專利名稱：：Ptd-sod融合蛋白在抗疲勞產(chǎn)品中的應用的制作方法
技術領域：
：該發(fā)明涉及融合蛋白領域，尤其涉及蛋白轉導結構域(ProteinTransductionDomain，PTD)連接超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)的融合蛋白PTD-SOD在抗疲勞產(chǎn)品中的應用。
背景技術：
：過量的氧自由基是導致肌肉疲勞的重要原因[']，因為過量的氧自由基能產(chǎn)生氧化脅迫，破壞機體內的DNA、蛋白質和脂肪等物質，抑帝噺陳代謝相關酶類的活性，造成細胞生理功能的異常、機體組織的損傷和代謝水平下降。例如，未受訓練的大鼠在固定跑臺上跑到筋疲力盡時，骨骼肌中氧自由基含量增加2-3倍；小鼠游泳至力竭時，肝臟中氧自由基含量明顯增加[2]。超氧化物歧化酶(SuperoxideDismiitase，SOD)是生物體內的一種抗氧化酶，它能特異性催化體內最主要的氧自由基一-超氧陰離子自由基將其歧化為過氧化氫和氧氣，起到消除氧自由基的作用，有助于增強機體代謝從而消除疲勞。因此適當添加的外源性SOD,可以彌補內源性消除過量氧自由基的不足的S0D，可望起到一定的抗疲勞作用。但是SOD分子量達32000，很難順利透過細胞膜，而疲勞機體的細胞產(chǎn)生氧自由基主要來源于細胞內部的線粒體。單純給與SOD，只能清除細胞外部的氧自由基而不能有效消除存在于細胞內部的、造成疲勞的、氧自由基。因此SOD作為有效成分添加到抗疲勞產(chǎn)品之中存在不足之處。
發(fā)明內容本發(fā)明目的是提供一種有利于減緩疲勞的PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產(chǎn)品中的應用。本發(fā)明的技術方案如下將PTD-SOD融合蛋白應用于制備抗疲勞的產(chǎn)品，所述的PTD-SOD為蛋白轉導結構域連接超氧化物歧化酶的融合蛋白PTD-SOD。PTD是一種新近發(fā)現(xiàn)的能在蛋白轉導過程中高效穿過細胞膜的蛋白質結構域，它能將與其共價連接的蛋白質和DNA等分子跨膜導入幾乎所有的組織和細胞，甚至可以通過血腦屏障，轉導效率很高而且對細胞沒有損傷。PTD系統(tǒng)被認為是一種很有前途的運載工具，在基礎醫(yī)學研究和臨床治療方面都有著非常廣泛的應用前景。本發(fā)明通過PTD與SOD的融合，解決SOD跨膜進入細胞內部的問題。該手段采用細胞內的自然機制，有效避免外源物質對靶細胞的損害，并且該方法能將SOD分子大量遞送進入細胞，阻斷氧自由基的連鎖反應，有助于保護細胞免于氧化損傷，并使機體疲勞得以減輕乃至恢復。圖1是與不同濃度PTD-SOD共培養(yǎng)的4小時的Hela細胞的胞內酶活圖。具體實施例方式在抗疲勞產(chǎn)品或非抗疲勞產(chǎn)品中加入PTD-SOD;其添加的劑量以服用的劑量范圍是1002000SOD活力單位/日Kg體重為準。所述的PTD-SOD為蛋白轉導結構域(ProteinTransductionDomain，PTD)連接超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)的融合蛋白PTD-S0D，將上述含有PTD-S0D的產(chǎn)品單獨使用或與現(xiàn)有的抗疲勞產(chǎn)品混合使用作為抗疲勞產(chǎn)品。本發(fā)明的融合蛋白PTD-SOD可采用多種給藥方式，如注射、口服、涂抹等方式進行給藥，以增強機體的抗疲勞能力。實施例l:單次服用PTD-SOD提高抗疲勞能力。經(jīng)過一周運動訓練后挑選出的7組小鼠，每組8只；其中l(wèi)組作為空白對照，給藥的6組分別在運動前半小時舌面喂服和腹腔注射20、40和60S0D活力單位的PTD-S0D。進行游泳運動90分鐘后，測定小鼠的血清乳酸、尿素氮和乳酸脫氫酶三項指標。結果表明，舌面喂服和腹腔注射的兩種給藥組的血清乳酸(如表l)、尿素氮(如表l)都大幅下降，而乳酸脫氫酶活力則顯著增強(如表l)，這些作用隨著給藥量增加而增強，表明PTD-S0D的抗疲勞效果顯著(如表l)。表i.游泳實驗后小鼠的加.液指標<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>舌面喂服2480±183.09±0.620.79±0.20PTD"S0D(60U)-鵬注射2480±1812.3±1.202.23±0.32實施例2:長期服用PTD-SOD提高抗疲勞能力。經(jīng)過一周運動訓練后挑選出的小鼠分成兩組，每組10只，其中一組連續(xù)一個月每天舌面喂服100單位PTD-S0D(PTD-S0D組)，另一組為空白。上述兩組小鼠的耐力游泳時間的實驗結果顯示為空白組10.49分鐘，PTD-S0D組22.95分鐘，PTD-SOD組的游泳衰竭時間比空白組提高了119%。實驗一如圖1所示，本實驗說明本發(fā)明的融合蛋白PTD-S0D的跨膜轉導能力明顯高于SOD，能夠有效地提高人Hela細胞的胞內SOD活力。為了研究本發(fā)明的融合蛋白PTD-SOD是否跨入Hda細胞內部，并比較本發(fā)明的融合蛋白PTD-S0D和SOD對細胞內SOD酶活力的影響。取Hela細胞分別培養(yǎng)在含有700、1400、2800U/ml的PTD-SOD或者SOD溶液中4h后，收集并清洗細胞，檢測細胞裂解液的SOD活力；對照組為PBS。如圖1所示，實驗結果表明，本發(fā)明的融合蛋白PTD-S0D使Hela細胞內的SOD酶活力從對照組的20.9U/mL分別提高到23.8，26.4禾Q28.2U/mL，效果最好的一組細胞內的SOD酶活力是對照組的1.35倍(pO.Ol)，而SOD組細胞內SOD酶活力基本沒有變化。實驗證明PTO-SOD能進入細胞內并顯著提高細胞內SOD的酶活力。實驗二1.實驗方法將實驗小鼠分為三組，每組8只。其中一組為對照組，另有兩組為PTD-SOD給藥組，給藥劑量分別為100U和400U，灌胃2小時后進行負重游泳試驗。負重游泳試驗方法如下把小鼠放入水溫為(28±0.5)°C，尺寸為50cmX40cmX30cm的水箱中游泳。小鼠尾根部負荷5%體重量的鉛皮，每只水箱一次放入6只小鼠。小鼠連續(xù)3次沉入水中，每次超過10s不能浮出水面為力竭，記錄小鼠游泳時間。用秒表記錄自游泳開始至力竭死亡的時間，該時間為小鼠的負重游泳時間(min)。與游泳致疲勞有關的血液生化指標---乳酸、乳酸脫氫酶、血清尿素氮和葡萄糖的測定方法為小鼠摘眼球采血0.5mL，置4-C冰箱約3h，2000r/min離心15min，分離血清后用全自動生化分析儀測定。肝腦組織的處理方法為處死小鼠后，迅速分離肝和腦組織，用預冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱重，制成P/。的勻漿液，3500r/min離心，取上清4T:保存?zhèn)溆蒙鲜龇椒ǚ蛛x得到的血清和肝腦組織中的SOD活力采用黃嘌呤氧化酶-黃嘌呤體系測定。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)標準差(±s)表示，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理,進t亍配對或組間t檢驗。2.實驗結果2.1SOD對小鼠游泳能力的影響PTD-S0D給藥組小鼠相對于對照組小鼠游泳時間從4.40±0.64min提高到10.36士1.79min，小鼠的游泳時間顯著提高(P〈0.01)，表明PTD-SOD有提高小鼠游泳能力的作用。2.2小鼠疲勞程度對比測定小鼠疲勞相關的血液指標(如表2)。結果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，游泳前2h給予100UPTD-S0D的小鼠游泳后血清中乳酸從2.64mmol/L降低到1.64醒ol/L，乳酸脫氫酶從897.4咖ol/L升高到1385.5mmol/L，二者的變化都非常顯著(P〈0.01);而血清尿素氮從IO.83mmol/L降低到9.99mmol/L，葡萄糖水平則從3.51mmol/L增加到3.99mmol/L，二者的變化顯著(P〈0.05)。2.3小鼠運動后各器臟SOD活力對比PTD-SOD對小鼠血清、肝和腦組織中的S0D活力的影響如表3。與對照組比較,給予100UPTD-S0D的小鼠血清中的S0D活力從94.22U升高到126.20U，非常顯著地提高(P<0.01)，而肝腦組織中的S0D活力分別從220.64U提高到233.22U和從190.80U提高到203.39U，提高顯著(P〈0.05);給予400UPTD-SOD4h后，小鼠血清、肝、腦組織中的S0D活力分別增加到136.60U，343.32U和284.IOU，增加都非常顯著(P〈0.01)。實驗結論力竭運動期間，肌肉對氧的消耗量將增力C1200倍，其中有2%5°/。的氧通過電子呼吸鏈轉化成超氧陰離子自由基，這就意味著運動強度和運動持續(xù)的時間與自由基的產(chǎn)生成正比例。乳酸、乳酸脫氫酶、血清尿素氮和葡萄糖是與游泳致疲勞有關的血液生化指標w。以上實驗結果如表2和表3顯示，PTD-SOD可能是通過降6低運動后乳酸水平和血清尿素氮增量,提高乳酸脫氫酶活性及葡萄糖含量，從而達到抗疲勞效果，增加小鼠的游泳時間。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>"P<0.01,*P〈0.05vscontrol<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>參考文獻卩]LeonardoF.Ferreira.andMichaelB.Reid，Muscle-derivedROSandthiolregulationinmusclefatigue,Jo"wa/^Mpp/'W/%'ofogy;104:853-860,2008.侯香玉.運動對自由對戈謝的影響[J].沐,邦學U991，4:29-35.龔夢鵑，f:《為，劉新民.人小鼠游泳實驗方法的研究概況[J].屮/f比SS"學^i志2005,15:311-314。對照組PTD"SOD(100U)PTD"S0D(側)權利要求1.一種PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產(chǎn)品中的應用，其特征在于所述的PTD-SOD為蛋白轉導結構域連接超氧化物歧化酶的融合蛋白PTD-SOD，并將PTD-SOD應用于制備抗疲勞的產(chǎn)品。2、根據(jù)權利要求l所述的PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產(chǎn)品中的應用，其特征在于在抗疲勞產(chǎn)品中加入PTD-S0D，其添加的劑量以服用的劑量范圍是1002000SOD活力單位/日Kg體重為準。3、根據(jù)權利要求1或2所述的PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產(chǎn)品中的應用，其特征在于PTD、SOD二者以肽鍵連接，連接發(fā)生在任何不明顯影響SOD活性的部位。4、根據(jù)權利要求1或2所述的PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產(chǎn)品中的應用，其特征在于所述抗疲勞產(chǎn)品的給用方式為注射、口服或局部涂抹。全文摘要本發(fā)明涉及一種PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產(chǎn)品中的應用，所述的PTD-SOD為蛋白轉導結構域連接超氧化物歧化酶的融合蛋白PTD-SOD，并將PTD-SOD應用于制備抗疲勞的產(chǎn)品。本發(fā)明產(chǎn)品可以提高細胞內SOD的活力，能夠有效地保護和修復因疲勞產(chǎn)生的自由基損傷的細胞。它可用作抗疲勞食品或者藥物的有效成分，具有保護和修復自由基損傷的細胞、提高機體抵抗疲勞能力的功效。文檔編號A61K38/44GK101554474SQ200810174189公開日2009年10月14日申請日期2008年11月6日優(yōu)先權日2008年11月5日發(fā)明者劉樹滔,楊元德,饒平凡申請人:武漢炎森科技股份有限公司