專利名稱：：急性肝炎治療劑或爆發(fā)性肝炎預(yù)防、治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：0001本發(fā)明涉及含有載脂蛋白A-II作為有效成分的急性肝炎治療劑或爆發(fā)性肝炎預(yù)防、治療劑。
背景技術(shù)：
：0002肝臟在合成身體必需物質(zhì)、排泄廢物等生命活動中擔(dān)任重要角色。具有上述作用的肝細(xì)胞被病毒、酒精、藥物等破壞時導(dǎo)致的肝臟發(fā)炎、肝功能下降的疾病即為肝炎。肝炎的癥狀表現(xiàn)為全身乏力，食欲不振，嘔吐，發(fā)熱，黃疰等。將肝炎發(fā)生6個月之內(nèi)表現(xiàn)出癥狀的特稱為急性肝炎。將呈現(xiàn)急性肝炎癥狀后8周以內(nèi)基于高度肝細(xì)胞功能障礙而引發(fā)肝昏迷II級以上的腦癥、凝血酶原時間40%以下的情況稱為爆發(fā)性肝炎。在爆發(fā)性肝炎中，肝細(xì)胞被急劇且大量破壞，導(dǎo)致肝細(xì)胞來不及增殖、再生，預(yù)后極不良。所以應(yīng)盡早預(yù)知從急性肝炎發(fā)展為爆發(fā)性肝炎的情況，以便盡早開始適宜處理。0003據(jù)稱，日本每年患急性肝炎的患者人數(shù)達(dá)35萬，其中發(fā)展為爆發(fā)性肝炎的患者人數(shù)是每年數(shù)千人。爆發(fā)性肝炎的發(fā)病機(jī)理被認(rèn)為是伴隨機(jī)體免疫應(yīng)答，且與肝局部的各種因素密切相關(guān)，但對其全局的認(rèn)識尚有諸多不明確之處。0004為了預(yù)知從急性肝炎發(fā)展為爆發(fā)性肝炎的情況，有必要注意患者的主觀癥狀及肝功能檢查中的各種異常值。一般情況下，從急性肝炎發(fā)展為爆發(fā)性肝炎的過程依以下順序發(fā)生由肝細(xì)胞急劇破壞導(dǎo)致肝合成功能下降，肝解毒代謝功能隨繼下降。肝細(xì)胞大量且急劇破壞會呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的全身乏力、食欲不振等主觀癥狀，并伴隨丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶3(AST)等氨基轉(zhuǎn)移酶水平和LDH(乳酸脫氫酶)水平的升高而引發(fā)黃疰的癥狀。另外，隨著肝解毒代謝功能下降而出現(xiàn)肝昏迷I或II級神經(jīng)癥狀，所以診斷時進(jìn)行腦波檢查也是重要的。最近也有有關(guān)預(yù)測、診斷爆發(fā)性肝炎等肝炎的病情的診斷試劑盒和診斷標(biāo)記的報道(專利文獻(xiàn)1)。受益于發(fā)現(xiàn)癥狀、檢查結(jié)果、診斷技術(shù)的不斷發(fā)展、如今也有可能以相當(dāng)高的準(zhǔn)確率預(yù)知從急性肝炎到爆發(fā)性肝炎的發(fā)展。0005急性肝炎的治療以靜養(yǎng)為基本，隨著病情發(fā)展而實(shí)施甘草皂苷等保肝劑的對癥療法。作為急性肝炎或爆發(fā)性肝炎的治療劑，有人提議使用含有丙氨酸、谷胱甘肽、鳥氨酸中至少一種的制劑(專利文獻(xiàn)2)、含有血小板活性因子拮抗劑的制劑(專利文獻(xiàn)3)含有胰島素樣生長因子或其衍生物的制劑(專利文獻(xiàn)4)等，但均非十分有效、尚未達(dá)到實(shí)用化。爆發(fā)性肝炎的治療方法有血漿交換、輸血、血液透析及其他的治療方法。最近還有人嘗試肝移植，但預(yù)后不良，存活率為約30%。又當(dāng)病毒為病原時，也有人正在嘗試用干擾素療法作為抗病毒療法，但這種療法會帶來發(fā)燒、關(guān)節(jié)痛、肌痛、白血球和血小板數(shù)減少，食欲降低、體重下降、脫發(fā)、甲狀腺功能異常、心肌障礙、糖尿病惡化、蛋白尿等副作用，故也非十分有效。專利文獻(xiàn)l:特開2008-17777號公報專利文獻(xiàn)2:特開平5-221858號公報專利文獻(xiàn)3:特開平7-304689號公報專利文獻(xiàn)4:特開平9-143094號公報
發(fā)明內(nèi)容擬解決的技術(shù)課題0006根據(jù)以上情況，非常希望開發(fā)出具有以下效果的急性肝炎治療劑或爆發(fā)性肝炎預(yù)防、治療劑通過預(yù)知從急性肝炎至爆發(fā)性肝炎的發(fā)展而早期開始治療而防止爆發(fā)性化、且即便在爆發(fā)性化發(fā)生后也有治療效果，并且副作用少。解決課題的技術(shù)方案0007本發(fā)明人在研究作為血液中的高密度脂蛋白HDL(高密度脂蛋白)成分的載脂蛋白A-II對機(jī)體的作用時偶然發(fā)現(xiàn)，所述載脂蛋白A-II對治療急性肝炎，預(yù)防、治療爆發(fā)性肝炎有效，且也觀察不到副作用。并基于此進(jìn)行更多研究而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明是含有栽脂蛋白A-II作為有效成分的急性肝炎治療劑或爆發(fā)性肝炎預(yù)防、治療劑。0008作為本發(fā)明的有效成分的栽脂蛋白A-II是高密度脂蛋白HDL的主要成分。HDL的化學(xué)組成的約50重量％是蛋白，其余約50重量％是以磷脂和膽固醇為主的脂類成分。HDL的蛋白成分中栽脂蛋白A-II的含量僅次于載脂蛋白A-I，其占蛋白成分全體的約20重量％。已知載脂蛋白A-II的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其為由77個氨基酸構(gòu)成的分子量約為8700的多肽。已知血液中的HDL為在第六個殘基半胱氨酸處以二石克鍵結(jié)合的二聚體結(jié)構(gòu)(TheLipidVol.2，No.3243-249，1991-4)。有體外實(shí)驗報道載脂蛋白A-II的生理作用，如通過將栽脂蛋白A-II取代為載脂蛋白A-I，可活化肝脂肪酶、抑制LCAT(卵磷脂-膽固醇-?；D(zhuǎn)移酶，Lecithin-cholesterolacyltransferase)的活'性，栽脂蛋白A-II抑制由凝血因子Vila的凝血因子V的活化，但尚未明確其體內(nèi)作用。而且，有報道稱高脂血癥患者的血中載脂蛋白A-II的濃度呈現(xiàn)升高的趨勢，而肝病(例如急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等)患者的血中栽脂蛋白A-II的濃度呈現(xiàn)下降的趨勢(臨床病理XXIX:2，135~138(1981))。但也僅記栽了肝炎患者的栽脂蛋白AH減少的事實(shí)，而未記載向患肝病(尤其是具有患急性肝炎和爆發(fā)性肝炎可能性的患者)施用載脂蛋白A-II可預(yù)防或治療肝炎。0009可通過常規(guī)蛋白分離提純方法從人血漿分離到作為本發(fā)明的有效成分的載脂蛋白A-II，，也可使用利用生物的基因重組技術(shù)生產(chǎn)所述載脂蛋白A-II。例如，特開昭63-237789號公報記栽了可通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)入了編碼載脂蛋白A-II基因的表達(dá)載體的大腸桿菌、枯草桿5菌、放線菌等原核細(xì)胞生物及酵母等真核生物細(xì)胞來制備作為本發(fā)明的有效成分的載脂蛋白A-II。栽脂蛋白A-II只要是具有預(yù)防、治療急性肝炎或爆發(fā)性肝炎的效果的即可，可使用在動物體內(nèi)的或由動物細(xì)胞生產(chǎn)出的栽脂蛋白A-II，也可使用通過基因重組技術(shù)使載脂蛋白A-II的結(jié)構(gòu)的一部分缺失、將結(jié)構(gòu)中的氨基酸取代為其他氨基酸或經(jīng)修飾的變體，及其糖鏈經(jīng)修飾或缺失的類似物。對于純度而言，只要是經(jīng)純化而在例如還原凝膠電泳中呈現(xiàn)單一條帶的程度即可，無需限定純化方法或原材料。0010栽脂蛋白A-II的具有代表性的制法有，從人血漿或其衍生物中分離純化的方法(例如AnalyticalBiochemistry178,301-305(1989))以及利用基因重組技術(shù)制備的方法等。人血漿的衍生物是例如將人血漿用科恩低溫乙醇分級分離法得到的沉淀級分IV-1或用KistlerandNitschmann法通過4氐溫乙醇分級分離法得到的沉淀級分B等。0011用人血漿或血漿級分衍生物制備出載脂蛋白A-II的具體方法有例如以下方法。首先將含有栽脂蛋白A-II的人血漿或人血漿級分衍生物在低溫(例如10。C以下)溶于緩沖液。然后加入例如乙醇/氯仿溶液進(jìn)行混合，離心，將下層的脂類成分去除，回收上清蛋白成分。向回收的上清中添加乙醇，進(jìn)行離心，將沉淀下來的高分子蛋白去除，回收上清。再向回收的上清中添加乙醇進(jìn)行離心，去除沉淀下來的栽脂蛋白A-l，回收含有載脂蛋白A-II的上清。用氯化鈉溶液超濾處理含有載脂蛋白A-II的上清，以去除乙醇。然后再用磷酸緩沖液進(jìn)行超濾處理后濃縮至合適濃度。對于脫脂不充分的經(jīng)純化載脂蛋白A-II，則通過加入乙醇/氯仿溶液進(jìn)行混合，離心而去除下層的脂類成分。上清載脂蛋白A-II用如上所述的方法進(jìn)行超濾而去除乙醇，并濃縮至合適濃度。通過這些操作得到了經(jīng)純化的栽脂蛋白A-II。0012制備栽脂蛋白A-II的另一優(yōu)選例為利用基因重組技術(shù)的方法。根據(jù)基因重組技術(shù)制備載脂蛋白A-II時，首先從DNA文庫中得到編碼人載脂蛋白A-II基因的cDNA，用合適的引物擴(kuò)增所述基因而得到編碼載脂蛋白A-II的多核苷酸。將所述多核苷酸插入克隆載體中進(jìn)行克隆后，切出編碼載脂蛋白A-II的多核苷酸，并根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法將其插入合適的表達(dá)載體內(nèi)。用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌、枯草桿菌等原核細(xì)胞，或酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等真核細(xì)胞)，并從所述經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)物中分離純化所述載脂蛋白A-II。優(yōu)選的宿主細(xì)胞有短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)等細(xì)菌類、裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)等酵母菌。0013當(dāng)根據(jù)基因重組技術(shù)由桿菌等微生物進(jìn)行生產(chǎn)時，用具有可在微生物中復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)、啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、DNA克隆位點(diǎn)、終止子等的表達(dá)栽體制成重組了編碼栽脂蛋白A-II的多核苷酸的表達(dá)栽體?？赏ㄟ^用所述表達(dá)栽體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)而得到的轉(zhuǎn)化體，并從培養(yǎng)物中分離、純化目的蛋白來得到載脂蛋白A-II。其中，當(dāng)向任意的翻譯區(qū)域前后附加起始密碼子和終止密碼子時，可得到含任意區(qū)域的蛋白片段。另外，還可作為與其他蛋白的融合蛋白進(jìn)行表達(dá)?？赏ㄟ^將該融合蛋白用合適的蛋白酶切斷來得到重組的載脂蛋白A-II。0014含有栽脂蛋白A-II的制劑可有水溶液、懸濁劑、凍干劑等，可通過適宜混合藥學(xué)上可接受的添加劑(稀釋劑、pH調(diào)節(jié)劑、等滲劑、表面活性劑等)，根據(jù)制劑制備中的常規(guī)手法將這些制成制劑。另外，凍干劑在使用時用注射用蒸餾水等溶解液溶解。0015用真核細(xì)胞生產(chǎn)重組載脂蛋白A-II時，將編碼載脂蛋白A-II的多核苷酸插入具有啟動子,、剪接區(qū)域、多聚(A)附加位點(diǎn)等的真核細(xì)胞用表達(dá)載體來制成重組栽體，將所述載體導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)，并從其培養(yǎng)物中分離、純化目的蛋白即可。其中所述真核細(xì)胞一般使用猴腎細(xì)胞COS7、中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO等哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞，出芽酵母、分裂酵母、蠶細(xì)胞、非洲爪蟾卵細(xì)胞等，但只要是能7表達(dá)重組載脂蛋白A-II的真核細(xì)胞均可。將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法可使用公知的電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE右旋糖酐法等。0016將重組的載脂蛋白A-II在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，為從培養(yǎng)物中分離純化目的蛋白，可使用公知的分離操作組合。例如用尿素等變性劑和表面活性劑進(jìn)行處理、超聲波處理、酶消化、鹽析和溶劑沉淀法、透析、離心、超濾、凝膠過濾、SDS-PAGE、等電點(diǎn)電泳、離子交換層析法、疏水層析法、親和層析法、逆相層析法等。0017此外，在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白在經(jīng)翻譯后可在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)各種修飾。因此，本發(fā)明中使用的重組栽脂蛋白A-II也包括經(jīng)N末端曱硫氨酸脫離、N末端乙?；?、糖鏈附加、被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的限制性分解、十四?；?、異戊烯化、磷酸化等翻譯后修飾的蛋白。0018這樣得到的載脂蛋白A-II中不含有殘留雜質(zhì)。又可與藥學(xué)上可接受的媒質(zhì)均勻混合而制成制劑。其中所述媒質(zhì)可根據(jù)藥劑的施用形態(tài)從寬范圍內(nèi)適宜選擇?？筛鶕?jù)需要將鹽、氨基酸、有機(jī)酸、糖醇、白蛋白等蛋白與多元醇等合適的穩(wěn)定劑共保存。0019本發(fā)明的制劑的施用途徑非特限于經(jīng)口和非經(jīng)口，但優(yōu)選靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射等非經(jīng)口施用，其中靜脈注射尤佳。作為注射劑，可根據(jù)常規(guī)方法將一定量的經(jīng)純化載脂蛋白A-II在無菌條件下與注射用蒸餾水混合即可，此時優(yōu)選適量配合緩沖劑、等滲劑、穩(wěn)定劑等。作為具體例，優(yōu)選使用磷酸鈉、檸檬酸鈉、氯化鈉、L-谷氨酸等。0020作為本發(fā)明涉及的急性肝炎治療劑或爆發(fā)性肝炎預(yù)防、治療劑的施用量，可根據(jù)對象施用充分發(fā)揮效果的量，可根據(jù)劑型、施用方法、每天施用次數(shù)、癥狀程度、體重、年齡等適宜增減。在對成年人靜脈注射的情況下，載脂蛋白A-II通常為約1~1000mg/kg，優(yōu)選約3~500mg/kg。可將所述量分成每天1~3次施用。發(fā)明效果0021本發(fā)明涉及的急性肝炎治療劑或爆發(fā)性肝炎預(yù)防、治療劑以載脂蛋白A-II作為有效成分，無副作用或副作用甚微，安全且可有效治療急性肝炎或預(yù)防、治療爆發(fā)性肝炎。實(shí)施方式0022以下通過例舉實(shí)施例及實(shí)驗例來具體說明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例0023含有載脂蛋白A-II的制劑的配制將基本去除肝炎病毒和其他病原微生物的人血漿作為原料，用人血漿科恩低溫乙醇分級分離法得到IV-1級分。將1.2kg所迷級分IV-1在28。C的低溫室中溶于含100mM三(羥甲基)氨基甲烷和6M尿素的，pH被調(diào)至7.8~8.2的2,4L溶液中。然后再加入與溶解液等量的乙醇/氯仿溶液(1:1)進(jìn)行混合，在4。C下、以12000g、離心10分鐘，回收上清蛋白成分。向回收的3.4L上清中添加4.1L(1.2倍的量)乙醇，在4。C下、12000g、離心10分鐘，回收上清6.8L。又向回收的上清中添加5.4L(0.8倍的量)的乙醇，在4。C下、12000g、離心10分鐘，回收含有載脂蛋白A-II的上清12L。對于含有載脂蛋白A-II的上清，則用截留分子量為10000的超濾膜(Pole公司制造)，通過注入120L的150mM氯化鈉溶液進(jìn)行超濾，以去除乙醇。接著注入含有20L150mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7)進(jìn)行超濾，以置換溶液。然后，通過超濾將栽脂蛋白'A-II濃縮至4mg/ml。接著，向500ml載脂蛋白A-II濃縮液加入等量的乙醇/氯仿(1:l)溶液進(jìn)行混合，在4。C下、12000g、離心10分鐘，去除下層，回收上清750ml。將上清用截留分子量為10000的超濾膜(Millipore公司制造)，通過注入25L150mM氯化鈉溶液進(jìn)行超濾，以去除乙醇。接著注入20L含有150mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH7)進(jìn)行9超濾，以置換溶液。然后進(jìn)行濃縮至含有22mg/ml載脂蛋白A-II。隨后，用孔徑為0.22nm的無菌過濾器(Millipore公司制造)進(jìn)行無菌過濾，得到載脂蛋白A-II制劑。對載脂蛋白A-II制劑的分析結(jié)果示于表1。0024<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>可將通過上述方法制得的制劑直接作為注射液使用。實(shí)施例0025(1)基因重組人載脂蛋白A-II表達(dá)載體的構(gòu)建將人肝臟cDNA文庫(寶生物公司制造，商品代碼9505)作為模板，通過PCR法克隆人載脂蛋白A-II基因。其中將序列表中SEQIDNO:l所示序列作為正向引物，以序列表中SEQIDNO:2所示序列作為反向引物。將得到的PCR片段用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)根據(jù)TA克隆法克隆于pCR2.1載體(Invitrogen公司制造)中。(2)用短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)制備人栽脂蛋白A-II表達(dá)林通過用含有所得人載脂蛋白A-II基因的栽體轉(zhuǎn)化短芽孢桿菌"(Bacillusbrevis)來構(gòu)建表達(dá)株。構(gòu)建表達(dá)林的方法根據(jù)專利公報第3734593號記栽的方法進(jìn)4亍。首先根據(jù)所述專利實(shí)施例1的方法構(gòu)建質(zhì)粒栽體，然后構(gòu)建插入了人栽脂蛋白A-II基因的質(zhì)粒栽體。然后，根據(jù)所述專利實(shí)例5所述方法，用電穿孔法轉(zhuǎn)化短芽孢桿菌H102(FERMBP-1087)。(3)將所述轉(zhuǎn)化體在TMN培養(yǎng)基中，于30'C下培養(yǎng)3天后，離心培養(yǎng)液分離上清，得到培養(yǎng)上清。為了證實(shí)所得人載脂蛋白A-H的氨基酸序列，用3100型DNA測序儀(ABI公司制造)分析pCR2.1載體的堿基序列，當(dāng)將其轉(zhuǎn)變?yōu)榘被釙r，得到序列表中SEQIDNO:3所示序列。此氨基酸序列是與記載于Swiss-ProtProteinKnowledgebase的人栽脂蛋白A-II(初次登錄號為P02^52)的成熟蛋白部分相同的序列。實(shí)施例0026由基因重組人載脂蛋白A-II的表達(dá)林(短芽孢桿菌)的培養(yǎng)上清配制含有載脂蛋白A-II的制劑將表達(dá)、分泌人載脂蛋白A-II的短芽孢桿菌的培養(yǎng)上清和含有1M氯化鈉的—20mM磷酸緩沖液(pH6.6~7.0)等量混合，攪拌后，使其通過0.45jim過濾器(Millipore公司制造)以去除沉淀。將此濾液裝栽于預(yù)先用含有0.5M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH6.87.4)平衡的HistrapFF(GEHealthcare公司制造)上。然后用與進(jìn)行平衡時相同的溶液進(jìn)行洗滌，隨后再用含有0.5M氯化鈉和40mM咪唑的20mM磷酸緩沖液(pH7.0~7.5)洗滌。最后用含有0,5M氯化鈉和500mM咪唑的20mM磷酸緩沖液(p!T7.0~7.5)洗脫吸附于HistrapFF上的級分。將吸附于HistrapFF上的級分的洗脫液用截留分子量10000的離心超濾膜(Millipore公司制造)通過注入含有150mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液進(jìn)行超濾，以置換液體。再進(jìn)行超濾濃縮，4吏濃縮至含13mg/ml載脂蛋白A-II。接著用孔徑0.22pm的無菌過濾器(Millipore公司制造)進(jìn)行無菌過濾，作為栽脂蛋白A-II制劑。實(shí)施例0027同實(shí)施例3—樣實(shí)施HistrapFF,將得到的洗脫液組分用截留分子量5000的離心超濾膜(MilliporeZ/^司制造)通過注入含有3M尿素及0.5M氯化鈉的3.3mM磷酸緩沖液(pH6，8~7.4)進(jìn)行超濾，以置換液體。將所述含有人載脂蛋白A-II的級分裝載于預(yù)先用含有3M尿素及0.5M氯化鈉的3.3mM磷酸緩沖液(pH6.8~7.4)11平衡的40jim的I型Macro-prep羥基磷灰石陶乾(BioRad公司制造)上，回收未吸附的級分。然后將此未吸附的級分用截留分子量5000的離心超濾膜(Millipore公司制造)，通過注入含有150mM氯化鈉的20mM磷酸緩沖液進(jìn)行超濾，以置換液體。再進(jìn)行超濾濃縮，使?jié)饪s至含2mg/ml載脂蛋白A-II。接著用孔徑0.22nm的無菌過濾器(Millipore公司制造)進(jìn)行無菌過濾，作為載脂蛋白A-II制劑。實(shí)施例0028SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)將實(shí)施例l和實(shí)施例4中得到的載脂蛋白A-II制劑的濃度調(diào)節(jié)至在OD280nm處的吸光度相同。將本樣品作為非還原樣品。另外，將本樣品用30mg/ml的DTT(和光純藥公司制造)處理，作為還原樣品。將非還原樣品和還原樣品在15%的均勾SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。其結(jié)果示于圖1。0029蛋白印跡法將實(shí)施例l和實(shí)施例4中得到的載脂蛋白A-II制劑的濃縮調(diào)節(jié)至在OD280nm處的吸光度相同。將本樣品經(jīng)SDS-PAGE后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(ATTO公司制造)上，并用山羊抗人栽脂蛋白All多克隆抗體(SANTACRUZBIOTECHNOLOGY公司制造)進(jìn)行第一次反應(yīng)。然后用經(jīng)HRP標(biāo)記的兔抗山羊免疫球蛋白抗體(DAKO公司制造)進(jìn)行第二次反應(yīng)，并通過DAB法顯色，其結(jié)果示于圖2。0030如圖1和圖2所示，經(jīng)SDS-PAGE染色的蛋白——實(shí)施例1的制劑和實(shí)施例4的制劑均與抗人載脂蛋白A-II抗體反應(yīng)，從而證實(shí)二者具有相同的抗原性。而且，在還原電泳圖中顯示為單一條帶。而且，當(dāng)比較圖1和圖2中實(shí)施例1的制劑和實(shí)施例4的制劑的條帶時，實(shí)施例4的制劑的條帶位置顯示其分子量稍大。這是由于在重組體中附加了His-Tag的分子量(6個組氨酸殘基)所致。實(shí)施例0031為比較在實(shí)施例1和實(shí)施例4中制備的制劑，通過制作肽圖進(jìn)行了檢驗。向20^il各制劑經(jīng)稀釋至載脂蛋白A-II為200ng/ml的經(jīng)配制溶液中各添加4jil樣品緩沖液(350mMTr';s-HCl、pH6.8、30%甘油、10%SDS、0.3%BPB、30%2-巰基乙醇)，在100。C下處理5分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE，并進(jìn)行CBB染色(PhastGelBlueR，AmershamBiosciences公司制造)。用電泳后凝膠上10kDa附近的條帶全量如下進(jìn)行凝膠內(nèi)消化。用刀將凝膠切成約lmmxlmm，并在lml純水中攪拌、洗滌(20分鐘x2次)。然后在50jU含有7M胍及10mMEDTA的0.5MTris-HCl緩沖液(pH8.5)中攪拌、洗滌(30分鐘)后，再于含lml50。/。的乙腈及l(fā)mMEDTA的50mM磷酸緩沖液(pH7.8)中攪拌、洗滌(20分鐘x2次)。再于lml乙腈中攪拌、洗滌(5分鐘)后，在干燥袋(義匕。一卜'"'少夕)內(nèi)干燥凝膠。向經(jīng)干燥的凝膠中添加10nl溶于含有2mMEDTA的100mM磷酸緩沖液(pH7.8)的內(nèi)切蛋白酶Glu-C(V8)(酶:底物=1:1)中。在冰上靜置1小時，使凝膠膨脹潤濕后，加入20~60jU含有2mMEDTA的100mM磷酸緩沖液(pH7.8)浸透凝膠，并在25。C下消化24小時。消化后，在干燥袋內(nèi)濃縮至全量50nl以下。向經(jīng)濃縮的樣品中加入0.1%三氟乙酸至達(dá)到55jd，并用其中的50nl在以下條件下進(jìn)行HPLC分析。HPLC條件裝置LC-10Avp系統(tǒng)(島津制作所制造)柱218TP54(4.6mml.D.x25cm、Vydac^^司制造)柱溫度40°C流速lml/分鐘檢測波長215nm移動相A:0.1%三氟乙酸移動相B:0.1%三氟乙酸/80%乙腈梯度條件0/040/5—75/554100/65—100/7540/85—0/90(%B/13分鐘)實(shí)施例1的肽圖結(jié)果示于圖3,實(shí)施例4的肽圖結(jié)果示于圖4。實(shí)施例1及實(shí)施例4中配制的制劑，除His-tag部分之外，表現(xiàn)出相同的肽圖，從而證實(shí)實(shí)施例1和實(shí)施例4的制劑相同。實(shí)施例0032基因重組人載脂蛋白A-II表達(dá)載體的構(gòu)建及利用酵母制備載脂蛋白A-II的表達(dá)抹人工合成了人載脂蛋白A-II基因。其堿基序列如配列表中SEQIDNO:4所示。將得到的人載脂蛋白A-II基因插入表達(dá)栽體pTIlM5(東田英毅、酵素工學(xué)-工一義、第57號、2007年4月)的多克隆位點(diǎn)中，從而構(gòu)建了誘導(dǎo)型表達(dá)用載體。根據(jù)岡崎等(Okazakietal,"NucleicAcidsRes."，18，6485-6489，1990)的方法用此i秀導(dǎo)型表達(dá)用載體和亮氨酸營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)載體pAL7轉(zhuǎn)化裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)ATCC38399而構(gòu)建表達(dá)林。將所述表達(dá)林用5ml含有G418的液體培養(yǎng)基YELG10(0.5%細(xì)菌用酵母提取物、3%葡萄糖、lOpg/mlG418)在32。C下培養(yǎng)7天。將所述培養(yǎng)物在5mlYPDG100(1%細(xì)菌用酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%葡萄糖、10ng/mlG418)中于32。C下培養(yǎng)7天后，再通過離心將菌體和上清分離，回收菌體。將菌體樣品懸浮于0.8ml菌體破碎緩沖液(50mMTris-HCL、pH7.5、0.1M氯化鈉、蛋白酶抑制劑(Roche公司制造))中，加入等容量的玻璃珠，用破碎機(jī)破碎4次，從而配制成菌體破碎液。將此菌體破碎液離心，回收含有栽脂蛋白A-II的上清。載脂蛋白A-II的表達(dá)量為2mg/L。實(shí)施例80033由基因重組人載脂蛋白A-II的表達(dá)林(裂殖酵母)培養(yǎng)菌體制備載脂蛋白A-II制劑將實(shí)施例7中制備的表達(dá)林于300mlYPDG100培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%蛋白胨、2%葡萄糖、0.1mg/mlG418)中培養(yǎng)。用3個小型發(fā)酵罐，在30。C下培養(yǎng)66小時，得到總量14.4g(濕重)的菌體。14將從每個小型發(fā)酵罐中回收的菌體懸浮于16~17ml破碎緩沖液(50mMTris-HCl、pH7.S、O.IM氯化鈉、蛋白酶抑制劑(Roche公司制造))中，再補(bǔ)入所述破碎緩沖液至配制成20ml的菌體懸浮液。接著，向配制的20ml各菌體懸濁液中加入同等容量的玻璃珠(直徑0.5mm)，并用破碎機(jī)破碎4次(以2500rpm破碎60秒鐘)，回收菌體破碎液13ml。將殘留的附著于玻璃珠上的破碎菌體用5ml破碎緩沖液洗滌，將此洗滌液并入先前的菌體破碎液中。將其以5000g離心IO分鐘，取上清。載脂蛋白A-II的表達(dá)量為2mg/L。將配制的上清用下述2種His-Tag柱進(jìn)行純化。首先將54ml上清裝栽于20ml的TALON單步驟柱(Clontech公司制造)上，用2ml含有500mM咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)4亍洗脫。將此洗脫液用DW稀釋3倍后，裝載于0.6ml的HisSpinTrap柱(GEHealthcare公司制造)上，用2ml含有500mM咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。然后，將洗脫液用0.5ml的高速離心過濾柱VIVASPIN500(Sartorius公司制造)進(jìn)行濃縮，并進(jìn)行PBS緩沖液交換(pH7,5)，從而得到含有栽脂蛋白A-II的制劑。實(shí)施例90034動物實(shí)驗l準(zhǔn)備22只實(shí)驗用7周齡雄性Balb/c小鼠(日本CharlesRiver公司制造)。將實(shí)施例1中配制的載脂蛋白A-II以4mg/kg的劑量靜脈內(nèi)一次施用給其中的8只小鼠(A-II施用組)。IO分鐘后，向A-II施用組的8只與其他8只(對照組)共計16只小鼠腹膜內(nèi)一次施用作為爆發(fā)性肝炎引發(fā)劑的700mg/kg半乳糖胺鹽酸鹽(Sigma公司制造)和50ng/kg脂多糖(大腸桿菌0111:B4，Sigma公司制造)。另外，將既未施用載脂蛋白A-II，也未施用爆發(fā)性肝炎引發(fā)劑的6只小鼠作為正常組。在施用載脂蛋白A-II制劑6小時后，在二氧化碳麻醉下，從腹部大動脈處采血得到血清。測定所述血清中作為肝功能障礙的指標(biāo)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST),算出各平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。有關(guān)ALT及AST的統(tǒng)計學(xué)解析，則分別通過t檢驗(Excel、Microsoft)檢查相對于正常組的對照組發(fā)癥和相對于對照組的A-II施用組的效果來進(jìn)行。其結(jié)果示于表2。0035表2實(shí)施例1的A-II(4mg/kg)施用組對照組正常組ALT(IU/L)1053±455^2896±862##51士4AST(IU/L)339±99*698±189##73±5*:對于對照組P〈0.05##:對于正常組PO.Ol如表2所示，相比正常組，對照組血中的ALT及AST顯著增力口。但是，對照組中呈現(xiàn)的肝功能高度障礙在A-II制劑施用組中顯著被抑制。根據(jù)此實(shí)驗證實(shí)了載脂蛋白A-II制劑對爆發(fā)性肝炎具有預(yù)防效果。A-II制劑施用組中未發(fā)現(xiàn)曾認(rèn)為施用載脂蛋白A-II制劑會出現(xiàn)的副作用。實(shí)施例100036動物實(shí)驗2準(zhǔn)備18只實(shí)驗用7周齡雌性Balb/c小鼠(日本CharlesRiver公司制造)。將實(shí)施例3中配制的載脂蛋白A-II以3mg/kg的劑量靜脈內(nèi)一次施用給其中的8只小鼠(A-II施用組)。IO分鐘后，向A-II施用組的8只與其他6只(對照組)共計14只小鼠以15pg/kg的劑量靜脈內(nèi)一次施用作為爆發(fā)性肝炎引發(fā)劑的IV型伴刀豆球蛋白A(Sigma公司制造)。另外，將既未施用栽脂蛋白A-II制劑，也未施用伴刀豆球蛋白A的4只小鼠作為正常組。在施用載脂蛋白A-II制劑8小時后，在二氧化碳麻醉下，從腹部大動脈處采血得到血清。測定所述血清中作為肝功能障礙的指標(biāo)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，算出各平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。有關(guān)ALT及AST的統(tǒng)計學(xué)解析，則分別通過t檢驗16(Excel、Microsoft)檢查相對于正常組的對照組的發(fā)癥和相對于對照組的A-II施用組的效杲來進(jìn)行。其結(jié)果示于表3。003表3實(shí)施例3的A-II(3mg/kg)施用組對照組正常組ALT(IU/L)785±377*3388±1156#33±2AST(IU/L)668±234*2450±750#64±2*:對于對照組P<0.05#:對于正常組P<0.05如表3所示，相比正常組，對照組血中的ALT及AST顯著增加。但是，對照組中呈現(xiàn)的肝功能高度障礙在A-II施用組中顯著被抑制。根據(jù)此實(shí)驗證實(shí)了栽脂蛋白A-II制劑對爆發(fā)性肝炎具有預(yù)防效果。A-II制劑施用組中未發(fā)現(xiàn)曾認(rèn)為施用栽脂蛋白A-II制劑會出現(xiàn)的副作用。實(shí)施例10038動物實(shí)驗3準(zhǔn)備18只實(shí)驗用7周齡雌性Balb/c小鼠(日本CharlesRiver公司制造)。將實(shí)施例3中配制的載脂蛋白A-II以13mg/kg的劑量靜脈內(nèi)一次施用給其中的8只小鼠(A-II施用組)。IO分鐘后，向A-II施用組的8只與其他6只(對照組)共計14只小鼠以15jig/kg的劑量靜脈內(nèi)施用一次作為爆發(fā)性肝炎引發(fā)劑的IV型伴刀豆球蛋白A(Sigma公司制造)。另外，將既未施用載脂蛋白A-II制劑，也未施用爆發(fā)性肝炎引發(fā)劑的4只小鼠作為正常組。在施用載脂蛋白A-II制劑8小時后，在二氧化碳麻醉下，從腹部大動脈處采血得到血清。測定所述血清中作為肝功能障礙的指標(biāo)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，算出各平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。有關(guān)ALT及AST的統(tǒng)計學(xué)解析，則分別通過t檢驗17(Excel、Microsoft)檢查相對于正常組的對照組的發(fā)癥和相對于對照組的A-II施用組的效果來進(jìn)行。其結(jié)果示于表4。0039<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*:對于對照組PO.05#:對于正常組P0.05如表4所示，相比正常組，對照組的血中ALT及AST顯著增加。但是，對照組中呈現(xiàn)的肝功能高度障礙在A-II制劑施用組中顯著被抑制。根據(jù)此實(shí)驗證實(shí)了栽脂蛋白A-II制劑對爆發(fā)性肝炎具有預(yù)防效果。A-II制劑施用組中未發(fā)現(xiàn)曾認(rèn)為施用栽脂蛋白A-II制劑會出現(xiàn)的副作用。實(shí)施例1O(HO動物實(shí)-險4準(zhǔn)備16只實(shí)驗用8周齡雄性Balb/c小鼠(日本CharlesRiver公司制造)。將實(shí)施例1中配制的栽脂蛋白A-II以300mg/kg的劑量靜J沐內(nèi)一次施用給其中的4只小鼠(A-II施用組)。10分鐘后，向A-II施用組的4只與其他6只(對照組)共計IO只小鼠以200ng/kg的劑量靜脈內(nèi)施用一次作為爆發(fā)性肝炎引發(fā)劑的抗Fas抗體(BectonDickinson公司制造)。另外，將既未施用栽脂蛋白A-II制劑，也未施用抗Fas抗體的6只小鼠作為正常組。在施用載脂蛋白A-II制劑4小時后，在二氧化碳麻醉下，從腹部大動脈處采血得到血清。測定所述血清中作為肝功能障礙的指標(biāo)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，算出各平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。有關(guān)ALT及AST的統(tǒng)計學(xué)解析，則分別通過t檢驗(Excel、Microsoft)檢查相對于正常組的對照組的發(fā)癥和相對于對照組的A-II施用組的效果來進(jìn)行。其結(jié)果示于表5。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>**:對于對照纟且P<0.01##:對于正常組P〈0.01如表5所示，相比正常組，對照組的血中ALT及AST顯著增加。但是，對照組中呈現(xiàn)的肝功能高度障礙在A-II制劑施用組中顯著被抑制。根據(jù)此實(shí)驗證實(shí)了載脂蛋白A-II制劑對爆發(fā)性肝炎具有預(yù)防效果。A-II制劑施用組中未發(fā)現(xiàn)曾認(rèn)為施用栽脂蛋白A-II制劑會出現(xiàn)的副作用。實(shí)施例10042動物實(shí)驗5準(zhǔn)備32只實(shí)驗用7周齡雌性Balb/c小鼠(日本CharlesRiver公司制造)。將IV型伴刀豆球蛋白A(Sigma公司制造)以15mg/kg的劑量靜脈內(nèi)一次施用給其中的21只小鼠，從而制備出不采取任何處理也表現(xiàn)出爆發(fā)性肝炎的肝障礙模型小鼠。向10只肝障礙模型小鼠施用伴刀豆球蛋白A1小時后，以100mg/kg的劑量靜脈內(nèi)一次施用了實(shí)施例1中配制的載脂蛋白A-II(A-II施用組)。剩余的11只小鼠未施用載脂蛋白A-II(對照組)。另外，將既未施用伴刀豆球蛋白A，也未施用載脂蛋白A-II的11只小鼠作為正常組。在施用載脂蛋白A-II制劑24小時后，在二氧化碳麻醉下，從腹部大動脈處采血得到血清。測定所述血清中作為肝功能障礙的指標(biāo)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST).，算出各平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。有關(guān)ALT及AST的統(tǒng)計學(xué)解析，則分別通過t檢驗(Excel、Microsoft)檢查相對于正常組的對照組的發(fā)癥和相對于對照組的A-II施用組的效果來進(jìn)行。其結(jié)果示于表6。0043<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*對于對照組P〈0.05##對于正常組PO.01如表6所示，相比正常組，對照組的ALT及AST顯示出增加。但是，對照組中呈現(xiàn)的肝功能高度障礙在A-II制劑施用組中顯著被抑制。根據(jù)此實(shí)驗證實(shí)了栽脂蛋白A-II制劑對爆發(fā)性肝炎具有預(yù)防效果。A-II制劑施用組中未發(fā)現(xiàn)曾認(rèn)為施用載脂蛋白A-II制劑會出現(xiàn)的副作用。實(shí)施例10044動物實(shí)驗6準(zhǔn)備32只實(shí)驗用7周齡雌性Balb/c小鼠(日本CharlesRiver公司制造)。將IV型伴刀豆球蛋白A(Sigma公司制造)以15mg/kg的劑量靜脈內(nèi)一次施用給其中的21只小鼠，從而制備出不采取任何處理也表現(xiàn)出爆發(fā)性肝炎的肝障礙模型小鼠。向IO只肝障礙模型小鼠施用伴刀豆球蛋白A1小時后，以500mg/kg的劑量靜脈內(nèi)一次施用了實(shí)施例1中配制的栽脂蛋白A-II(A-II施用組)。剩余的11只小鼠未施用栽脂蛋白A-II(對照組)。另外，將既未施用伴刀豆球蛋白A，也未施用栽脂蛋白A-II的ll只小鼠作為正常組。在施用載脂蛋白A-II制劑24小時后，在二氧化碳麻醉下，從腹部大動脈處采血得到血清。測定所述血清中作為肝功能障礙的指標(biāo)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，算出各平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。有關(guān)ALT及AST的統(tǒng)計學(xué)解析，則分別通過t檢驗(Excel、Microsoft)檢查相對于正常組的對照組的發(fā)癥和相對于對照組的A-II施用組的效果來進(jìn)行。其結(jié)果示于表7,0045表7<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*:對于對照纟且P<0.05**:對于對照組PO.Ol##:對于正常組P〈0.01如表7所示，相比正常組，對照組的ALT及AST顯示出增加。但是，對照組中呈現(xiàn)的肝功能高度障礙在A-II制劑施用組中顯著被抑制。根據(jù)此實(shí)驗證實(shí)了載脂蛋白A-II制劑對爆發(fā)性肝炎具有預(yù)防效果。A-II制劑施用組中未發(fā)現(xiàn)曾認(rèn)為施用載脂蛋白A-II制劑會出現(xiàn)的副作用。實(shí)施例10046動物實(shí)驗7作為實(shí)驗動物，使用了24只7周齡雄性Balb/c小鼠(日本CharlesRiver/>司制造)。將IV型伴刀豆球蛋白A(Sigma/>司制造)以15mg/kg劑量靜脈內(nèi)一次施用給其中的16只小鼠中，從而制備出不采取任何處理也表現(xiàn)出爆發(fā)性肝炎的肝障礙模型小鼠。向8只所述肝障礙模型小鼠施用伴刀豆球蛋白A1小時后，以500mg/kg的劑量靜脈內(nèi)一次施用實(shí)施例1中配制的栽脂蛋白A-II(A-II施用組)。剩佘的8只小鼠未施用A-II(對照組)。另外，將既未施用伴刀豆球蛋白A，也未施用載脂蛋白A-II的8'只小鼠作為正常組。在施用載脂蛋白A-II制劑24小時后，在二氧化碳麻醉下，從腹部大動脈處采血得到血清。測定所述血清中作為肝功能障礙的指標(biāo)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，算出各平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。有關(guān)ALT及AST的統(tǒng)計學(xué)解析，則分別通過t檢驗(Excel、Microsoft)檢查相對于正常組的對照組的發(fā)癥和相對于對照組的A-II施用組的效果來進(jìn)行。其結(jié)果示于表8。0047表8實(shí)施例1的A-II(500mg/kg)施用組對照組正常組ALT(IU/L)1055±281**4185±736##55±4AST(IU/L)936±198"2831±421##129±13**:對于對照纟且P<0.01##:對于正常組P<0.01如表8所示，相比正常組，對照組的ALT及AST顯示出增加。但是，對照組中呈現(xiàn)的肝功能高度障礙在實(shí)施例1的載脂蛋白A-II施用組中顯著被抑制。根據(jù)此實(shí)驗證實(shí)了載脂蛋白A-II對爆發(fā)性肝炎具有預(yù)防效果。A-II制劑施用組中未發(fā)現(xiàn)曾認(rèn)為施用栽脂蛋白A-II制劑會出現(xiàn)的副作用。工業(yè)實(shí)用性0048近年來，在日本出現(xiàn)急性肝炎發(fā)展為爆發(fā)性肝炎的病癥增多的趨勢。但是根據(jù)患者的主觀癥狀、醫(yī)生細(xì)心注意的診斷，醫(yī)療機(jī)關(guān)可預(yù)知患者的爆發(fā)性肝炎化，并通過在合適的時期施用本發(fā)明"急性肝炎治療劑、爆發(fā)性肝炎預(yù)防、治療劑來治愈急性肝炎，并提前防止向爆發(fā)性肝炎的發(fā)展。另外，即使例如已發(fā)生爆發(fā)性肝炎的癥狀，但仍可通過施用本發(fā)明的藥劑來緩解所述癥狀。22附圖簡述0049圖1示SDS-PAGE電泳圖。圖中，左端的數(shù)字表示分子量(kDa)。(1)是分子量標(biāo)記、(2)是實(shí)施例1的制劑(非還原)、(3)是實(shí)施例4的制劑(非還原)、(4)是實(shí)施例1的制劑(還原)、(5)是實(shí)施例4的制劑(還原)、(6)是分子量標(biāo)記。圖2示蛋白印跡法電泳圖。(l)是實(shí)施例1的制劑(非還原)、(2)是實(shí)施例4的制劑(非還原)、(3)是實(shí)施例1的制劑(還原)、(4)是實(shí)施例4的制劑(還原)。圖3示實(shí)施例1的制劑(源于血漿的載脂蛋白A-II)的肽圖。圖4示實(shí)施例4的制劑(基因重組的載脂蛋白A-II)的肽圖。在17分鐘附近檢測出His-Tag相關(guān)峰值。2權(quán)利要求1.含有載脂蛋白A-II作為有效成分的急性肝炎治療劑或爆發(fā)性肝炎預(yù)防、治療劑。2.權(quán)利要求1的急性肝炎治療劑或爆發(fā)性肝炎預(yù)防、治療劑，其為非經(jīng)口施用藥物。3.治療急性肝炎或預(yù)防、治療爆發(fā)性肝炎的方法，其向急性肝炎或爆發(fā)性肝炎患者施用含有載脂蛋白A-II作為有效成分的組合物。全文摘要當(dāng)急性肝炎發(fā)展為爆發(fā)性肝炎時，肝細(xì)胞急劇且大量被破壞，結(jié)果預(yù)后極不良。因此，應(yīng)盡早預(yù)知從急性肝炎發(fā)展為爆發(fā)性肝炎的情況，并迅速采取適宜處理尤為重要。但是，雖然近年來隨著檢查方法或者診斷技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)可預(yù)知肝炎爆發(fā)性化，但仍無合適的爆發(fā)性肝炎預(yù)防、治療劑。本發(fā)明的課題是提供副作用少的急性肝炎治療劑或爆發(fā)性肝炎預(yù)防、治療劑。含有載脂蛋白A-II的藥物組合物解決了上述課題。文檔編號A61K38/00GK101668537SQ20088001338公開日2010年3月10日申請日期2008年4月21日優(yōu)先權(quán)日2007年4月23日發(fā)明者佐佐木哲也,原尚子,石川誠申請人:日本制藥株式會社