv片段的2個(gè)結(jié)構(gòu)域\和Vh由分離 基因編碼，但它們可以使用重組DNA方法通過(guò)合成接頭進(jìn)行連接，所述合成接頭使得它們 能夠制備為其中區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子的單條蛋白質(zhì)鏈(稱(chēng)為單鏈Fv(SCFV)；參 見(jiàn)例如，Bird 等人(1988) Science 242 :423_426 ；和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 =5879-5883)。這些抗體片段使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，并且片 段以與完整抗體相同的方式就功能進(jìn)行評(píng)估。術(shù)語(yǔ)“人抗體”包括具有與本領(lǐng)域已知的人種系免疫球蛋白序列基本上相對(duì)應(yīng) 的可變和恒定區(qū)的抗體，包括例如，由Kabat等人描述的那些(參見(jiàn)Kabat，等人(1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版，U.S. Department of Health andHuman Services, NIH Publication No. 91-3242)。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人種 系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過(guò)隨機(jī)或體外的位點(diǎn)特異性誘變或通過(guò)體 內(nèi)的體細(xì)胞突變引入的突變)。人抗體可以具有至少1、2、3、4、5或更多個(gè)位置的氨基酸殘 基被不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基替換。CDR如由Kabat或在Chothia C， Lesk AM, Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins, J Mol Biol. 1987Aug20 ； 196 (4) :901_17中定義。CDR —般指在序列中高變和/或形成 結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)的區(qū)域，例如Kabat⑶R基于序列變異性，如在Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Departmentof Health and Human Services (1991), 編輯.Kabat等人中描述的，或備選地，指如由Chothia描述的高變結(jié)構(gòu)環(huán)的位置。參 見(jiàn)例如，Chothia, D.等人(1992) J. Mol. Biol. 227 :799_817 ；和 Tomlinson 等人(1995) EMBO J. 14 :4628-4638。另外一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是由OxfordMolecular ‘ s AbM抗體模擬軟件使 用的AbM定義，這基于晶體結(jié)構(gòu)限定了完整高變區(qū)。一般參見(jiàn)例如，Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains. In Antibody EngineeringLab Manual(Ed. Duebel,S.禾口 Kontermann,R. ,Springer-Verlag,Heidelberg)。就 Kabat CDR 而言描述的實(shí)施方案可以備選地使用就Chothia高變環(huán)或AbM限定的環(huán)而言相似描述的關(guān) 系來(lái)實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“有效量”指經(jīng)過(guò)治療過(guò)程足以減少任何⑶20活性、改善一種或多種臨床癥 狀或達(dá)到所需生物后果的劑量或量。短語(yǔ)“抑制”或“對(duì)抗” CD20活性及其同源物指由于結(jié)合CD20特異性結(jié)合分子而 減少、抑制或以其他方式降低CD20的至少一種活性，其中減少是相對(duì)于在不存在相同分子 的情況下的CD20活性。抑制或?qū)共灰欢ㄖ甘綜D20生物活性的總體消除。活性中的減少 可以是至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。術(shù)語(yǔ)“分離的”指基本上不獨(dú)立于其天然環(huán)境的分子。例如，分離的蛋白質(zhì)基本上 不含來(lái)自衍生其的細(xì)胞或組織來(lái)源的細(xì)胞材料或其他蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)還指其中分離的蛋 白質(zhì)對(duì)于藥物組合物足夠純的制劑；或至少70% (w/w)純；或至少80% (w/w)純；或至少 90%純；或至少 95%、96%、97%、98%、99%或 100% (w/w)純。術(shù)語(yǔ)“治療劑”是治療或幫助治療醫(yī)學(xué)病癥的物質(zhì)。治療劑可以包括但不限于抗 增殖試劑、抗癌劑包括化學(xué)治療劑、抗病毒劑、抗感染藥、免疫調(diào)節(jié)劑等，其以補(bǔ)充通過(guò)本發(fā)明的CD20特異性結(jié)合分子減少CD20活性的方式調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞或免疫應(yīng)答。治療劑的非限 制性例子和用途在本文中描述。如本文所使用的，“治療有效量”的CD20特異性結(jié)合分子指一定量的CD20特異性 結(jié)合分子，其在單次或多次劑量施用于受試者(例如，人患者)后，有效治療、阻止、治愈、延 遲、減少病癥或復(fù)發(fā)病癥的嚴(yán)重性，和/或改善病癥或復(fù)發(fā)病癥的至少一種癥狀，或延長(zhǎng)受 試者的存活超過(guò)在沒(méi)有治療情況下的預(yù)期。當(dāng)應(yīng)用于單獨(dú)施用的個(gè)別活性成分時(shí)，治療有 效量指單獨(dú)的那種成分。當(dāng)應(yīng)用于組合時(shí)，治療有效量指無(wú)論以組合、順次還是同時(shí)施用， 導(dǎo)致療效的活性成分的組合量。本發(fā)明特別包括一種或多種CD20特異性結(jié)合分子可以各 自以有效劑量根據(jù)本發(fā)明的方法施用。
術(shù)語(yǔ)“治療”或“處理”指治療、預(yù)防或防病措施。治療處理可以改善接受治療的 個(gè)體中的至少一種疾病癥狀，或可以延遲個(gè)體中的進(jìn)行性疾病的惡化，或阻止其他相關(guān)疾 病的發(fā)作。治療可以施用于具有醫(yī)學(xué)病癥或最終可能獲得病癥的受試者，以阻止、治愈、延 遲、減少病癥或復(fù)發(fā)病癥的嚴(yán)重性，和/或改善病癥或復(fù)發(fā)病癥的至少一種癥狀，或以便延 長(zhǎng)受試者的存活超過(guò)在沒(méi)有治療情況下的預(yù)期。術(shù)語(yǔ)“人⑶20”意指人B淋巴細(xì)胞限制的分化抗原(也稱(chēng)為Bp35)。⑶20在早期 前B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，并且保留直至漿細(xì)胞分化。CD20分子可以調(diào)節(jié)活化過(guò)程中的步 驟，這是細(xì)胞周期起始和分化所需的，并且通常以極高水平在腫瘤B細(xì)胞上表達(dá)。CD20存 在于“正?！?B細(xì)胞以及“惡性” B細(xì)胞(即，不衰退增殖的那些B細(xì)胞可以導(dǎo)致B細(xì)胞淋巴瘤)。II.⑶20特異性結(jié)合分子根據(jù)本發(fā)明，⑶20結(jié)合分子結(jié)合在原代B細(xì)胞和B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系上的⑶20， 所述細(xì)胞系包括NU-DHLl、Ramos、SU-DHL4、SU-DHL5和WSU-DLCL2。在各種實(shí)施方案中，CD20 結(jié)合分子以與圖1中所示的EC50相當(dāng)?shù)腅C50結(jié)合CD20表達(dá)細(xì)胞和/或以劑量依賴(lài)性方 式結(jié)合。在各種實(shí)施方案中，CD20結(jié)合分子具有選自下述的一種或多種性質(zhì)在原代B細(xì) 胞以及至少Ramos、SU-DHL4和BJAB細(xì)胞中的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(⑶C)，在某些情況下具 有至少40%的細(xì)胞毒性；在至少RamoS、BJAB和SU-DHL4細(xì)胞中的抗體依賴(lài)性(或Fc依賴(lài) 性細(xì)胞毒性(ADCC或FcCC)，其為劑量依賴(lài)性的，并且在某些情況下具有至少40 %的細(xì)胞毒 性；在骨髓和淋巴結(jié)中維持CD19+B細(xì)胞耗盡比RITUXAN 更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間，或超過(guò)8天并 且至少10、12、14、16、18、20或21天；如實(shí)施例中所述在小鼠模型中減少生長(zhǎng)建立的異種移 植物腫瘤，并且當(dāng)在各種小鼠模型中在播散性淋巴瘤的早期中施用時(shí)是保護(hù)性的，如實(shí)施 例中所述。在某些實(shí)施方案中，α-⑶20結(jié)合分子是小分子免疫藥物(SmallModular-Immuno Pharmaceutical, SMIP).在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了人源化⑶20特異性結(jié)合分子。申請(qǐng)人 已提供了 57種新型CD20特異性結(jié)合分子，其對(duì)于治療哺乳動(dòng)物受試者包括人和馴養(yǎng)動(dòng)物 有用。本發(fā)明還提供了編碼CD20特異性結(jié)合分子的核酸序列。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的CD20特異性結(jié)合分子具有高結(jié)合親和力、低離解速 率且與人⑶20特異性結(jié)合。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化CD20特異性結(jié)合分子是抗體，特別是抗CD20 單克隆抗體(mAb)或其抗原結(jié)合片段。
嵌合抗體是具有衍生自不同抗體的部分的抗體。例如，嵌合抗體可以具有衍生自2 種不同抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)。供體抗體可以來(lái)自相同或不同物種。在特定實(shí)施方案中， 本發(fā)明的嵌合抗CD20抗體的可變區(qū)是非人的，例如鼠類(lèi)的，(或非人和人的組合)，并且恒 定區(qū)是人的。本發(fā)明的人源化⑶20結(jié)合分子還包括⑶R移植的人源化抗⑶20抗體。在一個(gè)實(shí) 施方案中，人源化抗體包含本發(fā)明的人源化抗⑶20SMIP的重鏈⑶R和/或輕鏈⑶R (SEQ ID NO 1-59)，以及人受體免疫球蛋白的重鏈和輕鏈構(gòu)架和恒定區(qū)。制備人源化抗體的方法公 開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，761 ；5，693，762 ；和 6，180，370 中，所述專(zhuān) 利各自通過(guò)引用整體合并入本文。保留完整抗體的結(jié)合特異性的本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合片段也包括在本發(fā)明中。抗 原結(jié)合片段包括本文描述的任何CD20特異性抗體的部分或全部重鏈或輕鏈、可變區(qū)或CDR 區(qū)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化CD20特異性抗體包含本申請(qǐng)的序列表中例 示的任何結(jié)合分子的重鏈⑶R3、輕鏈⑶R3或兩者。在包含HCDR3和IXDR3的實(shí)施方案中， 它們可以來(lái)自本申請(qǐng)的序列表中的相同分子或不同分子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人 源化⑶20特異性抗體包含本申請(qǐng)的序列表中例示的結(jié)合分子的重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3， 輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3，或所有6個(gè)⑶R，或者HCDR1-3和IXDR1-3可以來(lái)自本申請(qǐng)的序列 表中的不同結(jié)合分子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化CD20特異性抗體是包含本申請(qǐng) 的序列表中例示的結(jié)合分子的重鏈可變結(jié)構(gòu)域、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或兩者的抗體。本發(fā)明還 包括的是包含本申請(qǐng)的序列表中顯示的任何Vh、本申請(qǐng)的序列表中顯示的任何\、本申請(qǐng) 的序列表中顯 示的此種Vh和\的任何組合或任何VH/\對(duì)的人源化抗CD20抗體，或此種抗 體的抗原結(jié)合部分。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的CD20特異性結(jié)合分子是CD20特異性的、小分子免疫 藥物(SMIP)。本發(fā)明的人源化抗⑶20SMIP包含3個(gè)模塊結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和 效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗⑶20SMIP的結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含Vh結(jié)構(gòu)域和 Vl結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的抗CD20SMIP的鉸鏈結(jié)構(gòu)域通過(guò)提供在結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域之 間的彈性連接形成2種互補(bǔ)功能，同時(shí)還控制SMIP的結(jié)合或多聚化。本發(fā)明的人源化抗 CD20SMIP的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域可以包含例如人抗體Fc結(jié)構(gòu)域、或具有效應(yīng)子功能的非抗體蛋 白質(zhì)。效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域決定活化何種類(lèi)型的免疫細(xì)胞，并且調(diào)節(jié)所采用的效應(yīng)子功能的平衡， 包括抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)的相對(duì)活性。效應(yīng)子結(jié)構(gòu) 域還可以進(jìn)行改造，以調(diào)節(jié)SMIP藥物多聚化。本發(fā)明的SMIP的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)，例如衍生自一種或多 種免疫球蛋白的可變輕鏈和可變重鏈結(jié)合區(qū)。這些區(qū)域一般通過(guò)接頭肽分開(kāi)，所述接頭 肽可以是與結(jié)構(gòu)域相容的本領(lǐng)域已知的任何接頭肽或區(qū)域連接者。示例性接頭是基于 Gly4Ser接頭基序的接頭，例如(Gly4Ser)n,其中η = 1_5，或本申請(qǐng)的序列表中顯示的任 何接頭。任何合適的接頭可以在本發(fā)明的上下文中使用，它的例子描述在WO 2007/146968 中。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含人源化單鏈免疫球蛋白衍生的Fv產(chǎn)物，其可以包括通過(guò)接頭連接的，至少一個(gè)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的全部或部分以及至少一個(gè)免疫 球蛋白重鏈可變區(qū)的全部或部分。本發(fā)明的人源化抗CD20SMIP的鉸鏈結(jié)構(gòu)域可以是天然存在的肽、突變或遺傳改 造的肽、或人工肽。例如，鉸鏈區(qū)可以衍生自免疫球蛋白鉸鏈區(qū)(例如，負(fù)責(zé)形成Ch1*Ch2 區(qū)中的鏈內(nèi)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域二硫鍵的免疫球蛋白重鏈序列的部分)。鉸鏈區(qū)還可以是在 分類(lèi)上視為具有鉸鏈功能的免疫球蛋白多肽鏈區(qū)域的片段(例如，5-65個(gè)氨基酸，10-50個(gè) 氨基酸，15-35個(gè)氨基酸，18-32個(gè)氨基酸，20-30個(gè)氨基酸，21、22、23、24、25、26、27、28或29 個(gè)氨基酸)。鉸鏈結(jié)構(gòu)域還可以包括位于相鄰的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，例如ChI結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié) 構(gòu)域或可變結(jié)構(gòu)域中的氨基酸(根據(jù)用于對(duì)特定殘基指定特定結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)，如本領(lǐng) 域已知的，所述標(biāo)準(zhǔn)可以改變)。本發(fā)明的人源化抗CD20SMIP的鉸鏈結(jié)構(gòu)域可以是人鉸鏈區(qū)，即人抗體的重鏈的 鉸鏈區(qū)。在包含人鉸鏈區(qū)的實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)可以來(lái)自任何人免疫球蛋白同種型，例如人 IgG免疫球蛋白(即，人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)。在特定實(shí)施方案中，鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含零 或1個(gè)半胱氨酸殘基。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗⑶20SMIP包含SEQ IDS 60 或63至66中的任何一個(gè)中所示的鉸鏈。本發(fā)明的人源化抗CD20SMIP包含免疫球蛋白的恒定區(qū)的足夠氨基酸序列，以提 供效應(yīng)子功能，優(yōu)選ADCC和/或CDC。例如，效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域可以包含人免疫球蛋白Ch2結(jié)構(gòu) 域的序列，或可以包含人免疫球蛋白G2和Ch3結(jié)構(gòu)域。在包含Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域的實(shí)施方 案中，結(jié)構(gòu)域可以來(lái)自相同或不同人免疫球蛋白。在其他實(shí)施方案中，效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域可以包 含人免疫球蛋白IgE Ch3和Ch4區(qū)的序列。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的SMIP的⑶20結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含SEQ IDNO :1_59中所 示的Vh氨基酸序列、Vl氨基酸序列、Vh和\氨基酸序列中的任何或VH/\對(duì)。在特定實(shí)施 方案中，本發(fā)明的SMIP的鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO :60中所示的氨基酸序列。在特定 實(shí)施方案中，本發(fā)明的SMIP的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO :60或61中所示的氨基酸序 列。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的SMIP的CD20結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含具有人免疫球蛋白構(gòu) 架序列的Vh區(qū)，以及選自SEQ ID NO 1-59的SMIP的⑶20結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈⑶Rl、CDR2 和⑶R3氨基酸序列輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3氨基酸序列或兩者。在特定實(shí)施方案中，SMIP 鉸鏈結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包含SEQ ID NO :60，并且效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :61。本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生⑶20特異性結(jié)合分子的眾多重鏈Vh、輕鏈\、和⑶R序列。 例如，本申請(qǐng)的序列表中顯示的一個(gè)或多個(gè)⑶R可以與人構(gòu)架亞區(qū)(例如，全人FR1、FR2、 FR3或FR4)組合，以產(chǎn)生⑶20特異性結(jié)合分子。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的⑶20特異性 結(jié)合分子包含來(lái)自輕鏈可變區(qū)的3個(gè)CDR和來(lái)自重鏈可變區(qū)的3個(gè)CDR，其中重鏈CDR和輕 鏈CDR來(lái)自相同參考序列。本發(fā)明的CDR可以移植至任何類(lèi)型的免疫球蛋白構(gòu)架。本發(fā)明還提供了包含如下氨基酸序列的人源化CD20特異性結(jié)合分子，所述氨基 酸序列與本申請(qǐng)的序列表中顯示的序列基本上相同或基本上同源，和包含如下CDR的人源 化CD20特異性結(jié)合分子，所述CDR與本申請(qǐng)的序列表中顯示的CDR序列(有下劃線(xiàn)的) 基本上相同或基本上同源。例如，許多氨基酸或核苷酸堿基可以在本申請(qǐng)的序列表中顯示 的序列中加以改變，特別是在一個(gè)或多個(gè)CDR、構(gòu)架區(qū)或兩者中。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CD20特異性結(jié)合分子具有如下氨基酸序列，其與SEQ ID NO 1_59中所示的序列 至少80%相同。在其他實(shí)施方案中，氨基酸序列與如SEQ ID NO 1_59中所示的序列至少 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。任何合適的接頭可以在本發(fā)明的上下文中 使用，所述接頭的例子在WO 2007/146968中描述。與本文公開(kāi)的序列基本上相同或同源(例如，至少約85%序列同一性)的序列也 是本申請(qǐng)的部分。在某些實(shí)施方案中，序列同一性可以是約85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99%或更高。備選地，與核酸相關(guān)，當(dāng)核酸區(qū)段在選擇性雜交條件(例如，高嚴(yán)格雜交 條件)下與鏈的互補(bǔ)體雜交時(shí)，存在基本同一性或同源性。核酸可以存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞 裂解物中、或以部分純化或基本上純的形式存在。 通過(guò)改變編碼氨基酸序列的核酸序列可以產(chǎn)生對(duì)氨基酸序列的改變?？梢酝ㄟ^(guò) 本領(lǐng)域已知的方法，使用本說(shuō)明書(shū)關(guān)于特定序列的指導(dǎo)制備編碼給定CDR的變體的核酸序 列。這些方法包括但不限于，通過(guò)較早制備的編碼CDR的核酸的定點(diǎn)(或寡核苷酸介導(dǎo)的) 誘變、PCR誘變和盒式誘變制備，所有這些都是本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)。例如，定點(diǎn)誘變可 以用于制備置換變體(參見(jiàn)例如，Carter等人，(1985)Nucleic Acids Res. 13 =4431-4443 和 Kunkel 等人，(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :488_492，所述 2 個(gè)參考文獻(xiàn)都通過(guò)引 用在此合并)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的抗CD20結(jié)合分子的核酸。在某些實(shí)施 方案中，核酸編碼包含SEQ ID N0:l-59中的任何一個(gè)中所示的￥11或\氨基酸序列的多肽， 或編碼包含SEQ ID NO :1-59中的任何一個(gè)的氨基酸序列的多肽。在某些實(shí)施方案中，核酸 是SEQ IDNO 67-126中的任何一個(gè)或者編碼Vh區(qū)或\區(qū)的那些序列之一的片段。III.產(chǎn)生CD20結(jié)合分子本發(fā)明的人源化⑶20特異性結(jié)合分子可以例如通過(guò)重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備。例 如，在本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的情況下，可以用一種或多種重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿 主細(xì)胞，所述重組表達(dá)載體攜帶編碼抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈，或抗體的抗原結(jié)合片 段的DNA片段，從而使得輕鏈和重鏈在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并且優(yōu)選地分泌到培養(yǎng)宿主細(xì)胞 的培養(yǎng)基內(nèi)，可以從所述培養(yǎng)基中回收抗體。在SMIP的情況下，將編碼SMIP的核酸引入宿 主細(xì)胞內(nèi)并且在宿主細(xì)胞中表達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)可以用于獲得抗體重鏈和輕鏈基因或編碼SMIP的核酸，將 這些基因摻入重組表達(dá)載體內(nèi)，并且將載體引入宿主細(xì)胞內(nèi)，例如Sambrook，F(xiàn)ritsch和 Maniatis(編輯)，MolecularCloning ;A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989), Ausubel, F. Μ. ^A (lie ) Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)和 Boss 等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，816，397 中所述的 那些，所述所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用合并入本文。例如，為了表達(dá)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段，可以首先獲得編碼輕鏈和重鏈 可變區(qū)的核酸。這些核酸可以通過(guò)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得和修飾人種系輕鏈和 重鏈可變區(qū)基因來(lái)獲得。關(guān)于人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列是本領(lǐng)域已知的。 一旦獲得Vh和\片段，這些序列就可以進(jìn)行遺傳改造，以編碼例如一個(gè)或多個(gè)SMIP序列、 SMIP序列的Vh和\片段、或本文公開(kāi)的SMIP序列的CDR(參見(jiàn)例如，本申請(qǐng)的序列表)。為了表達(dá)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段，編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的一種或多種核酸或在SMIP的情況下，可以將編碼SMIP的核酸插入一種或多種表達(dá)載體內(nèi)，從而使 得核酸與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可操作地連接。一般選擇與所使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容的表 達(dá)載體和表達(dá)控制序列。除抗體重鏈和/或輕鏈基因外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以另外攜帶調(diào)節(jié)序列， 所述調(diào)節(jié)序列控制一條或多條抗體鏈(或片段)或SMIP在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，例如啟動(dòng) 子、增強(qiáng)子或其他表達(dá)控制元件(例如，多腺苷酸化信號(hào))，其控制編碼本發(fā)明的結(jié)合分 子的一種或多種核酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯。此種調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如，通過(guò)引 用合并入本文的 Goeddel, Gene Expression Technology :Methodsin Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)， 包括調(diào)節(jié)序列的選擇可以依賴(lài)于如下因素，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需蛋白質(zhì)表達(dá) 水平等。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的示例性調(diào)節(jié)序列包括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中指導(dǎo)高水平 蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，例如衍生自巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如，CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、猴病 毒40(SV40)(例如，SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP)) 和多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。關(guān)于病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進(jìn)一步描述，參見(jiàn)例如 Stinski的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，168，062、Bell等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，510，245和Schaffner等人 的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，968，615，所述所有專(zhuān)利通過(guò)引用合并入本文。除編碼本發(fā)明的抗體重鏈和/或輕鏈或SMIP的序列和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組 表達(dá)載體可以攜帶另外的序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起 點(diǎn))和可選標(biāo)記基因?？蛇x標(biāo)記基因促進(jìn)對(duì)載體已引入其內(nèi)的宿主細(xì)胞的選擇(參見(jiàn)例如， Axel等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，399，216,4, 634. 665和5，179，017)。例如，一般地可選標(biāo)記基因 對(duì)已將載體引入其內(nèi)的宿主細(xì)胞賦予針對(duì)藥物的抗性，所述藥物例如G418、潮霉素或氨甲 蝶呤。其他合適的可選標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于在用氨甲蝶呤選 擇/擴(kuò)增的dhfr-宿主 細(xì)胞中使用)和新霉素基因(用于G418選擇)。為了表達(dá)，編碼抗體重鏈和輕鏈或SMIP的一種或多種表達(dá)載體可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技 術(shù)轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、或DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染。在特 定實(shí)施方案中，用于表達(dá)本發(fā)明的CD20特異性結(jié)合分子的表達(dá)載體是病毒載體，例如逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體。此種病毒載體還可以用于產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系(作為CD20特異性結(jié)合分子的 連續(xù)供應(yīng)的來(lái)源)。用于表達(dá)本發(fā)明的重組人源化抗CD20結(jié)合分子的合適哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括 PER.C6 細(xì)胞(Crucel 1, The Netherlands)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0 細(xì)胞)(包括 Urlaub 和 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216_4220 中描述的 dhfr-CHO 細(xì)胞，與 DHFR 可選標(biāo)記一起使用，例如，如 R. J. Kaufman 和 P. A. Sharp (1982)Mol. Biol. 159 :601_621 中 描述的)、NS0骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。此外，還可以使用表達(dá)GnTin的宿主細(xì)胞 (W09954342和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)20030003097中描述的，所述2個(gè)專(zhuān)利通過(guò)引用合并入本文)， 從而使得表達(dá)的CD20特異性結(jié)合分子具有增加的ADCC活性。當(dāng)將編碼抗體或SMIP的重組表達(dá)載體引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)，一般如下產(chǎn) 生抗體和SMIP 通過(guò)培養(yǎng)宿主細(xì)胞足夠的時(shí)間段以允許蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)，更優(yōu)選 地，抗體或抗原結(jié)合片段或SMIP分泌到宿主細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)?？耿?0結(jié)合分 子可以使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收。
應(yīng)當(dāng)理解關(guān)于上述操作的變化在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，重組DNA技術(shù)可以用于去除對(duì)于與CD20結(jié)合不需要的編碼輕鏈和重鏈中的任一或兩者的某些或全部DNA。此外， 可以產(chǎn)生雙功能抗體，其中一條重鏈和一條輕鏈?zhǔn)潜景l(fā)明的抗體，并且另一條重鏈和輕鏈 對(duì)于除CD20外的抗原特異(例如，通過(guò)經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)交聯(lián)方法使本發(fā)明的抗體與第二種抗 體交聯(lián))。用于制備SMIP的方法已在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2003/0133939、2003/0118592和 2005/0136049號(hào)中得到描述，所述專(zhuān)利通過(guò)引用整體合并入本文。在特定實(shí)施方案中，本發(fā) 明的SMIP是結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白融合蛋白，其特征在于(1)關(guān)于同源結(jié)構(gòu)(例如，抗 原、反受體等)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，(2)具有零、1或2個(gè)半胱氨酸殘基的IgGl、IgA或IgE鉸鏈 區(qū)或突變的IgGl鉸鏈區(qū)，和(3)免疫球蛋白CH2*CH3結(jié)構(gòu)域。在特定實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié) 構(gòu)域包含在鉸鏈區(qū)中的1或2個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基。在特定實(shí)施方案中，當(dāng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域 包含2個(gè)Cys殘基時(shí)，涉及重鏈和輕鏈之間的結(jié)合的第一個(gè)Cys不缺失或不被另一個(gè)氨基 酸置換。本發(fā)明的人源化抗CD20SMIP與嵌合抗CD20SMIP，TRU-015相關(guān)，所述TRU-015是 與CD20抗原結(jié)合的重組(鼠類(lèi)/人)單鏈蛋白質(zhì)，如US 2007/0213293中所述。TRU-015 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域基于可公開(kāi)獲得的2H7結(jié)合結(jié)構(gòu)域。結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)經(jīng)修飾的CSS鉸鏈區(qū)與 效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域，人IgGl的G2和Ch3結(jié)構(gòu)域連接。IV.治療用途在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療具有或懷疑具有與異常B細(xì)胞活性相關(guān)的疾病 的受試者的方法，其包括給患者施用治療有效量的本發(fā)明的人源化CD20特異性結(jié)合分子。 在一個(gè)實(shí)施方案中，CD20特異性結(jié)合分子是CD20特異性小分子免疫藥物(SMIP)?！爱惓細(xì)胞活性”指偏離正常、合適或預(yù)期過(guò)程的細(xì)胞活性。例如，異常細(xì)胞活性 可以包括不適當(dāng)?shù)募?xì)胞增殖，所述細(xì)胞的DNA或其他細(xì)胞組分已變得損害或有缺陷。異常B 細(xì)胞活性可以包括其特征與如下疾病相關(guān)的細(xì)胞增殖，所述疾病由不適當(dāng)高水平的細(xì)胞分 裂、不適當(dāng)?shù)退降牡蛲龌騼烧咭穑刹贿m當(dāng)高水平的細(xì)胞分裂、不適當(dāng)?shù)退降牡蛲龌?兩者介導(dǎo)，或?qū)е虏贿m當(dāng)高水平的細(xì)胞分裂、不適當(dāng)?shù)退降牡蛲龌騼烧?。此種疾病的特征 在于例如下文更全面地描述的，細(xì)胞、細(xì)胞群體或組織的單次或多次局部異常增殖，無(wú)論是 癌性還是非癌性的、良性還是惡性的。異常B細(xì)胞活性還可以包括異?？贵w生產(chǎn)，例如自身 抗體產(chǎn)生，或一般希望在正常水平下的抗體的過(guò)量生產(chǎn)。包括異常B細(xì)胞活性可以在B細(xì) 胞的特定亞群中并且不在其他亞群中發(fā)生。異常B細(xì)胞活性還可以包括T細(xì)胞的不適當(dāng)刺 激，例如通過(guò)不適當(dāng)?shù)腂細(xì)胞抗原呈遞給T細(xì)胞或通過(guò)涉及B細(xì)胞的其他途徑?！熬哂谢驊岩删哂信c異常B細(xì)胞活性相關(guān)的疾病的受試者”是如下受試者，其中疾 病或疾病的癥狀可以由異常B細(xì)胞活性引起，可以通過(guò)異常B細(xì)胞活性惡化，或可以通過(guò)調(diào) 節(jié)B細(xì)胞活性得到緩解。此種疾病的例子是B細(xì)胞癌癥(例如，B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞白血 病、B細(xì)胞骨髓瘤)，特征在于自身抗體產(chǎn)生的疾病或特征在于不適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞刺激的疾病， 例如通過(guò)不適當(dāng)?shù)腂細(xì)胞抗原呈遞給T細(xì)胞或通過(guò)涉及B細(xì)胞的其他途徑。在一個(gè)方面，通過(guò)本發(fā)明的方法治療的個(gè)體證實(shí)對(duì)用本文描述的CD20特異 性結(jié)合分子的治療的改善應(yīng)答，這改善超過(guò)對(duì)其他治療的應(yīng)答，例如，用于治療RA的 ENBREL (Amgen/Wyeth)、HUMIR A (Abbott)、REMICADE (Johnson&Johnson/Schering-Plough)、RITUX AN (Genentech/Roche)、ocrelizumab (Genentech/Roche)、 ORENCI A (BMS)、ACTEMRA (Roche/Chugai)、CIMZIA (UCB Pharma),以及用于 治療狼瘡(SLE)的 RITUXAN (Genentech/Roche)、ocrelizumab (Genentech/Roche)、 貝利木單抗(HGS)、依帕珠單抗(Immunomedics/UCB)、Humax CD20 (Genmab/GSK)、 atacic 印 t (Zymogenetics)、0RENCI A (BMS)和 ACTEMRA (Roche/Chugai)。經(jīng)改善 超過(guò)其他治療的應(yīng)答指如下臨床應(yīng)答，其中通過(guò)本發(fā)明的方法的治療導(dǎo)致患者中優(yōu)于單獨(dú) 或與其他試劑組合的其他治療的臨床應(yīng)答。改善的應(yīng)答通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知和本文描述的 臨床標(biāo)準(zhǔn)的比較進(jìn)行評(píng)估。示例性標(biāo)準(zhǔn)包括但不限于，B細(xì)胞耗盡的持續(xù)時(shí)間、B細(xì)胞數(shù)目 總體中的減少、生物樣品中B細(xì)胞數(shù)目中的減少、腫瘤大小中的減少、在治療后存在和/或 出現(xiàn)的腫瘤數(shù)目中的減少，以及如通過(guò)患者其自身和醫(yī)生評(píng)估的改善的總體應(yīng)答，例如，使 用國(guó)際預(yù)后指數(shù)(International Prognostic Index)。改善可以以一個(gè)或超過(guò)一個(gè)臨床標(biāo) 準(zhǔn)。用本發(fā)明的方法改善的應(yīng)答可以是由于對(duì)先前或目前治療不足夠的應(yīng)答，例如因?yàn)槠?他治療的毒性(例如，輸注相關(guān)不利事件)和/或不足夠的功效。此外，可以存在改善的本 發(fā)明的結(jié)合分子的給藥方案或時(shí)間表(例如，皮下施用)。例如，與RITUXAN 比較，在用人源化⑶20SMIP治療21天后，用人源化的 ⑶20SMIP的治療產(chǎn)生骨髓和淋巴結(jié)中的⑶19+Β細(xì)胞中的顯著減少。參見(jiàn)圖9和10以及實(shí) 施例4。在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，負(fù)責(zé)關(guān)節(jié)中的慢性炎癥以及后續(xù)軟骨破壞和骨質(zhì)侵蝕的主 要細(xì)胞類(lèi)型是巨噬細(xì)胞、滑液成纖維細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(Marrack等人，Nat Med. 2001 ；7 899-905)。已證實(shí)浸潤(rùn)發(fā)炎滑液組織的T和B淋巴細(xì)胞通常被組織成類(lèi)似淋 巴樣濾泡的結(jié)構(gòu)(Berek 禾Π Kim, Semin Immunol. 1997 ；9 :261_268 ；Berek&, Schroder, Ann N Y Acad Sci. 1997 ;81 5 :211-217 ;Kim 和 Berek，Arthritis Res. 2000;2 :126-131)。在 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎過(guò)程中從滑液濾泡結(jié)構(gòu)中分離的B細(xì)胞的分子分析證實(shí)B細(xì)胞在局部抗 原驅(qū)動(dòng)的特異性免疫應(yīng)答和類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)--具有自身反應(yīng)性的高親和力抗體的增加產(chǎn) 生中的重要性(Weyand 和 Goronzy，Ann N Y Acad Sci. 2003 ;987 :140_149 ;Gause 等人， BioDrugs. 2001 ；15 :73_79)。關(guān)于RF的陽(yáng)性與更具侵襲性的關(guān)節(jié)疾病和更高頻率的關(guān)節(jié)外 表現(xiàn)相關(guān)(van Zeben 等人，Ann Rheum Dis. 1992 ；51 1029-1035)。關(guān)于B細(xì)胞在RA中的致病性的證據(jù)近期已從在具有難治疾病的患者中的臨床試 驗(yàn)獲得，通過(guò)使用由利妥昔單抗(Rituxan )-人嵌合抗CD20單克隆抗體的β細(xì)胞消 融(Leandro 等人,Ann Rheum Dis. 2002 ；61 883-888 ；Edwards 等人，N Engl J Med. 2004 ； 350 =2572-2581) 0在用利妥昔單抗治療的所有組中，顯著更高比例的患者具有根據(jù)ACR標(biāo) 準(zhǔn)的疾病癥狀中的20%改善。所有ACR應(yīng)答在利妥昔單抗-氨甲蝶呤組中在48周時(shí)維持。 在涉及具有活性RA的161個(gè)患者中的這個(gè)研究中，在對(duì)照組中的1個(gè)患者(2.5%)中以及 在利妥昔單抗組中的4個(gè)患者(3.3%)中發(fā)生嚴(yán)重感染，指出B細(xì)胞耗盡在RA中是相對(duì)安 全的療法。⑶20是35KD非糖基化四次跨細(xì)胞膜嵌入磷蛋白，限制于B細(xì)胞譜系中，并且在前 B細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞、成熟的天然和記憶B細(xì)胞上表達(dá)，但在早期前B細(xì)胞和漿細(xì)胞上不表 達(dá)。目前，去除致病B細(xì)胞及其前體而不是抗體分泌漿細(xì)胞導(dǎo)致臨床改善的機(jī)制仍是令人 困惑的(Cragg 等人，Therapy. Curr Dir Autoimmun 2005;8:140-17410)。包括到 B 細(xì)胞作為淋巴樣聚集物在RA患者的滑液內(nèi)存在，除抗體產(chǎn)生外的B細(xì)胞功能(例如，細(xì)胞因子 產(chǎn)生、抗原呈遞、給T細(xì)胞提供共刺激信號(hào))也可能在疾病發(fā)病機(jī)理中起重要作用(Martin 和 Chan, Immunity. 2004 ；20 :517_527)。體外研究暗示利妥昔單抗通過(guò)3種可能機(jī)制誘導(dǎo)CD20陽(yáng)性淋巴瘤細(xì)胞的裂解 ADCC、CDC 和導(dǎo)致凋亡的直接信號(hào)傳導(dǎo)(Clark 和 Ledbetter，Ann Rheum Dis 2005 ；64 77-8012)。在人中的證據(jù)暗示在SLE中的B細(xì)胞裂解可能通過(guò)在天然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 上的Fc γ RIIIa(⑶16)銜接經(jīng)由ADCC和凋亡而發(fā)生，因?yàn)樵赟LE中的B細(xì)胞耗盡程度以 及淋巴瘤的臨床應(yīng)答依賴(lài)于Fc y RIIIa多態(tài)性 (Anolik等人，Arthritis Rheum 2003 ；48 455-459)?？耿?0療法也已在幾種其他自身免疫病癥包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中進(jìn)行測(cè) 試，提供B細(xì)胞在自身免疫中的作用的新了解(Eisenberg R.，Arthritis Res Ther. 2003 ； 5 =157-159)。接受利妥昔單抗的大多數(shù)SLE患者證實(shí)完全B細(xì)胞耗盡和臨床改善(Anolik 等人，Curr Rheumatol R印· 2003 ;5 :350_356)。相比之下，不含B細(xì)胞耗盡的那些對(duì)治療 不應(yīng)答。B細(xì)胞數(shù)目通常在初始給藥后1-3個(gè)月最低，并且這種耗盡持續(xù)3-12個(gè)月?；颊呖赡茉谥委熀蟀l(fā)展人抗嵌合抗體(HACA)，因?yàn)槔孜魡慰故乔逗峡贵w。在 一個(gè)研究中，用利妥昔單抗治療的患者中33%具有高HACA滴度(Looney等人，Curr Opin Rheumatol. 2004 ；16 180-185)。有趣的是，這些包括僅接受單次劑量的利妥昔單抗的患 者。發(fā)現(xiàn)HACA與較不有效的B細(xì)胞耗盡以及在初次輸注后2個(gè)月時(shí)較低的利妥昔單抗血 清水平相關(guān)。利妥昔單抗治療誘導(dǎo)具有RA的患者中所有外周血B細(xì)胞群體的幾乎完全耗盡 (Leandro等人，Arthritis Rheum 2006 ；54 613-620)。在1個(gè)患者中至少3個(gè)月無(wú)法達(dá)到 循環(huán)B細(xì)胞的97%耗盡與缺乏對(duì)治療的應(yīng)答相關(guān)。外周血的B細(xì)胞再增殖依賴(lài)于原初B細(xì) 胞的形成而不是記憶B細(xì)胞的擴(kuò)增。與其復(fù)發(fā)較后發(fā)生的患者相比較，在B細(xì)胞恢復(fù)時(shí)經(jīng) 歷較早疾病復(fù)發(fā)的患者趨于在再增殖時(shí)顯示更高數(shù)目的循環(huán)記憶B細(xì)胞。實(shí)體組織中較少 的廣泛B細(xì)胞耗盡因此可能與RA的較早復(fù)發(fā)相關(guān)。利妥昔單抗在自身免疫中的近期臨床成功指出需要開(kāi)發(fā)備選B細(xì)胞靶向治療，所 述治療將是更少免疫原性的，并且可能潛在耗盡希望重建免疫耐受的病理性自體反應(yīng)B細(xì) 胞的所有克隆殘留部分。盡管在用現(xiàn)有⑶20靶向療法治療的患者中可見(jiàn)顯著的臨床應(yīng)答，但這些試劑的 療效并不持久，并且特別是在淋巴瘤患者中的疾病復(fù)發(fā)頻率保持很高。CD20靶向治療在耗 盡來(lái)自循環(huán)的正常和轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞方面高度有效。然而，它們消除組織或淋巴管中包埋的B 細(xì)胞的能力更有限，可能是由于大生物分子接近這些部位的能力減少或通過(guò)組織微環(huán)境提 供的靶細(xì)胞抗性增加。無(wú)論是什么原因，這些環(huán)境可以提供關(guān)于存活B細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞 的保護(hù)儲(chǔ)庫(kù)，所述存活B細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞可以在表面上成功的治療方案后再度出現(xiàn)并且 引起疾病復(fù)發(fā)。與對(duì)照治療比較，用人源化SMIP治療非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物隨后為切除術(shù)和組織分析 已證實(shí)⑶20SMIP消除組織包埋的B細(xì)胞的極佳能力。這與消除來(lái)自循環(huán)的B細(xì)胞的明確 能力組合指出用這種試劑治療的患者在短期將有利地響應(yīng)有效的B細(xì)胞消除，但此外，與 目前的CD20靶向治療比較，治療后的功效將具有顯著更大的持續(xù)時(shí)間。對(duì)于這些試劑，看起來(lái)在骨髓和淋巴結(jié)組織中的深度耗盡是顯著的，指出這些分子可能能夠有效耗盡在免疫 活性的相關(guān)區(qū)域中的B細(xì)胞。因此，這些分子可能提供治療更廣泛的患者組，包括其中需要 增強(qiáng)此種功效的那些的優(yōu)選療法。在相關(guān)方面，對(duì)通過(guò)本發(fā)明的方法治療的個(gè)體還施用RITUXAN。在一個(gè)實(shí)施方案 中，RITUXAN可以已作為第一線(xiàn)治療進(jìn)行施用，并且當(dāng)用本發(fā)明的方法的治療已開(kāi)始時(shí)繼 續(xù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RITUXAN治療在用本發(fā)明的方法的治療已開(kāi)始后中斷。 “具有或懷疑具有風(fēng)濕性疾病的受試者”是受關(guān)節(jié)起源或肌肉骨骼系統(tǒng)的疾病或 病癥侵襲的受試者或個(gè)體，所述疾病或病癥影響此種區(qū)域如關(guān)節(jié)、軟骨、肌肉、神經(jīng)和腱。 進(jìn)一步包括具有或懷疑具有風(fēng)濕性疾病的受試者可能先前已接受治療風(fēng)濕性疾病的療 法。在一個(gè)實(shí)施方案中，風(fēng)濕性疾病包括但不限于，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、皮肌 炎、亨-許二氏(Henoch Schonlein)紫癜、幼年型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、雷諾氏 (Raynaud' s)綜合征、萊特氏(Reiter’ s)綜合征、肉瘤樣病、脊椎關(guān)節(jié)病變、進(jìn)行性系統(tǒng)性 硬化癥和肌炎。“具有或懷疑具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫疾病的受試者”或“中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥” 是受影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或病癥侵襲的受試者或個(gè)體，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括腦和脊 髓，或此種區(qū)域如視神經(jīng)。進(jìn)一步包括具有或懷疑具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥的受試者可能先 前已接受治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥的療法。在一個(gè)實(shí)施方案中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫疾病 包括但不限于，多發(fā)性硬化癥、變應(yīng)性腦脊髓炎、視神經(jīng)脊髓炎、狼瘡脊髓炎和狼瘡大腦炎?！懊}管炎”指與血管中的炎癥相關(guān)的疾病或病癥。示例性脈管炎病癥包括但不限 于，貝切特氏(Behcet’ s)病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)脈管炎、丘-斯二氏(Churg-Strauss)綜合 征、冷球蛋白血癥、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、亨-許二氏紫癜、超敏性脈管炎/血管炎、川崎病、白細(xì) 胞破壞性脈管炎、多血管炎、結(jié)節(jié)性多發(fā)性動(dòng)脈炎、多肌痛、多軟骨炎、類(lèi)風(fēng)濕性脈管炎、高 安氏(Takayasu’ s)關(guān)節(jié)炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener’ s granulamatosis)、由于肝 炎的脈管炎、家族性地中海熱、顯微鏡下多血管炎、科甘(Cogan' s)綜合征、韋-奧二氏 (Whiskott-Aldrich)綜合征和血栓閉塞性血管炎。本發(fā)明包括的方法對(duì)于治療疾病有用，例如B細(xì)胞癌癥(例如，B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì) 胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤)，特征在于自身抗體產(chǎn)生的疾病或特征在于不適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞刺激 的疾病，例如通過(guò)不適當(dāng)?shù)腂細(xì)胞抗原呈遞給T細(xì)胞或通過(guò)涉及B細(xì)胞的其他途徑。B細(xì)胞癌癥包括B細(xì)胞淋巴瘤(例如各種形式的霍奇金氏(Hodgkin' s)病、非 霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤)、白血病(例如急性成淋巴細(xì)胞性白血病 (ALL)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、毛細(xì)胞白血病和慢性成肌細(xì)胞性白血病)和骨髓瘤 (例如多發(fā)性骨髓瘤)。另外的B細(xì)胞癌癥包括小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、B細(xì)胞早幼淋巴細(xì)胞 性白血病、淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、漿細(xì)胞性骨髓瘤、骨的孤立性漿細(xì)胞瘤、 骨外漿細(xì)胞瘤、粘膜相關(guān)淋巴樣組織結(jié)節(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(MALT)、結(jié)節(jié)邊緣區(qū)B細(xì)胞 淋巴瘤、濾泡型淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細(xì)胞淋巴 瘤、血管內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、原因不明的惡性 潛在的B細(xì)胞增殖、淋巴瘤樣肉芽腫病、和移植后淋巴增生性病癥。特征在于自身抗體產(chǎn)生的病癥通常視為自身免疫疾病。自身免疫疾病包括但不 限于關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、多軟骨炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、皮炎、多肌炎/皮肌炎、包涵體肌炎、炎性肌炎、中毒性表皮壞死松懈癥、系統(tǒng)性 硬皮病和硬化癥、CREST綜合征、與炎性腸病相關(guān)的應(yīng)答、克羅恩氏(Crohn' s)病、潰瘍性 結(jié)腸炎、呼吸窘迫綜合征、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、腦膜炎、腦炎、葡萄膜炎、結(jié)腸炎、 腎小球腎炎、變應(yīng)性病狀、濕疹、哮喘、涉及T細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎癥應(yīng)答的病狀、動(dòng)脈粥樣硬 化、自身免疫性心肌炎、白細(xì)胞粘附缺陷、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、亞急性皮膚紅斑狼瘡、盤(pán) 狀狼瘡、狼瘡脊髓炎、狼瘡大腦炎、幼年型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、變應(yīng)性腦脊髓炎、視神經(jīng) 脊髓炎、風(fēng)濕熱、西德納姆氏(Sydenham’ s)舞蹈病、與由細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急 性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答、肺結(jié)核、結(jié)節(jié)病、肉芽腫病包括韋格納氏肉芽腫病和 許_斯二氏病、粒細(xì)胞缺乏癥、脈管炎(包括超敏性脈管炎/血管炎、ANCA和類(lèi)風(fēng)濕性脈管 炎)、再生障礙性貧血、戴-布二氏(Diamond Blackfan)貧血、免疫性溶血性貧血包括自身 免疫性溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血、單純紅細(xì)胞再生障礙(PRCA)、因子VIII缺陷、血友病 A、自身免疫性嗜中性白血球減少癥、全血細(xì)胞減少癥、白血球減少癥、涉及白細(xì)胞滲出的疾 病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性病癥、多器官損傷綜合征、重癥肌無(wú)力(mysathenia gravis), 抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基膜疾病、抗磷脂抗體綜合征、變應(yīng)性神經(jīng)炎、貝 切特氏病、卡斯?fàn)柭?Castleman' s)綜合征、古德帕斯徹氏(Goodpasture' s)綜合征、 朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌無(wú)力綜合征、雷諾氏(Reynaud’ s)綜合征、Sjogren' s綜 合征、斯-約二氏(Stevens-Johnson)綜合征、實(shí)體器官移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、 類(lèi)天皰瘡、天皰瘡、自身免疫性多內(nèi)分泌腺疾病、血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病、萊特氏(Reiter’ s) 病、僵人綜合征、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、免疫復(fù)合物腎炎、IgA腎病、IgM多發(fā)性神經(jīng)病或IgM介導(dǎo) 的神經(jīng)病、特應(yīng)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓血小板減少性(throbocytopenic)紫癜 (TTP)、亨-許二氏紫癜、自身免疫性血小板減少癥、睪丸和卵巢的自身免疫疾病包括自身 免疫性睪丸炎和卵巢炎、原發(fā)性甲狀腺機(jī)能減退；自身免疫性?xún)?nèi)分泌疾病包括自身免疫性 甲狀腺炎、慢性甲狀腺炎(橋本氏(Hashimoto' s)甲狀腺炎)、亞急性甲狀腺炎、特發(fā)性甲 狀腺機(jī)能減退、阿狄森氏(Addison' s)病、格雷夫斯氏(Grave' s)病、自身免疫性多內(nèi)分 泌腺綜合征(或多腺內(nèi)分泌病綜合征)、I型糖尿病也稱(chēng)為胰島素依賴(lài)性糖尿病(IDDM)和 席漢氏(Sheehan' s)綜合征；自身免疫性肝炎、淋巴樣間質(zhì)性肺炎(HIV)、閉塞性細(xì)支氣管 炎(非移植)對(duì)NSIP、格-巴二氏(Guillain-Barre')綜合征、大血管脈管炎(包括風(fēng)濕 性多肌痛和巨細(xì)胞(高安氏)動(dòng)脈炎)、中等血管脈管炎(包括川崎氏病和結(jié)節(jié)性多發(fā)性動(dòng) 脈炎)、結(jié)節(jié)性多發(fā)性動(dòng)脈炎(PAN)強(qiáng)直性脊柱炎、Berger' s病(IgA腎病)、急進(jìn)性腎小 球腎炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)、冷球蛋白血癥、與肝炎相關(guān)的冷球 蛋白血癥、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、冠狀動(dòng)脈病、家族性地中海熱、顯微鏡下多血管炎、科甘 氏綜合征、韋-奧二氏綜合征和血栓閉塞性血管炎。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是特征在于關(guān)節(jié)炎癥的慢性疾病，導(dǎo)致腫脹、疼痛和功能缺失。具有延長(zhǎng)時(shí)期的RA的患者通常顯示進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞、變形、殘疾且甚至早產(chǎn)兒死亡。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是通過(guò)對(duì)多器官中的血管的復(fù)發(fā)損傷引起的自身免疫疾 病，所述多器官包括腎、皮膚和關(guān)節(jié)。在具有SLE的患者中，T細(xì)胞和B細(xì)胞之間的錯(cuò)誤相互 作用導(dǎo)致攻擊細(xì)胞核的自身抗體的產(chǎn)生。一般同意自身抗體負(fù)責(zé)SLE的至少某些方面。包 括耗盡B細(xì)胞譜系允許免疫系統(tǒng)重新設(shè)定為新B細(xì)胞由前體產(chǎn)生的新療法，將提供SLE患 者中的長(zhǎng)期利益的希望。
克羅恩氏病和相關(guān)疾病潰瘍性結(jié)腸炎是屬于稱(chēng)為炎性腸病(IBD)的一組疾病的2 個(gè)主要疾病類(lèi)別?？肆_恩氏病是引起消化或胃腸(GI)道的炎癥的慢性病癥。盡管它可以 涉及從口腔到肛門(mén)的GI道的任何區(qū)域，但它最通常影響小腸和/或結(jié)腸。在潰瘍性結(jié)腸炎 中，GI牽涉局限于結(jié)腸。多發(fā)性硬化癥(MS)也是自身免疫疾病。它的特征在于中樞神經(jīng) 系統(tǒng)的炎癥和髓磷脂的破壞，所述髓磷脂使腦、脊髓和體內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞纖維絕緣。盡管MS 的原因不明，但廣泛相信自身免疫T細(xì)胞是該疾病的發(fā)病機(jī)理的主要貢獻(xiàn)者。然而，高水平 的抗體存在于具有MS的患者的腦脊髓液中，并且某些理論預(yù)測(cè)導(dǎo)致抗體產(chǎn)生的B細(xì)胞應(yīng)答 對(duì)于介導(dǎo)該疾病是重要的。MS的原因難以預(yù)測(cè)，并且該疾病可能有時(shí)靜止休眠或穩(wěn)定進(jìn)展。 幾個(gè)亞型或進(jìn)展模式已得到描述，這不僅與預(yù)后相關(guān)還與治療決定相關(guān)。復(fù)發(fā)-緩解型描 述了 85% -90%具有MS的個(gè)體的初始過(guò)程。這個(gè)亞型的特征在于不可預(yù)測(cè)的發(fā)作(復(fù)發(fā)) 隨后為數(shù)月至數(shù)年的相對(duì)平靜(緩解)時(shí)期，無(wú)疾病活性的新征兆。在發(fā)作過(guò)程中遭受的 缺陷可能消退或可能是持久的。當(dāng)缺陷總是在發(fā)作之間消退時(shí)，這稱(chēng)為“良性”MS。繼發(fā)進(jìn) 展型描述了具有初始復(fù)發(fā)-緩解型MS的約80%，其隨后開(kāi)始具有在其急性發(fā)作之間的神經(jīng) 病學(xué)減退，無(wú)任何確定的緩解期。這種減退可能包括新神經(jīng)病學(xué)癥狀、惡化認(rèn)知功能、或其 他缺陷。繼發(fā)進(jìn)展型是最常見(jiàn)類(lèi)型的MS，并且引起最大量的殘廢。原發(fā)進(jìn)展型描述了在其 初始MS癥狀后從未緩解的個(gè)體的約10%。減退持續(xù)發(fā)生，無(wú)明確發(fā)作。原發(fā)進(jìn)展亞型趨于 影響在疾病發(fā)作時(shí)年齡較大的人。進(jìn)展復(fù)發(fā)型描述了從其MS發(fā)作開(kāi)始具有穩(wěn)定的神經(jīng)病 學(xué)減退但也遭受重疊發(fā)作的那些個(gè)體；并且是所有亞型中最不常見(jiàn)的?？肆_恩氏病的特征可能在于針對(duì)嗜中性粒細(xì)胞抗原(即“核周抗嗜中性粒細(xì)胞抗 體”(pANCA))，和釀酒酵母(Saccharomycescervisiae)(即“抗釀酒酵母抗體”(ASCA))的 抗體。具有潰瘍性結(jié)腸炎的許多患者在其血液中具有PANCA抗體而不是ASCA抗體，而許多 克羅恩氏病患者顯示ASCA抗體而不是pANCA抗體。評(píng)估克羅恩氏病的一種方法是使用克 羅恩氏病活性指數(shù)(Crohn's disease Activitylndex) (CDAI)，基于由醫(yī)生收集的18個(gè)預(yù) 測(cè)變量得分。150和更低的CDAI值與休眠性疾病相關(guān)；高于其的值指示活動(dòng)性疾病，并且 超過(guò)450的值可見(jiàn)極其嚴(yán)重的疾病(Best，等人，“Development of aCrohn' s disease activity index. 〃 Gastroenterology 70:439-444,1976。然而，自最初研究以來(lái)，某些研 究者使用200-250的‘主觀值’作為健康得分。自身免疫性甲狀腺病起因于如下自身抗體的產(chǎn)生，所述自身抗體刺激甲狀腺以引 起甲狀腺功能亢進(jìn)(格雷夫斯氏病)，或破壞甲狀腺以引起甲狀腺機(jī)能減退(橋本氏甲狀腺 炎)。甲狀腺的刺激由結(jié)合且激活促甲狀腺激素(TSH)受體的自身抗體引起。甲狀腺的破 壞通過(guò)與其他甲狀腺抗原反應(yīng)的自身抗體引起。Sjogren' s綜合征是特征在于破壞機(jī)體的濕氣產(chǎn)生腺體的自身免疫疾病。免疫性血小板減少性紫癜(ITP)通過(guò)與血液血小板結(jié)合且引起其破壞的自身抗 體引起。重癥肌無(wú)力(MG)是特征在于如下自身抗體的慢性自身免疫性神經(jīng)肌肉障礙，所 述自身抗體與在神經(jīng)肌肉連接處表達(dá)的乙酰膽堿受體結(jié)合，導(dǎo)致隨意肌群的虛弱。牛皮癬特征在于皮膚中的自身免疫炎癥，并且在30%的病例中也與關(guān)節(jié)炎相關(guān)。還包括特發(fā)性炎癥性肌病(IIM)，包括皮肌炎(DM)和多肌炎(PM)的治療。炎癥性肌病已使用許多分類(lèi)方案進(jìn)行分類(lèi)。Miller’ s的分類(lèi)方案(Miller, Rheum Dis ClinNorth Am. 1994,20 :811_826)鑒定了 2種特發(fā)性炎癥性肌病(IIM)—多肌炎(PM)和皮肌炎(DM)。多肌炎和皮肌炎是慢性、虛弱炎性疾病，其涉及肌肉并且在DM的情況下涉及皮 膚。這些病癥是罕見(jiàn)的，具有在美國(guó)報(bào)告的每年發(fā)生率是每年約5-10個(gè)病例/百萬(wàn)成人 和 0. 6-3. 2 個(gè)病例 / 百萬(wàn)兒童(Targoff，Curr Probl Dermatol. 1991，3 :131_180)。特 發(fā)性炎癥性肌病與顯著的發(fā)病率和死亡率相關(guān)，其中高達(dá)一半的受累成人已遭受顯著損 害(Gottdiener 等人，Am J Cardiol. 1978,41 :1141_49)。Miller (Rheum Dis Clin North Am. 1994,20 :811_826 和 Arthritisand Allied Conditions,第 75 章，編輯 Koopman 和 Moreland, Lippincott Williams and ffilkins, 2005)闡述了用于診斷 IIM 的 5 組標(biāo)準(zhǔn)，即 特發(fā)性炎癥性肌病標(biāo)準(zhǔn)(IIMC)評(píng)估，包括肌無(wú)力、退化的肌肉活組織檢查證據(jù)、肌肉相關(guān) 酶的血清水平升高、肌病的電磁三聯(lián)、在皮肌炎中的皮疹證據(jù)，并且還包括自身抗體的證據(jù) 作為次級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。IIM相關(guān)因子，包括肌肉相關(guān)酶類(lèi)和自身抗體包括但不限于，肌酸激酶(CK)、乳酸 脫氫酶、醛縮酶、C反應(yīng)蛋白、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、以及抗 核自身抗體(ANA)、肌炎特異性抗體(MSA)和針對(duì)可提取核抗原的抗體。V.藥物組合物和施用方法在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的CD20特異性結(jié)合分子作為藥物組合物施用。為 了給人或測(cè)試動(dòng)物施用CD20特異性結(jié)合分子，優(yōu)選在包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載 體的組合物中配制結(jié)合分子。短語(yǔ)“藥學(xué)或藥理學(xué)上可接受的”指這樣的分子實(shí)體和組合 物，其當(dāng)使用本領(lǐng)域眾所周知的途徑施用時(shí)，不產(chǎn)生過(guò)敏或其他不良反應(yīng)，如下所述。“藥學(xué) 上可接受的載體”包括任何和所有臨床上有用的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌和抗真菌劑、等 滲和吸收延遲劑等。此外，化合物可能與水或常見(jiàn)有機(jī)溶劑形成溶劑化物。還包括此種溶劑化物。⑶20特異性結(jié)合分子組合物可以經(jīng)口、局部、經(jīng)皮、腸胃外、通過(guò)吸入噴霧、經(jīng)陰 道、經(jīng)直腸或通過(guò)顱內(nèi)注射進(jìn)行施用。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)腸胃外包括皮下注射、靜脈內(nèi)、 肌內(nèi)、腦池內(nèi)注射或輸注技術(shù)。還包括通過(guò)靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、乳房?jī)?nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、目艮 球后、肺內(nèi)注射的施用和或在特定部位處的手術(shù)植入。一般地，組合物基本上不含熱原，以 及可能對(duì)接受者有害的其他雜質(zhì)。在特定實(shí)施方案中，注射特別是靜脈內(nèi)的是優(yōu)選的。包含在本發(fā)明方法中使用的CD20特異性結(jié)合分子的本發(fā)明藥物組合物可以取決 于施用途徑包含藥學(xué)上可接受的載體或添加劑。此種載體或添加劑的例子包括水、藥學(xué)上 可接受的有機(jī)溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、 聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性右旋糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原 膠、阿拉伯樹(shù)膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、雙甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂 醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HAS)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、藥學(xué)上可接受的表面活性劑等。 適當(dāng)?shù)厝Q于本發(fā)明的劑型，所使用的添加劑選自但不限于上述或其組合。藥物組合物的配制將根據(jù)所選擇的施用途徑而改變(例如，溶液、乳狀液)。例如， 待施用的包含抗⑶20抗體(或其⑶20結(jié)合片段，例如SMIP)的合適組合物可以在生理學(xué) 上可接受的媒介物或載體中進(jìn)行制備。對(duì)于溶液或乳狀液，合適的載體包括例如水溶液或 醇/水溶液、乳狀液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外媒介物可以包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer' s)右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)媒介物可 以包括各種添加劑、防腐劑、或液體、營(yíng)養(yǎng)或電解質(zhì)補(bǔ)充劑。各種水載體例如水、緩沖水、0. 4 %鹽水、0. 3 %甘氨酸，或水懸浮液，可以包含與 適合于制造水懸浮液的賦形劑混合的活性化合物。此種賦形劑是懸浮劑，例如羧甲基纖 維素鈉、甲基纖維素、羧丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯樹(shù) 膠；分散或濕潤(rùn)劑可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或烯基氧化物與脂肪酸的縮合產(chǎn) 物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，例如十七氧乙烯鯨蠟醇 (h印tadecaethyl-eneoxycetanol)，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn) 物，例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮 合產(chǎn)物，例如聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。水懸浮液還可以包含一種或多種防腐劑，例如 乙基或正丙基、對(duì)羥基苯甲酸酯。CD20特異性結(jié)合分子組合物可以?xún)龈捎糜谫A藏并且在使用前在合適載體中進(jìn)行 重構(gòu)。已顯示這種技術(shù)對(duì)于常規(guī)免疫球蛋白有效?？梢圆捎萌魏魏线m的凍干和重構(gòu)技術(shù)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解凍干和重構(gòu)可以導(dǎo)致各種程度的抗體活性喪失，并且使用水平可 能必須進(jìn)行調(diào)整以補(bǔ)償。適合于通過(guò)添加水制備水懸浮液的可分散粉劑和粒劑提供與分散或濕潤(rùn)劑、懸浮 劑和一種或多種防腐劑混合的活性化合物。合適的分散或濕潤(rùn)劑和懸浮劑通過(guò)上文已提及 的那些例示。⑶20特異性結(jié)合分子在這些制劑中的濃度可以廣泛變化，例如從小于約0. 5重 量％通常為或至少約1重量％到多達(dá)15或20重量％，并且將主要基于流體體積、粘度等進(jìn) 行選擇，依照所選擇的具體施用方式。因此，用于腸胃外注射的一般藥物組合物 可以構(gòu)建為 包含Iml無(wú)菌緩沖水和50mg抗體。用于靜脈內(nèi)輸注的一般組合物可以構(gòu)建為包含250ml 無(wú)菌林格氏溶液和150mg抗體。用于制備可腸胃外施用的組合物的實(shí)際方法將是本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的或顯而易見(jiàn)的，并且在例如Remington' s Pharmaceutical Science，第 15版，MackPublishing Company, Easton, Pa. (1980)中更詳細(xì)地描述。抗體的有效劑量為 0. Olmg-lOOOmg/kg 體重 / 施用。藥物組合物可以為無(wú)菌可注射水懸浮液、油懸浮液、分散系或無(wú)菌粉末的形式，用 于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散系。懸浮液可以根據(jù)已知技術(shù)，使用上文已提及的那些 合適的分散或濕潤(rùn)劑和懸浮劑進(jìn)行制備。無(wú)菌可注射制劑還可以是在無(wú)毒的腸胃外可接受 的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或懸浮液，例如作為在1，3_ 丁二醇中的溶液。載體可 以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物、 蔬菜油、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液的溶劑或分散介質(zhì)。此外，無(wú)菌、不揮發(fā)性油照常規(guī) 用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個(gè)目的，可以采用任何溫和的不揮發(fā)性油，包括合成甘油單或 二酯。此外，脂肪酸例如油酸在注射劑的制備中有用。在所有情況下，形式必須是無(wú)菌的并且必須是流動(dòng)的至具有容易注射性 (syringability)的程度。合適的流動(dòng)性可以如下得到維持，例如通過(guò)使用包衣例如卵磷 月旨、在分散系的情況下通過(guò)維持所需顆粒大小以及通過(guò)使用表面活性劑。其在制造和貯藏 條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須針對(duì)微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用進(jìn)行保存。對(duì)微生 物作用的預(yù)防可以通過(guò)各種抗菌和抗真菌劑來(lái)達(dá)到，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，將希望包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉?？勺⑸浣M合 物的延長(zhǎng)吸收可以通過(guò)在組合物中使用延遲吸收的試劑來(lái)達(dá)到，所述試劑例如單硬脂酸鋁 和明膠。對(duì)于施用有用的組合物可以用攝取或吸收促進(jìn)劑進(jìn)行配制，以增加其功效。此種 促進(jìn)劑包括例如水楊酸鹽、甘膽酸鹽/亞油酸鹽、glycholate、抑肽酶、桿菌肽、SDS、癸酸鹽 等。參見(jiàn)例如，F(xiàn)ix(J. Pharm. Sci. ,85 1282-1285，1996)以及 Oliyai 和 Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.，32 :521_544，1993)。
此外，包括在本發(fā)明中使用的組合物的親水性和疏水性性質(zhì)是良好平衡的，由此 增強(qiáng)其用于在體外且特別是體內(nèi)使用的效用，而缺乏此種平衡的其他組合物具有基本上更 少的效用。特別地，包括在本發(fā)明中使用的組合物在水介質(zhì)中具有合適程度的溶解性，這允 許在體內(nèi)的吸收和生物利用度，同時(shí)還具有在液體中的一定溶解性程度以允許化合物穿過(guò) 細(xì)胞膜至假定作用部位。因此，當(dāng)包括的抗體組合物可以遞送至靶抗原活性部位時(shí)，它們是 最大限度有效的。在一個(gè)方面，本發(fā)明的方法包括施用包含本發(fā)明的CD20特異性結(jié)合分子的藥物 組合物的步驟。本發(fā)明的方法使用用于將治療劑直接或間接引入哺乳動(dòng)物受試者內(nèi)的任何醫(yī)學(xué) 上可接受的方法來(lái)執(zhí)行，包括但不限于注射、口服攝入、鼻內(nèi)、局部、經(jīng)皮、腸胃外、吸入噴 霧、陰道或直腸施用。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)腸胃外包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和腦池內(nèi)注射， 以及導(dǎo)管和輸注技術(shù)。還包括通過(guò)真皮內(nèi)、乳房?jī)?nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、眼球后、肺內(nèi)注射、硬膜外 施用和或在特定部位處的手術(shù)植入。用于口部或經(jīng)粘膜施用的藥物組合物可以為液體或固 體組合物形式。在特定實(shí)施方案中，藥物組合物經(jīng)配制與其預(yù)期施用途徑相容。用于腸胃外、真皮 內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包含下述組分無(wú)菌稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、不 揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲 酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩沖劑例如乙酸鹽、 檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)整張力的試劑例如氯化鈉或右旋糖。PH可以用酸或堿例如鹽酸 或氫氧化鈉進(jìn)行調(diào)整。腸胃外制劑可以封入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多 劑量小瓶中。用于皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液一般包含一種或多種下述組分無(wú)菌稀釋劑例如 注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑例如苯 甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙 酸；緩沖劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和用于調(diào)整張力的試劑例如氯化鈉或右旋糖。 PH可以用酸或堿例如鹽酸或氫氧化鈉進(jìn)行調(diào)整。此種制劑可以封入由玻璃或塑料制成的安 瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。在某些實(shí)施方案中，CD20結(jié)合分子為凍干劑型，并且可 以進(jìn)一步包含一種或多種下述賦形劑L-組氨酸、L-甲硫氨酸、蔗糖和聚山梨醇酯80。還包括的是使用本發(fā)明的藥物組合物的皮下療法。這些療法可以每天、每周、或更 優(yōu)選地每2周或每月施用。最終主治醫(yī)生將決定使用本發(fā)明的藥物組合物的靜脈內(nèi)或皮下 療法的合適持續(xù)時(shí)間，或用小分子的療法、和療法的施用時(shí)間測(cè)定。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，為了皮下提供高劑量，其中體積限制很小(例如，約1-1. 2ml/注射)，CD20結(jié)合分子的濃度一般為100mg/ml或更大。在其他實(shí)施方案中，施用在需要治療的癌癥或受累組織部位處進(jìn)行，通過(guò)直接注 射到部位內(nèi)或經(jīng)由持續(xù)遞送或持續(xù)釋放機(jī)制，這可以?xún)?nèi)部遞送制劑。例如，能夠持續(xù)遞送組 合物(例如，可溶性多肽、抗體或小分子)的生物可降解的微球體或膠囊或其他生物可降解 聚合物構(gòu)型可以包括在癌癥附近植入的本發(fā)明的制劑中。治療組合物還可以在多個(gè)部位處遞送給患者。多次施用可以同時(shí)給予或可以經(jīng)過(guò) 連續(xù)時(shí)間段施用。在本發(fā)明中還包括與第二種試劑結(jié)合的CD20特異性結(jié)合分子組合物的施用。本 發(fā)明包括的第二種試劑在下文段落中列出。第二種試劑可以是B細(xì)胞關(guān)聯(lián)分子。本發(fā)明包括的其他B細(xì)胞關(guān)聯(lián)分子包括與 并非CD20的B細(xì)胞表面分子結(jié)合的結(jié)合分子。B細(xì)胞關(guān)聯(lián)分子包括但不限于CD19 (B淋巴 細(xì)胞抗原⑶19，也稱(chēng)為B淋巴細(xì)胞表面抗原B4或Leu-12)、⑶21、⑶22 (B細(xì)胞受體⑶22， 也稱(chēng)為L(zhǎng)eu-14、B淋巴細(xì)胞細(xì)胞粘附分子或BL-CAM)、⑶23、⑶37、⑶40 (B細(xì)胞表面抗原 ⑶40，也稱(chēng)為腫瘤壞死因子受體超家族成員5、⑶40L受體或Bp50)、⑶80 (T淋巴細(xì)胞活化 抗原⑶80，也稱(chēng)為活化B7-1抗原、B7、B7-1或BBl)、⑶86 (T淋巴細(xì)胞活化抗原⑶86，也稱(chēng) 為活化B7-2抗原、B70、FUN-I或BTO3)、⑶137 (也稱(chēng)為腫瘤壞死因子受體超家族成員9)、 ⑶152 (也稱(chēng)為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)4或CTLA-4)、L6(腫瘤相關(guān)抗原L6，也稱(chēng)為跨 膜4超家族成員1，膜組分表面標(biāo)記1或M3S1)、⑶30 (淋巴細(xì)胞活化抗原⑶30，也稱(chēng)為腫瘤 壞死因子受體超家族成員8、CD30L受體或Ki-1)、CD50 (也稱(chēng)為細(xì)胞間粘附分子_3 (ICAM3) 或ICAM-R)、⑶54 (也稱(chēng)為細(xì)胞間粘附分子-1 (ICAMl)或主要組鼻病毒受體)、B7-H1 (由活 化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和骨髓樣細(xì)胞表達(dá)的免疫抑制受體的配體，也稱(chēng)為PD-Ll ；參見(jiàn)Dong，等 人’ “B7-H1,a third member of the B7 family,co-stimulates T-cel!proliferation and interleukin-lOsecretion, “ Nat. Med. 1999，5 :1365-1369)、CD134 (也稱(chēng)為腫瘤壞死 因子受體超家族成員4、0X40、0X40L受體、ACT35抗原或TAX轉(zhuǎn)錄活化的糖蛋白1受體)、 41BB (4-1BB配體受體、T細(xì)胞抗原4-1BB或T細(xì)胞抗原ILA)、⑶153 (也稱(chēng)為腫瘤壞死因子 配體超家族成員8、⑶30配體或⑶30-L)、⑶154 (也稱(chēng)為腫瘤壞死因子配體超家族成員5、 TNF相關(guān)的活化蛋白質(zhì)、TRAP或T細(xì)胞抗原Gp39)和Toll受體。構(gòu)建體靶和/或靶抗原的 上述列表僅是示例性的并且不是完全的。作為第二種試劑而包括的化學(xué)治療劑的例子包括但不限于烷化劑，例如氮芥(例 如，二氯甲基二乙胺、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖和苯丁酸氮芥)；亞硝基脲(例如，卡莫 司汀(BCNU)、羅莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基-CCNU))；乙烯亞胺和甲基-蜜胺(例如， 三乙撐蜜胺)(TEM)、三乙撐硫代磷酰胺(噻替派)和六甲基蜜胺(HMM，六甲蜜胺))；燒基 磺酸鹽(例如，白消安(buslfan，))；和三嗪(例如，達(dá)卡巴嗪(dacabazine) (DTIC))；抗代 謝藥例如葉酸類(lèi)似物(例如，氨甲蝶呤、三甲曲沙和培美曲塞(多靶向抗葉酸劑))；啼啶類(lèi) 似物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟脫氧尿苷、吉西他濱、胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖胞 苷)、 5_氮胞苷和2，2’-二氟脫氧胞苷)；和嘌呤類(lèi)似物(例如，6-巰嘌呤、6-硫鳥(niǎo)嘌呤、硫 唑嘌呤、2’-脫氧肋間型霉素(噴司他丁)、紅羥基壬基腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟達(dá)拉濱、2-氯 脫氧腺苷(克拉屈濱，2-CdA) ； I型拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑例如喜樹(shù)堿(CPT)、托泊替康和伊立替 康；特定天然產(chǎn)物例如表鬼臼毒素(印ipodophylotoxins)(例如，依托泊苷和替尼泊苷)；和長(zhǎng)春花生物堿(例如，長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春瑞濱)；抗腫瘤抗生素例如放線(xiàn)菌素D、多 柔比星和博來(lái)霉素；特定放射致敏劑例如5-溴脫氧尿苷(5-bromodeozyuridine)、5_碘脫 氧尿苷和溴脫氧胞苷；鉬配位絡(luò)合物例如順鉬、卡鉬和奧沙利鉬；取代的尿素例如羥基脲； 和甲基胼衍生物例如N-甲基胼(MIH)和丙卡巴胼?；瘜W(xué)治療劑、放射治療劑以及其他活性和輔助試劑的非限制性例子也在表1中顯 不。表 1烷化劑天然產(chǎn)物碰抗有絲分裂藥二氯甲基二乙胺環(huán)磷酰胺異環(huán)磷酰胺紫杉烷美法侖紫杉醇苯丁酸氮芥長(zhǎng)春花生物堿長(zhǎng)春堿(VLB)亞硝基脲長(zhǎng)春新堿卡莫司汀(BCNU)長(zhǎng)春瑞濱羅莫司汀(CCNU)Taxotere (多西他賽)司莫司汀(甲基-CCNU) 雌氮芥磷酸雌莫司汀乙烯亞胺/甲基-蜜胺三乙撐蜜胺(TEM)表鬼臼毒素三乙撐硫代磷酰胺(噻替派)依托泊苷六甲基蜜胺替尼泊苷(HMM，六甲蜜胺)抗生素烷基磺酸鹽放線(xiàn)菌素D白消安道諾霉素(柔紅霉素)多柔比星(阿霉素)三嗪mi toxantrone i darub i c in達(dá)卡巴嗪(DTIC)博來(lái)霉素splicamycin (光神霉素)抗代謝藥絲裂霉素C葉酸類(lèi)似物更生霉素氨甲蝶呤阿非科林三甲曲沙培美曲塞塵(多靶向抗葉酸劑)L-天冬酰胺酶L-精氨酸酶
嘧啶類(lèi)似物5_氟尿嘧啶放射致敏劑氟脫氧尿苷甲硝唑吉西他濱米索硝唑
胞嘧啶阿拉伯糖苷去甲基醚醇硝唑(AraC，阿糖胞苷)哌莫硝唑5-氮胞苷依他硝唑2，2’-二氟脫氧胞苷尼莫唑RSU 1069嘌呤類(lèi)似物E096-巰嘌呤RB 61456-硫鳥(niǎo)嘌呤SR4233硫唑嘌呤煙酰胺2'-脫氧肋間型霉素5-溴脫氧尿苷(噴司他丁)5-碘脫氧尿苷紅羥基壬基腺嘌呤(EHNA)溴脫氧胞苷磷酸氟達(dá)拉濱2-氯脫氧腺苷(克拉屈濱，2-CdA)混雜試劑鉑配位絡(luò)合物順鉬I型拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑卡鉬喜樹(shù)堿奧沙利鉬托泊替康蒽二酮伊立替康米托蒽醌生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑取代尿素G-CSF羥基脲GM-CSF甲基肼衍生物分化試劑N-甲基胼(MIH)視黃酸衍生物丙卡巴胼激素和拮抗劑腎上腺皮質(zhì)抑制劑腎上腺皮質(zhì)類(lèi)固醇/拮抗劑米托坦(0，p，-DDD)潑尼松和等價(jià)物ainoglutethimide地塞米松ainoglutethimide細(xì)胞因子干擾素(α，β，y)孕激素白介素-2己酸羥孕酮
乙酸甲羥孕酮光敏劑乙酸甲地孕酮血卟啉衍生物Photofr in 雌激素苯卟啉衍生物己烯雌酚Npe6乙炔雌二醇/等價(jià)物初卟啉錫(SnET2)pheoboride-a抗雌激素藥細(xì)菌葉綠素他莫西芬萘酞菁酞菁雄激素酞菁鋅丙酸睪酮氟甲睪酮/等價(jià)物X 射線(xiàn)抗雄激素藥紫外線(xiàn)氟他胺Y射線(xiàn)促性腺激素可見(jiàn)光激素類(lèi)似物紅外線(xiàn)輻射亮丙瑞林微波輻射^mmmmmmmmm氟他胺本發(fā)明包括的用于治療自身免疫疾病的第二種試劑還可以包括免疫抑制劑，其作 用于抑制或掩蔽待治療個(gè)體的免疫系統(tǒng)。免疫抑制劑包括例如非類(lèi)固醇抗炎藥(NSAID)、鎮(zhèn) 痛藥(analgesiscs)、糖皮質(zhì)激素、用于治療關(guān)節(jié)炎的疾病緩解抗風(fēng)濕性藥物(DMARD)、或 生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。DMARD描述中的組合物也在治療除RA外的許多其他自身免疫疾病中有用。示例性NSAID選自布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑例如V10XX 和 οει^β βχ 、以及唾液酸鹽。示例性鎮(zhèn)痛藥選自對(duì)乙酰氨基酚、羥可酮、鹽酸丙氧芬 (proporxyphene hygrochloride)的曲馬多。示例性糖皮質(zhì)激素選自可的松、地塞米松 (dexamethosone)、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍或潑尼松。示例性生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑包 括但不限于，針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記的分子(例如，⑶4、⑶5、CTLA4等)、阿巴西普、細(xì)胞因子 抑制劑例如TNF拮抗劑(例如依那西普(ENBREL )、阿達(dá)木單 抗(HUMIRA )和英 夫利昔單抗(REMICADE ))、趨化因子抑制劑和粘附分子抑制劑。生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑包 括單克隆抗體以及重組形式的分子。示例性DMARD包括但不限于硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、 環(huán)孢菌素、氨甲蝶呤、青霉胺、來(lái)氟米特、柳氮磺胺吡啶、羥氯喹、金[口服(金諾芬)和肌 內(nèi)]和米諾環(huán)素。因此，例如，本發(fā)明的結(jié)合蛋白質(zhì)可以與DMARD組合用于治療RA，所述 DMARD例如氨甲蝶呤(MTX)、柳氮磺胺吡啶(SSZ)或來(lái)氟米特(LEF)；與DMARD、類(lèi)固醇、環(huán) 磷酰胺或CELLCEPT 組合用于治療狼瘡(SLE)；以及與各種疾病緩解試劑組合用于治療MS，所述疾病緩解試劑例如干擾素(干擾素和κεβ ρ )或干擾素 i3-lb(BETASER0N 或BETAFERON ))、乙酸格拉替雷(glatiramer acetate) (COPAXONE )、米托蒽醌或那他珠單抗(TYSABRI )。包括⑶20特異性結(jié)合分子組合物和第二種試劑可以同時(shí)在相同制劑中給予。備 選地，試劑在分開(kāi)制劑中施用，并且同時(shí)施用，其中同時(shí)指試劑在彼此30分鐘內(nèi)給予。在另一個(gè)方面，在CD20特異性結(jié)合分子組合物施用前施用第二種試劑。在施用前 指第二種試劑的施用在用抗體治療前一周直到抗體施用前30分鐘的范圍內(nèi)。進(jìn)一步包括 第二種試劑在CD20特異性結(jié)合分子組合物施用后施用。在施用后意欲描述從抗體治療后 30分鐘直到抗體施用后1周的施用。進(jìn)一步包括當(dāng)CD20特異性結(jié)合分子與第二種試劑組合施用時(shí)，其中第二種試劑 是細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子、或化學(xué)治療劑，施用還包括使用放射治療劑或放射療法。對(duì)與CD20 特異性結(jié)合分子組合物和第二種試劑施用組合的放射療法的需要可以由治療醫(yī)生決定。CD20特異性結(jié)合分子組合物在給定劑量中的量將根據(jù)治療所施用的個(gè)體的大小 以及待治療病癥的特征而變。在示例性治療中，可能必須施用約Img/天、約5mg/天、約 IOmg/ 天、約 20mg/ 天、約 50mg/ 天、約 75mg/ 天、約 IOOmg/ 天、約 150mg/ 天、約 200mg/ 天、 約 250mg/ 天、約 400mg/ 天、約 500mg/ 天、約 800mg/ 天、約 IOOOmg/ 天、約 1600mg/ 天或約 2000mg/天。劑量還可以基于患者的體重以0. 01-50mg/kg的劑量施用。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方 案中，⑶20特異性結(jié)合分子可以以0. 015-30mg/kg的劑量范圍施用。在一個(gè)另外實(shí)施方案 中，CD20特異性結(jié)合分子以約0. 015、約0. 05、約0. 15、約0. 5、約1. 5、約5、約15或約30mg/ kg的劑量施用。首先在動(dòng)物模型中隨后在臨床測(cè)試中的標(biāo)準(zhǔn)劑量應(yīng)答研究可以揭示關(guān)于特定疾 病和患者群體的最佳劑量。在特定實(shí)施方案中，CD20特異性結(jié)合分子組合物的施用使B細(xì)胞群體在治療后降 低或減少至少約20%。在一個(gè)實(shí)施方案中，B細(xì)胞群體降低或減少至少約20、約30、約40、 約50、約60、約70、約80、約90或約100%。B細(xì)胞耗盡定義為絕對(duì)B細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少低于 正常范圍下限。B細(xì)胞回收定義為絕對(duì)B細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)至下述任一 1)70%的受試者基線(xiàn) 值；或2)正常范圍。在特定實(shí)施方案中，CD20特異性結(jié)合分子組合物的施用還導(dǎo)致特定B細(xì)胞子集中 凋亡的增強(qiáng)。凋亡指細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)，通過(guò)DNA斷裂、細(xì)胞收縮、細(xì)胞碎裂、膜 囊泡形成或如通過(guò)膜聯(lián)蛋白V染色評(píng)估的膜脂質(zhì)組成的改變顯示且評(píng)估的。在特定實(shí)施方案中，CD20特異性結(jié)合分子組合物的施用導(dǎo)致待治療的疾病或 病癥中的所需臨床效應(yīng)。例如，在受類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎侵襲的患者中，本發(fā)明的CD20分 子的施用使患者的病狀改善了臨床顯著的量[例如，達(dá)到美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的改善初步 檢狽Ij (American College ofRheumatology Preliminary Detection of Improvement) (ACR20)]，和/或觸痛和腫脹關(guān)節(jié)中20%的改善以及3/5其余ACR測(cè)量中20%的改善 (Felson 等人，Arthritis Rheum. 1995，38 :727_35)。關(guān)于 CD20 特異性結(jié)合分子施用后 RA 患者中的改善的生物測(cè)量包括經(jīng)由蛋白質(zhì)或RNA水平測(cè)量的細(xì)胞因子水平中的改變的測(cè) 量。目的細(xì)胞因子包括但不限于，TNF-α、IL-1、干擾素、Blys和APRIL。細(xì)胞因子改變可 以是由于減少的B細(xì)胞數(shù)目或減少的活化T細(xì)胞。在RA患者中，在CD20特異性結(jié)合分子施用前和后測(cè)量與骨更新(骨質(zhì)吸收或侵蝕)相關(guān)的標(biāo)記。相關(guān)標(biāo)記包括但不限于，堿性 磷酸酶、骨鈣素、膠原斷裂片段、羥脯氨酸、抗酒石酸鹽酸性磷酸酶和RANK配體(RANKL)。與 RA改善相關(guān)的其他讀數(shù)包括C反應(yīng)蛋白(CRP)水平、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、類(lèi)風(fēng)濕性因子、 CCP(瓜氨酸環(huán)肽)抗體的測(cè)量以及經(jīng)由流式細(xì)胞術(shù)的全身性B細(xì)胞水平和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的 評(píng)估。特異性因子還可以根據(jù)RA患者的滑膜進(jìn)行測(cè)量，包括在來(lái)自滑膜活組織檢查的滑膜 中B細(xì)胞水平的評(píng)估，RANKL和其他骨因子以及上文所述的細(xì)胞因子的水平。關(guān)于RA的另 外生物標(biāo)記包括CRP和SAA。在一個(gè)相關(guān)方面，CD20特異性結(jié)合分子治療對(duì)其他疾病的作用根據(jù)本領(lǐng)域已知的 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)量。例如，包括接受用CD20特異性結(jié)合分子的治療的克羅恩氏病患者達(dá)到克羅 恩氏病活性指數(shù)(Crohn，sDisease Activity Index, CDAI)中約50至約70單位的改善， 其中緩解為 150 單位(Simonis 等人，Scand. J Gastroent. 1998，33 :283_8)。150 或 200 的 得分視為正常的，而450的得分視為嚴(yán)重疾病得分。進(jìn)一步希望CD20特異性結(jié)合分子的 施用導(dǎo)致受炎性腸病侵襲的個(gè)體中核周抗嗜中性粒細(xì)胞抗體(PANCA)和抗釀酒酵母抗體 (ASCA)中的減少。進(jìn)一步包括接受用本發(fā)明CD20特異性結(jié)合分子的治療的成人和青少年肌炎患者 達(dá)到核心評(píng)估組中的改善，例如測(cè)量的6個(gè)核心組中的3個(gè)改善約20%，其中不超過(guò)2個(gè)核 心測(cè)量惡化約 25% (參見(jiàn) Rider 等人，Arthritis Rheum. 2004,50 :2281_90)。進(jìn)一步包括接受用本發(fā)明⑶20特異性結(jié)合分子的治療的SLE患者達(dá)到系統(tǒng)性紅 斑狼 瘡活性測(cè)量(Systemic Lupus Activity Measure) (SLAM)或 SLE 疾病活性指數(shù)(SLE Disease Activity Index) (SLEDAI)得分中至少 1 點(diǎn)的改善(G1 adman 等人，J Rheumatol 1994,21 1468-71) (Tan 等人，Arthritis Rheum. 1982,25 1271-7)。> 5 的 SLAM 得分或 > 2的SLEDAI得分視為臨床上活性疾病。對(duì)治療的應(yīng)答可以定義為在2種疾病活性測(cè)量 (SLE疾病活性指數(shù)[SLEDAI]和系統(tǒng)性紅斑狼瘡活性測(cè)量)和2種生活質(zhì)量測(cè)量(患者的 整體評(píng)價(jià)和Krupp疲勞嚴(yán)重度量表(Fatigue Severity Scale))中的改善或穩(wěn)定(Petri 等人，Arthritis Rheum. 2004，50 :2858_68.)。進(jìn)一步希望CD20特異性結(jié)合分子對(duì)SLE患 者的施用導(dǎo)致抗雙鏈DNA抗體中的減少。備選地，改善可以使用大不列顛群島狼瘡評(píng)估組 標(biāo)準(zhǔn)(British IslesLupus Assessment Group Criteria) (BILAG)進(jìn)行測(cè)量。關(guān)于 SLE 的 其他生物標(biāo)記包括B細(xì)胞子集(新生、記憶、過(guò)渡)；⑶40L ；補(bǔ)體、抗ds-DNA、ClQ ；尿生物標(biāo) 記(TWEAK、MIF)。此外，就分化標(biāo)記而言，F(xiàn)c γ RIII狀態(tài)(高或低親和力)可以用于使B細(xì) 胞耗盡和功效關(guān)聯(lián)。減少的補(bǔ)體激活還可以賦予安全優(yōu)點(diǎn)(基于C3a、C4a、Bb結(jié)合)。進(jìn)一步包括接受用本發(fā)明CD20特異性結(jié)合分子的治療的多發(fā)性硬化癥患者在 Kurtzke 擴(kuò)展殘廢狀態(tài)量表(EDSS) (Kurtzke, F.，Neurology 1983,33 1444-52)上達(dá)到臨 床得分中至少0. 5的改善，或在Kurtzke量表上臨床疾病惡化中至少1. 0的延遲(Rudick 等人，Neurology 1997,49 :358_63)。進(jìn)一步包括接受用本發(fā)明CD20特異性結(jié)合分子的治療的患有IIM的患者達(dá)到特 發(fā)性炎癥性肌病標(biāo)準(zhǔn)(Idiopathic InflammatoryMyopathy Criteria) (IIMC)評(píng)估中所述 的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中至少一個(gè)減少(Miller，F(xiàn).，同上)。進(jìn)一步包括給IIM患者施用本發(fā)明的 CD20特異性結(jié)合分子導(dǎo)致選自下述的IIM相關(guān)因子的減少肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶、醛 縮酶、C反應(yīng)蛋白、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、以及抗核自身抗體(ANA)、肌炎特異性抗體(MSA)和針對(duì)可提取核抗原的抗體。備選地，符合Rider等人， Arthritis Rheum. 2004,50 2281-90中所述的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的3個(gè)的患者可以是根據(jù)本發(fā)明 的治療的受試者，伴隨在不超過(guò)2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的惡化。在一個(gè)再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，患有B細(xì)胞癌癥的患者接受用本發(fā)明的⑶20特異 性結(jié)合分子的治療，并且證實(shí)對(duì)CD20特異性結(jié)合分子的總體有利應(yīng)答，基于本領(lǐng)域眾所周 知且通常使用的臨床標(biāo)準(zhǔn)，并且如下所述，例如腫瘤大小中的減少、腫瘤數(shù)目中的減少和/ 或疾病癥狀中的改善。例如，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(U. S. National Cancer Institute) (NCI)已將某些類(lèi) 別的癌癥分成“惰性”和“侵襲性”淋巴瘤的臨床種類(lèi)。惰性淋巴瘤包括分成細(xì)胞學(xué)“級(jí)別” 的濾泡細(xì)胞淋巴瘤、彌散性小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、淋巴漿細(xì) 胞樣淋巴瘤/沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥(Waldenstrom' sMacroglobulinemia)、邊緣區(qū) 淋巴瘤和毛細(xì)胞白血病。侵襲性淋巴瘤包括彌散性混合和大細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/ 彌散性小無(wú)裂細(xì)胞淋巴瘤、成淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤和AIDS相關(guān)淋巴瘤。在某 些情況下，國(guó)際預(yù)后指數(shù)(IPI)在侵襲性和濾泡型淋巴瘤的情況下使用。在IPI中考慮的 因素包括年齡(年齡< 60歲對(duì)年齡> 60歲)、血清乳酸脫氫酶(正常水平對(duì)升高水平)、 體力狀態(tài)(0或1對(duì)2-4)(參見(jiàn)下文定義)、疾病分期(I或II對(duì)III或IV)、和結(jié)節(jié)外部位 牽涉(0或1對(duì)2-4)。具有2種或更多危險(xiǎn)因素的患者具有小于50%的無(wú)復(fù)發(fā)機(jī)率和5年 的總體存活。侵襲性IPI中的體力狀態(tài)如下定義級(jí)別描述0完全能動(dòng)，能夠從事所有疾病 前行為而無(wú)限制；1在身體上的重體力作業(yè)方面有限制，但能走動(dòng)并且能夠從事輕或靜坐 狀態(tài)的工作，例如輕室內(nèi)工作、辦公室工作；2能走動(dòng)并且能夠全部自我護(hù)理， 但不能從 事任何工作作業(yè)高達(dá)且約超過(guò)50%的清醒時(shí)間；3僅能夠有限的自我護(hù)理，臥床不起或 不能站立超過(guò)50 %的清醒時(shí)間；4完全殘廢，無(wú)法從事任何自我護(hù)理，完全臥床不起或不 能站立；禾口 5,死亡。(參見(jiàn)，TheInternational Non-Hodgkin' s Lymphoma Prognostic FactorsProject. A predictive model for aggressive non-Hodgkin' slymphoma. N Engl J Med. 329 :987_94，1993)一般地，淋巴瘤的級(jí)別使用低度淋巴瘤通常呈現(xiàn)為結(jié)節(jié)疾病并且通常無(wú)痛或緩慢 生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床評(píng)估。中度和高度疾病通常呈現(xiàn)為侵襲性大得多的疾病，伴隨大結(jié)節(jié) 外龐大腫瘤。Ann Arbor分類(lèi)系統(tǒng)也用于測(cè)量腫瘤特別是非霍奇金氏淋巴瘤的進(jìn)展。在這個(gè)系 統(tǒng)中，成人NHL的I、II、III和IV期可以分成A和B類(lèi)，這取決于患者具有(B)且不具有(A) 定義明確的泛發(fā)癥狀。B名稱(chēng)給予具有下述癥狀的患者在診斷前6個(gè)月內(nèi)無(wú)法解釋的超過(guò) 10 %體重減輕，體溫超過(guò)38°C的無(wú)法解釋的發(fā)燒，和濕透性盜汗。分期的定義如下I期-單 個(gè)淋巴結(jié)區(qū)域的牽涉或單個(gè)淋巴外器官或部位的局限性牽涉。II期-在橫膈膜同一側(cè)上的 2個(gè)或更多淋巴結(jié)區(qū)域的牽涉，或單個(gè)關(guān)聯(lián)淋巴外器官或部位及其區(qū)域淋巴結(jié)伴隨或不伴 隨在橫膈膜同一側(cè)上的其他淋巴結(jié)區(qū)域的局限性牽涉。III期-在橫膈膜兩側(cè)上的淋巴結(jié) 區(qū)域的牽涉，可能伴隨淋巴外器官或部位的局限性牽涉，脾臟的牽涉，或兩者。IV期-一個(gè) 或多個(gè)淋巴外部位的播散性(多病灶)牽涉伴隨或不伴隨關(guān)聯(lián)淋巴結(jié)的牽涉，或分離的淋 巴外器官牽涉伴隨遙遠(yuǎn)的(非區(qū)域)結(jié)節(jié)牽涉。關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見(jiàn)ThelnternationalNon-Hodgkin ' s Lymphoma Prognostic FactorsProject :A predictive model for aggressive non-Hodgkin' slymphoma, New England J. Med. (1993)329:987-994。在一個(gè)方面，CD20特異性結(jié)合分子的療效通過(guò)應(yīng)答水平進(jìn)行測(cè)定，例如部分應(yīng)答 定義為腫瘤減少至小于其原始大小的一半。完全應(yīng)答定義為通過(guò)臨床或放射學(xué)評(píng)估證實(shí)的 疾病的完全消除。在一個(gè)實(shí)施方案中，接受用本發(fā)明CD20特異性結(jié)合分子的治療的個(gè)體證 實(shí)對(duì)治療的至少部分應(yīng)答。
根據(jù)與美國(guó)國(guó)家癌癥研究所合作開(kāi)發(fā)的用于評(píng)估NHL的Cheson標(biāo)準(zhǔn)(Cheson等 人，J Clin Oncol. 1999，17 1244 ；GriIlo-Lopez 等人，Ann Oncol. 2000，11 :399_408)，當(dāng) 存在疾病和疾病相關(guān)癥狀的所有可檢測(cè)的臨床和X線(xiàn)照片證據(jù)的完全消失，所有淋巴結(jié)回 復(fù)正常大小，脾的大小已回歸，并且骨髓沒(méi)有淋巴瘤時(shí)，獲得完全應(yīng)答。當(dāng)患者顯示疾病的完全消失并且脾的大小回歸，但淋巴結(jié)已回歸超過(guò)75%并且骨 髓不確定時(shí)，獲得未經(jīng)證實(shí)的完全應(yīng)答。未經(jīng)證實(shí)的完全應(yīng)答符合且超過(guò)關(guān)于部分應(yīng)答的 標(biāo)準(zhǔn)?？傮w應(yīng)答定義為總體腫瘤負(fù)荷中至少50%的減少。已開(kāi)發(fā)相似標(biāo)準(zhǔn)用于各種其他形式的癌癥或過(guò)度增生性疾病，并且對(duì)于本領(lǐng)域技 術(shù)人員容易獲得。參見(jiàn)例如，Cheson等人，Clin AdvHematol Oncol. 2006，4 :4_5，其描述了 用于評(píng)估CLL的標(biāo)準(zhǔn)；Cheson等人，J Clin Oncol. 2003,21 4642-9，其描述了用于AML的 標(biāo)準(zhǔn)；Cheson等人，Blood 2000,96 :3671_4，其描述了用于骨髓增生異常綜合征的標(biāo)準(zhǔn)。在另一個(gè)方面，在具有B細(xì)胞癌癥的患者中對(duì)CD20結(jié)合分子的治療性應(yīng)答表現(xiàn)為 與未接受治療的患者想比較疾病進(jìn)展緩慢。對(duì)緩慢的疾病進(jìn)展或任何上述因素的測(cè)量可以 使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進(jìn)行，包括骨掃描、CT掃描、鎵掃描、淋巴管造影照片、MRI、PET 掃描、超聲等。在一個(gè)相關(guān)方面，為了測(cè)定CD20結(jié)合分子治療的功效，測(cè)量個(gè)體的生物樣品中的 B細(xì)胞數(shù)目。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品選自血液、腫瘤活組織檢查、淋巴結(jié)、扁桃體、骨 髓、胸腺和其他富含淋巴細(xì)胞的組織。富含淋巴細(xì)胞的組織是特別富含淋巴細(xì)胞的組織， 包括但不限于，淋巴結(jié)和相關(guān)器官(脾、骨髓、扁桃體、胸腺、粘膜淋巴組織)、腫瘤和炎癥區(qū) 域。還顯而易見(jiàn)的是，如果將常規(guī)治療與本發(fā)明的治療組合施用時(shí)，可以修改劑量。進(jìn)一步包括待通過(guò)本發(fā)明的方法治療的個(gè)體可以是進(jìn)行再治療，例如如果疾病的 癥狀再現(xiàn)或治療的藥代動(dòng)力學(xué)和/或藥效學(xué)(pharmodynamics)使得此種再治療可行。在 一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)用本發(fā)明的CD20結(jié)合分子治療的個(gè)體施用另一種CD20特異性結(jié)合分 子。基于本領(lǐng)域的普通技術(shù)，臨床醫(yī)生將能夠確定何時(shí)指定再治療，基于例如疾病癥狀的再 現(xiàn)或個(gè)體的B細(xì)胞恢復(fù)至需要再治療的水平。臨床標(biāo)準(zhǔn)和后果的其他測(cè)量或標(biāo)記的例子在 本文中進(jìn)一步描述?？梢詫⑼ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法治療的個(gè)體置于維持治療時(shí)間表上，其中個(gè) 體用CD20特異性結(jié)合分子進(jìn)行再治療，這基于CD20特異性結(jié)合分子的藥代動(dòng)力學(xué)/藥效 學(xué)性質(zhì)。此種維持治療一般從初次治療后約3個(gè)月到約2年的任何地方施用。示例性藥效 學(xué)數(shù)據(jù)包括但不限于，如本文所述的關(guān)于疾病改善的生物學(xué)測(cè)量，例如在血清中的CD20特 異性結(jié)合分子水平，疾病評(píng)估中的改善(例如，通過(guò)ACR、SLAM或IPI)，細(xì)胞因子或表面標(biāo) 記表達(dá)中的改變、自身抗體水平、和腫瘤大小的改變。本領(lǐng)域進(jìn)一步理解對(duì)通過(guò)本發(fā)明的方 法治療的個(gè)體應(yīng)答中的差異可以使得用CD20特異性結(jié)合分子的再治療的時(shí)間選擇中的差異成為必需。作為一個(gè)另外的方面，本發(fā)明包括試劑盒，所述試劑盒包含以促進(jìn)其用于實(shí)施本 發(fā)明的方法的方式包裝的一種或多種化合物或組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，此種試劑盒包 括本文描述的CD20特異性結(jié)合分子化合物或組合物(例如，包含單獨(dú)或與第二種試劑組合 的CD20特異性結(jié)合分子的組合物)，包裝在容器例如密封瓶或小瓶中，具有描述化合物或 組合物在實(shí)施該方法中的用途的、附著于容器或包括在包裝中的標(biāo)簽。優(yōu)選地，化合物或組 合物以單位劑型包裝。試劑盒可以進(jìn)一步包括適合于根據(jù)特定施用途徑施用組合物或用于 實(shí)施篩選測(cè)定法的裝置。優(yōu)選地，試劑盒包含描述抗體組合物的用途的標(biāo)簽。本發(fā)明還包含了制造物品。此種物品包含至少一種⑶20特異性結(jié)合分子，任選連 同藥物載體或稀釋劑，和描述根據(jù)本發(fā)明的CD20特異性結(jié)合分子的使用方法的至少一個(gè) 標(biāo)簽。此種制造物品還可以任選包含用于與CD20特異性結(jié)合分子結(jié)合施用的至少一種第 二種試劑。
實(shí)施例實(shí)施例1 抗⑶20SMIP與原代B細(xì)胞的結(jié)合原代人B細(xì)胞
為了測(cè)定抗CD20SMIP與原代B細(xì)胞的結(jié)合，我們使用陰性選擇B細(xì)胞分離試劑 盒(StemCell Technologies)從血沉棕黃層中分離原代B細(xì)胞。使收獲的細(xì)胞與多種濃度 的抗⑶20SMIP —起在冰上溫育30分鐘。隨后在0. 5% BSA/PBS中洗滌細(xì)胞，并且用抗人 IgG-PE染色30分鐘，并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(MFI)在FacsCalibur上進(jìn)行分析。如圖1中證實(shí)的，在這個(gè)實(shí)施例中分析的所有抗CD20SMIP(TRU-015、018008csc、 018008sccp、2LM19-3csc、2LM19-3sccp、2LM20-4csc、2LM16csc、2LM16scc、2LM16sccp、 2LM20-4sccp、009csc、009scc、009sccp、018011csc、018011scc、018011sccp)對(duì)于在人 B 細(xì) 胞上的⑶20具有相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和力。表2-在原代B細(xì)胞上與P/S突變SMIP的結(jié)合
Tccp'~~一6」惡件B淋巴樣細(xì)朐使用5種人B淋巴瘤細(xì)胞系(BCL)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象組檢查抗⑶20018011、TRU-015和 RITUXAN 的結(jié)合NU-DHL1、RamoS、SU-DHL4、SU-DHL5 和 WSU-DLCL2。這些細(xì)胞系各自來(lái) 自不同的非霍奇金氏B細(xì)胞淋巴瘤患者。簡(jiǎn)言之，使?jié)舛葷u增的⑶20結(jié)合劑與100，OOOBCL 一起于4°C溫育30分鐘。細(xì)胞隨后用包含1 % BSA的PBS洗滌2次，以去除未結(jié)合的抗體， 并且隨后在4°C下加入FITC標(biāo)記的山羊抗人(H+L)次級(jí)抗體(100倍稀釋)30分鐘。細(xì)胞 再次洗滌2次，以去除未結(jié)合的次級(jí)抗體，并且隨后重懸浮于具有1 % BSA的1 %甲醛(在 PBS中)中。使用Becton Dickinson FACS0RT流式細(xì)胞儀測(cè)量每種樣品的熒光強(qiáng)度。結(jié)果 表示為熒光強(qiáng)度的幾何平均值(GeoMem)。圖2顯示了在5種細(xì)胞系中的結(jié)果。018011證實(shí)與這些細(xì)胞系中每個(gè)的劑量依 賴(lài)性結(jié)合。018008和2Lm20-4也與5種細(xì)胞系結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。018011與Ramos和 SWU-DLCL2細(xì)胞的結(jié)合根據(jù)實(shí)施例5中的方案通過(guò)免疫熒光法(IFA)加以證實(shí)實(shí)施例2 抗⑶20SMIP的補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性測(cè)定法Ramos 細(xì)胞為了測(cè)定人抗CD20SMIP的補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)水平，使Ramos細(xì)胞與抗 ⑶20SMIP在10%人血清(Quidel)的存在下一起于37°C溫育3. 5小時(shí)。通過(guò)測(cè)量從細(xì)胞的 LDH釋放評(píng)估細(xì)胞死亡(Promega試劑盒)。如圖3A 中所示，RITUXAN 、TRU-015.2LM 20-4.018008 和 018011 具有針對(duì)人 Ramos B細(xì)胞的相當(dāng)?shù)蘑荂活性。表3-對(duì)具有P/S突變SMIP的Ramos細(xì)胞的CDC 原代B細(xì)胞同樣使用陰性選擇B細(xì)胞分離試劑盒(StemCell Technologies)從血沉棕黃層中 分離原代B細(xì)胞。使5xl05個(gè)B細(xì)胞與抗h⑶55抗體(2ug/ml) —起于37°C預(yù)溫育10分鐘。 隨后加入抗⑶20SMIP和血清(10%:Quidel)。溫育3. 5小時(shí)后，通過(guò)7-AAD染色和FACs分 析評(píng)估細(xì)胞死亡。如圖3B中所示，TRU-015、RITUXAN *2LM 20_4具有針對(duì)原代B細(xì)胞的相當(dāng)?shù)?CDC活性。當(dāng)加入IgG對(duì)照時(shí)，未檢測(cè)出針對(duì)原代B細(xì)胞的CDC活性。SU-DHL4B 細(xì)胞和 BJAB 細(xì)胞還研究了人源化抗CD20SMIP介導(dǎo)針對(duì)SU-DHL4B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的CDC的能力， 其中使用新鮮的人血清作為補(bǔ)體來(lái)源。收集人全血并且允許在室溫下凝固60分鐘，這之后 離心試管以收集血清用于⑶c分析。在這個(gè)研究中，⑶20特異性TRU-015和RITUXAN 用作陽(yáng)性對(duì)照，并且HER2特異性曲妥珠單抗用作同種型匹配的非結(jié)合對(duì)照。SU-DHL4B細(xì)胞在96孔平板中與多種量的⑶20結(jié)合劑一起鋪平板。向每個(gè)孔中加 入由健康志愿者的血液制備的稀釋人補(bǔ)體(1 100)。測(cè)試以100μ 1/孔的最終體積一式 三份地進(jìn)行，其中單獨(dú)的培養(yǎng)基、單獨(dú)的細(xì)胞、單獨(dú)的CD20結(jié)合劑和單獨(dú)的補(bǔ)體全都用作 對(duì)照。于37°C溫育4小時(shí)后，從培養(yǎng)箱中取出平板并且平衡至22°C (約20-30分鐘)。LDH釋放測(cè)定法CYTOTOX-ONE 熒光測(cè)定法估計(jì)在細(xì)胞毒性測(cè)定法中的非存活細(xì)胞數(shù)目。它允許快 速熒光測(cè)量從具有損害細(xì)胞膜的細(xì)胞中釋放的乳酸脫氫酶(LDH)。釋放到培養(yǎng)基內(nèi)的LDH 用10分鐘偶聯(lián)酶促測(cè)定法進(jìn)行測(cè)量，所述測(cè)定法導(dǎo)致刃天青轉(zhuǎn)換成試鹵靈。熒光試鹵靈產(chǎn) 物的產(chǎn)生與LDH的量成比例。簡(jiǎn)言之，將等體積的CYTOTOX-ONE 加入每個(gè)孔中，輕輕振蕩30秒，并且進(jìn)一步于 22°C溫育10分鐘。作為陽(yáng)性對(duì)照，加入2μ1裂解緩沖液/孔(一式三份地)，以產(chǎn)生來(lái)自 細(xì)胞的最大LDH釋放。溫育10分鐘后，通過(guò)添加50 μ 1停止液來(lái)停止酶促反應(yīng)，并且使平 板輕輕振蕩10秒。用熒光計(jì)在560nm的激發(fā)波長(zhǎng)和590nm的發(fā)射波長(zhǎng)處測(cè)量熒光。通過(guò)下式計(jì)算細(xì)胞毒性百分比 如圖4中所示，018011能夠與來(lái)自2個(gè)分開(kāi)供體的人補(bǔ)體和SU-DHL4B細(xì)胞一起 介導(dǎo)⑶C。這個(gè)⑶C效應(yīng)與018011、TRU-015和RITUXAN 的濃度成比例。來(lái)自2個(gè)供體 之一的補(bǔ)體較不支持018011的⑶c活性，這看起來(lái)低于RITUXAN 的情況。對(duì)于oisoii 這個(gè)觀察的意義不明。在使用BJAB細(xì)胞作為靶細(xì)胞群體的相似研究中，018011和TRU-015都產(chǎn)生針對(duì) BJAB細(xì)胞的、等價(jià)的濃度依賴(lài)性補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(圖4)。實(shí)施例3 抗⑶20SMIP的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)測(cè)定法使用許多不同的靶細(xì)胞測(cè)定抗⑶20SMIP的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)(也稱(chēng)為 FcCC)的水平。B TAB淋巴瘤細(xì)胞在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用0. 5uM CFSE標(biāo)記BJAB淋巴瘤細(xì)胞。隨后使標(biāo)記細(xì)胞與抗⑶20 結(jié)合劑一起溫育15分鐘，隨后添加活化的PBMC (其先前用IL-2和IL-12刺激過(guò)夜)。溫育 6小時(shí)后，用PI染色CFSE靶細(xì)胞(CFSE+)，并且使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞死亡。如圖5中證實(shí)的，RITUXAN 、TRU-015和2LM20-4介導(dǎo)相當(dāng)?shù)腁DCC活性。使用 51Cr標(biāo)記的BJAB細(xì)胞的其他實(shí)驗(yàn)證實(shí)018008和018011的ADCC活性(數(shù)據(jù)未顯示)。Ramos B 細(xì)胞和 SU-DHL4效應(yīng)子細(xì)胞的制備通過(guò)密度梯度離心使用(Lymphoprep Axis-Shield PoC AS, Norway)分離PBMNC。 將全血收集在包含抗凝劑(肝素)的試管中。通過(guò)添加等體積的0.9% NaCl稀釋血液，并 且隨后將6ml稀釋血液鋪層在15ml圓錐管中的3ml Lymphoprep溶液上，并且以800xg在 室溫下離心20分鐘。從界面處回收的單核細(xì)胞進(jìn)行洗滌，并且在ADCC和FcCC測(cè)定法中使用。ADCC 方案效應(yīng)子和靶細(xì)胞以50 1的比在96孔平板中鋪平板，其中將多種濃度的⑶20結(jié) 合劑加入合適孔中。以100 μ 1/孔的最終體積一式三份地進(jìn)行測(cè)試，其中單獨(dú)的培養(yǎng)基、單 獨(dú)的效應(yīng)子細(xì)胞、單獨(dú)的靶細(xì)胞和單獨(dú)的CD20結(jié)合劑作為對(duì)照。如上文在CDC測(cè)定法中所 述測(cè)量熒光信號(hào)。結(jié)果將018011促進(jìn)Fc介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(FcCC)的能力針對(duì)CD20+SU-DHL4和Ramos BCL 進(jìn)行評(píng)估。此外，在這個(gè)評(píng)估中使用TRU-015、RITUXAN 和抗HER2曲妥珠單抗(用作同種 型匹配的非結(jié)合對(duì)照Fe)。來(lái)自正常健康供體的新鮮分離的PBMNC在這個(gè)評(píng)估中用作效應(yīng) 子細(xì)胞的來(lái)源。PBMNC包括能夠介導(dǎo)FcCC的Fc y R3/CD16+NK細(xì)胞。除NK細(xì)胞外，在PBMNC 中的單核細(xì)胞也表達(dá)Fc y R，并且具有造成FcCC的能力。圖6呈現(xiàn)來(lái)自使用⑶20+SU-DHL4 和Ramos B淋巴瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。CD20結(jié)合試劑各自能夠使用人效應(yīng)子細(xì)胞以劑量依 賴(lài)性方式介導(dǎo)FcCC。使用其他人源化⑶20結(jié)合分子的相似實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)Ramos B細(xì)胞的ADCC活性[圖11]。表4人源化抗CD20SMIP的排序 實(shí)施例4抗⑶20SMIP的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究。為了研究抗CD20SMIP的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)，在食蟹猴中進(jìn)行26周IV推注藥代 動(dòng)力學(xué)研究。根據(jù)下述處理成年雌性食蟹猴表 5 從動(dòng)物組中獲得血液樣品、淋巴結(jié)活組織檢查和骨髓抽吸物，以研究測(cè)試物品藥 代動(dòng)力學(xué)。對(duì)全血和血清樣品實(shí)施血液學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和PK分析；對(duì)淋巴結(jié)活組織檢查實(shí) 施流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)分析；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓抽吸物。
動(dòng)物的臨床觀察是正常的，測(cè)試物品無(wú)一與不利征候相關(guān)。此外，注意到血紅素水平以及血小板、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)不受測(cè)試物品影響。外周血的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示用10mg/kg 2LM 20_4(野生型)或2LM 20_4mut Fc 處理的那些組顯示CD19+B細(xì)胞的強(qiáng)和長(zhǎng)效消除(圖8)。用2LM 20_4、2LM 20_4mut Fc和 Rituxan處理的組顯示外周⑶19+B細(xì)胞的相當(dāng)?shù)暮谋M。骨髓的流式細(xì)胞術(shù)分析揭示用2LM 20_4、2LM 20_4mut Fc和Rituxan處理的組證 實(shí)在第8天時(shí)骨髓⑶19+B細(xì)胞的相當(dāng)?shù)暮谋M(圖9)。然而，在第22天時(shí)，與用2LM 20-4 和2LM 20-4mut Fc處理的組比較，Rituxan處理的組具有顯著更高數(shù)目的⑶19+B細(xì)胞(圖 9)。淋巴結(jié)的流式細(xì)胞術(shù)分析揭示在第8天和第22天時(shí)，與2LM 20_4mut Fc比較，2LM 20-4證實(shí)更佳的功效(圖10)。2LM 20-4顯著減少淋巴結(jié)⑶19+B細(xì)胞的相對(duì)百分比。在IV施用后在食蟹猴中還獲得2LM 20-4和2LM 20_4mut Fc的藥代動(dòng)力學(xué)(PK) 數(shù)據(jù)。當(dāng)以10mg/kg施用時(shí)，2LM 20-4和2LM 20-4都顯示緩慢的消除速率，伴隨對(duì)于2LM 20-4的7. 2 士 0. 6天半衰期，和對(duì)于2LM 20_4mut Fc的5. 5 士 2. 4天半衰期(圖11)。分配 的體積很小，約40-70ml/kg。存在關(guān)于l_20mg/kg劑量范圍的非線(xiàn)性PK的某些證據(jù)。2LM 20-4 和 2LM 20-4mut Fc 的 PK 譜與 Rituxan 和 TRU-015 的 PK 譜相當(dāng)?？傊?，我們證實(shí)人源化抗CD20SMIP，特別是2LM 20-4,顯示如果不比Rituxan更 佳，也與Rituxan相當(dāng)?shù)腂細(xì)胞耗盡功效。實(shí)施例5.體外研究A. CD20特異性018011針對(duì)皮下或系統(tǒng)件播散件人B細(xì)胞淋巴瘤異種移棺物的體 外評(píng)估檢查018011針對(duì)在裸鼠中生長(zhǎng)的人B細(xì)胞淋巴瘤異種移植物的臨床前抗瘤功效。 018011抑制建立的皮下B淋巴瘤異種移植物的生長(zhǎng)，并且引起在小鼠中建立的B細(xì)胞淋巴 瘤異種移植物的退行。在018011的抗瘤活性中不存在明確的劑量應(yīng)答關(guān)系。在播散性B細(xì) 胞淋巴瘤的小鼠模型中，當(dāng)在疾病過(guò)程的早期施用時(shí)，018011保護(hù)具有系統(tǒng)性播散性B細(xì) 胞淋巴瘤的scid小鼠不受后肢麻痹和死亡。測(cè)試和對(duì)照分子⑶-20結(jié)合分子使018011(溶解于20mM磷酸鈉、240mM蔗糖，pH 6. 0中的3. lmg/ml或溶解于 IOmM組氨酸、5%蔗糖，pH 6. 0中的4. 09mg/ml)和TRU-015貯藏于_80°C。利妥昔單抗 (RITUXAN )得自 MedWorldPharmacy(Chestnut Ridge，NY)。在使用前使藥物在磷酸鹽 緩沖鹽水中稀釋。細(xì)胞系B細(xì)胞淋巴瘤(BCL)系Ramos (CRL-1596)得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC， Manassas, VA)。彌散性大 B 細(xì)胞淋巴瘤系 WSU-DLCL2 (ACC-575)得自 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ Braunschweig, Germany)。通過(guò)DNA焚 光染料染色測(cè)定法(Bionique Testing Laboratories, Saranac Lake，NY)測(cè)定細(xì)胞不含支 原體。使細(xì)胞維持在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)UOmM HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙 磺酸)、ImM丙酮酸鈉、0. 2%葡萄糖、青霉素G鈉(100U/ml)、硫酸鏈霉素(100 μ g/m)和L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。在使用前，使用Lymphopr印(Axis Shield PoC AS, Oslo, Norway)密度梯度通過(guò)離心(在IOOOxg下30分鐘)分離活細(xì)胞。動(dòng)物雌性、BALB/c和 nu/nu (裸)鼠(18_23g)和 CB17scid 雄性小鼠(18_23g)得自 Charles River Laboratories，Wilmington，ΜΑ。所有小鼠飼養(yǎng)在微型隔離單元中，并且在 研究自始至終無(wú)限制地提供無(wú)菌食物和水。皮下BCL異種移棺物對(duì)雌性、無(wú)胸腺(裸)鼠植入Ramos或WSU-DLCL2皮下異種移植物。在Ramos BCL的腫瘤植入前，使另外一組小鼠暴露于全身照射(400radS)，以進(jìn)一步抑制其殘留免疫系 統(tǒng)。在背側(cè)、右脅腹中給小鼠注射懸浮在Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Be 1 ford，MA，在RPMI 1640培養(yǎng)基中1 1稀釋)中的IxlO7個(gè)Ramos細(xì)胞或5xl06個(gè) WSU-DLCL2細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達(dá)到合適的質(zhì)量(通常> IOOmg)時(shí)，在施用治療前，給它們分期以 使腫瘤質(zhì)量的一致性達(dá)到最大(η = 8-10只小鼠/處理組)。化合物在無(wú)菌鹽水(0. 2ml/ 小鼠)中iv或ip施用。為了考慮018011和RITUXAN 之間在分子量上的差異，調(diào)整給 小鼠施用的每種藥物的劑量，以使得每種蛋白質(zhì)的摩爾等價(jià)。因此，施用的RITUXAN 量 是施用的018011量的約137%。每周至少一次測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)度和寬度(以cm表示)，并且 通過(guò)下述計(jì)算腫瘤質(zhì)量腫瘤質(zhì)量(g) =
。計(jì)算關(guān)于每個(gè) 處理組的平均(士 sem)腫瘤質(zhì)量，并且使用ANOVA就統(tǒng)計(jì)顯著性與媒介物處理組比較和通 過(guò)單尾t檢驗(yàn)與媒介物處理組的后續(xù)配對(duì)比較，其中關(guān)于t檢驗(yàn)的誤差項(xiàng)基于跨越所有處 理組的合并方差。記錄關(guān)于每個(gè)處理組的腫瘤質(zhì)量值直至處理開(kāi)始后100天或直至腫瘤生 長(zhǎng)至體重的15%，在這時(shí)根據(jù)機(jī)構(gòu)規(guī)程對(duì)這些小鼠實(shí)施安樂(lè)死。記錄在每個(gè)研究結(jié)束時(shí)無(wú) 腫瘤小鼠的數(shù)目。描繪小鼠的存活，并且通過(guò)腫瘤質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定；對(duì)于存活曲線(xiàn)的計(jì)算，具 有腫瘤質(zhì)量> 1. 5g的任何小鼠視為死亡，即使小鼠直到腫瘤質(zhì)量達(dá)到小鼠體重的15%才 根據(jù)機(jī)構(gòu)指導(dǎo)方針被殺死。針對(duì)播散性BCL的抗瘤功效的評(píng)估用3xl06個(gè)Ramos細(xì)胞或5xl06個(gè)WSU-DLCL2細(xì)胞以0. 2ml的體積在尾靜脈中對(duì)雄 性scid小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。在藥物療法開(kāi)始前，允許細(xì)胞的散布和生長(zhǎng)的發(fā)生經(jīng)過(guò)3天 (命名為發(fā)展模型)、6天(命名為中間模型)或9天(命名為建立模型)的時(shí)間段。在指 定天數(shù)時(shí)給具有播散性疾病的小鼠(9-13只小鼠/處理組)iv施用媒介物(PBS)、018011、 TRU-015或RITUXAN 。每天就后肢麻痹或死亡的出現(xiàn)監(jiān)控具有播散性疾病的小鼠直至 100天。根據(jù)機(jī)構(gòu)規(guī)程，對(duì)顯示后肢麻痹的小鼠通過(guò)CO2窒息實(shí)施安樂(lè)死。對(duì)于每個(gè)組計(jì)算平均存活時(shí)間(天數(shù)士SD)。通過(guò)使用非參數(shù)法測(cè)定在組間在 存活分布中的差異，比較患病小鼠的存活分布。使用級(jí)轉(zhuǎn)化操作(rank transformation procedure)執(zhí)行多重比較。級(jí)轉(zhuǎn)化操作由用其級(jí)替換存活時(shí)間并對(duì)級(jí)應(yīng)用通常的參數(shù)F檢 驗(yàn)組成。使用Tukey's方法對(duì)級(jí)執(zhí)行多重比較。Tukey's方法指示小鼠中在存活時(shí)間中的 差異，其中報(bào)告的顯著性在0.05水平。使用Kaplan-Meier方法(J Am Stat Assoc 1958 ； 53 457-81)構(gòu)建存活曲線(xiàn)。從具有播散性Ramos BCL的某些scid小鼠中收集來(lái)自股骨的骨髓細(xì)胞，并且就人 ⑶19或鼠類(lèi)⑶45抗原的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估，這是通過(guò)與對(duì)照FITC標(biāo)記的大鼠IgG2A、FITC標(biāo)記的小鼠IgGl、FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠⑶45或FITC標(biāo)記的小鼠抗人⑶19 (所有FITC標(biāo) 記的試劑都來(lái)自BD Pharmingen, San Diego, CA) 一起溫育。使細(xì)胞形成團(tuán)塊，用PBS-1 % BSA洗滌，并且隨后用甲醛固定。在FACSort流式細(xì)胞儀上就人⑶19表達(dá)細(xì)胞的存在 或不存在分析樣品。人CD19+細(xì)胞的數(shù)目顯示為基于通過(guò)表達(dá)CD45常見(jiàn)白細(xì)胞抗原而鑒 定的淋巴樣細(xì)胞的正面和側(cè)面光散射性質(zhì)特征門(mén)控的細(xì)胞群體總數(shù)目百分比。在這個(gè)研究中使用的動(dòng)物在表5中列出。表6 所使用的小鼠的說(shuō)明 MM018011對(duì)Ramos皮下異種移植物的作用媒介物、018011(4mg/kgiv)或RITUXAN (5. 5mg/kg iv)以摩爾等價(jià)劑量施用 于具有建立的Ramos異種移植物的Balb/c小鼠。隨著時(shí)間的個(gè)別小鼠的腫瘤質(zhì)量顯示于 圖12中(描繪的結(jié)果合并自2個(gè)分開(kāi)研究)和存活(基于腫瘤質(zhì)量< 1. 5g)顯示于圖13 中。在使用nu/nu裸鼠進(jìn)行的另一個(gè)研究中，媒介物、018011(811^/1^ ip)、TRU_015 (8mg/kg ip)或RITUXAN (llmg/kg ip)以摩爾等價(jià)劑量施用于具有建立的Ramos異種移植物的 nu/nu小鼠ο在Balb/c小鼠中建立的Ramos異種移植物模型中檢查018011和RITUXAN 的劑量應(yīng)答活性，并且在nu/nu小鼠中建立的WSU-DLCL2異種移植物模型中檢查018011、 RITUXAN 和TRU-015的劑量應(yīng)答活性(表7)。在2個(gè)研究中，所有化合物以每隔一日 5個(gè)劑量(周末除外)通過(guò)藥物施用的ip途徑進(jìn)行施用。記錄無(wú)腫瘤小鼠的數(shù)目(對(duì)于 Ramos研究第50天，并且對(duì)于WSU-DLCL2研究第100天)。表7018011、TRU-015和利妥昔單抗對(duì)Ramos和WSU-DLCL2異種移植物的作用 018011、TRU-015和利妥昔單抗對(duì)Scid小鼠中的播散性淋巴瘤的作用評(píng)估了 018011、TRU-015和RITUXAN 延長(zhǎng)具有系統(tǒng)性播散性B淋巴瘤的 CB17scid小鼠的存活的能力。在這個(gè)模型中，⑶19+⑶20+Ramos B淋巴瘤細(xì)胞的靜脈內(nèi)注射 允許它們快速播散到各個(gè)器官包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，最終引起后肢麻痹和死亡(Clin Can Res 2004 ；10 8620-9)。在發(fā)展(早)期過(guò)程中(治療在Ramos細(xì)胞播散后3天開(kāi)始)、 在疾病的中間期(治療在腫瘤細(xì)胞播散后6天開(kāi)始)或播散疾病的建立(晚)期(治療 在播散后10天開(kāi)始)過(guò)程中，在具有播散性Ramos B淋巴瘤的scid小鼠中iv施用化合 物。如圖16中所示，在播散性疾病的發(fā)展期(第3天開(kāi)始)過(guò)程中，等摩爾劑量的018011、 TRU-015或RITUXAN (分別為2mg/kg、2mg/kg和2. 8mg/kg)的施用導(dǎo)致針對(duì)發(fā)展的播散 性疾病的顯著保護(hù)。018011、TRU-015或RITUXAN 的施用延遲至播散后 ο天導(dǎo)致每種 蛋白質(zhì)的保護(hù)活性的顯著喪失。在疾病的建立時(shí)期過(guò)程中，每種化合物給予5個(gè)劑量(與 發(fā)展期中的3個(gè)劑量和中間期的4個(gè)劑量形成對(duì)比)，并且4倍于發(fā)展期中施用的劑量(對(duì) 于 018011、TRU-015 和RITUXAN 分別為 8mg/kg、8mg/kg 和 11. 2mg/kg)。即使在這些更 高和更延長(zhǎng)的給藥下，每種化合物在建立的疾病中的活性顯著小于在播散模型的發(fā)展期過(guò) 程中的活性。這些結(jié)果說(shuō)明018011、TRU-015和RITUXAN 在Ramos播散性疾病模型中， 針對(duì)發(fā)展疾病比建立疾病更有效。從具有Ramos播散性疾病的小鼠中收集的骨髓就播散性人CD19+RamoS細(xì)胞的存 在進(jìn)行檢查。來(lái)自具有播散性疾病的、媒介物處理的小鼠的大多數(shù)骨髓衍生的淋巴樣細(xì)胞 表達(dá)CD19抗原，指示在骨髓中存在人淋巴樣細(xì)胞。在播散性疾病過(guò)程的早期中(BCL播散 后3天開(kāi)始)，用018011、TRU-015或RITUXAN 處理使骨髓中的人⑶19+細(xì)胞百分比減少至<10% (圖17)。在早期處理組中的這些小鼠無(wú)一呈現(xiàn)后肢麻痹。從疾病過(guò)程的建立 期(BCL播散后10天開(kāi)始)中處理的小鼠骨髓中分離的淋巴樣細(xì)胞接近30%表達(dá)人⑶19 抗原。在這個(gè)晚期處理組中的小鼠經(jīng)歷后肢麻痹。人B淋巴瘤細(xì)胞在骨髓中的擴(kuò)展可能指 示這些患病小鼠中的疾病進(jìn)展程度。在WSU-DLCL2彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤播散性疾病模型中研究018011、RITUX AN 和TRU-015的作用。對(duì)于發(fā)展模型在腫瘤細(xì)胞注射后第3天時(shí)開(kāi)始iv施用治療性蛋白質(zhì)， 總共3個(gè)劑量，而對(duì)于建立模型在第10天開(kāi)始iv施用治療性蛋白質(zhì)，總共5個(gè)劑量。蛋 白質(zhì)以等價(jià)摩爾劑量進(jìn)行施用。當(dāng)在疾病過(guò)程中早期(發(fā)展期)施用時(shí)，018011顯著(ρ < 0. 05對(duì)媒介物處理的小鼠)保護(hù)小鼠不受腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的后肢麻痹(圖18)，而TRU-015 的作用接近統(tǒng)計(jì)顯著性(Ρ = 0.073對(duì)媒介物處理的小鼠)。RITUXAN 的作用在發(fā)展期 中不顯著，當(dāng)在疾病的建立期施用時(shí)，3種蛋白質(zhì)中任何一種的作用都不顯著。這些結(jié)果類(lèi) 似于當(dāng)化合物在疾病的建立期過(guò)程中施用時(shí)在Ramos播散性模型中觀察到的那些。 靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)施用的018011對(duì)Ramos皮下異種移棺物的作用在iv和ip藥物施用后比較018011 (8mg/kg)的抗瘤活性。在腫瘤分期(Balb/c 小鼠)后每隔一日5次給予018011，并且監(jiān)控它的抗瘤活性。2種藥物施用途徑都顯著(ρ <0. 05)抑制腫瘤生長(zhǎng)(圖19)。將ip施用的018011的抗瘤活性維持比iv施用的018011 的抗瘤活性更長(zhǎng)的時(shí)間。這個(gè)研究證實(shí)ip或iv施用的018011在抑制人B細(xì)胞淋巴瘤異 種移植物的生長(zhǎng)方面有效。018011和利妥昔單抗對(duì)照射和未照射的棵鼠中的皮下異種移棺物的作用γ照射可以抑制先天免疫系統(tǒng)，促進(jìn)腫瘤異種移植物在免疫缺乏的裸鼠中的建 立。根據(jù)照射還可以影響能夠介導(dǎo)治療性抗體的抗瘤活性的效應(yīng)子細(xì)胞的可能性，在照射 (4Gy等價(jià)于400rads)或未照射的Balb/c裸鼠中評(píng)估018011和RITUXAN 針對(duì)Ramos B 淋巴瘤異種移植物的抗瘤活性。在照射和未照射的小鼠中都建立Ramos異種移植物。在照 射和未照射的小鼠中，018011 (8mg/kg ip)和RITUXAN (11.2mg/kg ip)各自能夠顯著 (P < 0. 05對(duì)媒介物處理的小鼠)抑制Ramos B淋巴瘤異種移植物的生長(zhǎng)(圖20)。與在未 照射的小鼠中觀察到的比較，在照射小鼠中腫瘤更快速地生長(zhǎng)并且每種化合物的抑制作用 不夠強(qiáng)。這些結(jié)果暗示宿主的照射可能負(fù)面影響免疫治療劑例如018011或RITUXAN 的 治療活性，所述免疫治療劑依賴(lài)于免疫系統(tǒng)的效應(yīng)子細(xì)胞的功能完整性。照射影響018011 的治療活性的機(jī)制仍未研究。Mrk018011在臨床前模型中作為抗腫瘤劑起作用。它抑制建立的皮下B淋巴瘤異種移 植物的生長(zhǎng)，并且當(dāng)在疾病過(guò)程中較早而不是較晚施用時(shí)，保護(hù)具有播散性B細(xì)胞淋巴瘤 的小鼠。B. HuCD20SMIP在裸鼠中建立的Ramos腫瘤異種移植物模型中的功效下述實(shí)驗(yàn)測(cè)試了人源化CD20特異性SMIPS (HuCD20SMIPS)在裸鼠中建立的Ramos 腫瘤異種移植物模型中的功效。實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行(在此稱(chēng)為(A)、(B)和(C))。使用 7. 5-8 周大的 Athymic Nude-Foxnlnu 小鼠(Harlan Livermore, CA)。Ramos腫瘤異種移植物的建立且分選成處理組Ramos細(xì)胞是衍生自伯基特淋巴瘤的⑶20+人B類(lèi)成淋巴細(xì)胞細(xì)胞系。將五百萬(wàn)Ramos細(xì)胞皮下注入雌性無(wú)胸腺nu/nu小鼠的脅腹內(nèi)。在腫瘤接種后第6天時(shí)，在大多數(shù) 小鼠中出現(xiàn)可觸知腫瘤。將荷瘤小鼠分選成具有等價(jià)平均腫瘤體積的組(η = 8/組；對(duì)于 每個(gè)組2個(gè)籠，每籠4只小鼠)。分選當(dāng)天定義為研究的第O天。用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤，并且 使用下式計(jì)算腫瘤體積V = 1/2 [長(zhǎng)度x(寬度)2]。關(guān)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)的基線(xiàn)平均腫瘤體積是 228mm3(A)和(B)或 227mm3(C)；中值基線(xiàn)腫瘤大小是 228mm3(A)、233 (B)或 225mm3 (C)；并 且范圍是 180-281mm3 (A)、168-300mm3 (B)或 157_300mm3 (C)。
用于體內(nèi)使用的試劑。 不知t青方案(blindinR protocol)以相似體積制備PBS和蛋白質(zhì)(藥物)溶液，并且在可去除標(biāo)記上注明試管的內(nèi) 容物。未處理或評(píng)估小鼠的研究者在每個(gè)試管上放置顏色編碼，并且在實(shí)驗(yàn)室筆記中注明 試管內(nèi)容物的編碼和身份。用這種設(shè)計(jì)減少但并未消除研究者偏見(jiàn)的可能性，因?yàn)閳?zhí)行研 究的研究者僅是部分“不知情的”，因?yàn)樗麄儾涣私馓囟ㄐ∈蠼M接受何種處理，但的確了解 在一組2個(gè)籠內(nèi)的所有小鼠都屬于相同組。在研究結(jié)束時(shí)揭開(kāi)編碼；然而，知道編碼的研究者能夠在中間基礎(chǔ)上監(jiān)控研究結(jié)果。體內(nèi)處理在第0、2、4、6和8天，用在0.2mL體積中的 100 μ g人 IgG、TRU_015、018008、018011 或2Lm20-4靜脈內(nèi)(IV)注射小鼠。PBS和藥物溶液如上所述進(jìn)行顏色編碼。監(jiān)控和終末點(diǎn)通過(guò)目視檢查每天監(jiān)控小鼠。測(cè)定重量，并且通過(guò)對(duì)處理組不知情的觀察者(參 見(jiàn)上文)用一對(duì)測(cè)徑器每周至少3次測(cè)量腫瘤(M、W、F)。如上所述計(jì)算腫瘤體積。在所有 組中的所有小鼠都活著的最后一天時(shí)的腫瘤體積也就相對(duì)于第0天的腫瘤體積而言進(jìn)行 表示，使用下式 在研究中的其余小鼠不具有可觸知腫瘤時(shí)，重量和腫瘤監(jiān)控天數(shù)變成每周一次。 如果腫瘤達(dá)到超過(guò)1500mm3，那么處死小鼠。應(yīng)注意死亡不是腫瘤方案中的終末點(diǎn)，并且除 非另有說(shuō)明，小鼠的“存活”由其處死的時(shí)間決定。研究在第90天時(shí)結(jié)束。統(tǒng)計(jì)分析所有統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism軟件來(lái)進(jìn)行。使用單向ANOVA用Dunnett，s 多重比較事后檢驗(yàn)(用于與hulgG對(duì)照的比較)和Tukey's多重比較事后檢驗(yàn)(用于所有 其他配對(duì)比較)測(cè)定在第8天時(shí)的平均腫瘤體積或平均相對(duì)腫瘤體積中的顯著性差異。使 用Kaplan-Meier存活分析、用于比較存活曲線(xiàn)的時(shí)序檢驗(yàn)測(cè)定隨著時(shí)間的小鼠存活中的 顯著性差異。使用Fisher’ s精確檢驗(yàn)測(cè)定在觀察期結(jié)束時(shí)的無(wú)腫瘤小鼠發(fā)生率中的顯著 性差異。P值<0.05視為顯著的。結(jié)果用TRU-015 或用 3 種 HuCD20SMIPS (018008、018011 和 2Lm20_4)中的任何一種處理 小鼠導(dǎo)致相對(duì)于對(duì)照的腫瘤生長(zhǎng)減慢和/或相對(duì)于基線(xiàn)測(cè)量的腫瘤體積減少(圖21-23)。 在第8天時(shí)hulgG處理組的平均腫瘤體積和平均相對(duì)腫瘤體積顯著不同于TRU-015、018008 和2Lm20-4(僅(C))處理組，這是所有小鼠都活著的最后一天(圖22A-22B)。hulgG處理 組和任何其他Hu⑶20SMIP處理組之間或在任何2個(gè)Hu⑶20SMIP處理組之間在平均腫瘤體 積或相對(duì)腫瘤體積中不存在顯著性差異。在第8天時(shí)開(kāi)始處死小鼠；因此在稍后時(shí)間點(diǎn)時(shí) 未進(jìn)行腫瘤體積的比較。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到上文提及的限制時(shí)，處死小鼠。未發(fā)現(xiàn)小鼠死亡并且沒(méi)有一只由 于極端重量減輕、腫瘤潰瘍形成或活動(dòng)性受損而處死，因此“存活”時(shí)間是腫瘤生長(zhǎng)速率的 另一個(gè)量度。如圖23中顯示和表8中概括的，hulgG對(duì)照組中的中值存活時(shí)間為10天。 相反，相對(duì)于對(duì)照組，在各其他小鼠組中的中值存活時(shí)間顯著增加。在TRU-015、018008、 018011和2Lm20-4處理組中小鼠的中值存活時(shí)間分別為24. 0,88. 5,20. 5和20. 5天(A)， 22·0、50·0、11·5和13. 5天(B)，或40. 5、52、16和83天(C)。這些組的任何2個(gè)之間在中 值存活時(shí)間中不存在顯著性差異(表8)。
8只hulgG處理的小鼠在90天觀察期結(jié)束時(shí)無(wú)一活著，并且因此在第90天時(shí)這個(gè)組的無(wú)腫瘤發(fā)生率是0/8 (圖24和表8)。在觀察期結(jié)束時(shí)的無(wú)腫瘤小鼠發(fā)生率在TRU-015 處理組中是 2/8(25% ) (A) ^ 1/8(12. 5% ) (B)和(C)；在 018008 處理組中是 4/8 (50 % ) (A), 3/8 (37. 5% ) (B)和(C)；在 018011 處理組中是 1/8(12. 5% ) (A)和(B)或 2/8 (25% ) (C)，并且在2Lm20-4處理組中是1/8 (12. 5% ) (A)和⑶或4/8 (50% ) (C)。hulgG對(duì)照組 和任何處理組之間或任何2個(gè)其他小鼠組之間在無(wú)腫瘤小鼠發(fā)生率中不存在顯著性差異 (表8和9)。在任何處理組中未觀察到明顯的毒性癥狀或重量減輕(圖25)。表8在觀察期結(jié)束時(shí)的中值存活時(shí)間和無(wú)腫瘤小鼠發(fā)生率 a通過(guò)根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)的其處死時(shí)間測(cè)定小鼠的“存活”。未發(fā)現(xiàn)小鼠由于其他原因 死亡或處死。研究在第90天時(shí)結(jié)束。b每個(gè)組與HuIgG處理組進(jìn)行比較。關(guān)于其他比較，參見(jiàn)下表9。c “無(wú)腫瘤”小鼠不具有可觸知腫瘤。腫瘤細(xì)胞的不存在未通過(guò)組織學(xué)加以證實(shí)。d粗體字的值顯著不同于HuIgG處理組的那些。表9關(guān)于在TRU-015和HuCD20SMIP處理組之間的存活曲線(xiàn)和無(wú)腫瘤發(fā)生率比較
的P值 a關(guān)于組的信息參見(jiàn)表8的圖例在研究第O天時(shí)，將具有可觸知Ramos腫瘤的裸鼠分選成處理組(η = 8/組)，從 而使得關(guān)于每個(gè)組的平均腫瘤體積是等價(jià)的。在第0、2、4、6和8天時(shí)用100 μ g人IgG、 TRU-015、018008、018011或2Lm20-4來(lái)IV處理小鼠。在指示天數(shù)時(shí)用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤，并 且使用下式計(jì)算腫瘤體積V = 1/2[長(zhǎng)度x(寬度)2]。一旦動(dòng)物由于腫瘤體積超過(guò)指定限 制而從研究中取出，就推進(jìn)關(guān)于最后一次腫瘤體積的值。結(jié)果僅顯示到最后一只對(duì)照小鼠 處死時(shí)的第10天。就第8天(其中所有小鼠都活著的最后時(shí)間點(diǎn))時(shí)個(gè)別小鼠的腫瘤體積(A)或相 對(duì)于第O天在第8天時(shí)個(gè)別小鼠的相對(duì)腫瘤體積(B)而言顯示結(jié)果。使用單向ANOVA用Dunnett' s多重比較事后檢驗(yàn)(用于與hulgG處理的對(duì)照的比較)和Tukey’ s多重比較事后檢驗(yàn)(用于所有其他配對(duì)比較)測(cè)定組間的顯著性差異；指出了關(guān)于所有配對(duì)比較的 P值°處理且監(jiān)控小鼠，并且如圖21的圖例中所述測(cè)定腫瘤體積。每周至少3次測(cè)定腫 瘤體積(MWF)，除在研究中的其余所有小鼠都不具有可觸知腫瘤的時(shí)間段期間監(jiān)控轉(zhuǎn)變成 每周一次。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到超過(guò)1500mm3(或在星期三時(shí)1200mm3)時(shí)，處死小鼠。未發(fā)現(xiàn)小 鼠由于其他原因死亡或處死。C.人源化⑶20結(jié)合分子的瘤內(nèi)累積通過(guò)直接免疫熒光分析(IFA)和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估018011在裸鼠中建立的皮下人 B細(xì)胞淋巴瘤異種移植物中的瘤內(nèi)累積，并且與RITUXAN —基準(zhǔn)CD20特異性抗體治 療的情況進(jìn)行比較。2種試劑都以單次靜脈內(nèi)劑量進(jìn)行施用。如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估的， RITUXAN 與Rarnos或WSDLCL2細(xì)胞在體外更大程度結(jié)合。這種差異通過(guò)IFA分析不明 顯。WSU-DLCL2皮下異種移植物的IFA分析(試劑iv施用0. 5mg)證實(shí)關(guān)于018011的染色 趨于在腫瘤中更分散，而RITUXAN 染色看起來(lái)更加強(qiáng)，并且不象018011那樣一樣分散。 當(dāng)試劑以Img/小鼠的劑量施用并且在施用后24小時(shí)或96小時(shí)分析時(shí)，在Ramos異種移植 物中觀察到相似結(jié)果。從異種移植物中分離的淋巴瘤細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)了這個(gè)觀 察。測(cè)試和對(duì)照物品⑶-20結(jié)合分子使018011(溶解于 20mM磷酸鈉、240mM蔗糖，pH 6.0 中的 3. lmg/ml 或 L37852-001 溶解于IOmM組氨酸、5%蔗糖，pH 6. 0中的4. 09mg/ml)貯藏于_80°C。利妥昔單抗 (RITUXAN )、曲妥珠單抗(HERCEPTIN )和西妥昔單抗(ERBITUX )得自
Medfforld Pharmacy (Chestnut Ridge, NY) 在使用前將藥物在磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋。細(xì)胞系B細(xì)胞淋巴瘤系Ramos (CRL-1596)得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC， Manassas, VA)。彌散性大 B 細(xì)胞淋巴瘤系 WSU-DLCL2 (ACC-575)得自 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ Braunschweig, Germany)。通過(guò) DNA 熒光染料染色測(cè)定法(Bionique Testing Laboratories,Saranac Lake，NY)測(cè)定所有細(xì)胞 系不含支原體。將每種細(xì)胞系維持在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)、10mM HEPES(N_2_羥乙 基哌嗪-N，-2-乙磺酸)、ImM丙酮酸鈉、0.2%葡萄糖、青霉素G鈉(100U/ml)、硫酸鏈霉素 (100 μ g/m)和L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。在使用前，使用Lymphopr印(Axis Shield PoCAS, Oslo, Norway)密度梯度通過(guò)離心(在IOOOx g下30分鐘)分離活細(xì)胞。雌性、BALB/c、nu/nu(裸)鼠(18_23g)得自Charles RiverLaboratories, Wilmington,MA0所有小鼠飼養(yǎng)在微型隔離單元中，并且在研究自始至終無(wú)限制地提供無(wú)菌 食物和水。在這個(gè)研究中使用的動(dòng)物在表10中列出。表10 使用的小鼠的說(shuō)明 免疫熒光(IFA)將Ramos或WSU-DLCL2細(xì)胞以500，000個(gè)細(xì)胞/孔在聚-D-賴(lài)氨酸8孔培養(yǎng)載玻 片(BD BioCoat目錄#354632)上進(jìn)行鋪平板，并且培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，在5% CO2的存在下 使細(xì)胞與lOOnMRITUXAN 、曲妥珠單抗或018011—起于37°C溫育30分鐘。細(xì)胞隨后用 在PBS中的3. 75%甲醛和0.2M蔗糖進(jìn)行固定。通過(guò)用PBS洗滌(3x5分鐘)以及隨后在溶 于PBS的0. IM甘氨酸中溫育10分鐘使細(xì)胞再水合。細(xì)胞用3% BSA/PBS封閉1小時(shí)。所 有后續(xù)步驟在黑暗中進(jìn)行。使用在1%BSA/PBS中稀釋度為1 100的Fcy片段特異的 熒光素(FITC)山羊抗人IgG于37°C 30分鐘來(lái)分析特異性結(jié)合(Jackson ImmunoResearch Labs 目錄 #109-095-008)。某些載玻片也用 R-PE 抗小鼠 CD31 (CaltagLaboratories)進(jìn)行 染色。為了分離小室和載玻片，將小室浸泡在70%ME0H中2分鐘，小心不使細(xì)胞暴露。向具 有蓋玻片的每個(gè)室中加入1滴具有DAPI復(fù)染劑(ProLong anti-fade reagent with DAP I, Invitrogen 目錄 #P36931)的封固劑(mounting media)。使用熒光顯微鏡(Nikon Eclipse E400)評(píng)估免疫熒光。為了允許直接比較，使用相同參數(shù)(亮度、對(duì)比度、40x放大倍數(shù)等) 獲得所有圖像。用 Spot RT Slider (Diagnostics Instruments, Sterling heights,MI)數(shù) 碼相機(jī)獲取圖像，并且使用Spot Advanced(版本4. 0. 9)數(shù)字軟件進(jìn)行加工。瘤內(nèi)累積到皮下異種移棺物內(nèi)在背側(cè)、右脅腹中給雌性、無(wú)胸腺(裸)鼠注射在Matrigel (Collaborative Biomedical Products，Belford，MA，在 RPMI 1640 培養(yǎng)基中 1 1 稀釋)中懸浮的 IxlO7 個(gè)Ramos細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達(dá)到合適大小時(shí)，將媒介物(PBS)、018011、RITUXAN 、曲妥珠單抗 (用作同種型匹配的、非結(jié)合對(duì)照)或西妥昔單抗(用作同種型匹配的、非結(jié)合對(duì)照)iv施 用(0.2ml/小鼠)到小鼠的尾靜脈內(nèi)。在24或96小時(shí)后摘除腫瘤用于分析。在尸檢時(shí)對(duì) 腫瘤稱(chēng)重。摘除的腫瘤在包埋劑(0.T.C·化合物，Tissue-Tek目錄#4583，Sakura Fintec Torrance, CA)中進(jìn)行速凍，并且貯藏于_80°C。用切片機(jī)(Tissue-Tek Cryo 2000)切割4 微米冷凍切片。使切片風(fēng)干30分鐘并且貯藏于-80°C。切片隨后如根據(jù)IFA方案(3. 1)所 述的進(jìn)行固定和加工。腫瘤組織消化和流式細(xì)胞術(shù)
摘除腫瘤并并將其切碎成l_2mm小片。通過(guò)于37°C將2ml的2mg/ml母液加入腫 瘤小片中30分鐘，用4型膠原酶處理(Worthington，Lakewood, NJ)消化腫瘤小片。滴定 (titerate)細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)以收集細(xì)胞，并且隨后將其重懸浮于新鮮培養(yǎng)基中。隨后如實(shí)施例1 中所述，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估經(jīng)由018011、RITUXAN 或曲妥珠單抗與分散的腫瘤細(xì)胞的
纟口口。MM 瘤內(nèi)累積到皮下異種移棺物內(nèi)給具有WSU-DLCL2皮下異種移植物(腫瘤質(zhì)量130mg_270mg)的小鼠施用018011、
RITUXAN 或曲妥珠單抗(0.5mg/小鼠iv)，并且24小時(shí)后摘除腫瘤用于IFA。關(guān)于
018011的染色趨于比RITUXAN 的情況更分散。RITUXAN 染色看起來(lái)更加強(qiáng)和濃 厚，并且不象018011的情況一樣分散。切片還就血管進(jìn)行染色(⑶31)。無(wú)一試劑看起 來(lái)在脈管周?chē)鄯e，兩者都能夠深度分散到腫瘤內(nèi)。還用0. 2mg/小鼠劑量的018011和 RITUXAN iv處理小鼠。取自o. 2mg處理組的腫瘤的IFA證實(shí)isoii和RITUXAN 兩 者的染色(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))，盡管無(wú)一試劑在其染色中與在0. 5mg處理組中觀察到的一樣濃厚 或分散。具有Ramos皮下腫瘤(腫瘤質(zhì)量100mg-400mg)的小鼠用018011、RITUXAN 或 曲妥珠單抗(所有人IgGl)以Img/小鼠iv進(jìn)行處理，并且在注射試劑后24和96小時(shí)摘 除腫瘤。在24或96小時(shí)后，018011染色強(qiáng)度和RITUXAN 染色強(qiáng)度看起來(lái)一樣。類(lèi)似 于使用WSU-DLCL2異種移植物得到的觀察，018011染色看起來(lái)比RITUXAN 的情況更分 散，所述:RIIUJ^N 的染色更加強(qiáng)和濃厚。曲妥珠單抗產(chǎn)生非常小的本底染色。用于IFA 的每個(gè)異種移植物組織的部分在摘除時(shí)進(jìn)行消化，并且隨后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析與異種移 植物衍生細(xì)胞結(jié)合的018011、RITUXAN 或曲妥珠單抗的存在(圖26)。流式細(xì)胞術(shù)譜暗 示檢測(cè)出在異種移植物衍生細(xì)胞的細(xì)胞表面上結(jié)合的018011和RITUXAN 。018011和 RITUXAN 的結(jié)合在量上相似。來(lái)自iv注射018011和RITUXAN 后96小時(shí)分離的異種 移植物的細(xì)胞具有比在相同處理后24小時(shí)分離的那些更高水平的CD20結(jié)合劑。不存在與 iv注射任一試劑后2小時(shí)分離的異種移植物衍生細(xì)胞結(jié)合的可檢測(cè)ο 18011和RITUXAN (數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。當(dāng)每種試劑的劑量減至0. 5mg/小鼠iv時(shí)，看起來(lái)相對(duì)于RITUXAN ， 018011的染色強(qiáng)度在2個(gè)分開(kāi)研究中略微增強(qiáng)(在給藥后24小時(shí)評(píng)估)，盡管這在研究條 件下無(wú)法定量。腫瘤質(zhì)量對(duì)于用于產(chǎn)生結(jié)果的小鼠為290mg-420mg，并且對(duì)于用于產(chǎn)生結(jié) 果的小鼠為820mg-3000mg。因此，看起來(lái)腫瘤大小不顯著影響任一試劑的腫瘤累積，因?yàn)?觀察到的結(jié)果是相當(dāng)?shù)?，而腫瘤質(zhì)量在第二個(gè)研究中明顯更大。當(dāng)小鼠用更低劑量的任一 CD20靶向試劑(0. 05,0. 1或0. 2mg/小鼠iv)進(jìn)行處理時(shí)，018011是檢測(cè)不到的，而在0. 1 和0. 2mg劑量組觀察到最低限度的RITUXAN 染色(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。實(shí)施例6.生長(zhǎng)抑制生長(zhǎng)抑制測(cè)定法使用MTS—活體染料(Promega，Madison, WI)評(píng)估BCL的體外生長(zhǎng)。這個(gè)測(cè)試依 賴(lài)于MTS通過(guò)來(lái)自活細(xì)胞的完整線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)變成有色產(chǎn)物，并且是培養(yǎng)中的活細(xì)胞的可靠指 示劑。對(duì)于6種BCL中的每一種，建立校正曲線(xiàn)(細(xì)胞數(shù)目對(duì)在與MTS約2小時(shí)的溫育時(shí)間后衍生的有色產(chǎn)物的光密度)，以估計(jì)合適的起始接種密度。細(xì)胞隨后以10，000-50, 000 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96多孔皿中，這取決于細(xì)胞系。接種后，使細(xì)胞暴露于多種濃度 的018011、TRU-015或RITUXAN ，并且在96小時(shí)溫育期后，測(cè)定在每種培養(yǎng)物中的活細(xì) 胞數(shù)目。使用通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的碘化丙啶(PI)排除來(lái)評(píng)估018011或RITUXAN 與 抗人IgG Fc抗體交聯(lián)的作用。損害細(xì)胞的細(xì)胞膜允許PI進(jìn)入細(xì)胞并且染色核DNA，而活細(xì) 胞的細(xì)胞膜對(duì)于PI是不通透的并且因此PI不能對(duì)其核DNA染色。為此，將三萬(wàn)BCL與增 加濃度的018011或RITUXAN —起在96孔微孔板中鋪平板，隨后添加I或10μ g/ml的 山羊抗人IgG Fc抗體(Jackson Immunoresearch)并且于37°C溫育24小時(shí)。溫育后，通過(guò) PI排除以流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞存活。使用CellQuest程序(Becton-Dickinson)進(jìn)行數(shù)據(jù) 分析。018011針對(duì)人B淋巴瘤細(xì)胞的牛長(zhǎng)抑制作用
在體外評(píng)估018011抑制各種B淋巴瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的能力，并且與RITUXAN 和 TRU-015的情況進(jìn)行比較。將6種人⑶20+B細(xì)胞系與增加濃度的個(gè)別⑶20結(jié)合劑一起 培養(yǎng)96小時(shí)，這之后計(jì)數(shù)每種培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)目。如圖27中所示，018011、TRU-015, RITUXAN 在所研究的6種B淋巴瘤細(xì)胞系的5種中都不直接引起生物學(xué)意義的生長(zhǎng)抑 制。例外是SU-DHL4B細(xì)胞系，其生長(zhǎng)以劑量依賴(lài)性方式被TRU-015和RITUXAN 抑制，但 不被018011顯著抑制。因此，⑶20的表達(dá)是必需的但不足以確保BCL被任何⑶20結(jié)合劑 的直接抑制。除⑶20的表面表達(dá)程度以外的因素控制B淋巴瘤細(xì)胞對(duì)這些抗⑶20結(jié)合劑 的敏感性。Ramos細(xì)胞表面上的018011或RITUXAN 與抗人IgGFc的交聯(lián)增強(qiáng)2種試劑 的細(xì)胞毒性活性(圖28)。所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用整體合并入本文，其程度與每種個(gè)別出版 物、專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e且個(gè)別指出通過(guò)引用整體合并入本文一樣。序列斜體接頭序列有下劃線(xiàn)的:CDR序列構(gòu)建體名稱(chēng)VK3VH5EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYIVffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGTG EVQLV2Lml9-QSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYNMHW180112H5m33VRQMPGKGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGQVTISADKSISTAYLQffSSLKASDTAMYYCAR
SYYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 1)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMH ffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGTG EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYMHWVRQMP18008 2Lm5 2H5GKGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGQVTISADKSISTAYLQffSSLKASDTAMYYCARYYYYSNSYffYFDLffGRGTLYTVSS(SEQ ID NO 2)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYIVffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGTG EVQLV2Lml9-QSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWHW180102H53VRQMPGKGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGQVTISADKSISTAYLQffSSLKASDTAMYYCARYYYYSNSYffYFDLffGRGTLYTVSS(SEQ ID NO 3)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYIVffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGTG EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYNMHW18009 2Lm5 2H5m3 VRQMPGKGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGQVTISADKSISTAYLQffSSLKASDTAMYYCARYYYYSNSYffYFDLffGRGTLYTVSS(SEQ ID NO 4)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGTG EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMHWVR2Lm5 2H3m3 2Lm5 2H3m3
QAPGKGLEffVSAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTisrdnskntlylqmnslraedtavyycaKSYYSNSYffYFDLffGRGTLYTYSS(SEQ ID NO 5)構(gòu)建體名稱(chēng)vk3vhleiyltqspatlslspgeratlscrasssyssymhw yqqkpgqaprlliyapsnlasgiparfsgsgsgtd
FTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKYeik DGGGSGGGGSGGGGSS qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsynmhwvrqapgqgle2l2hmwmgaiypgngdtsynqkfkgrvtmtrdtststVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLwgrgtlvtvss(seq id no 6)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMIffyqqkpgqaprlliyaisnlasgiparfsgsgsgt
DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQffISNPPTFGQGTKveik DGGGSGGGGSGGGGSS、qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsynmhwvrqapgq2 Lm 2HmglewmgaiypgngdtsynqkfkgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycarSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(seq id no 7)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMIffyqqkpgqaprlliyaisnlasgiparfsgsgsgt
DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQffISNPPTFGQGTKveik DGGGSGGGGSGGGGSS qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsynmhwvrqapgq2lm 2hglewmgaiypgngdtsynqkfkgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycarYYYYSNSYffYFDLffGRGTLYTYSS(SEQ ID NO 8)eivltqspatlslspgeratlscrasqssvsymhffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQffISNPPTFGQGtkveik DGGGSGGGGSGGGGSS qvqlvqsgae
VKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWHWVRQAP2Lml 2HmGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 9)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSSVSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSG
TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQffISNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKP
gasvkvsckasgytftsymhwvrqapgqglew2Lml 2HMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAYYYCARYYYYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO: 10)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMIffYQQKPGQAPRLLIYAISNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWHWVRQA2Lm 22HmPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO: 11)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMIffYQQKKPGQAPRLLIYAISNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffTSNPPTF2Lm3 2HmGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHffVRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO: 12)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffTSNPPTFGQgtkveik DGGGSGGGGSGGGGSS qvqlvqsgaEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQA2Lm4 2HmPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMT
RDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 13)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMH ffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV2Lm52Hm RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO: 14)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQgtkveik DGGGSGGGGSGGGGSS qvqlvqsgaEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQA2Lm5-l 2Hm3PGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARS. YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO: 15)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQA2Lm5-2 2Hm4PGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARV. YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO: 16)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQA2Lm5-3 2Hm5PGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYY. NSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO: 17)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffTSNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMH2Lm6 2HmffVRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS (SEQ ID NO 18)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQA2Lm6-l 2Hm3PGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARS.YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO: 19)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQA2Lm6-2 2Hm4PGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARV. YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 20)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffTSNPPTFG2Lm6-3 2Hm5QGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYYY. NSYffYFDLffGRGTLYTYSS(SEQ ID NO 21)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHffYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSG
SGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffTSNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV2Lm7 2HmRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 22)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMIffYQQKPGQAPRLLIYAISNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffISNPYTFgqgtkveik DGGGSGGGGSGGGGSS qvqlvQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMH2Lm8 2Hm ffVRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 23)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMIffYQQKPGQAPRLLIYAISNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQffISNPFTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV2Lm9 2HmRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 24)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMIffYQQKPGQAPRLLIYAISNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQffISNPLTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV2LmlO 2HmRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 25)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMIffYQQKPGQAPRLLIYAISNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQffISNPITFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV
2Lmll 2HmRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 26)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS、QVQLVQS
GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV2Lml2 2HmRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLYTYSS(SEQ ID NO 27)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQffISNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS^ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWHWVRQAP2Lml3 2HmGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 28)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMH
ffYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQffISNPPTFGQgtkveik DGGGSGGGGSGGGGSS qvqlvqsgaEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQA2Lml4 2HmPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 29)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQffISNPPTFGQG2Lml5 2HmTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
SVYYSN. YffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 30)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQS GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV2Lml6 2Hm3RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARS. YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 31)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLSffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV2Lml7-3 2Hm3RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAS.YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 32)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLTffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV2Lml7-4 2Hm3RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARS.YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 33)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLYffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQgtkveik DGGGSGGGGSGGGGSS、qvqlvqsgaEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQA2Lml7-6 2Hm3PGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARS.YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 34)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLH
ffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS^ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV2Lml7-8 2Hm3RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARS. YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 35)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLN ffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWH2Lml7-2Hm3ffVRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFK12GRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARS. YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 36)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYLAffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVR2Lml7-2Hm3QAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVT14MTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARS. YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 37)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYLAffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTIS SLEPEDFAVYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV2Lml8-2 2Hm3RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARS. YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 38)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYLNVYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQffSFNPPT 2Lml8-3 2Hm3FGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywh
ffVRQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARS. YYSNSYffYFDLffGRGTLVTVSS(SEQ ID NO 39)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYLDffYQQKPGQAPRLLIYAPSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAYYYCQQffSFNPPTFGQGTKVEIK DGGGSGGGGSGGGGSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWV2Lml8-4 2Hm3RQAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGR
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92)gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaag agccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagctacctgaactggtaccaacagaaacctggccag gcacctaggctcctca t[1243]ctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtg gatccgggacagactt2Lml7-12cactctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtca gcagtggagttttaaccctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa(SEQ ID NO 93)gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaag agccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagctacctggcttggtaccaacagaaacctggccag gcacctaggctcctcat [1251]ctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtg gatccgggacagacttc2Lml7_14actctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcag cagtggagttttaaccctcccacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa(SEQ ID NO 94)gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggtgaaaga gccaccctctcctgcagggccagttccagtgttagctacctggcctggtaccaacagaaacctggccagg cacctaggctcctcatctatgccccatccaacctggcttctggaattccagccaggttcagtggcagtgg atccgggacagactt2Lml8-2cactctcaccatcagcagtctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcag 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127)EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKIgGlGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE鉸鏈和CH2CH3WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO : 128)MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTHuman CD20QYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNI(下劃線(xiàn)的是胞外VLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEET結(jié)構(gòu)域)ETNFPEPPQDQESSPIENDSSP(SEQ ID NO 129)
權(quán)利要求
人源化CD20結(jié)合分子，其包含含有構(gòu)架區(qū)以及CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，，其中所述構(gòu)架區(qū)是人免疫球蛋白構(gòu)架區(qū)，并且其中(a)所述VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列包含SEQ ID NO1-59任何一個(gè)中發(fā)現(xiàn)的重鏈CDR3的氨基酸序列；或(b)所述VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列包含SEQ ID NO1-59任何一個(gè)中發(fā)現(xiàn)的輕鏈CDR3的氨基酸序列；或(c)所述人源化CD20結(jié)合分子包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列；或(d)所述人源化CD20結(jié)合分子包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列，并且其中所述VH和VL是在相同參考序列中發(fā)現(xiàn)的，或者所述結(jié)合分子的CD20結(jié)合片段。
2.權(quán)利要求1的人源化⑶20結(jié)合分子，其進(jìn)一步包含(a)包含與SEQID NO :1-59任何一個(gè)中發(fā)現(xiàn)的VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列至少90%相同的 氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列；或(b)包含與SEQID NO :1-59任何一個(gè)中發(fā)現(xiàn)的VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列至少90%相同的 氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列；或(c)(a)的 VH 和(b)的 VL;或(d)在相同參考序列中發(fā)現(xiàn)的(a)的VH和(b)的VL。
3.權(quán)利要求1的人源化⑶20結(jié)合分子，其進(jìn)一步包含(a)包含與SEQID NO :1-59任何一個(gè)中發(fā)現(xiàn)的VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列至少95%相同的 氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列；或(b)包含與SEQID NO :1-59任何一個(gè)中發(fā)現(xiàn)的VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列至少95%相同的 氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列；或(c)(a)的 VH 和(b)的 VL;或(d)在相同參考序列中發(fā)現(xiàn)的(a)的VH和(b)的VL。
4.權(quán)利要求1的人源化⑶20結(jié)合分子，其進(jìn)一步包含(a)包含SEQID NO: 1-59任何一個(gè)中發(fā)現(xiàn)的VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域氨基 酸序列；或(b)包含SEQID NO: 1-59任何一個(gè)中發(fā)現(xiàn)的VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域氨基 酸序列；或(c)(a)的 VH 和(b)的 VL;或(d)在相同參考序列中發(fā)現(xiàn)的(a)的VH和(b)的VL。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的人源化CD20結(jié)合分子，其為抗體或其抗原結(jié)合片段。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的人源化CD20結(jié)合分子，其為人源化小分子免疫藥物 (SMIP)。
7.人源化SMIP，其特異性結(jié)合⑶20。
8.權(quán)利要求7的人源化SMIP，其結(jié)合與人源化CD20結(jié)合分子相同的表位，與人源化 ⑶20結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)，所述人源化⑶20結(jié)合分子包含SEQ ID NO :1_59任何一個(gè) 中所示的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的人源化SMIP，其包含具有SEQID NO :60中所示的氨基酸 序列的鉸鏈結(jié)構(gòu)域。
10.權(quán)利要求9的人源化SMIP，其包含含有SEQID NO :61中所示的氨基酸序列的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域。
11.權(quán)利要求7的人源化SMIP，其中所述SMIP具有至少一種下述性質(zhì)(a)ADCC活性；(b)CDC活性；(c)減少異種移植物腫瘤的生長(zhǎng)；(d)減少體內(nèi)播散的淋巴瘤的進(jìn)展；(e)耗盡外周血、骨髓和淋巴結(jié)中的⑶19+B細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的人源化SMIP，其中所述SMIP具有至少3種所述性質(zhì)。
13.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的⑶20結(jié)合分子或權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的人源化SMIP， 其進(jìn)行可檢測(cè)地標(biāo)記。
14.組合物，其包含權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的⑶20結(jié)合分子或權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng) 的人源化SMIP。
15.試劑盒，其包含權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的⑶20結(jié)合分子、權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng) 的人源化SMIP或權(quán)利要求14的組合物和使用說(shuō)明書(shū)。
16.核酸，其編碼權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的CD20結(jié)合分子或抗原結(jié)合片段或者權(quán)利要 求7-12中任一項(xiàng)的人源化SMIP。
17.權(quán)利要求16的核酸，其編碼所述VH結(jié)構(gòu)域，并且包含編碼SEQID NO :1_59任何 一個(gè)中發(fā)現(xiàn)的VH氨基酸序列的核苷酸序列。
18.權(quán)利要求17的核酸，其包含SEQID NO 118-126任何一個(gè)的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求16的核酸，其編碼所述VL結(jié)構(gòu)域，并且包含編碼SEQID NO :1_59任何 一個(gè)中發(fā)現(xiàn)的VL氨基酸序列的核苷酸序列。
20.權(quán)利要求19的核酸，其包含SEQID NO :67_116任何一個(gè)的核苷酸序列。
21.權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)的核酸，其與表達(dá)控制序列可操作地連接。
22.載體，其包含權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)的核酸。
23.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)的核酸或權(quán)利要求22的載體。
24.用于產(chǎn)生人源化CD20結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求23 的宿主細(xì)胞并回收所述人源化CD20結(jié)合分子或抗原結(jié)合片段的步驟。
25.檢測(cè)來(lái)自受試者的生物樣品中的CD20的方法，其包括使所述樣品與權(quán)利要求13的 CD20結(jié)合分子或人源化SMIP接觸并檢測(cè)結(jié)合的步驟。
26.治療具有或懷疑具有與異常B細(xì)胞活性相關(guān)的疾病的受試者的方法，其包括給所 述受試者施用治療有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的人源化CD20結(jié)合分子、權(quán)利要求7-12 中任一項(xiàng)的人源化SMIP或權(quán)利要求14的組合物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中與異常B細(xì)胞活性相關(guān)的所述疾病是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅 斑狼瘡或多發(fā)性硬化癥。
28.減少有此需要的受試者中的B細(xì)胞數(shù)目的方法，其包括給所述受試者施用治療有 效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的人源化CD20結(jié)合分子、權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的人源化SMIP或權(quán)利要求14的組合物。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述受試者患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡或多發(fā)性硬化癥。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用CD20特異性結(jié)合分子，特別是抗體或其抗原結(jié)合片段用于治療涉及異常B細(xì)胞活性的疾病的材料和方法。本文公開(kāi)的組合物用于治療和診斷B細(xì)胞病癥，例如B細(xì)胞惡性腫瘤和自身免疫疾病。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101842389SQ200880100872
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月12日
發(fā)明者J·A·萊德柏特, K·鄧努斯-瓊諾波羅斯, L·S·戈羅斯邁爾, L·特奇斯蒂亞科娃, N·K·達(dá)姆勒, S·A·西蒙, W·布拉迪 申請(qǐng)人:惠氏有限責(zé)任公司;特魯比昂制藥公司