專利名稱：包含egcg的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
001本發(fā)明涉及包含表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑。更具體而言，本發(fā)明涉及包含EGCG的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑，其有效抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性，其過量表達(dá)為多種疾病的病原學(xué)的原因，并且本發(fā)明涉及其新應(yīng)用。
002
背景技術(shù)：
003轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是防護(hù)酶，其是正常狀況下響應(yīng)組織損傷而血液凝固的原因。然而，也報(bào)道這些酶在多種疾病的病理機(jī)制中起重
要作用，所述疾病中這些酶的表達(dá)水平缺少調(diào)節(jié)-控制(綜述論文
Soo-Youl Kim: New Target Against Inflammatory Diseases:Transglutaminase 2. Archivum Immunologiae & Therapiae Experimentalis52,332-337,2004)。
004在多種炎性疾病發(fā)生后，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的表達(dá)顯著地增加，所述炎性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、炎性肌炎、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、肝硬化、乳腺癌、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、杭廷頓舞蹈病、腦炎和腹部疾病。同樣，當(dāng)癌進(jìn)入轉(zhuǎn)移或變成化學(xué)抗性或放射抗性時(shí)，觀察到轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的表達(dá)水平與NF-KB—起增加
(Soo-Youl Kim， Transglutaminase 2 in inflammation. Fn wf 5/oscl 11,3026-3035,2006)。
005癌癥中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和化學(xué)抗性之間的關(guān)系迄今為止不清楚。然而，當(dāng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的表達(dá)在化學(xué)抗性乳腺癌細(xì)胞中被抑制時(shí)，癌細(xì)胞變得對化學(xué)品高度敏感，并最終死亡(Antonyak等人，Augmentation of tissue Transglutaminase expression and activation byepidermal growth factor inhibit doxombicin-induced apoptosis in humanbreast cancer cells. J Biol Chem. 2004 Oct l;279(40):41461-7.; Dae-SeokKim等人，Reversal of Drug Resistance in Breast Cancer Cells byTransglutaminase 2 Inhibition and Nuclear Factor-KB Inactivation. Cancer
3Res. 2006.印刷中)。
006同樣，對于抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性存在有力的理由，因?yàn)檗D(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化相關(guān)的病原學(xué)機(jī)制在分子水平被闡明
(Key Chung Park, Kyung Cheon Chung, Yoon-Seong Kim, Jongmin Lee,Tong H. Joh禾口Soo-Youl Kim. Transglutaminase 2 induces nitric oxidesynthesis in BV-2 microglia. i e51. Commww. 323,
1055-1062, 2004; Jongmin Lee,Yoon-Seong Kim, Dong-Hee Choi, MoonS. Bang, Tay R. Han ， Tong H. Joh禾卩Soo-Youl Kim. Transglutaminase 2induces NF-kB activation via a novel pathway in BV-2 microglia. </ B/o/.C/zew, 279， 53725-53735， 2004; Dae-Seok Kim等人，Reversal of DrugResistance in Breast Cancer Cells by Transglutaminase 2 Inhibition andNuclear Factor-KB Inactivation. Cancer Res. 2006.印刷中)。
007炎癥主要可歸因于NF-icB活化。已知NF-KB在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中由激酶活化。然而，也發(fā)現(xiàn)NF-KB獨(dú)立于激酶而活化，從而否定了激酶抑制劑的功能(Tergaonkar等人，IkappaB kinase-independentIkappaBalpha degradation pathway: functional NF-kappaB activity andimplications for cancertherapy. Mol Cell Biol. 2003Nov;23(22):8070-83.)。
008在本發(fā)明人進(jìn)行的先前研究中，報(bào)道了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶通過誘導(dǎo)與I-KBa交聯(lián)，獨(dú)立于激酶(IKK、 NAK)的活化而活化NF-kB
(Jongmin Lee等人，Transglutaminase 2 induces NF-kB activation via anovel pathway in BV-2 microglia. / CTzem. 279， 53725-53735，
2004)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是鈣依賴性酶，其僅在升高的細(xì)胞內(nèi)鈣水平下可以活化NF-kB。
009在發(fā)炎后，轉(zhuǎn)錄因子NF-KB的活化不但導(dǎo)致包括轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在內(nèi)的炎性因子的表達(dá)增加，而且也導(dǎo)致其抑制劑I-KB(x的表達(dá)增加。連續(xù)的NF《B活化在正常情況下由I-KB(x抑制，但是在慢性的炎性疾病中連續(xù)的NF-KB活化繼續(xù)。有趣地，TNF-a或LPS(脂多糖)-誘導(dǎo)的NF-KB活化引起轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶表達(dá)。因此， 預(yù) 期
炎性細(xì)胞中異?；罨霓D(zhuǎn)谷氨酰胺酶直接活化NF-KB或者進(jìn)一步維持活化的NF-kB，從而在炎癥維持中 起關(guān)鍵作用(圖l)。另外，該惡性循環(huán)可能是癌癥轉(zhuǎn)移和化學(xué)抗性的主要原因 (Jongmin Lee等人，Transglutaminase 2 induces NF-kB activationvia a novel pathway in BV-2 microglia. /歷o/. CTzem. 279, 53725-53735,2004)。
010因此，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑在中斷連續(xù) 的NF《B循環(huán)中可起關(guān)鍵作用，本發(fā)明人提議的類固醇-取代效應(yīng)正基于it匕(Sohn, J.， Kim, T,I.， Yoon， Y,H.和Kim, S.-Y.: TransglutaminaseInhibitor: A New Anti-Inflammatory Approach in Allergic Conjunctivitis.C7/w. /騰"111, 121-8, 2003)。
011已知胺化合物抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑的代表為胱胺(nature Genetics 18, 111-117, 1998; Nature Medicine 8，143-149,2002)和腐胺。除了胺化合物，也開發(fā)其他化學(xué)抑制劑例如單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine) (J. Med. Chem. 15， 674-675，1972) 、 w-二節(jié)基氨基烷基胺(J.Med. Chem. 18， 278-284,1975) 、 3-鹵素-4,5-二氫異^惡唑(Mol. Pharmacol. 35, 701-706, 1989)和2-[(2-氧代丙基)硫代]咪唑鐨鹽衍生物 (Blood, 75, 1455-1459,1990 )，但是據(jù)報(bào)道它們是有毒性的，以致在體內(nèi)非特異性地抑制其他酶。
012因此，對安全、有效的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-特異性抑制劑存在需要 。 近 來 ，
Sohn等從重組肽成功獲得與在豚鼠模型中類固醇藥物對豚草屬的變應(yīng)
性結(jié)膜炎炎癥的效果相同的效果(Sohn， J., Kim， T,I., Yoon， Y,H.和
Kim, S.-Y,: Transglutaminase Inhibitor: A New Anti-InflammatoryApproach in Allergic Conjunctivitis.C7/w. /"veW. Ill, 121-8， 2003 )。在
這一點(diǎn)，使用模擬轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化位點(diǎn)的抗炎蛋白(PLA2抑制劑)或抑彈性蛋白酶蛋白(非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物，Nara，K.等人，1994.Elastase inhibitor elafm is a new type of proteinase inhibitor which has aTransglutaminase-mediated anchoring sequence termed "cementoin". JBiochem(Tokyo).115:441-448 )-衍生的合成肽。在多種炎性疾病發(fā)生后，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的表達(dá)顯著增加，所述炎性疾病包括變性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、自身免疫肌炎、動(dòng)脈硬化、腦中風(fēng)、肝硬化、惡性乳腺癌、腦膜炎和炎性胃潰瘍。013除了上述化合物，也開發(fā)了其他化學(xué)抑制劑，但是據(jù)報(bào)道它們是有毒性的，以致非特異性地抑制其他酶。盡管它們抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是有效的，但是在本發(fā)明(韓國專利申請?zhí)?br> 10-2006-98921)之前開發(fā)的肽抑制劑就生產(chǎn)成本和安全實(shí)踐而言仍舊具有許多有待解決的問題。014
015在另一方面，(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是活性成分中的一類多酚，其包含在屬于茶科的茶樹(Camelliasinensis)中，并且是最有活性的主要成分，和綠茶功效的主要原因。EGCG的結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)三酚基，這被認(rèn)為對其強(qiáng)的藥學(xué)作用是重要的(Matsuo，N.等人，Allergy, 52(1997)58-64)。已知EGCG具有強(qiáng)的抗氧化活性(Guo.G.等，Biochim. Biophys， Acta, 1304(1996)210-222)、抗菌活性和抗誘變活性。
016
017另外，EGCG可被用于抑制MMP-9表達(dá)和破骨細(xì)胞形成，并且被用于預(yù)防或治療由完全缺血(global ischemia)誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，如分別在韓國專利公開號10-2005-45770和10-2002-55735中公開的。公開的是EGCG用作乙酰膽堿酯酶抑制劑(韓國專利號10-540369)，并用作治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活性成分(韓國專利號10-601080)。同樣，公開的是使用EGCG衍生物的美容組合物，其通過將EGCG與煙酸反應(yīng)制備(韓國專利號10-449228)。如上面提到的，EGCG可被用于多個(gè)領(lǐng)域用于不同的目的。然而，在現(xiàn)有技術(shù)中沒有提到EGCG對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有抑制活性，從而作為其抑制劑用于治療由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化引起的疾病。
018技術(shù)問題
019因此，本發(fā)明人通過篩選已被公認(rèn)對商業(yè)化安全的天然發(fā)生的化合物，對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑進(jìn)行徹底和全面的研究。他們發(fā)現(xiàn)EGCG對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有有效的抑制活性，從而完成本發(fā)明。
020技術(shù)方案021本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供包含EGCG的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑。
022另外，本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方 法，其特征為使用EGCG作為活性成分。
023本發(fā)明的又一個(gè)目標(biāo)是提供治療由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化引起 的疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含EGCG。
024本發(fā)明的又另一個(gè)目標(biāo)是提供治療由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化引 起的疾病的方法，其特征為使用EGCG。
025有益效果
026根據(jù)本發(fā)明，提供的是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑和抑制 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法，其特征為使用EGCG作為活性成分。
027以應(yīng)用EGCG為特征，根據(jù)本發(fā)明的抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的 新方法被安全地應(yīng)用于遭受由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶過量表達(dá)引起的疾病的患 者，從而獲得對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的抑制作用，而沒有引起副作用。
028附圖簡述
029

圖1是示出體外分析EGCG對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制作用的結(jié)果 的圖，其中測量[l,4,-"C]腐胺和琥珀酰酪蛋白之間的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-催 化反應(yīng)，這導(dǎo)致與腐胺競爭的EGCG表現(xiàn)抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性。
030

發(fā)明內(nèi)容
031根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及包含EGCG的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制 劑，以及抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法，其特征為使用EGCG作為活性成分。032
033如前所述，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)通常存在 于茶樹或類似物中，并且具有<32必180 的分子式、[2R， 3R]-2-[3,4，5-三 羥基苯基]-3，4-二氫-l[2H]-苯并吡喃-3,5,7-三醇-3-[3,4，5-三羥基苯甲酸
酯]的化學(xué)名稱和下列的結(jié)構(gòu)式l。034035在本發(fā)明中，可以使用衍生自天然來源如綠茶的EGCG， 并且根據(jù)已知方法通過提取和純化獲得EGCG。有多種方法制備 EGCG，例如使用多孔極性包裝材料的方法、使用HPLC的方法、通過 加入咖啡因分離的方法、使用聚酰胺包裝材料的方法和使用電子轉(zhuǎn)移 的方法(US專利公開號US4613672、韓國專利公開號10-2001-50080， N.S.Kumar等人，J. Chromatogr. A 1083(2005) 223-228, D. Labbe等人， Journal of Membrane Science 254(2005) 101-109,禾口J丄Kim等人，J. Chromatogr. A 949(2002) 275-280)。在本發(fā)明中，EGCG可通過由本領(lǐng) 域技術(shù)人員選擇的這樣已知的方法制備。另外，EGCG可被直接制備或 者是商業(yè)可獲得的。
036
037另外，EGCG是不穩(wěn)定的和親水的。因此，如果需要，可 以將其穩(wěn)定，而同時(shí)保持其功效。穩(wěn)定作用可以通過物理方法例如使 用聚合物包埋和化學(xué)方法例如修飾為更穩(wěn)定的衍生物來進(jìn)行，這在本 領(lǐng)域是熟知的。特別地，實(shí)現(xiàn)在穩(wěn)定性和溶解性兩方面的改進(jìn)，化學(xué)方法已被大量研究。例如，EGCG的8個(gè)羥基可被全部或部分用垸基或 ?；〈?。因此，用于本發(fā)明的EGCG包括從天然來源提取和純化的 EGCG，以及通過上述方法更穩(wěn)定的EGCG衍生物。038
039在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明人測量[1，4，-"C]
腐胺和琥珀酰酪蛋白之間的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-催化反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)與腐胺競爭 的EGCG表現(xiàn)抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性。在"C標(biāo)記的腐胺和琥珀酰酪 蛋白之間的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-催化反應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)較高濃度的 EGCG導(dǎo)致較差的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性(圖1)。因此，可見EGCG是 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑，并且甚至在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶過量表達(dá)后，EGCG可 降低轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的增加的活性。
041根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及預(yù)防和治療由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活 化引起的疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含EGCG，并且涉及使 用EGCG治療疾病的方法。
042如本文使用的，術(shù)語"預(yù)防"指所有的行動(dòng)，其中通過施 用包含EGCG的藥物組合物，由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化引起的任何疾病的發(fā) 生被限制或延遲。如本文使用的，術(shù)語"治療"指所有的行動(dòng)，其中 通過施用該藥物組合物，由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化引起的任何疾病己轉(zhuǎn)向 好轉(zhuǎn)或者有利地減輕。
043在本發(fā)明，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化引起的疾病包括隨轉(zhuǎn)谷氨 酰胺酶活性增加例如在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶過量表達(dá)之后，招致的所有疾病 ，并且具體以神經(jīng)學(xué)疾病和癌癥為實(shí)例。
044轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶肽抑制劑在預(yù)防或治療由于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被 不適當(dāng)活化引起的所有疾病中是有效的。更具體而言，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 肽抑制劑可被用于預(yù)防或治療由不適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化引起的 神經(jīng)學(xué)疾病或癌癥。
045
046還根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制組合物， 其包括本發(fā)明的肽的至少一種。047048典型的神經(jīng)學(xué)疾病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其與中樞神經(jīng)系 統(tǒng)的死亡或損傷相關(guān)，例如阿爾茨海默氏病、多梗塞癡呆、混合的阿 爾茨海默/多梗塞癡呆、帕金森氏病、甲狀腺功能減退、酒精相關(guān)的癡
呆和杭廷頓舞蹈病。這些疾病的特征為雜亂性；失定向；和具有認(rèn)知 機(jī)能障礙，語言功能損害，判斷、推理、時(shí)間的和空間的適應(yīng)和學(xué)習(xí) 方面機(jī)能障礙的主要綜合征的個(gè)性人格分裂(personality disintegration), 這最終導(dǎo)致受折磨的患者死亡。它們中，由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化引起的 疾病，例如在神經(jīng)組織中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶過量表達(dá)引起的疾病是根據(jù) 本發(fā)明的藥物組合物的標(biāo)靶。特別地，本發(fā)明的藥物組合物可用于治 療杭廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病和帕金森氏病，但不限于此，其中 所述杭廷頓舞蹈病與腦中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的過量表達(dá)相關(guān)(Nature Medicine, Vol 8. Number 2， February 2002 ppl43 - 149)，所述阿爾茨海默 氏病與小腦和大腦皮層中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的過量表達(dá)相關(guān)(The Journal of Biological Chemistry, Vol. 274. No. 43. Issue Of October 22, pp
30715-30721)，所述帕金森氏病與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)的a突觸核蛋白聚
集相關(guān)(PNAS, February 18,2003， Vol. 100, no.4， pp2047-2052)。本發(fā)明
可用于治療由神經(jīng)組織中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的過量表達(dá)引起的所有疾病。049
050至于癌癥，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移或進(jìn)入化學(xué)或放射抗性后，這些顯 著增加轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的表達(dá)水平。因此，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的抑制作為預(yù) 防和治療癌癥的關(guān)鍵出現(xiàn)?？梢允褂冒景l(fā)明的EGCG的藥物組合物
預(yù)防或治療的癌癥的具體的實(shí)例包括大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門 癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、子宮癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、 甲狀腺癌、前列腺癌、白血病、皮膚癌、結(jié)腸癌、腦瘤、膀胱癌、卵 巢癌和膽囊癌，但是不限于此。051
052包含EGCG的組合物和本發(fā)明的治療方法可以應(yīng)用于可遭 受由于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化的疾病的哺乳動(dòng)物，所述動(dòng)物包括牛、馬、 綿羊、豬、山羊、駱駝、羚羊、狗和貓，以及人。
053
054包含本發(fā)明的EGCG的藥物組合物可以單獨(dú)使用或者可以與其他藥物組合物組合使用。
055包含EGCG的藥物組合物可被配制成各種劑型。例如，其 可被裝載入含有EGCG而沒有賦形劑或連同微細(xì)固體載體和/或液體載 體一起的膠囊。如果需要，生成物可被壓制成優(yōu)選的制劑。適當(dāng)?shù)妮d 體的實(shí)例包括淀粉、水、鹽水、乙醇、甘油、林格溶液和葡萄糖溶液。 在配制藥物組合物時(shí)，可以參考文獻(xiàn)(Remington's Pharmaceutical Science, 19thEd.， 1995， Mack Publishing Company, Easton PA)。
056包含本發(fā)明的EGCG的藥物組合物可被制成任何劑型，其 為口服的或非口服的制劑，其包含表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG) 作為活性成分。非口服劑型可以是注射劑、包衣和噴霧劑例如氣溶膠， 其中優(yōu)選注射劑或噴霧劑例如氣溶膠。同樣優(yōu)選的是口服劑型。
057適于本發(fā)明的藥物組合物的口服劑型的實(shí)例包括片劑、含 片、錠劑、水懸浮液或乳劑懸浮液、粉末、顆粒、乳劑、硬膠囊或軟 膠囊、糖漿劑和酏劑。對于制劑例如片劑和膠囊，有用的是粘合劑一 一例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、支鏈淀粉、纖維素 和明膠——、賦形劑一一例如磷酸二鈣一一、崩解劑一一例如玉米淀 粉和甘薯淀粉一一、潤滑劑——例如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂富馬 酸鈉和聚乙二醇蠟——、甜味劑——例如蔗糖和糖精一一和調(diào)味劑一 一例如薄荷、水楊酸甲酯和果香香精。對于膠囊，液體載體例如聚乙 二醇和脂質(zhì)可被進(jìn)一步用于加入到上述化合物中。
058對于非口服施用，本發(fā)明的藥物組合物可被配制為注射劑， 用于皮下、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑；栓劑；或通過呼吸道可吸入的噴霧 劑例如氣溶膠。注射制劑可通過將EGCG連同穩(wěn)定劑或緩沖液溶解或懸 浮在水中并將溶液或懸浮液包裝入安瓿或小瓶單位而獲得。 一般地， 栓劑由栓劑基質(zhì)制成，例如可可脂和另一甘油酯或治療緩瀉藥。對于 噴霧劑例如氣溶膠，噴射水分散的濃縮物或潤濕粉末的推進(jìn)劑可以與 添加劑聯(lián)合使用。
059上述的藥學(xué)可接受添加劑或載體可包括為藥物純的、基本 無毒的且不干預(yù)活性成分作用的任何添加劑或載體。
060
061本發(fā)明的藥物組合物可以通過一般的途徑施用，例如直腸、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、吸入、眼內(nèi) 和皮下途徑。非口服施用指包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、 經(jīng)皮和動(dòng)脈內(nèi)途徑的施用方式。對于通過非口服途徑施用，包含期望
純度的EGCG的藥物組合物優(yōu)選與藥學(xué)上可接受的載體即在給藥濃度
和量下為無毒性并且與其他的成分相容的載體混合，然后配制成單位 劑型。特別地，需要排除氧化劑和已知對人體有害的其他化合物。
062
063本發(fā)明的EGCG可以連同至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑 作為藥物組合物一起施用。對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，當(dāng)本發(fā)明的 藥物組合物被施用給人類患者時(shí)，總的日劑量應(yīng)該通過醫(yī)生的適當(dāng)?shù)?醫(yī)學(xué)判斷來確定，這是顯而易見的。對于患者的治療有效量可根據(jù)醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域公知的多種因素改變，其包括待實(shí)現(xiàn)的響應(yīng)的種類和程度；根 據(jù)其他藥劑是否與其一起使用的具體混合物；患者狀況例如年齡、體 重、健康狀態(tài)、性別和飲食；給藥頻率、時(shí)間和途徑；組合物的分泌 率；治療的時(shí)間期限等。對于適合用于本領(lǐng)域的藥劑，可對文獻(xiàn) (Remington's Pharmaceutical Science, 19 Ed" 1995, Mack Publishing Company, EastonPA)進(jìn)行參考。因此，EGCG的有效劑量優(yōu)選地參考上 述考慮進(jìn)行確定。本發(fā)明的藥物組合物可以以l到2000mg的EGCG的有 效量施用。
064
065下文，通過下面的實(shí)施例可以獲得對本發(fā)明的更好的理解， 所述實(shí)施例被提出是為了闡述，而不應(yīng)該理解為對本發(fā)明加以限制。
066優(yōu)選實(shí)施方式
067實(shí)施例l:對抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的體外分析
068為了測量與腐胺競爭的EGCG的抑制活性，觀察[1,4,-"C]
腐胺和琥珀酰酪蛋白之間的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-催化反應(yīng)。069
070琥珀?；睦业鞍踪徸訡albiochem (目錄編號573464)，將1 g粉末溶于含有5 mM DTT (0.1 M Tris-乙酸鹽(pH 8.0)、 10 mM CaCl2、 0.15MNaCl、 1.0mMEDTA)的50ml反應(yīng)緩沖溶液中。將該溶液儲(chǔ)存
12于深度制冷器中用于將來應(yīng)用。[1 ，4-"C] 1,4-丁二胺二鹽酸鹽(腐胺
二鹽酸鹽)購自GE Healthcare (目錄編號CFA301)，并且用蒸餾水稀釋 母液以產(chǎn)生5 )LiCi/ml的放射學(xué)劑量。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2購自 Sigma-Aldrich(目錄編號T5398)，并且用蒸餾水稀釋以產(chǎn)生l單位/ml的 終濃度。將EGCG(Sigma-Aldrich,目錄編號E4143)以10 mM的濃度溶于 DMSO以制備其母液，并且用DMSO稀釋該母液以制備具有不同濃度的 溶液。
071
072將450^1的琥珀酰酪蛋白溶液和50 pl的[1，4-14C]
1,4-丁二胺二鹽酸鹽溶液混合在一起以制備底物溶液。將96 pl的反應(yīng)緩 沖液、3 pl的EGCG的母液和l pl的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的母液混合在一起以制 備每一樣品，然后在37"C下溫育10 min。將500 iil的底物溶液和lOO pl 的樣品溶液充分混合，并且將混合物在37。C下溫育2小時(shí)，然后用4.5 ml 冷的(4。C)7.5。/。TCA終止。將最終溶液在4'C儲(chǔ)存1小時(shí)。TCA-沉淀物 通過GF/玻璃纖維過濾器進(jìn)行過濾，用25ml冷的5y。TCA洗滌，并干燥。 使用卩-計(jì)數(shù)器(Beckman Coulter),測量交聯(lián)蛋白的放射性，并且通過 DMSO-對照組的活性作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行補(bǔ)償。通過測量值表示 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性。在相同條件下，重復(fù)該分析三次，并且結(jié)果在 下面的表l中示出。073
074表l
濃度分析1分析2分析3平均值SD (標(biāo)準(zhǔn)偏 差)
0.0 nMl細(xì)01.00001.0000l細(xì)00.0000
0.5 )iM0.51660.56900.52950.53830.0273
1.0 pM0.39500.38730.32070.36770.0408
2.0 (aM0.20090.22880.17070.20010.0291
3.0 nM0.19110.19020.14820.17650.0245
5.0 pM0.12460.09470.10000.10640.0159
10.0 jaM0.10290.07260扁10.08790.0152
50.0 [iM0.08610細(xì)30.08490.08710.0028
075
076另外，根據(jù)EGCG的濃度，描述平均值。通過普通的
13非線性回歸方法計(jì)算ICso值，其測定為0.5169(士0.0298) pM。077
078EGCG對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的相對抑制活性在圖1中描述。如在 圖1中所描述，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性以EGCG濃度依賴的方式被抑制。
079工業(yè)實(shí)用性
080根據(jù)本發(fā)明的包含EGCG作為活性成分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑 制劑被安全地應(yīng)用于遭受由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶過量表達(dá)引起的疾病的患 者，而沒有引起副作用，從而可用于開發(fā)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑，其包含表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)或其衍生物。
2. 抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的方法，其使用EGCG或其衍生物。
3. 治療或預(yù)防由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化引起的疾病的藥物組合物，其包含EGCG或其衍生物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中所述疾病是神經(jīng)學(xué)疾病或癌癥。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中所述神經(jīng)學(xué)疾病選自阿爾茨海默氏病、杭廷頓舞蹈病和帕金森氏病。
6. 治療或預(yù)防由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化引起的疾病的方法，其包括施用選自EGCG、其衍生物和權(quán)利要求3到5任一項(xiàng)所述的藥物組合物的物質(zhì)的步驟。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述疾病是神經(jīng)學(xué)疾病或癌癥。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述神經(jīng)學(xué)疾病選自阿爾茨海默氏病、杭廷頓舞蹈病和帕金森氏病。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含表沒食子兒茶素沒食子酸酯(下文稱為EGCG)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑。更具體而言，本發(fā)明涉及包含EGCG的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑，其有效抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性，其過量表達(dá)為多種疾病的病原學(xué)的原因，并且本發(fā)明涉及其新應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，提供的是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑和抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法，其以應(yīng)用EGCG作為活性成分為特征。以應(yīng)用EGCG為特征，根據(jù)本發(fā)明的抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的新方法被安全地運(yùn)用到遭受轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶過量表達(dá)引起的疾病的患者，從而獲得對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的抑制作用，而沒有引起副作用。
文檔編號A61K31/353GK101686961SQ200880019859
公開日2010年3月31日 申請日期2008年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月11日
發(fā)明者鄭炅采, 金銖烈 申請人:國立癌中心