專利名稱：：禽類ebx細(xì)胞中的重組蛋白生產(chǎn)的制作方法禽類EBX⑧細(xì)胞中的重組蛋白生產(chǎn)本發(fā)明一般涉及重組蛋白生產(chǎn)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及名為EBx⑧的禽類胚胎來源的干細(xì)胞系在生產(chǎn)蛋白中的用途，且更特別地，涉及在生產(chǎn)糖蛋白如抗體中的用途。本發(fā)明用于生產(chǎn)具有高的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性的單克隆IgGl抗體亞型。本發(fā)明涉及這樣的抗體作為藥物用于治療癌癥和炎性疾病的用途。糖蛋白介導(dǎo)人類中的包括催化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞-細(xì)胞通訊和分子識別及群聚(association)的許多基本功能。許多糖蛋白已經(jīng)被開發(fā)其治療目的。蛋白的寡糖成分能影響與治療性糖蛋白的效果有關(guān)的效能，這些效能包括物理穩(wěn)定性、對蛋白酶攻擊的抗性、與免疫系統(tǒng)的相互作用、藥代動力學(xué)和特定的生物活性。這樣的性質(zhì)可不僅取決于寡糖的存在或缺如，還取決于寡糖的特定結(jié)構(gòu)。例如，某些寡糖結(jié)構(gòu)介導(dǎo)糖蛋白自血流中通過與特定的糖類結(jié)合蛋白的相互作用而快速清除，而其他的能與抗體結(jié)合并觸發(fā)非預(yù)期的免疫反應(yīng)(Jenkinsetal.，NatureBiotechnol.,14:975-81(1996))。糖蛋白的例子包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)、組織纖溶酶原激活物(TpA)、干擾素p(IFN-b)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)和治療性單克隆抗體(Mab)。大多數(shù)抗體在重鏈恒定區(qū)的保守性位置含有糖類結(jié)構(gòu)，其中每種同種型具有獨特排列的N-連接的糖類結(jié)構(gòu)，其可變地影響蛋白的組裝、分泌或功能性活性(Wright&Morrison(1997)TrendsBiotech.15:26-32)。某些G免疫球蛋白的生物活性取決于其分子上的聚糖結(jié)構(gòu)的存在和類型，且特別取決于其Fc成分。已經(jīng)證明了含有聚糖的殘基的存在或缺如對抗體與其效應(yīng)分子(Fc受體和補(bǔ)體)相互作用能力的影響。通過在存在衣霉素的情況下培養(yǎng)抑制人的IgGl的糖基化造成，例如，該抗體與在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中存在的FqRI受體的親合力下降50倍(Leatherbarrowetal.(1985)Molec.Immun.,22:407-415)。IgG上的糖類缺失也影響與FcYRIII受體的結(jié)合，因為已經(jīng)公開非糖基化的IgG3不能誘導(dǎo)ADCC型(抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒作用)經(jīng)NK細(xì)胞的FcryRin受體的分解(lysis)(Lundetal.(1990)Molec.Immun.27:1145-1153)。然而，除了這些含有聚糖的殘基必須存在之外，更加精確的是他們的導(dǎo)致啟動效應(yīng)物功能的能力不同的結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性。所有人類和鼠類亞類的IgG分子具有與每條重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域相連的N-寡糖(對于人IgG，在殘基Asn297)。IgG上N-連接的寡糖的一般結(jié)構(gòu)是復(fù)雜類型，其特征在于有或無二等分GlcNac/L-巖藻糖(Fuc)的甘露糖基-殼二糖核心(Man3-GlcNac2-Asn)和包辨存在或缺乏半乳糖(Gal)和唾液酸的其它鏈變體(見圖17)。此外，寡糖可含有0(G0)、l(Gl)或2(G2)Gal(見圖17)。添加的N-相連的糖的結(jié)構(gòu)可相當(dāng)大地變化，這取決于加工的程度，且能包括高甘露糖、多分枝以及雙觸角的復(fù)雜寡糖。一般地，存在連在特定糖基化位點的核心寡糖結(jié)構(gòu)的異質(zhì)化加工，以使甚至是單克隆抗體以多種糖形存在。已經(jīng)觀察到半乳糖基化的概況，其依賴于個體而可變(人血清IgGl)。這些區(qū)別可能反映出這些個體的細(xì)胞克隆之間半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和其J也酶類活性的區(qū)別(Jefferisetal.(1990)BiochemJ.268:529-537)。同樣地，已經(jīng)顯示出，細(xì)胞系之間抗體糖基化存在較大區(qū)別，并且甚至對于在不同培養(yǎng)條件下的給定細(xì)胞系也能看到較小的區(qū)別，這些不同的細(xì)胞培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)基的成分、細(xì)胞密度、pH、充氧條件(Lifelyetal.(1995)Glycobiology5(8):813-22;Kumpeletal.(1994)Hum.Antibodiesandhybridomas5:143-151)。已經(jīng)進(jìn)行調(diào)查寡糖殘基對于抗體的生物活性的功能的研究。Boyd等人(1995Mol.Immunol.32:1311-1318)已顯示，IgG的唾液酸對ADCC無影響。數(shù)個報道己經(jīng)顯示，Gal殘基增強(qiáng)ADCC(kumpeletal.(1994)Hum.Antib.Hybrid5:143-151;Kumpeletal.(1995)Hum.Antib.Hybrid6:82-88)。二等分GlcNac，其是轉(zhuǎn)變成核心卩-甘露糖(Man)殘基的pi，4-GlcNac殘基，己牽扯到治療性抗體的生物性殘基(Lifelyetal.(1995)Glycobiology5(8):813-22)。Shield等人(2002,J.Biol.Chem.277:26733-26740)已經(jīng)揭示了巖藻糖基化的寡糖對于抗體的效應(yīng)物功能的影響；已顯示出Fuc-缺陷的IgGl與FcyRIII結(jié)合的50倍增加和增強(qiáng)的ADCC。目前，用于治療性應(yīng)用.(即癌癥、炎性疾病…)的廣大范圍的重組蛋白包含糖基化的單克隆抗體。由于治療和經(jīng)濟(jì)原因，有巨大:的興趣獲得更高特異性的抗體活性。一種獲得大的能力增加而同時保持在細(xì)胞系中的簡單生產(chǎn)過程和潛在地避免顯著的、非預(yù)期的副作用的方法是增強(qiáng)Mab的天然的細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)物功能。因此，對IgG的寡糖進(jìn)行工程化可產(chǎn)生最佳化的ADCC，其被認(rèn)為是一些治療性抗體的主要功能，盡管抗體具有多種治療功能(如抗原結(jié)合、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(CDC))。像GLYCARTBIOTECHNOLOGYAG(Zurich,CH)這樣的公司已經(jīng)表達(dá)出N-乙酰基-葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII)，其在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系內(nèi)催化二等分GlcNac殘基加至N-連接的寡糖上，并且產(chǎn)生的IgGl抗體顯示出更強(qiáng)的ADCC(WO99/54342;WO03/011878;WO2005/044859)。通過從抗體的JFc部分移除或代替巖藻糖，KYOWAHAKKOKOGYO(東京，日本)增強(qiáng)了Fc結(jié)合^"改進(jìn)了ADCC，并因此增強(qiáng)Mab的效能(US6,946，292)。更近地，LaboratoireFranaisduFractio皿ementetdesBiotechnologies(LFB)(法國)顯示，Mab寡糖中的Fuc/Gal比率應(yīng)等于或低于0.6以獲得具有高ADCC的抗體(FR2861080)。然而，仍舊需要有在適于大規(guī)模生產(chǎn)的細(xì)胞中生產(chǎn)人單克隆抗體的另外的方法，這些細(xì)胞尚未被工程化以表達(dá)或沉默適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶，及這些細(xì)胞提供具有增強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)物功能的一致的人類類型的糖基化。這是本發(fā)明的目標(biāo)。本發(fā)明現(xiàn)在證明，在禽類胚胎來源的干細(xì)胞系EBx⑧中表達(dá)的單克隆抗體令人吃驚地顯示出類似人的糖基化模式。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在EBx⑧細(xì)胞中生產(chǎn)的很大部分的IgGl抗體群具有雙觸角類型的普遍的N-連接的寡糖結(jié)構(gòu)，其包含高度半乳糖基化的帶有末端GlcNac的長鏈。接近一半的IgGl抗體群含有未巖藻糖基化的雙觸角類型的N-連接的寡糖結(jié)構(gòu)，其賦予抗體以強(qiáng)的ADCC活性。本發(fā)明提供禽類胚胎來源的干細(xì)胞EBx，優(yōu)選雞或鴨胚胎來源的干細(xì)胞EBx，且更優(yōu)選雞EB14細(xì)胞或鴨的EB24和EB66細(xì)胞，使其遺傳工程化以表達(dá)重組蛋白，且更特別地，抗體、抗體片段或包括抗體片段的ADCC活性增強(qiáng)的融合蛋白。禽類胚胎來源的干細(xì)胞系EBx⑧是VIVALIS(Nantes，法同)開發(fā)出來的細(xì)胞系，該公司利用其在禽類生物學(xué)和在禽類胚胎干(ES)細(xì)胞方面的專業(yè)知識的優(yōu)勢承擔(dān)了開發(fā)滿足工業(yè)化和管理規(guī)范的新型穩(wěn)定的禽類細(xì)胞系的任務(wù)。通過使用專利方法(見WO03/076601)，發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生出一系列良好鑒定和記錄的細(xì)胞系(即"EBx⑧細(xì)胞")而不需遺傳的、化學(xué)的或病毒的永生化的步驟。在優(yōu)選的具體實施方式中，本發(fā)明所述的禽類細(xì)胞是雞或鴨細(xì)胞。EBx⑧細(xì)胞已經(jīng)通過使用一個完整記錄的2個步驟的方法且考慮了所有管理要求(例如常規(guī)檢測雞群或鴨群的衛(wèi)生狀況，使用無BSE國家的血清，使用鏈霉蛋白酶而不是胰蛋白酶，方法中包括的所有成分的來源斷隊證可査…)生產(chǎn)出來。步驟1:雞或鴨ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增胚胎干細(xì)胞在下列方面具有獨特的特點(i)在體外它們能像未分化細(xì)胞那樣無限地自我更新，(ii)它們具有無限的再生能力，(iii)它們保持穩(wěn)定的染色體內(nèi)容；(iv)它們表達(dá)高水平的端粒酶和特異性細(xì)胞表面標(biāo)記。盡管在全世界范圍內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行了很多努力，ES細(xì)胞僅能從非常有限數(shù)目的物種(小鼠、人、猴)中成功分離出來。本發(fā)明人在過去的歲月里付出了重要的資源來從不同禽類物種中分離和建立ES細(xì)胞，且主要自雞和鴨中分離和建立ES細(xì)胞。這樣的研究努力導(dǎo)致成功分離和鑒定雞ES細(xì)胞(Painetal.1999.CellTissuesOrgans165:212-219)和鴨ES細(xì)胞。本發(fā)明人然后開發(fā)出專利方法，該方法允許在體外有效培養(yǎng)和大規(guī)模地擴(kuò)增雞和鴨的ES細(xì)胞而未誘導(dǎo)分化。步驟2:EBx⑧細(xì)胞的衍生然后本發(fā)明人建立專利方法來自禽類ES細(xì)胞衍生穩(wěn)定的貼壁或懸浮的連續(xù)的細(xì)胞系。該方法包括自細(xì)胞培養(yǎng)基中逐漸撤掉血清、飼養(yǎng)細(xì)胞和生長因子，并使細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。這些胚胎來源的禽類細(xì)胞系保持了ES細(xì)啤的所期望的特征的大多數(shù)(即無限增殖、表達(dá)ES特異性標(biāo)記如端粒酶、核型i急定)，但此外還表現(xiàn)出新的"工業(yè)友好型"的特征(在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長到高細(xì)胞密度)?；谒鼈兊奈说纳锾匦裕景l(fā)明人選擇一些雞的EBx⑧細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)，如懸浮雞細(xì)胞系EB14(見WO03/076601和WO05/007840)或EBvl3?？蛇x地，本發(fā)明人選擇一些鴨,EBx⑧細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)，如EB24、EB26、EB66。本發(fā)明所述的EBx⑧細(xì)胞系是"連續(xù)的"，因為它們具有能在體外長時間培養(yǎng)的特征。有利地，本發(fā)明所述的細(xì)胞能增殖至少50代，至少75代，至少100代，至少125代，至少150代，至少175代，至少200代，至少250代。250代并非是時間限制，因為獲得的細(xì)胞仍存活并仍然能再傳代。不希望被束縛于理論，假定本發(fā)明所述的細(xì)胞能連續(xù)地培養(yǎng)，只要細(xì)胞表達(dá)端粒酶。實際上，據(jù)假定，本發(fā)明所述的禽類細(xì)胞的端粒酶的高水平表達(dá)是遺傳穩(wěn)定性(即本發(fā)明所述的禽類EBx⑧細(xì)胞是二倍體)和細(xì)胞連續(xù)生長的原因。術(shù)語"傳代"是指細(xì)胞移植稀釋或不稀釋地自一個培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移至另外一個培養(yǎng)器皿中。據(jù)理解，不管細(xì)胞自一個器皿轉(zhuǎn)移至另一器皿任何次數(shù)，均可能丟失細(xì)胞的一定比例，因此可出現(xiàn)細(xì)胞的稀釋，不管考慮是否周到。該術(shù)語與術(shù)語"繼代培養(yǎng)"同義。傳代數(shù)是細(xì)胞在培養(yǎng)中(懸浮或是貼壁生長的細(xì)胞)被繼代培養(yǎng)或傳至新的器皿中的次數(shù)。該術(shù)語不與群體倍增或增殖同義，其是細(xì)胞群體復(fù)制一次所需時間；也就是說，大概是群體的每個細(xì)胞復(fù)制的時間。例如，鴨或雞的ES的群體倍增時間(PDT)大約是>40小時。本發(fā)明所述的禽類EBx⑧細(xì)胞的PDT大約是短于30小時，通常短于24小時，且優(yōu)選短于20小時。對于EBx⑧細(xì)胞，通常每3代是一次傳代。術(shù)語"二倍體"是指本發(fā)明所述的細(xì)胞每個染色體有2個拷貝(2n)，通常一個來自母親一個來自父親。本發(fā)明所述的禽類EBx⑧細(xì)胞系是連續(xù)的并且是二倍體(即使遺傳穩(wěn)定的)的這一事實構(gòu)成顯著和獨特的特征，因為這些術(shù)語通常是對抗性的。因此，通過化學(xué)的、物理的(U.V照射、X射線或g-輻射…)或i^傳修飾(病毒轉(zhuǎn)化、癌基因過表達(dá)…)而獲得的癌細(xì)胞和/或永生化細(xì)胞因其能夠無限復(fù)制培養(yǎng)而是連續(xù)的細(xì)胞，但是它們因其表現(xiàn)出多倍體核型而不是遺傳穩(wěn)定的。另一方面，原代細(xì)胞如雞胚胎成纖維細(xì)胞MRC5、WI38，這些是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，是不連續(xù)的，因為它們具有傳少數(shù)幾代之后有限的生命期，但是它們是遺傳穩(wěn)定(即二倍體)的細(xì)胞。在本發(fā)明中，不加區(qū)分地使用術(shù)語"細(xì)胞系"和"細(xì)胞"。如本文所用，術(shù)語"禽"、"鳥"、"鳥綱"或"鳥目"具有相同的含義，且不加區(qū)分地使用。"鳥"是指分類學(xué)綱"<〈鳥綱》"的生物體的任何種、亞種或種族。在優(yōu)選的具體實施方式中，"鳥"是指下列分類學(xué)目的任何動物-"雁形目"(即鴨、鵝.、天鵝和同類(ally))。雁形目含有約150個鳥類物種，可分為三個科叫鴨科(叫鴨)、鵲鵝科(Anseranatidae)(喜鵲)和鴨科，其包括超過140個物種的水鳥，其中它們包括鴨、鵝和天鵝。在該目中的所有物種高度適于在水表面水生生活。全部是有蹼足以有效游泳(盡管有些后來已經(jīng)成為主要是陸棲的動物)。-"雞形目"(即雞、鵪鶉、火雞、野雞和同類)。雞形目是含有雞、火雞、鵪鶉、野雞的鳥類目。在全世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)約256個物種。-"鴿形目"(即鴿子及其同類)。鳥的鴿形目包括分布非常廣泛的斑鳩(dove)和鴿子。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式，本發(fā)明所述的禽類選自在其基因組中不包含禽類E型造白細(xì)胞組織增生(leucosis)病毒(ALV-E)和內(nèi)源性禽類病毒(EAV)的前病毒序列的禽類。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定ALV-E和EAV序列是否存在于禽類基因組中(JohnsonetHeneine,2001，J.Virol75:3605-3612;Weissmahretal.，1997,J.Virol71:3005-3012)。優(yōu)選地，禽類選自雁形目(即鴨、鵝或天鵝)、火雞、鵪鶉、日本鵪鶉、珠雞或孔雀(PeaFowl)。因此，源自這樣的禽類的細(xì)胞不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性ALV-E和/或EAV顆粒。在優(yōu)選的具體實施方式中，本發(fā)明所述的禽類選自鴨、鵝、天鵝、火雞、鵪鶉和日本鵪鶉、珠雞或孔雀。根據(jù)更優(yōu)選的具體實施方式，#鴨更鄰哮的是北京鴨或莫斯科一鳥(NtoscovydudO。根據(jù)更優(yōu)選的具體實施i"k，禽類是北京鴨。因此，'本發(fā)明提供獲得來源于胚胎干細(xì)胞(ES)的連續(xù)的二倍體鴨細(xì)胞系的方法，其中所述的鴨細(xì)胞系不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒^本發(fā)明所述的鴨EBx⑧細(xì)胞系的例子是EB24、EB26、EB66或它們的亞克隆，如EB24-12。根據(jù)第二優(yōu)選具體實施方式，本發(fā)明所述的禽類選自在其基因組中不包含完整的ALV-E前病毒序列但最終包含EAV前病毒序列的禽類。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定在禽類的基因組中是否存在部分或完整的ALV-E和EAV序列(JohnsonandHeneine，2001)。通過飼養(yǎng)選擇了不含有完整ALV-E前病毒序列(即ev-0品種)并因此不產(chǎn)生感染性ALV-E逸轉(zhuǎn)錄顆粒(retroparticle)的幾個雞的品種，例如-品系0東方蘭辛(EastLansing)USDA家禽原種的家雞(ELL-0品種)。東方蘭辛品系0雞不含任何與ALV相關(guān)的內(nèi)源性病毒(ev)基因座(DunwiddieandFaras,1985Proe.Natl.Acad.SciUSA82:5097-5101)。-品系22査爾斯河(CharlesRiver)白色來亨雞(SPAFAS)。-品系DE禾BPE11來自國家農(nóng)業(yè)研究所(InstitutNationaldelaRechercheAgronomique)(DomainedeMagneraud，Surg6res,法國)。因此，來源于ev-O禽類的細(xì)胞不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性ALV-E顆粒。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式，該禽類是ev-0家雞(原雞(GaZ/附亞種家雞Wom勸'c7w))，優(yōu)選地選自ELL-O、Line22、DE或PEll。通常，ev-0雞仍舊含有EAV前病毒序列，但是迄今為止無感染性EAV隔離群被鑒定。因此，本發(fā)明提供獲得來自ev-O雞品種的胚胎干細(xì)胞(ES)的連續(xù)的二倍體雞細(xì)胞系的方法，其中所述ev-0雞細(xì)胞系不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。根據(jù)第三具體實施方式，本發(fā)明所述的禽類選自在其基因組中包含完整和/或不完整的ALV-E和EAV前病毒序列但是不能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的的ALV-E和EAV逆轉(zhuǎn)錄顆粒的禽類。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定ALV-E和/或EAV感染性和/或非感染性逆轉(zhuǎn)錄顆粒是否自禽類細(xì)胞產(chǎn)生(JohnsonandHeneine,2001;Weissmahretal.,1996)。優(yōu)選地，禽類選自無特定病原體(SPF)的雞，優(yōu)選選自Valo品種。本發(fā)明所述的雞的EBx⑧細(xì)胞系的例子是EBvl3細(xì)胞系。在本發(fā)明中，術(shù)語"內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒"或"內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒"，這些術(shù)語能不加區(qū)分地使用，是指由一些禽類細(xì)胞的基因組中存在的ALV-E或EAV前病毒序列編碼的和/或表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在禽類中，已知ALV-E前病毒序列存在于家雞(除了品系-0雞)、紅林雞(redjunglefowl)和環(huán)頸雉雞(RingneckPheasant)的基因組中。在禽類中，已知EAV前病毒序列存在于包括家雞、品系-0雞、紅林雞、綠林雞、灰林雞、錫蘭林雞及其同類的)所有原雞(gallus)屬中(見Resnick"a/"1990,J.Virol.，64:4640-4653)。術(shù)語"具有復(fù)制能力"是指內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒是感染性的，也就是說，這樣的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒能感染本一fe明所述的禽類細(xì)胞并能在其中復(fù)制。建立本發(fā)明所述的名為EBx⑧的連續(xù)的二倍體禽類細(xì)胞系的方法包括下列2個步驟a)在含有允許這些細(xì)胞的生長的所有因子和存在飼養(yǎng)層并添加了動物血清的完全培養(yǎng)基中分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增胚胎干細(xì)胞(ES)，這些胚胎干細(xì)胞來自不含完整的內(nèi)源性前病毒顆?；蚱淦蔚?，對產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒易感的，更特別地，不包含EAV和/或ALV-E前病毒序列或其片段的禽類；可選地，所述完全培養(yǎng)基可包含添加物，如添加的氨基酸(即谷氨酰胺…)、丙酮酸鈉、P-巰基乙醇、非動物起源的蛋白水解物(即酵母提取物(yeastolate)，植物蛋白水解物…)；b)通過修改培養(yǎng)基進(jìn)行傳代，以完全去除所述的因子、所述的飼養(yǎng)層和所述的血清，和可選的所述的添加物，并進(jìn)一步獲得貼壁或懸浮的禽類細(xì)胞系(命名為EBx⑧)，其不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中在缺乏外源性生長因子、飼養(yǎng)層和動物血清下在長時間內(nèi)增殖。；，-以至于逐漸或完全去除生長因子、血清和飼養(yǎng)層的建立EBx⑧細(xì)胞系的方法中的步驟b)的培養(yǎng)基的修飾能同時、順序或分別進(jìn)行。培養(yǎng)基的"斷奶(weaning)"順序可選自下列順序-伺養(yǎng)層/血清/生長因子；-飼養(yǎng)層/生長因子/血清；-血清/生長因子/飼養(yǎng)層；-血清/飼養(yǎng)層/生長因子；-生長因子/血清/飼養(yǎng)層；-生長因子/飼養(yǎng)層/血清。在優(yōu)選具體實施方式中，"斷奶"的順序是生長因子/飼養(yǎng)層/血清。根據(jù)優(yōu)選具體實施方式—二本發(fā)明的步驟a)中所述的禽類胚胎干細(xì)胞收集自在產(chǎn)卵的禽類胚胎，也就是說—^卵產(chǎn)下來時。根據(jù)Sdlier等人(2006，J.Appl.Poult.Res.,15:219-228)，產(chǎn)卵對應(yīng)于根據(jù)Eyal-Giladi分類的下列發(fā)育階段(EYAL-GILADI，sclassification:EYAL-GILADIandKOCHAN，1976,Frowa/1//2e/kst0/f/zecfeve/d萍ew/c/z/cA:."GeneralMorphology"Dev.Biol.49:321-337):-俄國鴨(Muscovy):階段VII-珠雞階段VII-VIII-火雞階段VII-VIII-北京鴨VIII-雞階段X-日本鵪鶉階段XI-鵝階段XI。優(yōu)選地，歩驟a)的鴨胚胎干(ES)細(xì)胞通過分離約處于Eyal-Giladi分類的階段VIII(產(chǎn)卵)的胚胎獲得，對于俄國鴨更優(yōu)選約處于階段VIL的胚胎，對于北京鴨更優(yōu)選約處于階段VIII的胚胎。優(yōu)選地，步驟a)中的雞胚胎干(ES)細(xì)胞，優(yōu)選來自ev-0雞品種，通過分離約處于Eyal-Giladi分類的階段X(產(chǎn)卵)的胚胎而獲得?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明步驟a)的禽類胚胎干細(xì)胞收集自產(chǎn)卵前的胚胎。產(chǎn)卵前遇到的主要限制在于卵必須從母雞體內(nèi)通過外科手術(shù)取出且每個胚胎的ES細(xì)胞的數(shù)量是較不重要的事實。此外，在禽類胚胎發(fā)育的非常早期階段，ES細(xì)胞并未良好地個體化(individualized),這導(dǎo)致了體外培養(yǎng)ES細(xì)胞的困難。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能定義在產(chǎn)卵前可收集禽類ES細(xì)胞的時間范圍?？蛇x擇地，根據(jù)本發(fā)明步驟a)的禽類胚胎干細(xì)胞可從產(chǎn)卵后至孵化的禽類胚胎收集。然而，禽類胚胎干細(xì)胞逐漸進(jìn)入分化以產(chǎn)生分化的組織；因此，優(yōu)選收集禽類ES是不長過產(chǎn)卵。本領(lǐng)域技術(shù)人員能定義產(chǎn)卵后可收^"禽類胚胎干細(xì)胞的時間范圍。這些禽類胚胎干細(xì)胞的特征是在39°C培養(yǎng)中包含48至72小時的緩慢的倍增時間。不希望受縛于理論，所限定的在逐漸去除生長因子、飼養(yǎng)層和血清之后的禽類ES細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件允許改造和選擇那些保留了所期望保留的ES細(xì)胞的大多數(shù)特征(核型穩(wěn)定、無限增殖、表達(dá)ES標(biāo)記)但是此外還表現(xiàn)出工業(yè)友好的特征，如在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長直到達(dá)到高細(xì)胞密度的細(xì)胞。端粒酶是最重要的ES標(biāo)記之一。由于在細(xì)胞傳代過程中端粒酶持續(xù)和維持(maintain)表達(dá)，EBx細(xì)胞是連續(xù)的(即永生的)但此外是遺傳穩(wěn)定的(即二倍體)。本發(fā)明提供獲得連續(xù)的二倍體的來自ES細(xì)胞的禽類細(xì)胞系(命名為EBx⑧細(xì)胞系或EBx⑧細(xì)胞)的方法，其中所述的禽類細(xì)胞系不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，所述方法包含下列步驟a)在包括從Eyal-Giladi分類(EYAL-GILADI，sclassification:EYAL-GILADIandKOCHAN,1976，《Fnwc/eavagefo/n'm/riveWreacA:ybrmaricw..ac0OT//eraewfa7wo7na/fa6/eawc/a/ooA:a/rsf■stagesq/"血cfew/op艦WZnAec/j/cb>."GeneralMorphology"Dev.Biol"49:321-337)的大約階段VI的發(fā)育階段和孵化前的發(fā)育階段分離禽類胚胎，優(yōu)選從鴨或從雞，優(yōu)選ev-0雞。優(yōu)選地，所述禽類基因組不含有對于產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒易感的內(nèi)源性前病毒序列；b)將通過分離步驟a)的胚胎獲得的禽類胚胎干(ES)細(xì)胞在添加下列物質(zhì)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中懸浮-胰島素生長因子((IGF-l)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF);-動物血清；和-可選地，選自白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-6受體(IL-6R)、干細(xì)胞因子(SCF)或成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的生長因子；c)將在步驟b)獲，得的懸浮ES細(xì)胞接種在詞養(yǎng)細(xì)胞層上并將ES細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)至少一代；d)可選地，從1至大約15代的數(shù)代的時間跨度內(nèi)從培養(yǎng)基中去除所有選自IL-6、IL-6R、SCF或FGF的生長因子，并將禽類ES細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)至少一代。優(yōu)選地，從培養(yǎng)基中去除所有選自IL-6、IL-6R、SCF或FGF的生長因子在一代內(nèi)同時進(jìn)行。通常地，于大約10至15代內(nèi)去除IL-6、IL-6R、SCF、FGF;e)從培養(yǎng)基中去除IGF-1和CNTF，并進(jìn)一步培養(yǎng)禽類ES細(xì)胞至少一代。優(yōu)選地，從培養(yǎng)基中去除選自IGF-1或CNTF的生長因子在一代內(nèi)同時進(jìn)行。通常在大約15至25代內(nèi)去除IGF-1和CNTF?？蛇x地，通過在數(shù)代間(至少2代和大約多達(dá)15代)逐漸減少地進(jìn)行IGF-1和CNTF的去除；f)逐漸減少培養(yǎng)基中飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度以至于在數(shù)代后將飼養(yǎng)層完全去除并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞；g)可選地，逐漸姨少培養(yǎng)基中添加物的濃度以至于在至少一代后將添加物完全去除；且h)可選地，逐漸減少培養(yǎng)基中動物血清的濃度以至于在數(shù)代后將動物血清完全去除；且，i)獲得貼壁禽類細(xì)胞系(命名為EBx⑧)，其來源于能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中在缺乏生長因子、飼養(yǎng)層、及可選地?zé)o動物血清和添加物的條件下增殖的ES細(xì)胞，且其中所述連續(xù)的二倍體禽類細(xì)胞系優(yōu)選不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；j)可選地，進(jìn)一步使所述貼壁禽類EBx⑧細(xì)胞系適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)條件；k)可選地，進(jìn)一步亞克隆所述禽類EBx⑧細(xì)胞，例如通過有限稀釋。在優(yōu)選的具體實施方式中，本發(fā)明涉及獲得連續(xù)的二倍體禽類細(xì)胞系，命名為EBx，其來源于禽類胚胎干細(xì)胞(ES)的方法，其中所述禽類細(xì)胞系不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄，窗毒顆粒，且所述方法包含下列步驟a)于大約產(chǎn)卵期的發(fā)育階段分離禽類胚胎，其中所述禽類的基因組不含有易于產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的內(nèi)源性前病毒序列；b)使通過分離步驟a)中的胚胎而獲得的禽類胚胎干(ES)細(xì)胞在至少添加了下列物質(zhì)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中懸浮-胰島素生長因子l(IGF-1)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF);和-哺乳動物血清如胎牛血清；c)將在步驟b)中獲得的懸浮ES細(xì)胞接種在飼養(yǎng)細(xì)胞層上并進(jìn)一步將ES細(xì)胞培養(yǎng)至少一代；e)從培養(yǎng)基中去除IGF-1和CNTF，并進(jìn)一步將細(xì)胞培養(yǎng)至少一代；f)逐漸減少培養(yǎng)基中飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度以至于在數(shù)代后完全去除飼養(yǎng)層，并進(jìn)一步培養(yǎng)該細(xì)胞；g)逐漸減少培養(yǎng)基中所述哺乳動物血清的濃度以至于在數(shù)代后完全去除哺乳動物血清，并,；h)獲得貼壁的禽類EBx⑧細(xì)胞系，其來源f能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在缺乏生長因子、飼養(yǎng)層和哺乳動物血清的條件下增殖的ES細(xì)胞，并且其中所述連續(xù)的二倍體禽類細(xì)胞系不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；i)可選地，進(jìn)一步使貼壁的禽類EBx⑧細(xì)胞系適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)條件，優(yōu)選通過促進(jìn)懸浮生長、更優(yōu)選通過將在步驟h)中獲得的貼壁的禽類EBx細(xì)胞系轉(zhuǎn)移至另一種比最初使用的支持物(即如吸附(attachment)性超低的支持物)的吸附性低的支持物上。當(dāng)進(jìn)行使貼壁的禽類EBx⑧細(xì)胞系適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)條件的步驟j)時，該步驟j)能在逐漸減少培養(yǎng)基中的哺乳動物血清的濃度的步驟g)之前在另一優(yōu)選具體實施方式中受到影響。在另一優(yōu)選的具體實施方式中，為了獲得本發(fā)明所述的連續(xù)的二倍體禽類細(xì)胞系而在該方法的步驟b)中所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)一步添加選自白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素6受體(IL-6R)、干細(xì)胞因子(SCF)或成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的生長因子，且所述的方法進(jìn)一步包含下列步驟d):d)可選地，從培養(yǎng)基中去除所有選自IL-6、IL-6R、SCF或FGF的生長因子，并進(jìn)一步將ES細(xì)胞培養(yǎng)至少一代。在更優(yōu)選具體實施方式中，當(dāng)進(jìn)行步驟d)時，從培養(yǎng)基中去除IGF-1和CNTF的歩驟e)在從培養(yǎng)基中去除所有選自IL-6、IL-6R、SCF或FGF的生長因子的步驟d)后受影響。根據(jù)本發(fā)明，"基礎(chǔ)培養(yǎng)基"是指具有經(jīng)典培養(yǎng)基配方的培養(yǎng)基，其借由其本身至少使細(xì)胞存活，并且甚至更好地使細(xì)胞生長?；A(chǔ)培養(yǎng)基的例子是BME(基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基)、MEM(最小Eagle培養(yǎng)基)、培養(yǎng)基199、DMEM(Dulbecco's改良Eagle培養(yǎng)基)、GMEM(Glasgow改良Eagle培養(yǎng)基)、DMEM-HamF12、Ham-F12和Ham-FlO、Iscove，s改良Dulbecco's培養(yǎng)基、MacCoy，s5A培養(yǎng)基、RPMI1640、GTM3?；A(chǔ)培養(yǎng)基包含無機(jī)鹽(例如CaCl2、KC1、NaCl、NaHC03、NaH2P04、MgS(V")、氨基酸、維生素(硫胺素、核黃素、葉酸、D-泛酸鈣…)和其它成分，如葡萄糖、P-蔬基-乙醇、丙酮酸鈉。優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是合成培養(yǎng)基。'.'此外，本發(fā)明所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可添加選自下列物質(zhì)的添加物-0.1至5mML-谷氨酰胺，優(yōu)選2至3mML-谷氨酰胺；-0.05至2mM丙酮酸鈉，優(yōu)選0.1mM至1mM丙酮酸鈉；-0.1至2.5%非必1需氨基酸，優(yōu)選大約1%非必需氨基酸；-0.05至5mM(3-巰基-乙醇，優(yōu)選大約0.16mMP-巰基-乙醇；-非動物來源的蛋白水解物。為了建立本發(fā)明所述的鴨EBx⑧細(xì)胞，基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選添加非動物來源的蛋白水解物。非動物來源的蛋白水解物選自細(xì)菌胰蛋白胨、酵母胰蛋白胨、植物水解物，如大豆水解物，或其混,物。在優(yōu)選的具體實施方式中，非動物來源的蛋白水解物是酵母胰蛋白胨。術(shù):I吾"水解物"包括大豆蛋白胨或酵母提取物的酶解消化產(chǎn)物。水解物能分別從很多大豆蛋白胨或酵母提取物制品中獲得，其能進(jìn)一步被酶解消化(例如木瓜酶)和/或通過自溶、加熱分解和/或質(zhì)壁分離而形成。水解物也能通過商業(yè)途徑獲得，如Yeastolate、Hy-Soy、Hy-Yeast412和Hi-Yeast444，從女口JRHBiosciences(Lenaxa,KA)、QuestInternational(Norwich,N.Y.)、OrganoTechnieS.A.(法國)或DeutscheHefewerkeGmbH(德國)的來源獲得。酵母提取物的來源還公開在WO98/15614中。酵母提取物和大豆水解物的來源還公開在WO00/03000中。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中所使用的水解物優(yōu)選從粗組分中純化，因為優(yōu)選去除在該純化過程中可能干擾有效培養(yǎng)的雜質(zhì)，借此改進(jìn)了水解物的一致性。能通過超濾或葡聚糖凝膠層析方法(例如用SephadexG25或SephadexG10或等效材料)、離子交換層析方法、親和層析、大小排阻層析或"反相"層析進(jìn)行純化。優(yōu)選地，通過使用10kDa截留濾膜的超濾進(jìn)行純化。本領(lǐng)域已知這些方法。通過使用這些方法，能選擇含有所限定分子量的大豆或酵母水解物的組分。優(yōu)選地，大豆或酵母水解物的平均分子量優(yōu)選是在大約220和375道爾頓之間。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基中含有酵母水解物。例如從JRH-BIOSCIENCES,(Ref58902)獲得的酵母水解物50X(大約200g/1)在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度是在大約0.1X至2X之間，優(yōu)選大約0.5X至1X之間。還可將大豆水解物加進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)基中。加入培養(yǎng)基中的例如從JRH-BIOSCIENCES(Ref58903100M)獲得的大豆水解物50X的終濃度是在大約0.1X至2X之間，優(yōu)選大約1X?？蛇x地，可如US2004/0077086所述，將大豆水解物和酵母水輛物的混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中。根據(jù)本發(fā)明所述的優(yōu)選基礎(chǔ)培養(yǎng)基是DMEM-Ha^iF12，.其加入2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、1%非必需氨基酸、0.16mM(3-巰基-乙醇和可選地，IX酵母水解物。術(shù)語"完全培養(yǎng)基"是指添加了至少一種生長因子和動物血清的補(bǔ)充的或不補(bǔ)充的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，優(yōu)選地，基'礎(chǔ)合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基的例子如WO03/076601、WO05/007840、EP787180、US6,114,168、US5,340,740、US6,656,479、US5,830,510和Pain等人(1996，Development122:2339-2348)中所述的?？蛇x地，完全培養(yǎng)基可是條件培養(yǎng)基(conditionedmedium),優(yōu)選BRL條件培養(yǎng)基。以舉例的方式，BRL條件培養(yǎng)基根據(jù)本領(lǐng)域公知技術(shù)，如Smith和Hooper(1987，Dev.Biol.121:1-9)中所述的技術(shù)生產(chǎn)。B叫細(xì)啤，，自AT,CC登錄號CRL-"42獲得。條件培養(yǎng)基可添加如下所述的外源性生長因》和動物血清。如本文所用，術(shù)語"生長因子"是指對于培養(yǎng)中的未分化的禽類ES細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的存活和生長必需的生長因子?？赡芨乓缘貙⑸L因子分成2個家族細(xì)胞因子和營養(yǎng)因子。細(xì)胞因子主要是其功能是通過gpl30蛋白相關(guān)受體的細(xì)胞因子。因此，白血病抑制因子(LIF)、白細(xì)胞介素11、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素6受體、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、制瘤素和心臟營養(yǎng)素在特別的鏈的受體水平上募集和后者與gpl30蛋白以單體或有時是以異源雙體形式結(jié)合上具有相似的作用模式。營養(yǎng)因子主要是干細(xì)胞因子(SCF)、胰島素生長因子l(IGF-1)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，優(yōu)選堿性FGF(bFGF)或人FGF(hFGF)。本發(fā)明所述的完全培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基，優(yōu)選基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基，和至少一種其作用是通過gpl30蛋白相關(guān)受體的細(xì)胞因子和/或至少一種營養(yǎng)因子的細(xì)胞因子。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的完全培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和至少一種選自白血病抑制因子(LIF)、制瘤素、心臟營養(yǎng)素、胰島素生長因子l(IGF-l)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、白細(xì)胞介素6(K-6)、白細(xì)胞介素6受體(IL-6R)、干細(xì)胞因子(SCF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)或白細(xì)胞介素ll(IL-ll)的細(xì)胞因子。'根據(jù)第一優(yōu)選具體實施方式，完全培養(yǎng)基是添加動物血清和至少添加IGF-1和CNTF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。根據(jù)第二優(yōu)選具體實施方式，完全培養(yǎng)基是添加動物血清和至少添加IGF-1、CNTF、IL-6和IL-6R的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。根據(jù)第三優(yōu)選具體實施方式，完全培養(yǎng)基是添加動物血清和至少添加IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。根據(jù)另一具體實施方式，完全培養(yǎng)基是條件培養(yǎng)基，其包含生長因子(即例如由BRL或STO細(xì)胞表達(dá)的)和可選地添加至少一種外源性的選自LIF、IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF、IL-ll的生長因子?；A(chǔ)培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基中生長因子IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF、IL-ll的濃度是在大約0.01至10ng/ml之間，優(yōu)選是O.l至5ng/ml,，且更優(yōu)選是大約1ng/ml。此外，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基還可包含抗生素，如舉例來說，慶大霉素、青霉素和鏈霉素，來預(yù)防細(xì)菌污染?？稍贓S細(xì)胞培養(yǎng)的早期傳代時將抗生素加入培養(yǎng)基中。例如，終濃度是IOng/ml的慶大霉素、終濃度是100U/ml的青霉素和終濃度是100pg/ml的鏈霉素可加入到培養(yǎng)基中。在優(yōu)選的具體實施方式中，在本發(fā)明所述的建立連續(xù)的二倍體禽類細(xì)胞系的方法的后面歩驟中在培養(yǎng)基中不加抗生素。在本發(fā)明所述的建立禽類胚胎干細(xì)胞的方法的過程中，將細(xì)胞培養(yǎng)在飼養(yǎng)細(xì)胞層上。更加優(yōu)選地，飼養(yǎng)細(xì)胞是為了培養(yǎng)禽類ES細(xì)胞的目的而培養(yǎng)的動物細(xì)胞或細(xì)胞系?？蛇x地，飼養(yǎng)細(xì)胞能用細(xì)胞外基質(zhì)加結(jié)合的生長因子取代。因此飼養(yǎng)基質(zhì)在下文是指飼養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)。如本文所用，飼養(yǎng)基質(zhì)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的程序構(gòu)建。如上所注明的，優(yōu)選飼養(yǎng)基質(zhì)是經(jīng)預(yù)處理的。術(shù)語"預(yù)處理"是指在來源于受精的禽類卵的胚盤的細(xì)胞放置下來與飼養(yǎng)基質(zhì)接觸之前將飼養(yǎng)基質(zhì)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，例如飼養(yǎng)基質(zhì)足以起始和建立例如生長因子或其它因子的生產(chǎn)的時間；通常詞養(yǎng)基質(zhì)是在來源于受精的禽類卵的胚盤的細(xì)胞放置下來與飼養(yǎng)基質(zhì)接觸之前一至兩天通過培養(yǎng)飼養(yǎng)基質(zhì)本身而預(yù)處理。飼養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選包含小鼠成纖維細(xì)胞。優(yōu)選STO成纖維細(xì)胞，但是原:代成纖維細(xì)胞也是合適的。當(dāng)本發(fā)明也就小鼠細(xì)胞飼養(yǎng)基質(zhì)的用途進(jìn)行描述時，本發(fā)明也考慮使用包含來自其它鼠類物種(例如大鼠)；其它哺乳動物物種(例如有蹄動物、牛、豬物種)；或禽類物種(例如雞(Gallinacea)、雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉)的詞養(yǎng)基質(zhì)。在另一具體實施方式中，本發(fā)明所述的飼養(yǎng)細(xì)胞可轉(zhuǎn)染表達(dá)載體，以允許例如生長因子如禽類SCF在STO細(xì)胞中組成性表達(dá)。因此，該"飼養(yǎng)"產(chǎn)生可溶性和/或連接在細(xì)胞的質(zhì)膜上的形式的因子。因此，本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法可可選地包含建立單層飼養(yǎng)細(xì)胞的步驟。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可使飼養(yǎng)細(xì)胞的有絲分裂滅活。例如，飼養(yǎng)細(xì)胞可暴露于X或Y射線照射中(例如4000Rad的Y射線照射)或可以絲裂霉素C處理(例如以10pg/ml處理2-3小時)。有絲分裂滅活細(xì)胞的方法的細(xì)節(jié)也見于通常與美國典型培養(yǎng)物保藏中^、(ATCC，10801UniversityBoulevard,Manassas，Va.20110-2209)所傳送的細(xì)胞共同遞送的信息中，(例如STO飼養(yǎng)細(xì)胞以ATCC登錄號1503可得到)?？煽蛇x地將單層培養(yǎng)至大約80%融合，優(yōu)選至大約90%融合，且更優(yōu)選大約100%融合。當(dāng)詞養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)是單層時是培養(yǎng)的優(yōu)選結(jié)構(gòu)，任何合適的結(jié)構(gòu)旨在包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，例如，飼養(yǎng)細(xì)胞的多層、單層、成叢、聚集或其它結(jié)合或成組旨在包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)并且尤其是旨在包含在術(shù)語"基質(zhì)"的含義內(nèi)。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基添加動物血清。所使用的動物血清優(yōu)選是胚胎動物血清。優(yōu)選胎牛血清。同樣，在本發(fā)明就胎牛血清進(jìn)行描述時，本發(fā)明旨在也使用包含來自其它動物物種的血清(例如雞、馬、豬、有蹄動物等)。動物血清在培養(yǎng)基中的終濃度是在大約1至25%之間，優(yōu)選在5%至20%之間，優(yōu)選在8%和12%之間。在優(yōu)選的具體實施方式中，動物血清在培養(yǎng)基中的終濃度是在大約10%。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式，培養(yǎng)基包含大約10%胎牛血清。本發(fā)明還涉及連續(xù)的二倍體禽類EBx⑧細(xì)胞系。EBx⑧細(xì)胞是小的、圓的(即直徑約10um)、分開的細(xì)胞，其倍增時間于37°C或39°C時是大約30小時或更短。禽類EBx⑧細(xì)胞，優(yōu)選鴨EBx⑧或雞EBxev-0，表達(dá)具有下列特征的胚胎干細(xì)胞表型-高核-質(zhì)比例，-內(nèi)源性端粒酶活性，-可選地，它們表達(dá)一種或多種另外的ES標(biāo)記如堿性磷酸酶、SSEA-1、EMA-1、ENS1標(biāo)記。-于37°C時的倍增時間比本發(fā)明所述的方法中的步驟a)中的禽類ES細(xì)胞的倍增時間(在39'C時為48-72小時)短，大約是30小時或更短(優(yōu)選24小時)。所述的細(xì)胞EBx⑧優(yōu)選不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。本發(fā)明所述的禽類EBx⑧細(xì)胞系能在無外源性生長因子、血清和/或滅活的飼養(yǎng)細(xì)胞層，可選地，添加各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常使用的添加物的條件下在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，尤其是在如SAFCExcell培養(yǎng)基、DMEM、GMEM、DMEM-HamF12或McCoy的培養(yǎng)基中無限增殖。添加物的例子是非必需氨基酸、維生素、丙酮酸鈉和抗生素。本發(fā)明所述的鴨EBx⑧細(xì)胞具有在不添加谷氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長的顯著特征。本發(fā)明所述的禽類EBx⑧細(xì)胞的核型分析顯示EBx⑧細(xì)胞是二倍體且代與代之間遺傳穩(wěn)定。本發(fā)明提供禽類EBx⑧細(xì)胞，優(yōu)選雞EBx⑧或鴨EBx⑧細(xì)胞，這些細(xì)胞轉(zhuǎn)染至少一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含至少一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含編碼目的重組蛋白或多肽的核酸序列，優(yōu)選脫氧-核糖核酸(DNA)序列，所述序列可通過操作連接到能影響所述蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的啟動子序列上。表達(dá)載體進(jìn)一步包含至少一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒至少包含編碼可選擇標(biāo)記的DNA序列，所述可選擇標(biāo)記可通過操作連接到能影響所述可選擇標(biāo)記在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動子序列上。表達(dá)載體含有至少一種目的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件。能使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知和使用酌方法來構(gòu)建含有編碼目的蛋白和多肽的序列以及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組技術(shù)。這些技術(shù)見例如Sambrook等人(1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.)禾口Ausubel等人(1989'CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.)所述。合適的表達(dá)載體包含至少一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含編碼目的異源蛋白的核酸序列，優(yōu)選DNA序列，這些序列可通過操作連接到調(diào)控元件和調(diào)節(jié)性序列上。至少，表達(dá)盒包含編碼目的異源蛋白的核酸序列，優(yōu)選DNA序列，這些序列可通過操作連接到啟動子序列上。如本文所使用，"啟動子"是指調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核酸序列。如本文所使用，術(shù)語"可通過操作連接"是指編碼和調(diào)控序列的安排，例如在表達(dá)載體內(nèi)，以至于實現(xiàn)編碼序列的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。因此，可通過操作連接到編碼序列上的調(diào)控序列能影響編碼序列的表達(dá)，并能調(diào)節(jié)基因表達(dá)在哪種組織中、于什么發(fā)育時間點表達(dá)，或坰應(yīng)于哪些信號等。當(dāng)DNA聚合酶結(jié)合至啟動子序列上并將編碼序列轉(zhuǎn)錄成能被翻譯成所編碼的蛋白的mRNA時，可通過操作將編碼序列連接到或置于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的調(diào)控下。調(diào)控序列不需與編碼序列連續(xù)，只要它們具有指導(dǎo)其表達(dá)的功能即可。因此，例如，在啟動子序列和編碼序列之間能出現(xiàn)插入的非翻譯或轉(zhuǎn)錄序列，且仍可認(rèn)為這種啟動子序列"通過操作連接"到編碼序列上。這樣的插入序列包括但不限于不被轉(zhuǎn)錄或不與聚合酶結(jié)合的增強(qiáng)子序列。如本文所使用，術(shù)語"表達(dá)"是指將核酸序列轉(zhuǎn)錄成RNA核酸分子，所述RNA核酸分子至少與一條基因編碼序列的兩條核酸鏈之中的一條鏈中的區(qū)域部分互補(bǔ)，和/或從RNA核酸分子翻譯成蛋白或多肽。這樣的表達(dá)盒進(jìn)一步包含調(diào)控元件，或調(diào)節(jié)性序列，其是所述表達(dá)盒上那些除啟動子外的非翻譯區(qū)(例如增強(qiáng)子、5'和3'非翻譯區(qū))，其與宿主細(xì)胞蛋白相互作用以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。如本文所用，術(shù)語"調(diào)控元件"和"調(diào)節(jié)性序列"包括啟動子、增強(qiáng)子和其它可調(diào)控基因表達(dá)的元件?？蓞⒖紭?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)手冊如Sambrooketal.eds"MolecularCloning:—ALaboratoryManual"3rded.,ColdSpringHarborPress(2001)來設(shè)計合適的表達(dá)載體，這些表達(dá)載體可進(jìn)一步;包括復(fù)制起始子和選擇性基因標(biāo)記。這些元件其強(qiáng)度和特異性不同。取決于載體系統(tǒng)，'能'使用任何數(shù)目的包括組成性和誘導(dǎo)性啟動子的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。然而，應(yīng)認(rèn)識到，合適的表達(dá)載體的選擇和其中功能元件的組合取決于多種因素，這些因素包括例如要奉達(dá)的蛋白的類型。表達(dá)載體的代表性例子包括，例如，細(xì)菌質(zhì)粒載體，其包括表達(dá)和克隆載體，如但是不限于pBR322，動物病毒載體如但是不限于，修飾的禽類腺病毒、麻疹病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、痘病毒(poxvirus)、逆轉(zhuǎn)錄病毒等和來源于細(xì)菌噬菌體核酸的載體，例如，質(zhì)粒和粘粒、人工染色體，如但是不限于，酵母人工染色體(YAC)和細(xì)菌人工染色體(BAC)，和合成的寡核苷酸像化學(xué)合成的DNA或RNA。因此，如本文所用，術(shù)語"核酸載體"或"載體".畢指天然或合成的單鏈或雙鏈的質(zhì)粒或病毒核酸分子，或能轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞并能獨立于或在宿主細(xì)胞染色體內(nèi)復(fù)制的任何其它核酸分子。能通過用限制性內(nèi)切酶剪切載體并連接剪切片段到一塊而將核酸插入載體內(nèi)。核酸分子能是RNA或DNA。優(yōu)選地，核酸分子是DNA。某些載體能在其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制，例如，具有細(xì)菌復(fù)制起始子的細(xì)菌載體和附加型(episomal)哺乳動物載體。其它載體，如非附加型哺乳動物載體，在將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中后整合入宿主細(xì)胞基因組中，并因此與宿主基因組一同復(fù)制。將用于蛋白表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)盒設(shè)計成含有至少一種編碼目的重組蛋白的DNA序列，所述DNA序列可通過操作連接到啟動子序列上，并可選地連接到調(diào)控元件或調(diào)節(jié)性序列上。調(diào)控元件或調(diào)節(jié)性序列對于基因表達(dá)的正確轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)是必要的和需要的。這些序列優(yōu)選選自轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、復(fù)制起始位點、多腺苷酸化序列、肽信號或染色質(zhì)隔離元件。調(diào)節(jié)性序列見例如在Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)所述。為了優(yōu)化基因表達(dá)，增強(qiáng)子序列可位于啟動子區(qū)域序列的上游或下游。"增強(qiáng)子"是核酸序列，其具有與該基因是何基因、該序列相對于基因的位置或該序列的方佝無關(guān)的增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄的活性。本發(fā)明所述的載體可選地包括增強(qiáng)子。增強(qiáng)子的例子是CMV即早期(immediate,early)增強(qiáng)子和SV40早期增強(qiáng)子。為優(yōu)化基因表達(dá)，可將內(nèi)含子序列置于編碼目的重組蛋白的序列的上游或下游。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式，內(nèi)含子序列位于啟動子序列和編碼目的重組蛋白的序列之間。本發(fā)明所述的內(nèi)含子序列優(yōu)選選自嵌合內(nèi)含子，所述嵌合內(nèi)含子包含來自人類P-球蛋白基因的第一內(nèi)含子的5'-供體位點和分支和來自免疫球蛋白基因的重量可變區(qū)的內(nèi)含子的3'-受體位點。本發(fā)明所述的啟動子序列優(yōu)選選自哺乳動物或禽類起源的基因或選自哺乳動物或禽類病毒的基因。在優(yōu)選的具體實施方式中，啟動子序列來自病毒起源并且選自人類或鼠類巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子、禽類肉瘤病毒(ASV)xLN啟動子，早期和晚期啟動子來自猴病—40(SV40)(Fiersetal.(1973)Nature273:113)、魯斯氏肉瘤病毒(RousSarcomaVirus，RSV)啟動子、單純皰疹病毒(HSV)胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動子、呼吸道合胞病毒啟動子、MDOT啟動子、多瘤病毒啟動子、腺病毒2啟動子、牛乳頭瘤病毒啟動子、腺病毒主要晚期啟動子或這些啟動子中每一種啟動子的功能性部分。根據(jù)另一具體實施方式，啟動子序列選自小鼠磷酸甘油酸激酶啟動子、鼠白血病病毒(MLV)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、EiF4a啟動子、嵌合EFla/HTLV啟動子、嵌合CAG啟動子(由結(jié)合人類CMV即早期增強(qiáng)子和修飾的雞p-肌動蛋白啟動子和第一內(nèi)含子而成的復(fù)合啟動子)或禽類基因啟動子或這些啟動子中每一種啟動子的功能性部分。在禽類基因啟動子中，啟動子優(yōu)選選自雞啟動子，如(3-肌動蛋白啟動子、輸卵管特異性啟動子、卵類粘蛋白啟動子、卵清蛋白啟動子、伴清蛋白啟動子、卵粘蛋白啟動子、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動子、溶菌酶啟動子、ENS1基因啟動子或這些啟動子中每一種啟動子的功能性部分。根據(jù)另一具體實施方式；啟動子可選自調(diào)節(jié)啟動子，如可被特定化合物或分子誘導(dǎo)的啟動子，例如小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(GRE)可被糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)(Chandleretal.(1983)Cell33:489-499)。而且，如果必要或需要，能用組織特異性啟動子或調(diào)節(jié)性元件(Swiftet'al.(1984)Cell,38:639-646)。能用在本發(fā)明中的其它啟動子的非限制性例子包括但不限于PolIII啟動子(例如1型、2型禾B3型Po1III啟動子)，如HI啟動子、U6啟動子、tRNA啟動子、RNA酶MPR啟動子或這些啟動子中每一種啟動子的功能性部分。通常，在本發(fā)明中根據(jù)所使用的啟動子選擇使用功能性終止子序列。本發(fā)明所述的表達(dá)載體可進(jìn)一步包含至少一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含至少一條編碼選擇性標(biāo)記的核酸序列，優(yōu)選DNA序列，所述序列可通過操作連接至能影響所述選擇性標(biāo)記在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動子序列上。這樣的選擇性標(biāo)記可賦予含有這種載體的EBx⑧細(xì)胞以抗性使可在合適的選擇培養(yǎng)基中選擇這些細(xì)胞。對于本發(fā)明所述的方法，穩(wěn)定表逸通常優(yōu)選瞬時表達(dá)，因為其通常達(dá)到更多可復(fù)制的結(jié)果并且更能達(dá)到大規(guī)模的生產(chǎn)。因此，本發(fā)明所述的表達(dá)載體是穩(wěn)定地?fù)饺胫罞Bx⑧細(xì)胞的染色體DNA中。在將外源性基因?qū)胫?，工程化的?xì)胞可得以在豐富培養(yǎng)基中生長l-2天，并且然后將其轉(zhuǎn)換成選擇培養(yǎng)基。重組載體中的選擇性標(biāo)記產(chǎn)生對選擇的抗性并使在其染色體組穩(wěn)定整合了載體并長成集落的細(xì)胞得以被選擇出來，其依次被克隆和擴(kuò)增形成細(xì)胞系。在優(yōu)選具體實施方式中，將抗代謝劑抗性用作下述非限制性標(biāo)記基因的范例的選擇基礎(chǔ)DHFR，其賦予氨甲喋呤抗性(Wigleretal.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:357和O'Hareetal.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1527);GPT，其賦予霉酚酸抗性(MulliganandBerg(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072);新霉素(NEO)，其賦予氨基-糖苷G418抗性(WuandWu(1991)Biotherapy,3:87-95;Tolstoshev(1993)Ann.Rev.Ph羅acol.Toxicol.,32:573-596;Mulligan(1993)Science,260:926-932;Anderson(1993)Ann.Rev.Biochem.,62:191-21);和潮霉素B，其賦予潮霉素(Santerreetal.(1984)Gene,30:147)和嘌呤霉素(puromycine)抗性。在一個最優(yōu)選具體實施方式中；抗生素抗性基因用作選擇的基礎(chǔ)。根據(jù)優(yōu)選具體實施方式，本發(fā)明所述的選擇性標(biāo)記是新霉素抗性基因優(yōu)選地，編碼NEO的核酸序列是TN5的新霉素/卡那霉素抗性基因。根據(jù)另一優(yōu)選具體實施方式，本發(fā)明所述的選擇性標(biāo)記是卡那霉素抗性基因。根據(jù)另一優(yōu)選具體實施方式，本發(fā)明所述的選擇性標(biāo)記是嘌呤霉素抗性基因?？蛇x地，這樣的選擇系統(tǒng)需要，本發(fā)明所述的EBx⑧細(xì)胞以前已經(jīng)遺傳修飾以表現(xiàn)出合適的基因型(即TK-、HGPRT-、ART-、DHFR-、GPT-等)。能使用許多選擇系統(tǒng)，包括但是不限于單純皰疹病毒胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(HSVTK)，(Wigleretal.(1977)Cell11:223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)(Szybalska&Szybalski(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:202)和腺嘌呤磷酸-核糖基轉(zhuǎn)移酶(adeninephosp^or-ribosyltransferase)基因(Lowyetal.1980Cell22:817)基因，這些系統(tǒng)能分別用于tk-,hgprt-，或art-細(xì)胞(APRT)。本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)的方法能常規(guī)地應(yīng)用于選擇所需重組細(xì)胞克隆，并且這樣的方法見例如Ausubel等人(1993)和Kriegle(1990,GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY;在第12禾卩13章中)所述。此外，表達(dá)的蛋白分子的表達(dá)水平能通過載體擴(kuò)增增加(綜述見Bebbingt0n&Hentschel,"TheuseofvectorsbasedongeneamplificationfortheexpressionofclonedgenesinmammaliancellsinDNAcloning",Vol.3,AcademicPress,New-York1987)。當(dāng)表達(dá)蛋白的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記是可擴(kuò)增的，在宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中出現(xiàn)的抑制物水平的增加將增加標(biāo)記基因的拷貝數(shù)目。由于擴(kuò)增區(qū)與編碼蛋白的基因相關(guān)，該蛋白的產(chǎn)生將伴隨增加(Crouseetal.(1983),Mol.Cell.Biol.,3:257)。作為選擇性標(biāo)記的含有編碼谷氨酰胺合酶(GS)或二氫葉酸還原酶(DHFR)的核酸的載體能分別在藥物甲硫氨酸砜亞胺或氨甲喋呤存在條件下擴(kuò)增。谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)及其成分詳細(xì)見PCT公開WO87/04462、WO86/05807、WO89/01036、WO89/10404和WO91/06657。此外，根據(jù)本發(fā)明能使用的谷氨酰胺合酶表達(dá)載體可從供應(yīng)商那里購得，這些供應(yīng)商包括例如LonzaBiologies,Inc.(Portsmouth,NH)。含有編碼序列并表達(dá)生物活性基因產(chǎn)物《即目的蛋婦，，選擇性標(biāo)記…》的宿主細(xì)胞可通過至少4種一般性方法鑒定(a)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(b)"標(biāo)記"基因功能的存在或缺如；(c)如通過各個mRNA轉(zhuǎn)錄本在EBx⑧細(xì)胞中的表達(dá)所測定的來評價轉(zhuǎn)錄水平；和(d)通過測定免疫檢測或通過測定其生物活性檢測基因產(chǎn)物。在第一種方法中，能使用包含分別與各個編碼序列同源的核酸序列的探針或其部分或衍生物，通過DNA-DNA或DNA-RNA雜交檢測插入在表達(dá)載體上的目的蛋白的編碼序列的存在。在第二種方法中，重組表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)能在某些標(biāo)記基因功能存在或缺如的基礎(chǔ)上進(jìn)行鑒定和選擇(例如，胸腺嘧啶脫氧核苷激酶活性、抗生素抗性、氨甲喋呤抗性等)。本發(fā)明所述的一種或兩種載體可包含至少一個復(fù)制起始子，使載體構(gòu)建體得以在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。根裙l尤選具體實施方式，本發(fā)明所述的載體包含一個細(xì)菌復(fù)制起始子，如FlORI，使表達(dá)載體得以在細(xì)菌內(nèi)(例如E.coli))復(fù)制和SV40復(fù)制起始子，使表達(dá),體得以通過快速瞬時檢測檢測到。本發(fā)明所述的表達(dá)載體可進(jìn)一步包含染色質(zhì)隔離元件。本發(fā)明所述的染色質(zhì)隔離元件包括邊界元件(BE)、基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)、基因座調(diào)控區(qū)(LCR)和通用染色質(zhì)開放元伴(UCOE)。邊界元件("BE")或隔離元件，在許多例子中限定染色質(zhì)的邊界(Bell&Felsenfeld(l999)CurrOpinGenetDev9:191-198)并可在體內(nèi)發(fā)揮限定轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域的作用。BE缺乏內(nèi)在啟動子活性/增強(qiáng)子活性，但是仍被認(rèn)為可保護(hù)基因免于受周圍染色質(zhì)中調(diào)節(jié)性元件的轉(zhuǎn)錄影響。增強(qiáng)子阻斷檢測通常用于鑒定隔離元件。在該檢測中，染色質(zhì)元件置于增強(qiáng)子和啟動子之間，并且測定增強(qiáng)子激活的轉(zhuǎn)錄。在果蠅、酵母和在哺乳動物細(xì)胞中，邊界元件顯示能保護(hù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的報告基因免受位置影響(Waltersetal.(1999)Mol.Cell.Biol.19:3714-3726)。基質(zhì)結(jié)合區(qū)域("MAR";也稱作骨架結(jié)合區(qū)域或骨架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)域("S/MAR"))是在體外以高親和力結(jié)合隔離的核骨架或核基質(zhì)的DNA序列(HartandLaemmli(1998)Curr,Opi_n,GenetDev8:519-525)。因為如此，它們可限定獨立的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域的邊界，以致于只有那些包含順式調(diào).節(jié)性元件的能調(diào)控結(jié)構(gòu)域內(nèi)基因的表達(dá)。MAR元件能增強(qiáng)異源性基因在細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)(KalosandFournier(1995)Mo1.Cell.Biol.15:198-207))?；蜃{(diào)控區(qū)域("LCR")是被基因座的起始染色質(zhì)激活和隨后的在其天然位置的基因轉(zhuǎn)錄所需要的順式調(diào)節(jié)性元件(綜述見Grosveld1999,CurrOpinGenetDev9:152-157)。最廣泛的鑒定的LCR是那些球蛋白基因座的LCR。近期己經(jīng)報道通用染色質(zhì)開放元件("UCOE"，也稱作"通用活性染色質(zhì)開放元件")(見WO00/05393)。根據(jù)優(yōu)選具體實施方式，本發(fā)明所述的染色質(zhì)隔離元件是MAR元件。優(yōu)選地，MAR元件選自雞溶菌酶5'MAR元件(如WO02/074969所述)或人類MAR元件(如WO2005/040377所述)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，選擇合適的載體(例如質(zhì)粒)，正確轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的成分(啟動子、調(diào)控序列&調(diào)節(jié)性序列)和分離細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知并常規(guī)確定和操作。根據(jù)一個具體實施方式，以至少一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染本發(fā)明所述的EBx⑧細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體至少包含-第一表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序歹U:SEQIDN°1的CMV啟動子序列或其片段或變體、內(nèi)含子序列、編碼目的重組蛋白的DNA序列、多腺苷酸化序列；和-第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SV40啟動子、抗生素抗性基因(優(yōu)選新霉素抗性基因)、多腺苷酸化序列；-可選地，至少一個雞溶菌酶5'MAR元件(如WO02/074969所述)或人類MAR元件(如WO2005/040377所述)。根據(jù)第二具體實施方式，以至少一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染本發(fā)明所述的EBx⑧細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體至少包含隱第一表達(dá)盒，^包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN°2的EFla/HTLV啟動子序列或其片段或變體、內(nèi)含:子序列、編碼目的重組蛋白的DNA序列、多腺苷酸化序列；和''-第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SV40啟動子、抗生素抗性基因(優(yōu)選新霉素抗性基因)、多腺苷酸化序列；-可選地，至少一個雞溶菌酶5'MAR元件(如WO02/074969所述)或人類MAR元件(如WO2005/040377所述)。根據(jù)一個具體實施方式，以至少一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染本發(fā)明所述的EBx⑧細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體至少包含-第一表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN。3的RSV啟動子序列或其片段或變體、內(nèi)含子序列、編碼目的重組蛋白的DNA序列、多腺苷酸化序列；和-第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列；SV40啟動子、抗生素抗性基因(優(yōu)選親M素抗性基因)、多腺苷酸化序列；-可選地，至少一個雞溶菌酶5'MAR元件(如WO02/074969所述)或人類MAR元件(如WO2005/040377所述)。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式，內(nèi)含子序列是序列SEQIDN°4或其片段或變體，并且多腺苷酸化序列是序列SEQ-IDN。5或其片段或變體。當(dāng)本發(fā)明所述的重組目的蛋白是多聚體蛋白，所述的蛋白的不同鏈?zhǔn)窃谝粋€表達(dá)載體上編碼或在不同的表達(dá)載體上編碼。在后一種情形下，不同的表達(dá)載體同時或相繼共轉(zhuǎn)染入EBx⑧細(xì)胞。"共轉(zhuǎn)染"是指以一種以上的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染EBx細(xì)胞的方法。當(dāng)以能表達(dá)抗體的輕鏈的表達(dá)載體和能表達(dá)抗體的重鏈的載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，載體優(yōu)選包含獨立的選擇性標(biāo)記。當(dāng)一種表達(dá)載體能表達(dá)抗體的輕鏈和抗體的重鏈時，載體優(yōu)選含有至少一種選擇性標(biāo)記。令人吃驚的是，發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，抗體在EBx⑧細(xì)胞中的表達(dá)水平當(dāng)轉(zhuǎn)染一種編碼抗體的重鏈和輕鏈的表達(dá)載體時較共轉(zhuǎn)染兩種表達(dá)載體時較高，這兩種表達(dá)載體中每一種編碼一條抗體錄。而且，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)染一種載體時，當(dāng)該表達(dá)載體以下列順序組成時，抗體在EBx⑧細(xì)胞中的表達(dá)水平較高第一表達(dá)盒，其編碼抗體的重鏈和第二表達(dá)盒，其編碼抗體的輕鏈，每種表達(dá)盒具有相同的啟動子。實際上，只要抗體分子中輕鏈和重鏈等摩爾比例地連接在一起，那么即可希望EBx⑧細(xì)胞平衡表達(dá)抗體的輕鏈和重鏈。表達(dá)載體使得抗體以具有功能的形式獲得并以很好的產(chǎn)量分泌。因此，該方法可獲得足量的具有功能的抗體用于病理性疾病的免疫治療。本發(fā)明所述的細(xì)胞系能產(chǎn)生所有種類的通常包含等摩爾比例的輕鏈和重鏈的抗體。因此，本發(fā)明包括人類抗體，其中重鏈和輕鏈的氨基酸序列與那些在體內(nèi)通過人類淋巴細(xì)胞或體外通過雜交瘤產(chǎn)生的抗體的序列同源。本發(fā)明還包括改變了的抗體如雜交抗體，其中重鏈和輕鏈與天然抗體同源但是以一種天然不會出現(xiàn)的方式結(jié)合在一起。例如，.-，特異性抗體有對一種以上的抗原有特異性的抗原結(jié)合位點。抗體的恒定區(qū)可涉及一種或其它抗原結(jié)合區(qū)或可來自另一個抗體。改變了的抗體，如嵌合抗體，有來自一種抗體的可變區(qū)和來自另一種抗體的恒定區(qū)。因此，嵌合抗體可是物種/物種(species/species)嵌合體或類別/類別(class/class)嵌合體。這樣的嵌合體抗體可有一種或一種以上的進(jìn)一步修飾以改進(jìn)抗原結(jié)合能力或改變效應(yīng)物功能。改變了的抗體的另一種形式是人源化或移植CDR的抗體，其包括復(fù)合抗體，其中除CDR外還將部分高度可變區(qū)轉(zhuǎn)移至人類抗體的框架上?？筛淖冞@種抗體的框架或恒定區(qū)中的其他的氨基酸。改變了的抗體的限定還包括Fab片段，其大略等同于重鏈和輕鏈的Y分支部分；這些可包括包含部分Fc區(qū)的不完整片段或片段。因此，在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括任何改變了的抗體，其中氨基酸序列不是天然存在的氨基酸。優(yōu)選地，目的蛋白是單克隆抗體，優(yōu)選是人類單克隆抗體或改變了的抗體，并且以至少一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染本發(fā)明所述的EBx⑧細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體至少包含以下列順序-第一表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列啟動子序列、內(nèi)含子序列、編碼抗體的輕鏈或其片段的DNA序列(優(yōu)選cDNA序列)、多腺苷酸化序列；-第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列啟動子序列、內(nèi)含子序列、編碼抗體的重鏈或其片段的DNA序列(優(yōu)選cDNA序列)、多腺苷酸化序列；-第三表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列病毒啟動子、抗生素抗性基因、多腺苷酸化序列；-可選地，至少一個雞溶菌酶5'MAR元件(如WO02/074969所述)或人類MAR元件(如WO2005/040377所述)。然而，本發(fā)明的目標(biāo)還提供轉(zhuǎn)染了至少一種表達(dá)載體的EBx⑧細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包含以下列順序-第一表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列啟動子序列、內(nèi)含子序列、編碼抗體的輕鏈或其片段的DNA序列(優(yōu)選cDNA序列)、多腺苷酸化序列；-第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列啟動子序列、內(nèi)含子序列、編碼抗體的重鏈或其片段的DNA序列(優(yōu)選cDNA序列)，、多腺苷酸化序列；-第三表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列病毒啟動子、抗生素抗性基因、多腺苷酸化序列；-可選地，至少一個雞溶菌酶5'MAR元件(如WO02/074969所述)或人類MAR元件(如WO2005/040377所述)。根據(jù)另一優(yōu)選具體實施方式，本發(fā)明所述的EBx⑧細(xì)胞轉(zhuǎn)染了至少一種表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體包含以下列順序-第一表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN。1的CMV啟動子或其片段或變f本、內(nèi)含子序列、編碼抗體的重鏈或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；-第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列:'SEQIDN。1的CMV啟動子或其片段或變體、內(nèi)含子序列、編碼抗體的輕鏈或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；-第三表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SV40啟動子、新霉素抗性基因、多腺苷酸化序列；-可選地，至少一個雞溶菌酶5'MAR元件(如WO02/074969所述)或人類MAR元件(如WO2005/040377所述)。根據(jù)另一優(yōu)選具體實施方式，本發(fā)明所述的EBx⑧細(xì)胞轉(zhuǎn)染了至少一種表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體包含以下列順序--第一表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN。2的嵌合EFla/HTLV啟動子或其片段或變體、內(nèi)含子序列、編碼抗體的重鏈或其片段的cDNA序列、多^苷酸化序列；-第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN°2的嵌合EFla/HTLV啟動子或其片段或變體、內(nèi)含子序列、編碼抗體的輕鏈或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；-第三表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SV40啟動子、新霉素抗性基因、多腺苷酸化序列；-可選地，至少一個雞溶菌酶5'MAR元件(如WO02/074969所述)或人類MAR元件(如WO2005/040377所述)。根據(jù)另一優(yōu)選具體實施方式，本發(fā)明所述的EBx⑧細(xì)胞轉(zhuǎn)染了至少一種表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體包含以下列順序-第一表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN°3的RSV啟動子或其片段或變體、內(nèi)含子序列、編碼抗體的重鏈或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；-第二表達(dá)盒，其.包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN°3的RSV啟動子或其片段或變體、內(nèi)含子序列、編碼抗體的輕鏈或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；'-第三表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SV40啟動子、新霉素抗性基因、多腺苷酸化序列；-可選地，至少一個雞溶菌酶5'MAR元件(如WO02/074969所述)或人類MAR元件(如WO2005/040377所述)。輕鏈和重鏈基因可構(gòu)成基因組DNA，或優(yōu)選地cDNA,并可用本領(lǐng)域已知的方f去進(jìn)《亍克隆(MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,Maniatisetal,ColdSpringHarbor)。根據(jù)另一具體實施方式，本發(fā)明所述的EBx㊣細(xì)胞進(jìn)一步包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含至少一種表達(dá)^食，所述表達(dá)盒包含編碼抗細(xì)胞凋亡蛋白的核酸序列，優(yōu)選DNA序列，所述序列可il過操作連接至能影響所述的抗細(xì)胞凋亡蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動子序列上?？辜?xì)胞凋亡蛋白選自哺乳動物、禽類、兩棲動物和魚類Bcl2家族蛋白。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式，抗細(xì)胞凋亡蛋白是命名為NR13的禽類Bcl2家族成員(Leeetal.1999Genes&Dev.13:718-728;Lalleetal.2002,Biochem.L368:213-221)。編碼抗細(xì)寧凋亡的NR13蛋白的表達(dá)載體的例子至少包含-第一表達(dá)盒，^包含下列順序的下列DNA序列CMV、RSV或嵌合EFla/HTLV啟動子序列、內(nèi)含子序列、編碼抗細(xì)胞凋亡的NR13蛋白的cDNA序列、多腺苷酸化序列；和-第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SV40啟動子、新霉素抗性基因、多腺苷酸化序列；-可選地，第三表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SV40啟動子、新霉素抗性基因、多腺苷酸化序列；-可選地，至少一個雞溶菌酶5'MAR元件(如WO02/074969所述)或人類MAR元件(如WO2005/040377所述)。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式，NR13序列是SEQIDN°6或其片段或其變體。本發(fā)明進(jìn)一步提供在禽類EBx⑧細(xì)胞產(chǎn)生至少一種目的生物活性產(chǎn)物的方法，所述的方法包含下列步驟a)通過轉(zhuǎn)染至少一種表達(dá)載體來生產(chǎn)本發(fā)明所述的EBx⑧細(xì)胞；轉(zhuǎn)染用貼壁或懸浮EBx⑧細(xì)血進(jìn)行；b)在合適的條件和細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)染了的EBx⑧細(xì)胞；和c)從所述的轉(zhuǎn)染了的EBx⑧細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基或既從所述的EBx⑧細(xì)胞也從所述的培養(yǎng)基中收獲目的生物產(chǎn)物。本文所述的表達(dá)載體能通過各種方法導(dǎo)入EBx⑧細(xì)胞。特別地，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法可被進(jìn)行，如磷酸鈣沉淀、DEAE-Dextran介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔法、核轉(zhuǎn)染法(AMAXAGmbh,GE)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(例如用lipofectin或lipofectamine⑧技術(shù))或微注射法。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式，在步驟a)中，EBx細(xì)胞，優(yōu)選雞或鴨EBx⑧細(xì)胞以至少一種表達(dá)載體在無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中的貼壁培養(yǎng)物中通過電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，更優(yōu)選的是通過核轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，核轉(zhuǎn)染法是由AMAXAGmbh(DE)開g的優(yōu)化的電穿孔技術(shù)。根據(jù)優(yōu)選的具體實施方式，在步驟a)中，EBx⑧細(xì)胞，優(yōu)ii雞或鴨EBx⑧細(xì)胞以至少一種表達(dá)載體在無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)物中通過電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，更優(yōu)選的是通過核轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)另一優(yōu)選的具體實施方式，在步驟a)中，EBx⑧細(xì)胞、優(yōu)選雞或鴨EBx⑧細(xì)胞以至少一種表達(dá)載體在無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中的貼壁或懸浮培養(yǎng)物中使用像Lipofectamin⑧的化合物等通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。如本文所用，術(shù)語"目的蛋白"是指通過肽鍵連接在一起的氨基酸多聚體。術(shù)語"目的蛋白"包括蛋白、蛋白片段、蛋白類似物、多肽、寡肽、肽等。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"目的生物產(chǎn)物"是指單體的"目的蛋白"或至少2種單體目的蛋白的復(fù)合物以構(gòu)成多聚體蛋白。多聚體目的蛋白的例子是由4個單體目的蛋白(即兩條重鏈和兩條輕鏈)組成的抗體。并非EBx⑧細(xì)胞基因組的天然部分的"蛋白"或"生物產(chǎn)物"被稱作"異源蛋白"或"異源生物蛋白"。本發(fā)明提供具有禽類EBx⑧糖基化的目的生物產(chǎn)物。更特別地，本發(fā)明提供具有雞EBx⑧糖基化的抗體，更優(yōu)選的是EB14或EBvl3糖基化，或具有鴨EBx⑧糖基化，更優(yōu)選的是EB24糖基化、EB24-12糖基化、EB26糖基化、EB66糖基化。能根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染了的EBx⑧細(xì)胞。為了理解而不是限制的目的，熟練的從業(yè)者應(yīng)理解，蛋白先產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)流程能包括三種通常的類型；即連續(xù)培養(yǎng)、分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)(fed-batchculture)。例如，連續(xù)培養(yǎng)時，在培養(yǎng)時期內(nèi)將新鮮培養(yǎng)基添加物(即補(bǔ)料培養(yǎng)基(feedingmedium))提供給細(xì)胞，同時每日去除舊培養(yǎng)基并且收獲產(chǎn)物，例如每日或連續(xù)地。在連續(xù)培養(yǎng)時，"補(bǔ)料培養(yǎng)基能每日加入或連續(xù)加入，即如滴入或注入。對于連續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞能保持在培養(yǎng)物中，只要是所需的，只要細(xì)胞保持存活且環(huán)境和培養(yǎng)條件保持不變。在分批培養(yǎng)中，在培養(yǎng)流程結(jié)束期間或在結(jié)束之前，細(xì)胞起始培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，并且該培養(yǎng)基既不去除、置換也不添加，即細(xì)胞不補(bǔ)充新的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)流程結(jié)束時收獲所需產(chǎn)物。對于補(bǔ)料-分批培養(yǎng)，培養(yǎng)流程時間通過在該流程內(nèi)向培養(yǎng)基中每日一或多次(或連續(xù))添加新鮮培養(yǎng)基而增加，即在細(xì)胞,養(yǎng)期間給細(xì)胞"界以'"新的培養(yǎng)基(",料培養(yǎng)基"h補(bǔ)料-分批培養(yǎng)能包括如上所述的各，中補(bǔ)料方法和次數(shù)，例如每日，，每ri—日，每兩日等，每曰一次以上或每日不到一次，等等。而且，補(bǔ)料-分批培養(yǎng)能以補(bǔ)料培養(yǎng)基連續(xù)補(bǔ)給。然后于培養(yǎng)/生產(chǎn)流程結(jié)束時收獲所需產(chǎn)物。本發(fā)明優(yōu)選包含補(bǔ)料-分批細(xì)胞培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞培養(yǎng)能進(jìn)行，并且蛋白優(yōu)選糖蛋白能在大規(guī)模和小規(guī)模蛋白生產(chǎn)條件下，使用動物或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)使用的培養(yǎng)容器和/或培養(yǎng)裝置通過細(xì)胞生產(chǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，組織培養(yǎng)皿、T型培養(yǎng)瓶和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶通常用于實驗室規(guī)模。對于大規(guī)模培養(yǎng)而言(例如3L、7L、20L、100L、500L、5000L等)，能使用包括但是不限于流化床生物反應(yīng)器、空心纖維生物反應(yīng)器、滾瓶培養(yǎng)或攪拌釜式生物反應(yīng)器系統(tǒng)的方法。微載體可用于或不用于滾瓶或攪拌釜式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。系統(tǒng)能在分批、連續(xù)或補(bǔ)料-分批模式中操作。此外，培養(yǎng)裝置或系統(tǒng)可與或不與使用濾器、重力、離心力等的細(xì)胞分離器裝配在一起。在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)過程或方法中，細(xì)胞能在各種細(xì)胞培養(yǎng)基，即本領(lǐng)域通常已知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中維持-(maintain)。例如，方法適合用于維持在細(xì)胞培養(yǎng)基中的大體積細(xì)胞，其能添加營養(yǎng)物等。通常，"細(xì)胞培養(yǎng)基"(也稱作"培養(yǎng)基")是本領(lǐng)域的從業(yè)者理解的術(shù)語，并且知道是指細(xì)胞，優(yōu)選動物或哺乳動物細(xì)胞在其中生長的營養(yǎng)液，并且其通常提供至少一種或多種下列成分能量來源(通常為碳水化合物的形式，如葡萄糖)，所有的必需氨基酸，并且一般是指20種基礎(chǔ)氨基酸，以及半胱氨酸；通常需要低濃度的維生素和/或其他有機(jī)化合物；脂類或游離脂肪酸，例如，亞油酸；和微量元素，例如無機(jī)化合物或天然存在的元素，其通常需要非常低的通常在微摩爾范圍內(nèi)的濃度。還能往細(xì)胞培養(yǎng)基中添加使其含有各種可選成分，如激素和其他生長因子，例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、血清等等；鹽，例如鈣、鎂和磷，和緩沖液，例如HEPES;核苷和堿基，例如腺苷、胸腺嘧啶、次黃嘌呤；和蛋白及組織水解物，例如，水解動f，蛋白(蛋白胨或蛋白胨混合物，其能從動物副產(chǎn)品、純化明膠或植物材料獲得);，抗生素，例如慶大霉素；和細(xì)胞保護(hù)劑，例如聚醚多元醇(聚醚F68)。優(yōu)選是細(xì)胞營養(yǎng)培養(yǎng)基，其是無血清和無動物源性產(chǎn)物或成分。本發(fā)明所述的EBx⑧細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)了在無血清條件下培養(yǎng)。能使用商業(yè)上可得到的培養(yǎng)基，且包括例如Ham'sF12培養(yǎng)基(Sigma,St.Louis,MO)、Dulbecco，s改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)、optipro培養(yǎng)基(Invitrogen,Carlsbad,CA)或Excell培養(yǎng)基(SAFC,Lenexa,KS)。往上述示例性培養(yǎng)基中能加入上述添加性組分或成分，這些組分或成分包括可選的成分，以合適的濃度或量，在必要或需要時加入，并且正如那些具有本領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)的人員所知和操作的那樣。此外，適合于本發(fā)明所述的方法的細(xì)胞培養(yǎng)條件是那些對于細(xì)胞的分批、補(bǔ)料-分批或連續(xù)培養(yǎng)是通常使用的和已知的方法，注意pH，例如大約6.5至大約7.5;溶解氧(02)，例如在大約是空氣飽和度的5-90%和二氧化碳(C02)，攪動和濕度，除溫度以外。一旦收獲，目的生物產(chǎn)物通常是濃縮的。一旦以濃縮形式獲得，任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如制備型圓盤凝膠電泳；離子交換層析、凝膠過濾、大小分離層析、等電聚焦等等可用于純化、分離和/或鑒定異源蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地設(shè)計出異源蛋白純化的親和層析的方法，尤其是對于那些例子而言，其中異源蛋白的結(jié)合配偶體(partner)是已知的，例如抗體。單克隆抗體的分離是簡單的，并且其安全性由于培養(yǎng)液中不含另外的人或動物蛋白而得到增強(qiáng)。不含血清進(jìn)一步增強(qiáng)系統(tǒng)的可靠性，由于使用合成培養(yǎng)基，正如本文所關(guān)注的，增強(qiáng)了重現(xiàn)性。能優(yōu)選通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的目的蛋白的例子包括但是不限于細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、生長因子(即EGF、HER-2、FGF-a、FGF-p、TGF-a、TGF-P、PDGF、IGF-1、IGF-2、NGF)、生長因子受體，包括它們的蛋白片段。其它非限制性范例包括生長激素(例如人生長激素、牛生長激素)；胰島素(例如胰島素A鏈和胰島素B鏈)、前胰島素、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、集落刺激因子(例如G-CSF、GM-CSF、M隱CSF);白細(xì)胞介素(仿i[多口IL-1至IL-12);血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)及其受體(VEGF-R)、干擾素(例如IFN-a，卩，Y)、腫瘤壞死因子(TNF)及其受體(TNFR-1和TNFR-2)、血小板生成素(TPO)、凝血酶、腦利鈉肽(BNP);凝血因子(例如因子VIII、因子IX、vonWillebrand因子等)、抗凝血因子；組織型纖溶酶原激活物(TPA)、尿激酶、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、降,丐素、CD蛋白(例如，CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CDlla、CDllb、CD18、CD19、CD20、CD25、CD33、CD44、CD45、CD71等等)、CTLA蛋白(例如CTLA4);T細(xì)胞和B細(xì)胞受體蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BNP，例如BMP-l、BMP-2、BMP-3等)、神經(jīng)營養(yǎng)因子，例如骨源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、例如凝乳酶、類風(fēng)濕因子、RANTES、白蛋白、松弛素、巨噬細(xì)胞抑制蛋白(如MIP-1、MIP-2)、病毒蛋白或抗原、表面膜蛋白、離子通道蛋白、酶、調(diào)節(jié)性蛋白、抗體、免疫調(diào)制蛋白(如HLA、MHC、B7家族)、歸巢受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、G蛋白偶聯(lián)受體蛋白(GPCR)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、阿爾茨海默病相關(guān)蛋白和肽(如A-p)和其它本領(lǐng)域已知的蛋白。融合蛋白和多肽，嵌合蛋白質(zhì)和多肽，以及上述任何蛋白質(zhì)和多肽的片段或部分，或突變體，變體，或類似物也包括在能通過本發(fā)明所述的方法生產(chǎn)的適當(dāng).的蛋白質(zhì)、多肽和肽中。'在優(yōu)選的具體實施方式中，目的蛋白是糖蛋白，并優(yōu)選病毒蛋白?？赡芨鶕?jù)本發(fā)明所述的方法生產(chǎn)的病毒蛋白的例子包括但不限于來自腸病毒，如鼻病毒，口瘡病毒(aphtovirus)，或脊髓灰質(zhì)炎病毒，皰疹病毒，如單純皰疹病毒，偽狂犬病病毒或牛皰疹病毒，正粘病毒如流感病毒，副粘病毒，如新城疫病毒，呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒或麻疹病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒如人類免疫缺陷病毒或細(xì)小病毒組或乳頭瘤病毒，輪狀病毒或冠狀病毒，如病毒或麻疹病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，如傳染性人胃腸炎病毒或黃病毒屬，如蜱傳播的森林腦炎病毒或黃熱病病毒，披膜病毒，如風(fēng)疹病毒或東部-，西部-，或委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒，致肝炎病毒，如肝炎A或肝炎B肝炎病毒，鼠疫病毒，如豬瘟病毒或桿狀病毒，如狂犬病毒。根據(jù)另一具體實施方式，目的蛋白質(zhì)是一種細(xì)菌蛋白質(zhì)。在另一優(yōu)選的具體實施方式，目的生物產(chǎn)物是抗體。如本文中所使用，術(shù)語"抗體"是指多克隆和單克隆抗體及其片段，及其免疫結(jié)合等效物。術(shù)語"抗體"是指同質(zhì)分子實體，或混合物，如由多個不同的分子實體構(gòu)成的多克隆血清產(chǎn)物，并廣泛地包括天然出現(xiàn)的抗體的形式(例如IgD、IgG、IgA、IgM、IgE)和重組抗體如單鏈抗體、嵌合或人源化抗體和多特異性抗體。術(shù)語"抗體"，也指所有上述抗體的片段和衍生物，并可進(jìn)一步包含其保留了特異結(jié)合抗原表位的能力的任何修飾或衍生的變體?？贵w衍生物可包含蛋白質(zhì)或偶聯(lián)到抗體的化學(xué)基團(tuán)。單克隆抗體能夠選擇性地結(jié)合到目標(biāo)抗原或表位?？贵w可包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、人源化或嵌合抗體、camelized抗體、單鏈抗體(scFv)、Fab片段、F(ab')2片段、二硫鍵連接Fv(sdFv)片段、抗個體遺傳型(抗-Id)抗體、內(nèi)抗體、合成抗體和上述任一的表位結(jié)合片段。術(shù)語"抗體"，也指融合蛋白，其包括與免疫球蛋白Fc區(qū)等效的區(qū)域。在本發(fā)明的范圍內(nèi)優(yōu)選的抗體包括包含下列氨基酸序列的下列抗體抗-HER2抗體，其包括包含huMAb4D5-8的重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗體('Carteretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289(1992)，美國專利No.5,725,856)或曲妥單抗如HERCEPTINTM;抗-CD20抗體如嵌合的抗-CD20"C2B8"(見美國專利No.5,736,137(RITUXAN)),2H7抗體的嵌合或人源化的變體(見美國專利No.5,721,108)或托西莫單抗(BEXXAR);抗IL-8抗體(StJohnetal.,Chest,103:932(1993)和國際公開號No.WO95/23865);抗-VEGF抗體，其包括人源化和/或親和性熟化的抗-VEGF抗體，如人源化的抗-VEGF抗體huA4.6.1AVASTIN(Kimetal.,GrowthFactor,7:53-64(1992)，國際公開號No.WO96/30046和WO98/45331);抗-PSCA抗體(WO01/40309);抗CD40抗體，其包括S2C6及其人源化變體(WO00/75348);抗CD1la(美國專利No.5,622,700，WO98/23761);抗EGFR(嵌合的或人源化225抗體，見WO96/40210);抗CD3抗體如OKT3(美國專利No.4,515,893);抗CD25或抗tac抗體如CHI-621(SIMULECT)和(ZENAPAX)(見美國專利No.5,693,762);抗CD4抗體如cM-7412抗體(Choyetal.ArthritisRheum39(1):52-56(1996));抗CD52抗體如CAMPATH-1H(Riechmannetal"Nature332:323-337(1988);抗癌胚抗原(CEA)抗體如hMN-14(Sharkeyetal.，CancerRes.55(23Suppl):5935s-5945s(1995);抗EpCAM抗體如17-1A(PAN0REX);抗GpIIb/IIIa抗體如阿昔單抗或c7E3Fab(REOPRO);抗RSV抗體如MEDI-493(SYNAGIS);抗CMV抗體如PROTOVIR;抗肝炎抗體如抗HepB抗體OSTAVIR;抗人腎細(xì)胞癌抗體如ch-G250;抗人17-1A抗體(3622W94);抗人結(jié)腸直腸腫瘤抗體(A33);抗人黑色素瘤抗體R24，其定向抗GD3神經(jīng)節(jié)苷脂；抗人鱗狀上皮細(xì)胞癌(SF-25);和抗人白細(xì)胞抗原(HLA)抗體如SmartIDlO和抗HLADR抗體Oncolym(Lym-1)。本發(fā)明提供生產(chǎn)抗體的方法，該方法包含培養(yǎng)本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)染了的EBx⑧細(xì)胞。可在含血清的或優(yōu)選不含血清和蛋白的培養(yǎng)基中進(jìn)行EBx⑧細(xì)胞的培養(yǎng)。所得抗體可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序純化和配制。Mab的兩條鏈以實質(zhì)上等摩爾比例表達(dá)使獲得的具有功能的抗體有可能達(dá)到最佳的產(chǎn)量。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)染了的EBx⑧細(xì)胞，并且更特異的是雞EBx⑧和鴨EBx⑧細(xì)胞，能產(chǎn)生的免疫球蛋白是在分批培養(yǎng)中至少10pg/細(xì)胞/日，優(yōu)選在分批培養(yǎng)中至少15pg/細(xì)胞/日，更優(yōu)選在分批培養(yǎng)中至少25pg/細(xì)胞/日，更優(yōu)選在分批培養(yǎng)中至少35pg/細(xì)胞/日。2條鏈在細(xì)胞內(nèi)組裝并然后分泌至培養(yǎng)基中成為有功能的抗體。EBx⑧細(xì)胞產(chǎn)生的糖基化抗體保留了抗原結(jié)合能力和效應(yīng)物功能。令人感興趣的是，發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)證明，包括與通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的免疫球蛋白的Fc區(qū)等價的區(qū)域的抗體、抗體片段或融合蛋白增加Fc介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。例如，禽類EBx⑧細(xì)胞優(yōu)選雞EB14細(xì)胞生產(chǎn)的IgGl亞型抗體的ADCC活性較雜交瘤和CHO細(xì)胞產(chǎn)生的同一抗體增加。這通過提供以禽類EBx糖基化模式，更優(yōu)選雞EBx⑧糖基化模式或鴨EBx⑧糖基化模式產(chǎn)生的目的抗體而達(dá)到。特別地，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)染了的禽類EBx⑧細(xì)胞能表達(dá)大比例的帶有雙觸角類型常見的N-連'湊的寡糖結(jié)構(gòu)的抗體或其片段，其包含末端為GlcNac的長鏈，該長鏈?zhǔn)歉叨劝肴樘腔头菐r藻糖巖藻糖基化的并且其賦予抗體強(qiáng)的ADCC活性。在EBx⑧細(xì)胞中產(chǎn)生的重組抗體群中，非巖藻糖基化的抗體的比例是抗體的至少20%，更優(yōu)選至少35%，且更優(yōu)選至少45%或更高。所以，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)染了的EBx⑧細(xì)胞系(優(yōu)選鴨EB66細(xì)胞系)產(chǎn)生的重組多肽，其中重組多肽的特征是具有的非巖藻糖基4t的N-連接的寡糖結(jié)構(gòu)大約是20%，更優(yōu)選是大約35%，更優(yōu)選大約45%。更準(zhǔn)確地，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)染了的EBx⑧細(xì)胞系(優(yōu)選鴨EB66細(xì)胞系)產(chǎn)生的重組單克隆抗體，其中所述抗體的特征是其具有大約45%或更多的非巖藻糖基化的N-連接的寡糖結(jié)構(gòu)。所述抗體的特征是其具有大約35%或更多的非巖藻糖基化的N-連接的寡糖結(jié)構(gòu)G0，Gl和G2。本發(fā)明還涉及EBx⑧細(xì)胞，優(yōu)選鴨EB66細(xì)胞產(chǎn)生的抗體或抗體群，較雜交瘤或野生型CHO細(xì)胞系(優(yōu)選CH0-K1和CHO-DG44)產(chǎn)生的同一抗體其ADCC活性增加?？贵w優(yōu)選選自IgG，且更優(yōu)選選自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。更優(yōu)選抗體是IgGl或lgG3。因此，EBx⑧細(xì)胞蛋白生產(chǎn)平臺用于增加Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞的抗非所需的細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，其由免疫球蛋白或其片段介導(dǎo)或由任何帶有免疫球蛋白區(qū)域的Fc區(qū)或等價于免疫球蛋白區(qū)域的Fc區(qū)的生物分子介導(dǎo)。本發(fā)明提供EBx⑧細(xì)胞產(chǎn)生的并且具有EBx糖基化特征的抗體(或免疫球蛋白)群，其中所述抗體群或其片段構(gòu)成大的抗體比例，其中Fc區(qū)帶有雙觸角類型的常見的N-連接的巖藻糖基化的寡糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)構(gòu)成帶有末端GlcNac的長鏈，該長;鏈?zhǔn)前肴樘腔⑶沂强贵w的大比例，其中Fc區(qū)帶有雙觸角類型的常見的N-連^的寡糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)構(gòu)成半乳糖基化的帶有末端GlcNac的長鏈。所述抗體群的特征是其非巖藻糖基化的N-連接的寡糖結(jié)構(gòu)大約是45%，并且該結(jié)構(gòu)賦予所述抗體強(qiáng)的ADCC活性。這些抗體中大多數(shù)，也就是說，EBx細(xì)胞產(chǎn)生的抗體群中的這些抗體的60%以上，優(yōu)選75%以上，85%以上，并且更優(yōu)選95。/。以上在連接到Fc區(qū)的雙觸角類型的N-連接的寡糖結(jié)構(gòu)上不含唾液酸殘基。大比例的唾液酸殘基是N-乙酰-神經(jīng)氨酸(NeuAC);實際上，80%以上，優(yōu)選90%以上，并且優(yōu)選95%以上的唾液酸殘基是已知在人類是非免疫源性的NeuAc。唾液酸殘基的剩余的小比例由N-羥乙?；窠?jīng)氨酸(NeuGc)構(gòu)成。如本文中所使用，術(shù)語jc介導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性包括抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性和由含有人類Fc區(qū)的可溶性Fc-融合蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性。這是導(dǎo)致"抗體靶向細(xì)胞"被"人類免疫效應(yīng)細(xì)胞"裂解的免疫機(jī)制。"人類免疫效應(yīng)細(xì)胞"是一群白細(xì)胞，在這些白細(xì)胞表面顯示Fc受體，通過Fc受體，這些白細(xì)胞結(jié)合到抗體的Fc區(qū)或Fc融合蛋白的Fc區(qū)，并執(zhí)行效應(yīng)物功能。這樣的細(xì)胞群可包括但不限于外周血單核細(xì)胞(PBMC)和/或自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞?？贵w靶向細(xì)胞是那些被抗體或Fc-融合蛋白結(jié)合的細(xì)胞。如本文中所使用，術(shù)語增加的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒作用被限定為在特定的時間內(nèi)，在靶細(xì)胞周圍的培養(yǎng)基中，以特定的抗體濃度或特定的Fc-融合蛋白的濃度，通過上述限定的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒作用裂解的抗體耙向細(xì)胞的數(shù)目增力Q，和/或在特定時間內(nèi)通過Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的機(jī)制達(dá)到裂解特定數(shù)目的"抗體靶向細(xì)胞"所需的在靶細(xì)胞周圍的培養(yǎng)基中的抗體濃度或Fc-融合蛋白的濃度下降。Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒作用增加與其它類型的宿主細(xì)胞(例如雜交瘤)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的同一標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)、純化、配制和貯存方法產(chǎn)生的同一抗體或Fc-融合蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒作用有關(guān)。術(shù)語具有增加的抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(ADCC)的抗體是指，正如在本文所限定的那樣，.真有通過任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員己知的方法測定的增加的ADCC的抗體。一種已被接受的體外ADCC檢測如下'1)該檢測使用己知表達(dá)抗體的抗原結(jié)合區(qū)域識別的耙抗原的靶細(xì)胞。該檢測使用從隨機(jī)選擇的健康供體的血液中分離的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)作為效應(yīng)細(xì)胞；2)該檢測根據(jù)下列流程進(jìn)行i)使用標(biāo)準(zhǔn)密度離心方法分離PBMC，并且在RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基中使其以5x106細(xì)胞/ml懸??；ii)通過標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)耙細(xì)胞，并將其于活力在90%以上的指數(shù)生長期收獲，用RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌，標(biāo)記上100微居的5lCr，用細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌2遍，并使其以10S細(xì)胞/ml的密度懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)基中；iii)將上述的100微升最終的靶細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板的每孔中；iv)將抗體在細(xì)J&培養(yǎng)基中從4000ng/ml至0.04ng/ml進(jìn)行連續(xù)稀釋，并將50微升所得到的抗體g液加入96孔微量滴定板的耙細(xì)胞中，測定包含以上全部濃度范圍的各種抗體濃度，重復(fù)三次；v)在用作最大釋放(MR)對照的含有標(biāo)記的靶細(xì)胞的平板上3個另外的孔中加入50微升2%(V/V)的非離子去污劑的水溶液(Nonidet,Sigma,St.Louis)，而不是加入抗體溶液(上文點iv);vi)在用作自發(fā)釋放(SR)對照的含有標(biāo)記的耙細(xì)胞的平板上3個另外的孔中加入50微升RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基，而不是加入抗體溶液(上文點iv);vii)然后將96孔微量滴定板以50xg離心1分鐘并在4°C孵育1小時；viii)在每孔中加入50微升PBMC懸液(上文點i)以產(chǎn)生效應(yīng)物靶細(xì)胞的比例是25:1，并且將平板置于孵箱(5Q/。C02大氣，37°C)中4小時；ix)收獲每孔中的無細(xì)胞上清并使用Y計數(shù)器定量實驗性釋放的放射活性(ER);x)根據(jù)公式(ER-MR)/(MR-SR)x100計算每個抗體濃度的特異性裂解的百分?jǐn)?shù)，該公式中ER是抗體濃度的定量測定的平均放射活性(見上文點ix)，MR是MR對照的定量測定的平均放射活性(見上文點v)，并且SR是SR對照的定量測定的平均放射活性(見上文點ix);4)"增加的ADCC"限定為在上述測定的抗體濃度范圍內(nèi)觀察到的特異性裂解的最大的百分?jǐn)?shù)增加，和/或達(dá)到在上述測定的抗體濃度范圍內(nèi)觀察到的特異性裂解的最大的百分^C的一半^f需的抗體濃度的下降。ADCC增加與使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的同一標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)、純化、配制和je存方法的另一種類型的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的同一抗體介導(dǎo)的通過上述檢測測定的ADCC相關(guān)。例如，通過本發(fā)明所述的方法產(chǎn)生的IgGl亞型抗體的ADCC活性較雜交瘤或CHO細(xì)胞產(chǎn)生的同一抗體增加。本發(fā)明還涉及EBx⑧細(xì)胞系，優(yōu)選涉及鴨EB66細(xì)胞系，用于產(chǎn)生重組多肽，優(yōu)選單克隆抗體，所述產(chǎn)生糖基化的多肽的細(xì)胞系的特征為，與使用CHO細(xì)胞系產(chǎn)生的同一多肽相比，其具有實質(zhì)上下降的巖藻糖含量。與CHO細(xì)胞系(ECACCRef.Q6911)產(chǎn)生的大約0至20%的抗體相比，EB66細(xì)胞系產(chǎn)生的大約55%或以上的抗體不含巖藻糖基化的寡糖結(jié)構(gòu)。與CHO細(xì)胞系(G0:大約2.5%;Gl大約7%)產(chǎn)生的抗體相比，EB.6^細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體含有的非巖藻糖基化形式GO(>15%)禾QGl(>13%)更高。本發(fā)明所述的EBx細(xì)胞系可此外選擇其抗凝集素抗性。實際上，凝集素能用于選擇表達(dá)特異類型的寡糖的細(xì)胞系(Ri沐a&Stanley,1986，SomaticCellMolGen12:51-62)。人們能使用巖藻糖特異性凝集素小扁豆凝集素(LensCulinarisagglutinin(LCA))選擇表達(dá)甚至是更低水平的巖藻糖的EBx細(xì)胞系。例如，可將EB66細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中以5000個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度在各種濃度的LCA凝集素存在條件下接種于在96孔板內(nèi)。5天后，檢査細(xì)胞存活，并且能選擇巖藻糖轉(zhuǎn)移酶FUT8mRNA的表達(dá)水平下降的少見的天然EB66變體，并將這些變體細(xì)胞在存在50ug/mlLCA條件下接種于另一個96孔板內(nèi)。數(shù)周后，抗性EBx克隆將出現(xiàn)，然后能將其擴(kuò)增并鑒定它們產(chǎn)生巖藻糖含量下降的重組多肽的能力。本發(fā)明涉及作為藥物的本發(fā)明所述的目的生物產(chǎn)品。更特異地，本發(fā)明涉及作為藥物的本發(fā)明所述的抗體。產(chǎn)生〖gG的EBx⑧的更高的細(xì)胞毒活性使施用于患者的抗體的量減少并能減少治療相關(guān)的花費。,EBx糖基化和非糖基化生物產(chǎn)品(例如病毒蛋白，抗體…)用于預(yù)防和治療多種人或動物的疾病的藥物治療。疾病的非限制性輛子有病毒性感染性疾病、細(xì)菌感染性疾病、癌癥(如非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤等)、傳染病(AIDS、皰疹、乙型肝炎、丙型肝炎…)、自體免疫性疾病(如多發(fā)性硬化癥、移植物抗宿主病、牛皮癬、幼年發(fā)病糖尿病、Sjogrens病、甲狀腺疾病、重癥肌無力、移植排斥反應(yīng)、'哮喘等)、炎癥性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性狼瘡…)。因此，本發(fā)明提供EBx⑧糖基化和非糖基化生物產(chǎn)品(如抗體，病毒蛋白…)在制備用于預(yù)防性和治療性處理上述疾病中任意病種的藥物中用途。還提供了治療患有任意這些疾病的人的方法，該方法包含將預(yù)防或治療有效量的EBx糖基化和非糖基化生物產(chǎn)品施用于所述個體。本發(fā)明還包括本發(fā)明所,的生物產(chǎn)品用于制備旨在預(yù)防或治療人或動物的疾病的藥物組合物中的用途。i除包括所述生物產(chǎn)品外，這樣的藥物組合物優(yōu)選包括可能與其它制劑如抗生素混合的生理上可接受的稀釋劑或載體。合適的載體包括但是不限于生理鹽水、磷酸緩沖鹽水、磷酸緩沖鹽葡萄糖和緩沖鹽?？蛇x地，如抗體的生物產(chǎn)品可被凍干(冷凍干燥)，當(dāng)需要時通過加入上述水緩沖溶液重組使用。因此，本發(fā)明提供包含本發(fā)明所述的生物產(chǎn)品和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。這樣的生物產(chǎn)品的劑量因治療的狀況和治療的受體不同而不同。對于抗體而言，其劑量對于在1至30日間的時期通常每日給藥的劑量是例如是對于成人患者而言，是在l至大約100mg范圍，優(yōu)選是l-10mg。給藥途徑是常規(guī)的胃腸道外，包括靜脈、肌肉、皮下和腹膜內(nèi)注射或遞送。下列實施例更加詳細(xì)解釋本發(fā)明。給予下列制品和實施例以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能更清楚地理解和操作本發(fā)明。然而，本發(fā)明并不限于示例性具體實施方案的范圍，其僅是旨在解釋本發(fā)明的一個方面，并且功能上相同的方法包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實際上，本發(fā)明的各種修改除了本文所述的那些之外，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)上述說明書和附圖是顯而易見的。這些修改旨在包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。說明書的剩余部分，參考下列附圖的說明。.圖l:親代空表達(dá)載體pVVS431(pKNexp)VIVALIS載體骨架包含一個單抗性盒以使質(zhì)粒能在E.coli中擴(kuò)增并在將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染禽類細(xì)胞后克隆選擇。"^//基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白并賦予有機(jī)體抗卡那霉素抗性(原核生物界)和新霉素抗性(真核生物界)。轉(zhuǎn)錄被"/^//基因的串聯(lián)上游的原核和真核啟動子驅(qū)動。編碼目的蛋白的cDNA克隆在位于包含易于交換的啟動子(即CMV啟動子…)、內(nèi)含子和多聚腺苷酸區(qū)(polyAregion)的空表達(dá)盒上的MCS(多克隆位點)內(nèi)。圖2A和2B:i人陽小鼠嵌合MabIgGl(K輕鏈和重鏈)由MAT-Biopharma(Evry，法國)惠贈。圖2A:帶有驅(qū)動IgGl輕鏈表達(dá)的RSV啟動子的載體:pVVS452(pRSV-IgGl-L)圖2B:帶有驅(qū)動IgGl重鏈表達(dá)的RSV啟動子的載體pVVS450(pRSV-IgGl鄰圖3A和3B:在RSV啟動子調(diào)控下表達(dá)IgGl輕鏈和重鏈的雙載體圖3A:pVVS455(pRSV-LH-IgGl)圖3B:pVVS460(pRSV-HL陽IgGl)圖4:在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鴨EBx⑧細(xì)胞中的IgGl瞬時表達(dá)IgGl在鴨EBx⑧細(xì)胞中瞬時表達(dá)。轉(zhuǎn)染后24H和48H通過ELISA測定IgGl濃度?？贵w濃度在細(xì)胞培養(yǎng)上清中達(dá)到大約4.5|ag/ml。圖5:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、克隆分離和篩選IgGl生產(chǎn)行A:以含EF1/HTLV啟動子(左)或含RSV啟動子(右)的IgGl表達(dá)載體轉(zhuǎn)染雞EB14細(xì)胞。從雞EB14轉(zhuǎn)染中挑選200個抗性克隆，將其接種于Excell63066培養(yǎng)基(SAFCBiosciences),0.25mg/ml遺傳霉素。接種后生長5天后，進(jìn)行ELISA檢測以分析每個挑選出的克隆的IgGl生產(chǎn)卩行B:僅將最佳的產(chǎn)生IgGl的克隆在24孔板中進(jìn)行擴(kuò)增。行C:僅將有最佳的產(chǎn)生IgGl的克隆在6孔板中進(jìn)行擴(kuò)增和傳代。行D:最后，僅將有最佳的產(chǎn)生IgGl的克隆在175cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。該行D顯示了在常規(guī)培養(yǎng)一個雞的EB14克隆(EF1/HTLV啟動子)的過程中通過ELISA檢測監(jiān)測到的IgGl的產(chǎn)生能力的例子。圖6:雞EB14細(xì)胞和鴨EB66細(xì)胞中產(chǎn)生的IgGl抗體圖6A:在攪拌釜式生物反應(yīng)器中的雞EB14細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體表達(dá)IgGl(EF1/HTLV啟動子)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的雞EB14克隆適于在無血清的ExCell培養(yǎng)基(SAFCBiosciences)中懸浮生長。將0.4百萬細(xì)胞/ml接種在3升的攪拌釜式生物反應(yīng)器(Applikon)中。然后進(jìn)行分批培養(yǎng)；使細(xì)胞得以生長13天。于第10天時，EB14細(xì)胞達(dá)到16百萬細(xì)胞/ml的最大細(xì)胞密度。通過ELISA檢測監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)基中的IgGl雄度。于第12天，最大IgGl濃度達(dá)到0.25g/l。蛋白的特異性生產(chǎn)能力大約是10-20pg湖胞/24h。圖6B:在攪拌釜式生物反應(yīng)器中的鴨EB66細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體表達(dá)IgGl的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的鴨EB66克隆適于在無血清的ExCdl培養(yǎng)基(SAFCBioSdences)中懸浮生長。將0.4百萬細(xì)胞/ml接種在3升的攪拌釜式生物反應(yīng)器(Applikon)中。然后進(jìn)行分批培養(yǎng)；使細(xì)胞得以生長l'3天。于第11天時，EB66細(xì)胞達(dá)到11百萬細(xì)胞/ml的最大細(xì)胞密度。通過ELISA檢測監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)基中的IgGl濃度。于第11天，最大IgGl濃度達(dá)到0.07g/l。圖7A和7B:雞EBx細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體的糖基化特征圖7A:毛細(xì)管電泳分析雞EB14細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體的糖基化特征與人的絲氨酸(seric)IgG分子之一相似。圖7B:質(zhì)譜分析巖藻糖含量低(focose-less)的IgGl抗體的百分?jǐn)?shù)達(dá)到雞EB14細(xì)胞產(chǎn)生的抗體群的48%，而CHO細(xì)胞盧生的抗體僅2%(數(shù)據(jù)來自文獻(xiàn)〉。圖8:雞EBx細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體的糖基化的誶細(xì)特征'通過Maldi-Toff質(zhì)譜分析對一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的雞EB14細(xì)胞克隆產(chǎn)生的IgGl的糖基化特征進(jìn)行分析。分析了在Asn297殘基上連接于每個IgGl重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域上的N-寡糖的結(jié)構(gòu)。該雞EB14克隆產(chǎn)生的大多數(shù)IgGl抗體具有常見的雙觸角類型的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)，其包含末端GlcNac的長鏈，該長鏈?zhǔn)前肴樘腔?。IgGl抗體群的重要部分(48%)是非巖藻糖基化的。一些抗體群具有二等分GlcNac的雙觸角類型的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)。圖9:雞EBx細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體抑制腫瘤細(xì)胞的增殖開發(fā)一種檢測方法以測定雞EB14細(xì)胞或雜交瘤產(chǎn)生的IgGl免疫球蛋白的細(xì)胞增殖抑制活性。IgGl抗體定，抗人類腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的CD標(biāo)記。腫瘤細(xì)胞在氚標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷存lE條件下生長并與從正?；颊唧w內(nèi)純化的單核細(xì)胞或自然殺傷T細(xì)胞在IgGl免疫球蛋白存在條件下孵育。該檢測測定作為IgGl介導(dǎo)的經(jīng)自然殺傷細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞裂解的后果的摻入增殖的腫瘤細(xì)胞中的氚標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷的量。培養(yǎng)4天后，低量氚標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入以NK細(xì)胞和雞EB14細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體處理的腫瘤細(xì)胞中，這提示腫瘤細(xì)胞并未增殖。相反，在以NK細(xì)胞或單核細(xì)胞和以雜交瘤生產(chǎn)的IgGl抗體處理的腫瘤細(xì)胞觀察到較高水平的H3-胸腺嘧啶脫氧核苷，這提示腫瘤細(xì)胞增殖。雞EB14細(xì)胞生產(chǎn)的IgGl顯示其較雜交瘤產(chǎn)生的同一抗體具有較好的細(xì)胞抗增殖活性。圖10:雞EB14相對于CHO細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體的抗腫瘤細(xì)胞毒反應(yīng)使用來自兩名健康供體的自然殺傷細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ADCC檢測。在無白細(xì)胞介素2(IL-2)條件下或IL-2為5或100單位條件下培養(yǎng)NK細(xì)胞。以前用放射活性格培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞與IgGl免疫球蛋白和NK細(xì)胞孵育。以釋放至培養(yǎng)基中的鉻的百分?jǐn)?shù)評價ADDC活性。腫瘤陰性對照腫瘤+來自雜交瘤(非嵌合抗體)的抗腫瘤IgGl:陽性對照腫瘤+CHO產(chǎn)生的抗腫瘤IgGl腫瘤+雞EB14細(xì)胞產(chǎn)生的抗腫瘤IgGl雞EB14細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體顯示較CHO細(xì)胞產(chǎn)生的同一IgGl抗體具有較高的ADCC活性。圖11:表達(dá)NR13抗細(xì)胞凋亡基因的貼壁雞EBx⑧細(xì)胞的生長分析行A:pVVS437和pVVS438載體的說明。pVVS437僅含有嘌呤霉素(puromycine)抗性基因。PVVS438可表達(dá)嘌呤霉素抗性和雞抗細(xì)胞凋亡基因NR13。以pVVS437或pVVS438載體轉(zhuǎn)染貼壁雞EBx⑧細(xì)胞(EB45)，并對這些細(xì)胞進(jìn)行選擇。行B:將克隆按群進(jìn)行富集或分離，且使用從這些群或克隆中分離的總RNA進(jìn)行RT-PCR以檢測NR13基因的表達(dá)。該行顯示克隆B2、B3和Cl表達(dá)抗細(xì)胞-——1>凋亡基因NR13。行C:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NR13抗細(xì)胞凋亡基因的貼壁雞EBx⑧細(xì)胞(EB45)生長分析。表達(dá)NR13蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的EBx⑧細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在100mm培養(yǎng)皿中。不表達(dá)NR13蛋白的EBx⑧細(xì)胞在培養(yǎng)中不能存活并且大多數(shù)這種細(xì)胞在培養(yǎng)6至7天后死亡。僅有小比例和穩(wěn)定比例的表達(dá)NR13蛋白的EBx⑧在培養(yǎng)中死亡，大多數(shù)NR13EBx⑧細(xì)胞在培養(yǎng)較長一段時間后依然保持存活。圖12:鴨EB66細(xì)胞和CHO細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體的糖基化特征在鴨EB66細(xì)胞的」種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆和在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的IgGl的糖基化特征通過MALDITOF質(zhì)譜分析進(jìn)行分析。分析了于Asn297殘基上連接到每個IgGl重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域的N-寡糖的結(jié)構(gòu)。該鴨EB66克隆產(chǎn)生的大多數(shù)IgGl抗體具有常見的雙觸角類型的N-連接的寡糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含具有末端GlcNac的半乳糖基化的長鏈。EB66生產(chǎn)的IgGl抗體群的重要部分(大約55%)是非巖藻糖基化的。CHO細(xì)胞生產(chǎn)的IgGl抗體群的一小部分(大約20%)是非巖藻糖基化的p——圖13:在殘基Asn297上連接到鴨EB66細(xì)胞或CHO細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域的N-連接的寡糖的質(zhì)譜分析糖苷酶F(PNGaseF)消化釋放出來的抗體Fc寡糖進(jìn)行預(yù)甲基化(permethyled)并使用MALDI-TOFMS在正離子模式下使用DHB矩陣分析。3個主要糖型被建立在兩細(xì)胞系產(chǎn)生的IgG。與CHO產(chǎn)生的IgG相比，EB66產(chǎn)生的IgG包括較高百分?jǐn)?shù)的非巖藻糖化形式G0'和Gl。圖14:EB66和CHO細(xì)胞產(chǎn)生的同一IgGl抗體的3種主要的巖藻糖基化和非-巖藻糖基化的糖型GO、G1和G2的百分?jǐn)?shù)表糖苷酶F消化釋放出來的抗體Fc寡糖進(jìn)行預(yù)甲基化并使用MALDI-TOFMS在正離子模式下使用DHB矩陣分析。3個主要糖型G0、Gl和G2被建立在兩細(xì)胞系產(chǎn)生的IgG上。與CHO產(chǎn)生的IgG相比，EB66產(chǎn)生的IgG包括較高百分?jǐn)?shù)的非巖藻糖化形式G0和G1':圖15A-15B:雞EB14、鴨EB66和CHO細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體的抗腫瘤細(xì)胞毒性反應(yīng)圖15A:NK細(xì)胞的激活(IFNg分泌細(xì)胞的分析)IgGl激活自然殺傷細(xì)胞通過用流式細(xì)胞儀檢測INFg而評價。來自2名健康供體的NK細(xì)胞在無白細(xì)胞介素2(IL-2)或有5或100單位的IL-2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。將腫瘤細(xì)胞與IgGl免疫球蛋白和NK細(xì)胞一同孵育。通過以偶聯(lián)藻紅蛋白(PE)的抗-INFg進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色來測定INFg檢測。與CHO細(xì)胞產(chǎn)生的同一IgGl抗體相比，雞EB14細(xì)胞和鴨EB66細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體顯示出較高的NK激活。圖15B:NK細(xì)胞的激活(CD107陽性細(xì)胞的分析)IgGl激活自然殺傷細(xì)胞通過用流式細(xì)胞儀分析CD107的活動化而評價。來自2名健康供體的NK細(xì)胞在無白細(xì)胞介素2(IL-2)或有5或100單位的IL-2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。將腫瘤細(xì)胞與IgGl免疫球蛋白和NK細(xì)胞一同孵育。與FITC偶聯(lián)的抗CD107抗體用于檢測激活的NK細(xì)胞。與CHO細(xì)胞產(chǎn)生的同一IgGl抗體相比，雞EB14細(xì)胞和鴨EB66細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體顯示出狡高的NK激活。圖16:雞EB14、鴨EB66和CHO細(xì)胞生產(chǎn)的IgGl抗體的抗腫瘤細(xì)胞毒性反應(yīng)使用來自健康供體的純化的自然殺傷細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ADCC檢測。將NK細(xì)胞在無白細(xì)胞介素2(IL-2)或有100單位的IL-2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。以前用放射活性鉻培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞與不同濃度的范圍是0.8至50p/ml的IgGl免疫球蛋白和NK細(xì)胞進(jìn)行孵育。以釋放至培養(yǎng)基中的鉻的百分?jǐn)?shù)評價ADCC活性。在非限制性條件下(〈50昭/ml的抗體)，EB66和EB14生產(chǎn)的IgGl與CHO細(xì)胞生產(chǎn)的同一抗體相比更能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞殺傷。圖17:連接至每個IgG重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域上的雙觸角寡糖結(jié)構(gòu)的潛在異質(zhì)性(對于人IgG而言，在殘塞"Asn297上)圖17A:甘露糖基-殼二糖核(Man3-GlcNac2)以普通黑線表示，并且可存在的(+/-)另外的糖殘基連接至Man3-GkNac2核上，以點線表示。圖17B:復(fù)雜類型的連接至每個重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域上的N-連接的雙觸角寡糖結(jié)構(gòu)的線圖(對于人IgG而言，在殘基Asn297上)。實施例實施例1:來自SPF雞品種VALO的雞EBvl3細(xì)胞系1.1-原材料卵無特異性病原體(SPF)的品種稱為Valo。Valo品種是來自德國的Lohmann產(chǎn)生和傳送的白色來亨雞品種。那些進(jìn)行了分析認(rèn)證的SPF雞卵檢測其CAV、禽類腺病毒(第1組，血清型1-12和第3組)、EDS、禽類腦脊髓炎病毒、禽白血病病毒/RSV(包括血清型ALV-J)、禽腎炎病毒、禽呼腸孤病毒、禽痘病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性滑囊炎病毒(IBDV)、傳染性喉氣管炎病毒、A型流感病毒、馬立克氏病(Marek，sDisease)病毒、支原體(Mg+Ms)、分支桿菌、新城疫病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒、雞白痢沙門氏齒、其他^^門氏菌感染、禽傳染性鼻氣管炎病毒(ART)、嗜血桿菌屬副雞嗜血桿菌(Hemophilusparagallinarum)。僅用去污劑將Valo雞卵進(jìn)行消毒，以避免任何在運(yùn)輸過程中與操作雞卵相關(guān)的污染的風(fēng)險。詞養(yǎng)細(xì)胞'在建立EBvl3方法中的第一步中，從鼠起源的細(xì)胞(STO細(xì)胞)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，以保持雞干細(xì)胞多能性。在將其接種至塑料培養(yǎng)皿之前，將那些飼養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)Y照射(45至55格瑞)進(jìn)行有絲分裂滅活。這種照射劑量是亞致死劑量的，其誘導(dǎo)細(xì)胞周期最終停滯，但仍能產(chǎn)生生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)，這些生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)對于促進(jìn)未分化細(xì)，的細(xì)胞生長是必要的。STO細(xì)胞系來自A.Bernstein,OntarioCancerInstitute,Toronto,加拿大)，來自SIM(Sandos近親交配小鼠)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的連續(xù)細(xì)胞系并由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)提供(STO產(chǎn)品號CRL-1503,批號1198713)。新鮮飼養(yǎng)層一周準(zhǔn)備兩次，一般在周一和周四。指數(shù)期的細(xì)胞被消化下來并計數(shù)。部分細(xì)胞被接種以維持存活培養(yǎng)并且另外部分進(jìn)行照射。對于照射，我們準(zhǔn)備在試管內(nèi)的10xl()S細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液。細(xì)胞暴露于45至55格瑞劑量，并且將其接種于塑料培養(yǎng)皿中。接種后，覆蓋了滅活的飼養(yǎng)細(xì)胞的皿或板最長使用5天。培養(yǎng)基DMEM國HamF12(Cambrex，Catn。BE04-687)Optipro培養(yǎng)基(Invitrogen，Catn°12309)EX-CELL65195、60947和65319(SAFC，專門培養(yǎng)基)添加物谷氨酰胺(Cambrex，Catn°BE17-605E)青霉素/鏈霉素(Cambrex，Catn°BE17-602E))非必需氨基酸(Cambrex，Catn。BE13-114E)丙酮酸鈉(Cambrex，Catn°BE13-115)維生素(Cambrex，Catn°13-607C)(3巰基乙醇(Sigma，Catn°M7522)緩沖液和介體PBSIX(Cambrex，Catn。BE17-516F)多聚甲醛4%(Sigma，Catn°P6148)KC15,6%(Sigma，Catn。P9333)甲醇/乙酸(3/l):甲醇(Merck，Catn。K34497209;乙酸SigmaCatn°A6283)秋水仙胺，Karyomax(Gibco,Catn°15212-046)冷凍防護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)(Sigma,Catn°D2650)因子使用兩種不同的因子；''0重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)(PeprotechInc，Catn°450-l3)Cl重組人胰島素樣因子I(IGF1)(PeprotechInc，Catn。100-11)在E.Coli細(xì)菌中生長這兩種因子。胎牛血清未照射的胎牛血清(FBS)(JRH，Catn°12103)在程序中使用的未照射的血清在美國收集和生產(chǎn)。用于收集的動物是USDA檢查并是可以進(jìn)行屠宰的。在禽類干細(xì)胞培養(yǎng)過程中加人培養(yǎng)基中。這批不進(jìn)行照射以避免關(guān)鍵蛋白或成分的結(jié)構(gòu)破壞，這些蛋白或成分經(jīng)鑒定對于培養(yǎng)中干細(xì)胞的維持是必要的。照射的血清(JRH，Catn°12107)在該程序中使用的照射批次的血清也在美國收集。該批照射血清作為補(bǔ)充物加入用于培養(yǎng)STO或FED細(xì)胞(飼養(yǎng)細(xì)胞)的DMEM:培養(yǎng)基中。這些細(xì)胞不像干細(xì)胞那樣需要特定質(zhì)量的血清以在培養(yǎng)中生長和維持。為f最小化培養(yǎng)基中的血清的高濃度，我們使STO細(xì)胞適應(yīng)于在僅有4%FBS存在的條件下生長。消化劑鏈霉蛋白酶(Roche，Catn°165921)鏈霉蛋白酶是RocheDiagnostics(德國)生產(chǎn)的重組蛋白酶，用于消化貼壁的禽類干細(xì)胞。胰蛋白酶EDTA(Cambrex，catn°BE17-161E)胰蛋白酶用于消化STO或FED細(xì)胞，并且在后期傳代時用于消化適應(yīng)于無血清培養(yǎng)基的禽類細(xì)胞。豬起源的該酶是根據(jù)cGMP指示條件通過經(jīng)驗證的滅菌過濾方法無菌生產(chǎn)出來的，并根據(jù)當(dāng)前E.P進(jìn)行檢測。嚴(yán)格根據(jù)9/CFR113.53，將在配制之前經(jīng)照射的原材料進(jìn)—行豬的細(xì)小病毒組的檢測。非酶細(xì)胞消化溶液(Sigma，Catn。C5914)該消化試劑易于使用配方，其用于溫和地將細(xì)胞從培養(yǎng)皿的生長表面上解離下來。該配方不含蛋白并能不使用酶而使細(xì)胞脫離。細(xì)胞蛋白得以保留以可能進(jìn)行免疫化學(xué)研究，免疫化學(xué)研究依賴于識別細(xì)胞表面的蛋白。該酶用于在進(jìn)行像EMA-1(上皮細(xì)胞膜抗原1)和SSEA1(階段特異性胚胎抗原-l)的生物標(biāo)記的FACS分析之前將細(xì)胞解離下來。1.2-雞EBvl3細(xì)胞系的建立方法將卵打開，在打開過程中將卵黃從卵清中分離出來。直接借助于巴斯德移液管或借助于小的吸收濾紙(Whatmann3M紙)將胚胎從卵黃中取出，借助于打孔器預(yù)先將濾紙剪成多孔的環(huán)。孔的直徑是大約5mm。將這些小環(huán)在烤箱中干熱滅菌大約30分鐘。將這些小紙環(huán)放置在卵黃表面并集中于胚胎上，其因此被紙環(huán)環(huán)繞。然后將后者用一把小剪刀剪開，并將整個胚胎取出置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中含有PBS或生理鹽水。在培養(yǎng)基中清除因此通過紙環(huán)帶下來的胚胎上多余的卵黃，并用巴斯德移液管收集(因此不含多余的卵磷脂)。'.Valo雞胚置于含有生理培養(yǎng)基(1XPBS、Tris葡萄糖、培養(yǎng)基等)的試管中。然后機(jī)械分離Valo胚胎，并將其接種在39°C的完全培養(yǎng)基中的STO細(xì)胞飼養(yǎng)層上。飼養(yǎng)細(xì)胞以大約2.7xl(^細(xì)胞/cn^接種在培養(yǎng)瓶中。完全培養(yǎng)基由基礎(chǔ)商業(yè)培養(yǎng)基DMEM-HamF12添加10%胎牛血清、IGF1和CNTF(終濃度是1ng/ml)、1%非必需氨基酸、1%商業(yè)起源的維生素的混合物、丙酮酸鈉(終濃度是lmM)、卩-巰基-乙醇(終濃度是0.2mM)、谷氨酰胺(終濃度是2.9mM)、含有青霉素(終濃度是100U/ml)和鏈霉素(終濃度是100(ag/ml)的抗生素的起始混合物而組成。在將細(xì)胞傳一代后很快地，不再將抗生素混合物加入培養(yǎng)基中。應(yīng)理解，表述"很快地"意味著一般在首次3至5次傳代后。當(dāng)將來自Valo雞胚胎的禽類ES細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶傳代至另一培養(yǎng)瓶中時，以完全培養(yǎng)基中的大約7x104/cm2至8x10"cn^之間的禽類ES細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)瓶接種。優(yōu)選地，以大約7.3x104/cm2(4x1()6細(xì)胞/55cm2或4x106細(xì)胞/100mm皿)進(jìn)行接種。將禽類細(xì)胞，優(yōu)選步驟a)的禽類胚胎細(xì)胞在數(shù)次傳代過程中培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中。于第15代，完全培養(yǎng)基中的生長因子IGF1和CNTF去除。去除從一代至另一代直接一步進(jìn)行。胚胎干細(xì)胞，優(yōu)選禽類胚胎細(xì)胞在不含IGF1和CNTF生長因子的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)代。在去除生長因子IGF1和CNTF后，然后通過在數(shù)代中逐漸減少飼養(yǎng)細(xì)胞的濃度進(jìn)行詞養(yǎng)細(xì)胞的去除。實際上，使用同一濃度的飼養(yǎng)細(xì)胞2至4代，然后對另2至4代使用較低濃度的飼養(yǎng)細(xì)胞，等。開始時，培養(yǎng)瓶接種以大約2.7xlOH司養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后大約2.2xl0"詞養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后大約1.8xl(^飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后大約1.4x10n司養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后大約1.1xl0"飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后大約0.9xl(/詞養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后大約0.5xl(^詞養(yǎng)細(xì)胞/cm、然后將培養(yǎng)瓶以6.5x104禽類細(xì)胞/cm2至7.5x104禽類細(xì)胞/cn^和無飼養(yǎng)細(xì)胞接種。大約在21代時開始去除詞養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)束在大約65代。在去除飼養(yǎng)細(xì)胞期間，將雞ValoES細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，接種密度比步驟a)低，為大約—4x104細(xì)胞/0112至5x104細(xì)胞/cm2。在假設(shè)中，在減少培養(yǎng)瓶中的詞養(yǎng)細(xì)胞濃度后，ValoES細(xì)胞形態(tài)不好，然后將禽類細(xì)胞以同一飼養(yǎng)細(xì)胞濃度再培養(yǎng)數(shù)代，然后繼續(xù)去除詞養(yǎng)細(xì)胞。在去除生長因子和飼養(yǎng)細(xì)胞后去除血清。一開始去除血清時，培養(yǎng)基由基礎(chǔ)商業(yè)培養(yǎng)基DMEM-HamFi2添加10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%商業(yè)起源的維生素的混合物、丙酮酸鈉(終濃度是lmM)、P-巰基-乙醇(終濃度是0.2mM)、谷氨酰胺(終濃度是2.9mM)而組成。在分兩個歩驟的過程中使雞Valo細(xì)胞適應(yīng)于在無血清培養(yǎng)基中生長首先，雞Valo細(xì)胞很快適應(yīng)于由商業(yè)上的無血清培養(yǎng)基(SFM)，優(yōu)選ExCell60947(SAFCBiosciences)添加10%胎牛血清和1%非必需氨基酸、1%商業(yè)起源的維生素的混合物、丙酮酸鈉(終濃度是lmM)、P-巰基-乙醇(終濃度是0,2mM)、^氨酰胺(終濃度是2.9mM)組成的培養(yǎng)基。一旦進(jìn)行了這一對新的培養(yǎng)基(DMik-HamF12至Exce1160947)的快適應(yīng)，進(jìn)行第二步，這一步由開始緩慢適應(yīng)于SFM培養(yǎng)基中動物血清濃度下降構(gòu)成。血清去除通過逐漸減少血清濃度而進(jìn)行，開始SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清濃度是10%血清，然后是7.5%，然后是5%，然后是2.5%，然后是1.25%，然后是0,75%，至最后SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清濃度是0%。血清去除開始于103代并且結(jié)束于135代。在去除血清的過程的結(jié)尾，當(dāng)SFM培養(yǎng)基中保留的血清濃度是0.75%或0%時，貼壁依賴的EBvl3細(xì)胞開始適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)。在進(jìn)行的數(shù)次以分離不依賴貼壁的EBvl3分離物的嘗試中，有62.5%的嘗試是成功的并能得到懸浮EBvl3細(xì)胞的不同分離物。EBvl3細(xì)胞的一個分離物根據(jù)群體倍增時間(大約18小時)、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時最佳細(xì)胞濃度(大約4百萬細(xì)胞/ml)、細(xì)胞活力、細(xì)胞培養(yǎng)同質(zhì)性(細(xì)胞團(tuán)塊的存在和大小)和操作細(xì)胞的便利性來選擇。在血清去除結(jié)束時，依賴貼壁的雞Valo細(xì)胞(名為EBvl3)能在缺乏生長因子、缺乏飼養(yǎng)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中生長。然后通過逐漸降低培養(yǎng)溫度(0.5°C/日)使EBvl3細(xì)胞適應(yīng)于在37。C生長。實施例2:鴨EBx細(xì)胞系EB662.1-原材料鴨卵來自北京鴨品種GL3(T的鴨卵獲自GRIMAUDFRERESSELECTION(LaCorbidre,Roussay法國)。親代鴨接種抗大腸桿菌(大腸桿菌自體疫苗01&02)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Landavax)、鴨病毒性肝炎(Hepatovax)、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae，Ruvax)、禽變異肺病毒(metapneumovims，Nemovac)、鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌(自體疫苗)、鴨疫里默氏桿菌(里默氏桿菌自體疫苗)、禽變異肺病毒(NobilisRTV滅活)和紅斑丹毒絲菌(Ruvax)^疫苗。接種后，將北京鴨受精鴨卵浸于次氯酸鈣(hypochloryde)槽進(jìn)行消毒，接著以Fermacidal(Thermo)去污染以避免任何與外殼上附著的灰塵相關(guān)的污染風(fēng)險。飼養(yǎng)細(xì)胞在方法的第一步，鼠起源的細(xì)胞(STO細(xì)胞)用作飼養(yǎng)層以維持鴨干細(xì)胞的多能性。這些飼養(yǎng)細(xì)胞通過Y照射(45至55格瑞)滅活有絲分裂，然后將其接種于塑料培養(yǎng)器皿中。這個照射劑量是亞致死量的，該量誘導(dǎo)細(xì)胞周期最終停滯但仍使之能產(chǎn)生生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)，生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)對于促進(jìn)未分化細(xì)胞的細(xì)胞生長是必要的。STO細(xì)胞系來源于A.Bernstein,OntarioCancerInstitute,Toronto,加拿大，來自SIM(Sandos近親雜交小鼠)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的連續(xù)細(xì)胞系并由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)提供(STO產(chǎn)品號是CRL-1503，批號是1198713)。新鮮飼養(yǎng)層一周制備兩次。將指數(shù)期的細(xì)胞消化下來并計數(shù)。將部分細(xì)胞接種以維持存活培養(yǎng)，并且另一部分接受照射。對于照射，我們在試管中準(zhǔn)備細(xì)胞懸液(10xl06細(xì)-胞/mL)。使細(xì)胞暴露于45至55格瑞的劑量并接種于塑料培養(yǎng)器皿中。接種后，覆蓋滅活飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板最長使用5天。土昔養(yǎng)基培養(yǎng)基EX-CELL65788，65319，63066和66444(SAFC，專門培養(yǎng)基)培養(yǎng)基GTM-3(Sigma，Catn。G9916)DMEM-HamF12(Cambrex，Catn。BE04-687)DMEM(Cambrex，Catn°BE12-614F)添加物谷氨酰胺(Cambrex,Catn。BE17-605E)青霉素/鏈霉素(Cambrex，Catn°BE17-602E))非必需氨基酸(Cambrex，Catn°BE13-114E)丙酮酸鈉(Cambrex，"Catn。BE13-115)維生素(Cambrex，Catn°13-607C)卩國巰基乙醇(Sigma,Catn°M7522)酵母提取物(SAFC，Catn°58902C)緩沖液和介體PBSIX(Cambrex，Catn。BE17-516F)冷凍防護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)(Sigma，Catn°D2650)因子使用兩種不同的重組因子□重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)(PeprotechInc，Catn°450-13)口重組人胰島素樣生長因子I(IGF1)(PeprotechInc，Catn。100-11)這兩個因子在E.Coli細(xì)菌中產(chǎn)生。胎牛血清未照射的胎牛血清(FBS)(JRH，Catn。12003)在程序中使用的未照射-的血清在澳大利亞收集和生產(chǎn)。用于收集的動物是USDA檢查并是可以進(jìn)行屠宰的。在禽類干細(xì)胞培養(yǎng)'過程中將其加入培養(yǎng)基中。這批不進(jìn)行照射以避免關(guān)鍵蛋白或成分的結(jié)構(gòu)破壞，這些蛋白或成分經(jīng)鑒定對于干細(xì)胞在培養(yǎng)中維持是必要的。照射的血清(JRH，Catn°12107)在該程序中照射批次的血清在美國收集。該批照射血清作為補(bǔ)充物加入用于培養(yǎng)STO細(xì)胞(詞養(yǎng)細(xì)胞)的DMEM養(yǎng)基中。這些細(xì)胞不像干細(xì)胞那樣需要特定質(zhì)量的血清以在培養(yǎng)中生長和維持。為了最小化培養(yǎng)基中的血清的高濃度，我們使STO細(xì)胞適應(yīng)于在僅有4%FBS存在的條件下生長。消化劑鏈霉蛋白酶(Roche，—，Catn。165921)鏈霉蛋白酶是RocheDiagnostics(德國)生產(chǎn)的重組蛋白酶，用于消化貼壁的禽類干細(xì)胞。胰蛋白酶EDTA(Cambrex，catn°BE17隱161E)胰蛋白酶用于消化STO細(xì)胞，并且在后期傳代時用于消化適應(yīng)于無血清培養(yǎng)基的禽類細(xì)胞。豬起源的該酶是根據(jù)cGMP指示條件通過經(jīng)驗證的滅菌過濾方法無菌生產(chǎn)出來的，并根據(jù)當(dāng)前E.P進(jìn)行檢測。嚴(yán)格根據(jù)9/CFR113.53，將在配制之前照射的原材料進(jìn)行豬細(xì)小病毒組的檢測。Trypzean(Sigma，catn°T3449)以重組牛胰蛋白酶配制Trypzean溶液，重組牛胰蛋白酶在玉米中表達(dá)并由SigmaAldrich利用ProdiGene專有的轉(zhuǎn)基因植物蛋白表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)。該產(chǎn)品優(yōu)化用于無血清和添加血清的貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞消化。非酶細(xì)胞消化溶液(Sigma，Catn。C5914)該消化試劑易于使用配方，其用于溫和地將細(xì)胞從培養(yǎng)皿的生長表面上解離下來。該配方不含蛋白并不使用酶而使細(xì)胞脫離。細(xì)胞蛋白得以保留以可能進(jìn)行免疫化學(xué)研究，免疫化學(xué)研究依賴于識別細(xì)胞表面的蛋白。該酶用于在進(jìn)行像EMA-1(上皮細(xì)胞膜抗原1)和SSEA1(階段特異性胚胎抗原-l)的生物標(biāo)記的FACS分析之前將細(xì)胞解離下來。2.2-鴨EBx細(xì)胞系EB66的建立方法將大約360只受精鴨卵打開，在打開過程中將卵黃從卵清中分離出來。借助于小的吸收濾紙(Whatman^3M紙)將胚胎從卵黃中取出，借助于打孔器預(yù)先將濾紙剪成多孔的環(huán)?？椎闹睆绞谴蠹s5mm。將這些小的環(huán)在烤箱中干熱滅菌大約30分鐘。實際上，在收集胚胎的步驟中，將這些小的紙環(huán)放置在卵黃表面并集中于胚胎上，胚胎因此被紙環(huán)環(huán)繞。然后將后者用一把小剪刀剪開，并將整個胚胎取出置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中含有PBS。在培養(yǎng)基中清除因此通過紙環(huán)帶下來的胚胎上多余的卵黃，并用巴斯德移液管收集胚胎盤(其因此不含多余的卵磷脂)。將鴨胚置于含有l(wèi)XPB的50ml試管中。然后機(jī)械分離鴨胚，PBS洗滌，并將其接種在39°C、7.5%C02的完全培養(yǎng)基中的滅活的STO細(xì)胞飼養(yǎng)層上。飼養(yǎng)細(xì)胞以大約2.7x104細(xì)胞/cm2接種在6孔培養(yǎng)板中。完全培養(yǎng)基由無血清培養(yǎng)基DMEM-HamF12添加10%胎牛血清、IGF1和CNTF(終濃度是1ng/ml)禾卩1%非必需氨基酸、1%商業(yè)起源的維生素的混合物、丙酮酸鈉(終濃度是O.lmM)，P陽巰基-乙醇(終濃度是0.5mM)、谷氨酰胺(終濃度是2.1mM)、青霉素(終濃度是100U/ml)、鏈霉素(終濃度是100pg/ml)和酵母提取物IX組成。在第4代時很快地，不再將抗生素混合物加入培養(yǎng)基中。將鴨ES細(xì)胞在DMEM-HamF12培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第4代。4代后，基礎(chǔ)培養(yǎng)基被修改并且DMEM-HamF12完全培養(yǎng)基被置換成SFMGTM-3培養(yǎng)基，其中添加10%胎牛血清、IGF1和CNTF(終濃度是1ng/ml)、1%非必需氨基酸、1%商業(yè)起源的維生素的混合物、丙酮酸鈉(終濃度是O.lmM)、P-巰基-乙醇(終濃度是0.5mM)、谷氨酰胺(終濃度是2.1mM)和酵母提取物IX。將鴨ES細(xì)胞在新的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)14代，然后于第18代時進(jìn)行生長因子的去除。同時將IGF1和CNTF從培養(yǎng)基中去除，因此從第19代至24代，培養(yǎng)基是GTM-3培養(yǎng)基，其中添加10。/。FBS、1%非必需氨基酸、1%商業(yè)起源的維生素的混合物、丙酮酸鈉(終濃度是O.lmM)、(3-巰基-乙醇(終濃度是0.5mM)、谷氨酰胺(終濃度是2.1mM)和酵母提取物IX。當(dāng)將來自北京鴨胚胎的鴨ES細(xì)胞從一個培養(yǎng)皿傳代至另一培養(yǎng)皿時，在完全培養(yǎng)基中，以大約7x104/cm2至12x104/cm2之間的鴨ES細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)皿接種。然后，在24代后，通過在數(shù)代中逐漸減少詞養(yǎng)細(xì)胞的濃度進(jìn)行飼養(yǎng)細(xì)胞的去除。開始時培養(yǎng)皿接種以大約2.7xl(^飼養(yǎng)細(xì)胞/cn^接種，然后在25至31代之間以大約1.8^04詞養(yǎng)細(xì)胞/112接種，然后在32至35代之間以大約1.4xl0"細(xì)胞/cm2接種，然后在36至41代之間以大約lxlO"細(xì)胞/cr^接種，然后在42至44代之間以大約0.7xl(^飼養(yǎng)細(xì)胞/cr^接種，并且最后從45代起培養(yǎng)皿僅以禽類細(xì)胞并無飼養(yǎng)細(xì)胞接種。在去除飼養(yǎng)細(xì)胞的末期，培養(yǎng)皿以9x104禽類細(xì)胞/(^12至12.7x104禽類細(xì)胞/cm4妾種。大約在25代時開始去除飼養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)束在大約45代。在去除飼養(yǎng)細(xì)胞期間，將鴨ES細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，接種濃度比步驟a)高，為大約9x104細(xì)胞/cm2至12.7x104細(xì)胞/cm2。在無詞養(yǎng)細(xì)胞數(shù)代后，研究了生長參數(shù)(群體倍增時間(PDT)和密度)以確定細(xì)胞穩(wěn)定性和強(qiáng)壯度并開-始去除氨基酸、維生素、卩巰基乙醇、丙酮酸鈉和酵母提取物。如果PDT低于大約40小時，并且細(xì)胞密度高于大約26x104細(xì)胞/cm2，則認(rèn)為細(xì)胞足夠強(qiáng)壯來接受這樣的去除。在開發(fā)本鴨EBx⑧細(xì)胞(名為EB66)情況下，于52代時開始去除維生素，丙酮酸鈉，非必需氨基酸和p-巰基乙醇。所有這些添加物同時從培養(yǎng)基中去除。因此，在52代至59代之間，培養(yǎng)基是SFMGTM-3，其中添加谷氨酰胺，酵母提取物和FBS。在短期適應(yīng)于新的培養(yǎng)條件后，開始降低溫度。從60代至67代之間逐漸開始該降低。67代后，細(xì)胞能在37。C生長。67代后，基礎(chǔ)培養(yǎng)基GTM-3被置換以新的SFM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(名為Excell65788)。因此，67代后，培養(yǎng)基是Excell65788，其中添加了10%FBS，2.5mM谷氨酰胺和IX酵母提取物。80代時，4乂106細(xì)胞轉(zhuǎn)移至超低附著培養(yǎng)皿(UltraLowAttachment,ULA)中，其維持在恒定的攪拌下以起始不依賴貼壁的細(xì)胞生長。為了促進(jìn)懸浮生長，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行修改，并且血清的百分?jǐn)?shù)從10%降至5%(對于在ULA皿中的接種)。因此，從80代至85代，培養(yǎng)基是SFMGTM-3，其中添加5%FBS、2.5mM谷氨酰胺和IX酵母提取物。85代后緩慢減少EB66細(xì)胞懸液中的FBS。通過從SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清濃度是2.5%血清開始逐漸進(jìn)行血清去除，然后是1.5%血清濃度，最后達(dá)到在SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清濃度是0%。血清去除開始于86代結(jié)束于94代。在血清去除結(jié)束時，不依賴貼壁的dEB66細(xì)胞能在37°C、缺乏生長因子、缺乏詞養(yǎng)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中生長。獲得能生長在37°C的添加2.5mM谷氨酰胺的SFMGTM-3的EB66鴨細(xì)胞后，一些對SFM培養(yǎng)基的進(jìn)一步適應(yīng)通過稀釋或逐漸適應(yīng)新SFM配方而進(jìn)行，如Excell63066，Excell66444,ExcellCHOACF。懸浮鴨EB66細(xì)胞的亞克隆也能在存在或不存在酵母提取物的情況下實現(xiàn)。實施例3:鴨EBx細(xì)胞系E^263.1-原材料鴨卵，飼養(yǎng)細(xì)胞，添加物，緩沖液和介體，冷凍保護(hù)劑，胎牛血清&消化劑(這些項同實施例3)。使用北京鴨品種GL30的鴨卵。土昔養(yǎng)基培養(yǎng)基EX-CELL65319，63066和66444(SAFC，專門培養(yǎng)基)培養(yǎng)基GTM-3(Sigma，Catn。G9916)DMEM(Cambrex，Catn。BE12-614F)因子使用6種不同重組因子□重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)(PeprotechInc，Catn°450-13)□重組人胰島素樣因子I(IGFl)(PeprotechInc，Catn°100-11)□重組人白細(xì)胞介素6(IL6)(PeprotechInc，Catn°200-06)□重組人可溶性白細(xì)胞介素6受體(sIL6r)(PeprotechInc，Catn°200-06R)□重組人干細(xì)胞因子(SCF)(PeprotechInc，Catp°300-07)□重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)(PeprotechInc，Catn。100-18B)所有這些因子，除了IL6r，在E.Coli細(xì)菌中產(chǎn)生?？扇苄訧L6r在轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中表達(dá)。3.2-鴨EBx細(xì)胞系EB26的建立方法按照以前EB66所述的方法收集鴨胚。將鴨胚置于含PBSIX的50mL試管中。然后機(jī)械分離鴨胚，以PBS洗滌并接種于39°C、7.5%C02的完全培養(yǎng)基中的滅活的STO細(xì)胞詞養(yǎng)層上。飼養(yǎng)細(xì)胞以大約2.7x104細(xì)胞/cn^接種于6孔板中或皿中。完全培養(yǎng)基由無血清培養(yǎng)基GTM-3添加5。/。胎牛血清，IGF1、CNTF、11-6、I1-6R、SCF禾卩FGF(終濃度是lng/ml)，和1%非必需氨基酸，1%商業(yè)起源的維生素的混合物，丙酮酸鈉(婆濃度是0.1mM)，(3-巰基-乙醇(終濃度是0.5mM)，谷氨酰胺(終濃度是2.1mM)，青霉素(終濃度是100U/ml)，鏈霉素(終濃度是100|ag/ml)和酵母提取物1X組成。在細(xì)胞第一次傳代后很快地，不再將抗生素混合物加入培養(yǎng)基中。表述"很快地"應(yīng)理解為一般是指在首次3至9代后。鴨ES細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中至9代。9代后，將完全培養(yǎng)基中的部分因子去除。因此，10至13代之間，將SCF、IL6、IL6r和bFGF從培養(yǎng)基中去除，并且僅重組IGF1和CNTF維持在1ng/ml濃度。其次在13代至16代之間同時減少IGF1和CNTF的濃度以最后獲得能于17代時在無重組因子的條件下生長的細(xì)胞。通過逐漸適應(yīng)于較低的因子濃度去除因子。當(dāng)來自北京鴨的鴨胚的鴨ES細(xì)胞從一個培養(yǎng)皿傳代至另一個時，培養(yǎng)皿接種以大約7x104/cm2至12x104/cm2的完全培養(yǎng)基中的鴨ES細(xì)胞。優(yōu)選地，以大約7.3xl()4/cm2(4x106細(xì)胞/55cm2或4xl06細(xì)胞/100讓皿)接種。去除重組因子后，于23代時降低酵母提取物達(dá)到終濃度是0.5X。然后，31代后，通過在數(shù)代間逐漸減少詞養(yǎng)細(xì)胞濃度進(jìn)行詞養(yǎng)細(xì)胞的去除。最初，培養(yǎng)皿接種的飼養(yǎng)細(xì)胞是2.7xl0，飼養(yǎng)細(xì)胞/cn^，然后32代和38代之間是大約1.8x104飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2'，然后在39至44代之間是大約1.4x10;細(xì)胞/cm2，然后在45至47代之間大約是1x104詞養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后在48至50'代之間大約是0，7x104詞養(yǎng)細(xì)胞/cm2，且最后從51代起培養(yǎng)皿僅接種禽類細(xì)胞，'沒有飼養(yǎng)細(xì)胞。在去除飼養(yǎng)細(xì)胞結(jié)束時，培養(yǎng)皿中接種9x104禽類細(xì)胞/cr^至12.7x104禽類細(xì)胞/(:1112的細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的去除開始于^2代結(jié)束于51代。飼養(yǎng)細(xì)胞的去除過程中，將鴨ES細(xì)胞以較步驟a)高的濃度接種于培養(yǎng)皿中，其濃度是大約9x104細(xì)胞/cn^至12.7x1(^細(xì)胞/cm2。在無飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)代后，研究生長參數(shù)(群體倍增時間(PDT)和密度)以確定細(xì)胞穩(wěn)定性和強(qiáng)壯度并開始細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。如果PDT低于大約40小時并且細(xì)胞密度高于大于26x104細(xì)胞/cn^則認(rèn)為細(xì)胞足夠強(qiáng)壯以接受懸浮培養(yǎng)。此外，細(xì)胞形態(tài)應(yīng)當(dāng)是圓的、折光的、非常小的，并且細(xì)胞不太能附著于塑料培養(yǎng)皿上。在開發(fā)EB26細(xì)胞的情4i下，在53代時開始懸浮培養(yǎng)，將7xl0e個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至超低附著皿中并維持在大約50至70rpm的恒定攪動條件下。對于后續(xù)傳代，將細(xì)胞以0.4至0.5x106細(xì)胞/mL之間的濃度接種在T175培養(yǎng)瓶(Sarsted，ref831812502)中。短期適應(yīng)于新的培養(yǎng)條件后，細(xì)胞PDT從大約160H下降至40小時。關(guān)于這一良好進(jìn)化，于59代時，進(jìn)行新的一系列去除。因此，去除維生素、丙酮酸鈉、P-巰基乙醇和非必需氨基酸。因此，在59代后，培養(yǎng)基中僅添加5%FBS、0.5X酵母提取物和2.5mM谷氨酰胺。己經(jīng)去除了生長因子、飼養(yǎng)細(xì)胞、維生素、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、(3-巰基乙醇的細(xì)胞懸浮液開始去除血清。通過從5%血清開始，然后2.5%，然后L5。/。逐漸降低SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清濃度，直至最后達(dá)到SFM細(xì)胞培養(yǎng)基含0%血清而進(jìn)行血清的去除。血清去除開始于61代結(jié)束于79代。在去除血清結(jié)束時，貼壁非依賴的鴨EB26細(xì)胞能夠在39。C、在無生長因子、無詞養(yǎng)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中生長。然后通過在80代降低細(xì)胞培養(yǎng)的溫度使EB26細(xì)胞適應(yīng)于在37°C、無0.5X酵母提取物條件下生長。獲得能在37°C、在添加2.5mM谷氨酰胺的SFMGTM-3中生長的EB26細(xì)胞后，通過稀釋或逐漸適應(yīng)于i的SFM配方(如Excell63066、Excell66444、ExcellCHOACF)進(jìn)行一些進(jìn)一步改進(jìn)。在存在或缺乏酵母'提取物的條件下，也能實現(xiàn)懸浮鴨EB26細(xì)胞的亞克隆。實施例4:鴨EBx細(xì)胞系EB244.1原材料'鴨卵，飼養(yǎng)細(xì)胞，添加物，緩沖液和介體，冷凍保護(hù)劑，胎牛血清&消化劑(這些項同實施例3)。使用北京鴨品種GL30的鴨卵。培養(yǎng)基培養(yǎng)基EX-CELL65319、63066和66444(SAFC，專門培養(yǎng)基)培養(yǎng)基GTM-3(Sigm『Catn。G9916)DMEMF12(Cambrex，Catn°BE04-687)DMEM(Cambrex，Catn°BE12-614F)因子使用6種不同重組因子□重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)(Peprotechlnc，Catn°450-13)□重組人胰島素樣因子I(IGF1)(PeprotechInc，Catn°100-11)□重組人白細(xì)胞介素6(IL6)(PeprotechInc，Catn。200-06)□重組人可溶性白細(xì)胞介素6受體(sIL6r)(PeprotechInc，Catn°200-06R)□重組人干細(xì)胞因子(SCF)(PeprotechInc，Catn°300-07)□重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)(PeprotechInc，Catn°100-18B)所有這些因子，除了IL6r，在E.Coli細(xì)菌中產(chǎn)生?？扇苄訧L6r在轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中表達(dá)。4.2-鴨EBx⑧細(xì)胞系EB24的建立方法按照以前在建立EB66細(xì)胞系時所述的方法收集鴨胚。將鴨胚置于含PBSIX的50mL試管中。然后機(jī)械分離鴨胚，并接種于39。C,,7.5%'CQ2的完全培養(yǎng)基中的滅活的STO細(xì)胞詞養(yǎng)層上。飼養(yǎng)細(xì)胞以大約2.7x104細(xì)胞/cr^接種于6孔板中或皿中。完全培養(yǎng)基由無血清培養(yǎng)基DMEM-HamF12添加10%胎牛血清，IGF1、CNTF、11-6、I1-6R、SCF禾nFGF(終濃度是1ng/ml)，和1%非必需氨基酸，1%商業(yè)起源的維生素的混合物，.丙酮酸鈉(終濃度是O.lmM)，卩-巰基-乙醇(終濃度是0.5mM)，谷氨酰胺(終濃度是2.1mM)，青霉素(終濃度是100U/ml)，鏈霉素(終濃度是100)ag/ml)和酵母提取物1X組成。在細(xì)胞第一次傳代后很快地，不再將抗生素混合物加入培養(yǎng)基中。表述"很快地"應(yīng)理解為一般是指在首次3至9代后。將鴨ES在DMEM-HamF12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至第7代。7代后，基礎(chǔ)培養(yǎng)基被修改并且DMEM-HamF12完全培養(yǎng)基被GTM-3完全培養(yǎng)基置換，GTM-3完全培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，IGF1、CNTF、11-6、I1-6R、SCF禾QFGF(終濃度是lng/ml),1%非必需氨基酸，1%商業(yè)起源的維生素的混合物，丙酮酸鈉(終濃度是O.lmM)，P-巰基-乙醇(終濃度是0.5mM),谷氨酰胺(終濃度是2.1mM)，青霉素(終濃度是100U/ml)，鏈霉素(終濃度是100ng/ml)和酵母提取物IX。因此，在11代，血清濃度下降至5%，并將SCF、IL6、IL6r和bFGF從培養(yǎng)基中去除。所以，從11代開始，培養(yǎng)基由5%FBS，IGF1和CNTF(終濃度是1ng/mL)，1%非必需氨基酸，1%商業(yè)起源的維生素的混合物，丙酮酸鈉(終濃度是0.1mM)，卩-巰基-乙醇(終濃度是0.5mM)，谷氨酰胺(終濃度是2.1mM)，青霉素(終濃度是100U/ml),鏈霉素(終濃度是100)ag/ml)和酵母提取物1X組成。于22代進(jìn)行IGF1和CNTF的同時去除。22代后，GTM-3培養(yǎng)基中沒有重組因子。將鴨細(xì)胞從23代至28代之間在這樣的培養(yǎng)基中維持。當(dāng)將來自北京鴨的胚胎的鴨ES細(xì)胞從一個培養(yǎng)皿中傳代至另一培養(yǎng)皿中時，以大約7x104/cm2至12x104/cm2的鴨ES細(xì)胞在完全培養(yǎng)基屯進(jìn)行培養(yǎng)皿接種。優(yōu)選地，以大約7.3x104/cm2(4x106細(xì)胞/55cn^或4x1()S細(xì)胞/100mm培養(yǎng)皿)進(jìn)行接種。，然后，28代后，通過在數(shù)代間逐漸減少詞養(yǎng)細(xì)胞的濃度進(jìn)行飼養(yǎng)細(xì)胞的去除。'開始時培養(yǎng)皿接種以大約2.7xl0"飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，然后在29至33代間以大約1.8乂104飼養(yǎng)細(xì)胞/0112接種，然后在34至37代間大約1.4xl0"飼養(yǎng)細(xì)胞/ci^接種，然j^在38至42代間大約lx104飼養(yǎng)細(xì)胞/cn^接種，然后在43至46代間大約0.7xl0"飼養(yǎng)細(xì)胞/cm2，且，最后從47代開始，培養(yǎng)皿僅以禽類細(xì)胞接種并無飼養(yǎng)細(xì)胞。在飼養(yǎng)細(xì)胞去除結(jié)束時，培養(yǎng)皿以9x104禽類細(xì)胞/^112享12.7x104禽類細(xì)胞/cr^接種。飼養(yǎng)細(xì)胞去除開始于29代結(jié)束于47代。在去除飼養(yǎng)細(xì)胞的過程中，將鴨ES細(xì)胞以比步驟a)高的濃度，大約9xl04細(xì)胞/cr^至12.7x104細(xì)胞/^112接種在培養(yǎng)皿中。在無飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下傳數(shù)代后，研究生長參數(shù)(群體倍增時間(PDT)和密度)以確定細(xì)胞的穩(wěn)定性和強(qiáng)壯度，并開始將細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。如果PDT低于大約40小時并且細(xì)胞密度高于26x104細(xì)胞/cm2，則認(rèn)為細(xì)胞足夠強(qiáng)壯以接受懸浮培養(yǎng)。此外，細(xì)胞形態(tài)應(yīng)是圓的、折光、非賞小的，并且細(xì)胞不太能附著于塑料培養(yǎng)皿上。在開發(fā)EB24細(xì)胞的情況下，于48代幵始懸浮培養(yǎng)，8乂106個細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至超低附著皿中并維持在大約50至70rpm恒定攪動條件下。對于后續(xù)傳代，將細(xì)胞以0.4至0.5x106細(xì)胞/1112之間的濃度接種在T175培養(yǎng)瓶(Sarsted,ref831812502)中。短期適應(yīng)于新的培養(yǎng)條件后，細(xì)胞PDT從248H下降至128小時，并然后進(jìn)行下一步去除。因此，在52代，去除維生素，非必需氨基酸，丙酮酸鈉和(3-巰基乙醇。鑒于PDT達(dá)到44小時這一進(jìn)化，在56代，從57代開始，開始去除血清。因此，從57代開始，GTM-3培養(yǎng)基中僅添加5%FBS，IX酵母提取物和2.5mM谷氨酰胺。已經(jīng)去除了生長因子、詞養(yǎng)細(xì)胞、維生素、非必需氨基酸、丙酮酸鈉和P-巰基乙醇的細(xì)胞懸浮液開始去除血清。通過從5%血清開始，然后2.5%，然后2%,然后1.5%逐漸降低SFM細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清濃度，至最后達(dá)到SFM細(xì)胞培養(yǎng)基含0%血清而進(jìn)行血清的去除。血清去除開始于57代結(jié)束于77代。在血清去除期間，也進(jìn)行適應(yīng)于37。C的培養(yǎng)。因此，在65代，將在添加2.5。/。FBS的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至37°C，以避免逐漸的溫度變化。在去除血清結(jié)束時，貼壁非依賴的鴨.EB24細(xì)胞能夠在37。C、一在無生長因子、無飼養(yǎng)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中生長。獲得能在37°C、在添加2.5mM谷氨酰胺的SFM'GTM-3中生長的EB24細(xì)胞后，通過稀釋或逐漸適應(yīng)于新的SFM配方(如Excell63066、Excell66444、ExcellCHOACF)進(jìn)行一些進(jìn)一步改進(jìn)。進(jìn)行懸浮鴨EB24細(xì)胞的亞克隆，選擇鴨EB24-12亞克隆，因其有效復(fù)制病毒的良好表現(xiàn)。實施例5:表達(dá)載體和構(gòu)建體5.1-親代空表達(dá)載體pVVS431(pKNexp)VIVALIS載體骨架包含單個的抗性盒以允許質(zhì)粒在E.coli中擴(kuò)增，和在將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染禽類EBx⑧細(xì)胞后進(jìn)行克隆選擇?；蚓幋a新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶并賦予有機(jī)體以卡那霉素抗性i(原核生物)和新霉素抗性(真核生物)。轉(zhuǎn)錄被克隆進(jìn)串聯(lián)上游"^//基因的1核和真核啟動子驅(qū)動。編碼目的蛋白的cDNA克隆進(jìn)位于帶有易于互換啟動子'(即CMV啟動子…)、內(nèi)含子和polyA區(qū)域的空表達(dá)盒中的MCS(多克隆位點)中(圖l)。下列是帶有RSV啟動子序列的表達(dá)載體的例子；使用相似的方法構(gòu)建帶有CMV、EF&/HTLV、SV40、卩-Actin、mPGK、eiF4a、CAG、ENS隱1啟動子的表達(dá)載體。，5.2-馬區(qū)動IgGl輕鏈表;的帶有RSV啟動子的載體pVVS452(pRSV-IgGl-L)人-小鼠嵌合MabIgGl(K輕鏈)由MAT-Biopharma(Evry，法國)惠贈。將plgGl-L-克隆10(MAT-Biopharma)的平末端Ncol-KpnlDNA片段克隆進(jìn)入pKNexpMCS區(qū)域中的平末端Nhel-Notl位點以產(chǎn)生pVVS451(pCMV-IgGl-L)。在pVVS451中，Mab輕鏈的表達(dá)被CMV啟動子驅(qū)動。RSV啟動子(勞斯肉瘤病毒)獲自PhilippeMoullier(InsermU649-LaboratoiredeTh6rapieG6nique,CHUHotel-Dieu，Nantes)。RSV啟動子從pAAV5RSVLacZ以引物S029(RSV-Bgl2F:ATAAGATCTGCGATGTACGGGCCAGATA)(SEQIDN°7)和SO30(RSV-IPpoIR:TATGCTACCTTAAGAGAGTCCAGCTTGGAGGTGCACACC)(SEQIDN°8)進(jìn)行PCR擴(kuò)增而來。將RSV啟動子PCR片段和pVVS451用BglII和IPpoI進(jìn)行消化。將pVVS451CMV無啟動子(promoterless)DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠純化，并連接到RSV啟動子上以造出pVVS452(圖2A).5.3-驅(qū)動IgGl重鏈表達(dá)的帶有RSV啟動子的載體pVVS450(pRSV-H90H)Maby同種型獲自MAT-Biopharma(Evry，法國)。將pHIgGl-H-克隆28(MAT-Biopharma)的平末端NcoI-HindIIIDNA片段克l釜進(jìn)入pKNexpMCS區(qū)域的平末端Nhel-Notl位點以產(chǎn)生pVVS449(pCMV-HIgGlL)。在pVVS449中，Mab重鏈的表達(dá)被CMV啟動子驅(qū)動。將RSV啟動子的PCR片段和pVVS449用BglII和IPpol進(jìn)行消化。將pVVS449CMV無啟動子DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠純化并連接到RSV啟動子上以造出pVVS450(圖2B)。5.4在RSV啟動子調(diào)控下既表達(dá)H90輕鏈也表達(dá)重鏈的雙載體pVVS455(pRSV-LH-IgGl)和pVVS460(pRSV陽HL-IgGl)RSV啟動子驅(qū)動的IgGl輕鏈的表達(dá)盒通過PCR從pVVS452上，使用引物S029禾卩AS455(AscBamSV40polyAR:ATAGGCGCGCCGGATCCCGATCCTTATCGGATTTTACCAC)(SEQIDN°9)擴(kuò)增而來。將帶有RSV啟動子H90輕鏈和SV40晚期polyA的該DNA片段用Ascl和BamHI進(jìn)行消化。受體pVVS450載體經(jīng)AscI-BglII消化。將線性化載體的5，末端去磷酸化后，將其與純化的擴(kuò)增DNA片段連接造出pVVS455(pRSV-LH-IgGl)(圖3A)。同一S029和AS455引物用于從pVVS450上擴(kuò)增RSV啟動子驅(qū)動的IgGl重鏈表達(dá)盒。這一帶有RSV啟動子、IgGl重鏈和SV40晚期polyA的DNA片段用Ascl和BamHI進(jìn)行消化。受體pVVS452載體用AscI-BglII進(jìn)行消化。將線性化載體的5'末端去磷酸化后，將其與純化的PCRDNA片段連接造出pVVS460(pRSV-HL-IgGl)(圖3B)。5.5-帶有嘌呤霉素抗性的NR13表達(dá)載體pVVS438(pNR13-puro)從S86N45原雞(Gallusgallus)物種純化的的總RNA進(jìn)行RT-PCR實驗，以產(chǎn)生編碼NR13抗細(xì)胞凋亡基因的cDNA。帶有Nhel和Notl位點的寡核苷酸AS376(Nhel-NR13F:ACGCTAGCATGCCGGGCTCTCTGAAGGAGGAGAC)(SEQIDN°10)禾QAS377(Notl-NR13R:GAGCGGCCGCCTACCGCACCACCAAGAGAAAAGCTAATC)(SEQIDN°1l)分別用于產(chǎn)生NR13cDNA片段。在基于pCiNeo的載體中刪悟CMV啟動子并代以RSV啟動子，這樣的載體用作NR13cDNA的受體。2種DNA進(jìn)行Nhel和Notl消化后進(jìn)行連接實驗。連接產(chǎn)物用于進(jìn)行以引物S029和AS4349進(jìn)行的PCR擴(kuò)增以得到NR13RSV驅(qū)動的啟動子表達(dá)盒。這一PCR片段經(jīng)BglII和Swal消化。受體pVVS437載體經(jīng)BglII-SwaI消化。純化的插入片段和載體都連接起來以造出pVVS438(pNR13-puro)。實維例^在無血清i音養(yǎng)基，瞬時轉(zhuǎn),染和分離最佳啟動子6.1-瞬時轉(zhuǎn)染雞EBx細(xì)胞'在貼壁的雞EBx細(xì)胞中進(jìn)行2個報告基因(紅色熒光蛋白dsREDnuc和人血凝血因子IX)(每個被8個不同的啟動子驅(qū)動)的瞬時表達(dá)以分離最佳啟動子。在該實驗中測定的8個不同j的啟動子是:CMV啟動子(即人巨細(xì)胞病毒啟動子)；SV40啟動子(猴病毒40)ri人P-肌動蛋白啟動子；小鼠PGK啟動子(磷酸甘油酸激酶)；RSV-LTR(勞斯—瘤病毒的LTR);人類elF4a啟動子(翻譯起始因子4a);EFla-HTLV復(fù)合啟動子(連接至HTLV1病毒5'UTR區(qū)的人EF1延伸因子)；CAG復(fù)合啟動子(連接至雞(3-肌動蛋白啟動子上的CMV增強(qiáng)子)。將帶有這8個啟動子(表1)的表達(dá)載體用lipofectamineTM或fugeneTM試劑或通過電穿孔法瞬時轉(zhuǎn)染雞貼壁EBx⑧細(xì)胞系。觀察到其中報告基因的瞬時表達(dá)最高的4種啟動子是EFla-HTLV、RSV、CAG和CMV，并被選擇和進(jìn)一步用于在EBx細(xì)胞中表達(dá)嵌合人/小鼠IgGl。'表1:用于在瞬時表達(dá)實驗中驅(qū)動cDNA表達(dá)以選擇在EBx⑧細(xì)胞中表達(dá)水平高的啟動子的啟動子列表。^y^叛浮歪A,DMeW咖c..夷^^叛告歪A,'/zF漢；乂凝逾激fZZ;/gG7-丄Z/或iffi,克廣遂^一載沐齊,/^一名歡游啟動7承動游潔礙/gG/游存舒浙f舒。袞舒克廣剪置經(jīng)游J:,,畫經(jīng)克虔，輕凝游丄,。；FK&a;7/座報版函'纖,贈絲纖沐。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>可以得到在EBx⑧細(xì)胞中最高IgGl的表達(dá)的啟動子是EFla-HTLV、RSV和CMV(數(shù)據(jù)未顯示)并被進(jìn)一步進(jìn)行在EBx⑧細(xì)胞中表達(dá)嵌合人/小鼠IgGl的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗。.6.2-瞬時轉(zhuǎn)染鴨EBx細(xì)胞方法通過核轉(zhuǎn)染法(Amaxa，DE)將表達(dá)載體[pEFl/HTLV-IgGl輕鏈和重鏈〗(pvVS490)瞬時轉(zhuǎn)染懸浮鴨EBx細(xì)胞，其中懸浮鴨EBx細(xì)胞在添加2.5mM谷氨酰胺的無血清培養(yǎng)基(來自SAFCBiosciences的ExcellGTM3培養(yǎng)基)的六孔板中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24H和鄰小時通過ELISA檢測進(jìn)行IgGl的表達(dá)監(jiān)測。用無DNA的細(xì)胞作為對照核轉(zhuǎn)染。結(jié)果鴨EBx細(xì)胞瞬時表達(dá)高達(dá)4.5ng/ml的IgGl抗體(圖4)。實施例7:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和最佳生產(chǎn)克隆鑒定7.1-材料&方法細(xì)胞在添加2.5mM谷氨酰胺的無血清培養(yǎng)基(Excell-來自SAFCBiosciences)中培養(yǎng)雞EB14和鴨EB66細(xì)胞。表達(dá)載體對于EB14細(xì)胞pVVS490(pEFl/HTLV)禾UpVVS455(pRSV)對于EB66細(xì)胞pVVS490(pEFl/HTLV)轉(zhuǎn)染將表達(dá)載體在無血清培養(yǎng)基中通過電穿孔法(Amaxa)轉(zhuǎn)染入EB14和EB66細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后3天，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入選擇劑(遺傳霉素，對于EB14細(xì)胞是0.25mg/ml，對于EB66細(xì)胞是0.15mg/mL)。分離、'挑選和在較大培養(yǎng)容器(微孔板，培養(yǎng)瓶然后是生物反應(yīng)器)中培養(yǎng)遺傳霉素抗i克隆。'ELISA:對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆進(jìn)行ELISA篩選檢測以測定上清中的抗體表達(dá)水平。該檢測使用定量夾心酶免疫檢測技術(shù)。預(yù)先將抗IgG-Fc特異性抗體包被在96孔板中。將標(biāo)準(zhǔn)、樣品和交聯(lián)劑加入孔中，且任何存在的IgG被固定抗體和連接第二酶的IgG-K特異性單克隆抗體夾在中間。在沖洗以去除任何未結(jié)合的物質(zhì)和/或抗體-酶試劑后，將底物溶液加在孔中，顯色與結(jié)合的IgG的量成比例。使反應(yīng)終止且測定顯色強(qiáng)度(0.D.490nm)。通過Y軸上每一標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度對X軸上的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且通過圖上的點繪制出最佳適應(yīng)曲線。每一未知樣品的濃度通過計算標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)于曲線上平均吸步度的IgG的濃度而確定。例如，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的濃度必須乘以稀釋因素。'7.2—結(jié)果獲得許多穩(wěn)定轉(zhuǎn)染編碼嵌合人-小鼠IgGl的重鏈和輕鏈cDNA的表達(dá)載體的EBx⑧細(xì)胞克隆，并通過ELISA進(jìn)行選擇。最佳生產(chǎn)克隆被選擇并將其培養(yǎng)在較大容器中(圖5)。一種表達(dá)IgGl的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的EB14和EB66克隆適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)，并進(jìn)一步在3升攪拌釜式生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。在3升生物反應(yīng)器中非-最佳化(optimized)條件下培養(yǎng)9天后，EB14細(xì)胞密度達(dá)到16百萬細(xì)胞/ml，并且細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IgGl濃度是大約0.25g/1(圖6A)。在非-最佳化(optimized)條件下，在3升生物反應(yīng)器中EB66細(xì)胞也能有效地表達(dá)IgGl(圖6B)。實施例8:EBx⑧生產(chǎn)的IgGl單克隆抗體的糖基化模式分析將附著在EBx生產(chǎn)的IgGl上的聚糖進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，并與附著在人絲氨酸IgG上的聚糖的毛細(xì)管電泳分析進(jìn)行比較。獲得的結(jié)果證明，EBx糖基化特征與入糖基化特征相似(圖7A)。還用N-連接聚糖的Maldi-Toff質(zhì)譜分析對CHO(中國倉鼠卵巢)和雞EB14細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl的糖基化模式進(jìn)行了比較。雞EB14細(xì)胞生能產(chǎn)較普通CHO細(xì)胞(圖7B)或HEK細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)較少巖藻糖基化的抗體群。'通過Maldi-Toff質(zhì)譜分析對雞EB14細(xì)胞的一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆產(chǎn)生的IgGl的糖基化特征進(jìn)行了分析。分析了通過殘基Asn297連接到每個IgGl重鏈的的CH2結(jié)構(gòu)域的N-寡糖結(jié)構(gòu)(圖8)。該雞EB14細(xì)胞克隆產(chǎn)生的大多數(shù)IgGl抗體具有常見的雙觸角類型的N-連接寡齒結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含半乳糖基化的帶有GlcNac末端的長鏈。IgGl抗體群的一個重要部分(48%)是非巖藻糖基化(圖7B和8)。用N-連接聚糖的MALDI-TOF質(zhì)譜分析還對CHO(中國倉鼠卵巢)和鴨EB66細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl的糖基化模式進(jìn)行了比較。鴨EB66細(xì)胞能產(chǎn)生較普通CHO細(xì)胞(圖12-表2)較少巖藻糖基化的抗體群。通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析對鴨EB66細(xì)胞的一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆f生的IgGl的糖基化特征進(jìn)行了分析。分析了通過殘基Asn297連接到每個Igd重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域的N-寡糖的結(jié)構(gòu)(圖13)。該鴨EB66克隆產(chǎn)生的大多數(shù)IgGl抗體具有常見的雙觸角類型的N-連接寡糖結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含半乳糖基化的帶有GlcNac末端的長鏈。EB66產(chǎn)生的IgGl抗體群的一個重要部分(>50%)是非巖藻糖基化的(圖12，13，14)。相反地，CHO產(chǎn)生的同一IgGl抗體顯示出具有雙觸角類型的N-連接寡糖結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含高度巖藻糖基化(>70%)的帶有GlcNac末端的長鏈(圖12，13，14)。表2:鴨EB66細(xì)胞和CHO細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl中復(fù)雜類型N-連接寡糖的百分?jǐn)?shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>進(jìn)行了EB66細(xì)胞表達(dá)的IgGl上唾液酸殘基含量的分析。以乙酸(終濃度2M,80°C，2h)水解后，EB66克隆1D7表達(dá)的IgGl上存在的唾液酸被標(biāo)記上DMB(1，2-二氨基-4,5-二氧甲叉基-苯)。通過HPLC(熒光檢測)分析了N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAC)和N-乙醇?；窠?jīng)氨酸(NeuGc)的相對比例。NeuAc代表了在《EB66》IgGl上95。/。的唾液酸(見表3)。表3:EB66細(xì)胞(克ltjD7)產(chǎn)生的IgGl上的唾液酸的相對比例<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>實施例9:EBX⑧細(xì)胞相對于雜交瘤產(chǎn)生的IgGl的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的分析測定雞EB14細(xì)胞或雜交瘤產(chǎn)生的IgGl免疫球蛋白的抑制細(xì)胞增殖的活性的檢測被開發(fā)出來。IgGl抗體定向抗人腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的CD標(biāo)記。在氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶苷存在條件下培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，并在IgGl免疫球蛋白存在條件下，將其與來自正常患者的單核細(xì)胞或自然殺傷T細(xì)胞孵育。該檢測測定作為IgGl介導(dǎo)的經(jīng)單核細(xì)胞或NK細(xì)胞裂解腫瘤細(xì)胞的后果摻入到腫瘤細(xì)胞中的氚標(biāo)記的脫氧胸腺啼啶苷的量。培養(yǎng)4天后，以NK或或單核細(xì)胞和雞EB14細(xì)胞產(chǎn)生的IgGl抗體處理的腫瘤細(xì)胞中有少量氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶.摻入。相反地，以NK或單核細(xì)胞和雜交瘤產(chǎn)生的IgGl抗體處理的腫瘤細(xì)胞中觀察到較高水平的氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶摻入。所以，雞EB14細(xì)胞生產(chǎn)的IgGl顯示較雜交瘤產(chǎn)生的同一IgGl抗體具有較好的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性(圖9)。實施例10:EBX⑧細(xì)胞產(chǎn)生的IgGlMAB的ADCC活性10.1-方法使用標(biāo)準(zhǔn)密度離心程序?qū)碜詢擅】倒w的PBMC進(jìn)行分離并將其在RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基中以5xl()S細(xì)胞/ml重懸。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)疾病相關(guān)靶細(xì)胞，從活力大于90%的指數(shù)生長期將其收獲，以RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗，并標(biāo)記以100微居里的51Cr，以細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗2遍，并以細(xì)胞培養(yǎng)基以10S細(xì)胞/ml的密度重懸。將100微升疾病相關(guān)靶細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至96孔微孔板的每個孔中。將抗所述疾病靶細(xì)胞的抗原性表面標(biāo)記的抗體在細(xì)胞培養(yǎng)基中從4000ng/ml至0.04ng/ml進(jìn)行系列稀釋，將50微升所得抗體溶液加入96孔微孔板的靶細(xì)胞中，檢測包括上述整個濃度范圍的各個抗體濃度，重復(fù)3次。然后將96孔微孔板于50Xg離心1分鐘并在4°C孵育1小時。在每孔中加入50微升PBMC懸液以提供效應(yīng)物靶細(xì)胞的比例是25:1，并且將培養(yǎng)板置于5%0)2大氣、37。C孵箱中4小時。收獲每孔的無細(xì)胞上清，并使用Y計數(shù)器對實驗性釋放的放射活性(ER)進(jìn)行定量。10.2-結(jié)果使用從2名不同健康供體的PBMC中純化的NK細(xì)胞進(jìn)行的2個獨立的實驗顯示，與CHO細(xì)胞產(chǎn)生的同一抗體相比，雞EB14和鴨EB66細(xì)胞產(chǎn)生的定向抗疾病相關(guān)靶細(xì)胞的IgGl抗體的ADCC活性增加(圖10，15和16)。通過鉻釋放方法測定ADCC活性或通過表達(dá)IFNy或CD107標(biāo)記的NK細(xì)胞百分?jǐn)?shù)來估計ADCC活性(圖15)。實施例ll:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NR13抗細(xì)胞凋亡基因的貼壁的雞EBX⑧細(xì)胞的生長分析"構(gòu)建2種不同的表達(dá)載體pVVS437和pVVS438載體。pVVS437僅含有博來霉素抗性基因。PVVS438能表達(dá)嘌呤霉素抗性和雞抗細(xì)胞凋亡基因NR13。以pVVS437或pVVS438載體轉(zhuǎn)染雞貼壁EBx⑧細(xì)胞，選擇最佳生產(chǎn)者克隆。將表達(dá)NR13蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的EBx⑧細(xì)胞在100mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。不表達(dá)NR13蛋白的EBx⑧細(xì)胞不能存活于培養(yǎng)物中，并且大多數(shù)這種細(xì)胞在培養(yǎng)6至7天后死亡。僅有小的和穩(wěn)定比例的表達(dá)NR13蛋白的EBx⑧在培養(yǎng)過程中死亡，大多數(shù)NR13EBx⑧細(xì)胞在培養(yǎng)較長時期后仍然存活(圖ll)。權(quán)利要求1、一種轉(zhuǎn)染至少一種表達(dá)載體的禽類id="icf0001"file="A2008800171310002C1.tif"wi="10"he="3"top="31"left="103"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含至少一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含編碼目的重組蛋白的核酸序列，該序列通過操作連接至能影響所述蛋白在所述細(xì)胞中表達(dá)的啟動子序列上。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的EBx⑧細(xì)胞，其中表達(dá)載體進(jìn)一步包含至少一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含至少一種編碼選擇性標(biāo)記的核酸序列，所述核酸序列通過操作連接至能影響所述選擇性標(biāo)記在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動子序列上。3、根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的EBx⑧細(xì)胞，其中選擇性標(biāo)記選自谷氨酰胺合酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、嘌呤霉素、潮霉素B、新霉素基因或二氫葉酸還原酶(DHFR)。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的EBx⑧細(xì)胞，其中啟動子序列選自巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子、猴病毒40(SV40)早期啟動子、單純皰疹病毒(HSV)胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、鼠磷酸甘油酸激酶啟動子、elF4a啟動子、嵌合EFla/HTLV啟動子、CAG啟動子或(3-肌動蛋白啟動子。5、根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的EBx⑧細(xì)胞，其中所述表達(dá)盒進(jìn)一步包含一種或多種調(diào)控元件或調(diào)節(jié)性序列，其選自轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、內(nèi)含子序列、多腺苷酸化序列、終止序列或染色質(zhì)隔離元件。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的EBx細(xì)胞，其中染色質(zhì)隔離元件選自邊界元件(BE)、基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)、基因座調(diào)控區(qū)(LCR)或通用染色質(zhì)開放元件(UCOE)。7、根據(jù)權(quán)利要求l至6所述的EBx⑧細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體至少包含一第一表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN°l的CMV啟動子序列、內(nèi)含子序列、編碼目的重組蛋白的cDNA序列、多腺苷酸化序列；和一第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SV40啟動子、新霉素基因、多腺苷酸化序列。8、根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的EBx⑧細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體至少包含—第一表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN。2的嵌合EFla/HTLV啟動子序列、內(nèi)含子序列、編碼目的重組蛋白的cDNA序歹U、多腺苷酸化序列；和一第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SV40啟動子、新霉素基因、多腺苷酸化序列。9、根據(jù)權(quán)利要求l至6所述的EBx⑧細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體至少包含下列順序的一第一表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN。1的CMV啟動子、內(nèi)含子序列、編碼抗體的重鏈或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；一第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN。1的CMV啟動子、內(nèi)含子序列、編碼抗體的輕鏈或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；一第三表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SV40啟動子、新霉素基因、多腺苷酸化序列。10、根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的EBx⑧細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體至少包含下列順序的-一第一表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN。2的嵌合EFla/HTLV啟動子、內(nèi)含子序列、編碼抗體重鏈或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；一第二表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SEQIDN。2的嵌合EFla/HTLV啟動子、內(nèi)含子序列、編碼抗體輕鏈或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；_一第三表達(dá)盒，其包含下列順序的下列DNA序列SV40啟動子、新霉素基因、多腺苷酸化序列。11、根據(jù)權(quán)利要求1至10所述的EBx⑧細(xì)胞，其中細(xì)胞進(jìn)一步包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體至少包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含編碼抗-細(xì)胞凋亡蛋白的DNA序列，所述DNA序列通過操作連接至能影響所述抗細(xì)胞凋亡蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的啟動子序列上。12、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的EBx⑧細(xì)胞，其中抗細(xì)胞凋亡蛋白是雞NR13蛋白?！?3、根據(jù)權(quán)利要求l至12所述的EBx⑧細(xì)胞，其中表達(dá)載體穩(wěn)定摻入細(xì)胞的染色體DNA中。14、根據(jù)權(quán)利要求1至B所述的EBx⑧細(xì)胞，其中細(xì)胞是選自EB14或EBvl3細(xì)胞的雞EBx⑧細(xì)胞和選自EB24、EB24-12、EB26或EB66的鴨EBx細(xì)胞。15、根據(jù)權(quán)利要求14所述的EBx⑧細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是適應(yīng)于無血清培養(yǎng)基的懸浮EBx⑧細(xì)胞。16、根據(jù)權(quán)利要求14所述的EBx⑧細(xì)胞，其中細(xì)胞是適應(yīng)于無血清培養(yǎng)基的貼壁EBx⑧細(xì)胞。17、一種在禽類EBx⑧細(xì)胞中生產(chǎn)至少一種目的生物產(chǎn)品的方法，所述方法包含下列步驟a)通過轉(zhuǎn)染至少,.r種表達(dá)載體制備根據(jù)權(quán)利1至16所述的EBx⑧細(xì)胞；b)在合適的條件和在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述EBx⑧細(xì)胞；和c)從EBx⑧細(xì)胞、合適的培養(yǎng)基或既從所述EBx⑧細(xì)胞也從所述培養(yǎng)基收獲目的生物產(chǎn)品。18、根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中EBx⑧細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的貼壁培養(yǎng)中通過電穿孔法轉(zhuǎn)染至少一種表達(dá)載體。19、根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中EBx⑧細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)中通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至少一種表達(dá)載體。20、根據(jù)權(quán)利要求17至19所述的方法，其中目的生物產(chǎn)品是抗體分子、抗體片段或包括等同于免疫球蛋白Fc區(qū)的區(qū)域的融合蛋白，其中所述目的生物產(chǎn)品具有增強(qiáng)的Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。21、一種具有雞或鴨EBx⑧糖基化的目的生物產(chǎn)品。22、一種在EBx⑧細(xì)胞中生產(chǎn)并具有EBx⑧糖基化的抗體群，其中所述抗體群或其片段包含F(xiàn)c區(qū)，其包含大部分的帶有常見的雙觸角類型的N—連接巖藻糖基化的一寡糖結(jié)構(gòu)的抗體，所述寡糖結(jié)構(gòu)包含具有高度半乳糖基化的末端GlcNac的長鏈，且其賦予所述抗體強(qiáng)ADCC活性。23、根據(jù)權(quán)利要求22所述的具有IgGl或IgG3亞型的抗體，其在EBx⑧細(xì)胞生產(chǎn)并具有較雜交瘤或CHO細(xì)胞中生產(chǎn)的同一抗體增加的ADCC活性。24、作為藥物的根據(jù)權(quán)利要求21所述的目的生物產(chǎn)品。25、作為藥物的根據(jù)權(quán)利要求22和23所述的抗體或其片段。26、根據(jù)權(quán)利要求24所述的生物產(chǎn)品或根據(jù)權(quán)利要求25所述的抗體或其片段在制備用于預(yù)防或治療人和動物疾病的藥物組合物中的用途。27、一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求24所述的生物產(chǎn)品或根據(jù)權(quán)利要求25所述的抗體或其片段和藥學(xué)上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明一般涉及重組蛋白生產(chǎn)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及名為EBx的禽類胚胎來源的干細(xì)胞系在生產(chǎn)蛋白中的用途，并且更特別地，是在生產(chǎn)糖蛋白如抗體中的用途。本發(fā)明用于生產(chǎn)具有高細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性的單克隆IgG1抗體亞型。本發(fā)明涉及這樣的抗體作為藥物在治療癌癥和炎性疾病中的用途。文檔編號A61K39/395GK101688179SQ200880017131公開日2010年3月31日申請日期2008年5月21日優(yōu)先權(quán)日2007年5月21日發(fā)明者M(jìn)·梅赫泰里申請人:維渦里斯公司