專利名稱：核桃葉提取物的制備及其在改善記憶、抗腫瘤領(lǐng)域的應用前景的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于核桃葉提取物的制備及其在改善記憶、抗腫瘤領(lǐng)域的應用前景的發(fā)
明，屬于天然藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核桃，在國際市場上它與扁桃、腰果、榛子一起，并列為世界四大干果。它的足跡幾 乎遍及世界各地，主要分布在美洲、歐洲和亞洲很多地方。核桃在國外，人稱"大力士食品"、 "營養(yǎng)豐富的堅果"、"益智果";在國內(nèi)享有"萬歲子"、"長壽果"、"養(yǎng)人之寶"的美稱。其卓 著的健腦效果和豐富的營養(yǎng)價值，已經(jīng)為越來越多的人所推崇。 核桃的藥用價值很高，中醫(yī)應用廣泛。祖國醫(yī)學認為核桃性溫、味甘、無毒，有健 胃、補血、潤肺、養(yǎng)神等功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將核桃列為久服輕身益氣、延年益壽的上品。唐 代孟詵著《食療本草》中記述，吃核桃仁可以開胃，通潤血脈，使骨肉細膩。宋代劉翰等著《開 寶本草》中記述，核桃仁"食之令肥健，潤肌，黑須發(fā)，多食利小水，去五痔。"明代李時珍著
《本草綱目》記述，核桃仁有"補氣養(yǎng)血，潤燥化痰，益命門，處三焦，溫肺潤腸，治虛寒喘咳， 腰腳重疼，心腹疝痛，血痢腸風"等功效。 現(xiàn)代醫(yī)學研究認為，核桃中的磷脂，對腦神經(jīng)有良好保健作用。核桃油含有不飽和 脂肪酸，有防治動脈硬化的功效。核桃仁中含有鋅、錳、鉻等人體不可缺少的微量元素。人 體在衰老過程中鋅、錳含量日漸降低，鉻有促進葡萄糖利用、膽固醇代謝和保護心血管的功 能。核桃仁的鎮(zhèn)咳平喘作用也十分明顯，冬季，對慢性氣管炎和哮喘病患者療效極佳。民間 常用于清熱、解毒、抗癌、鎮(zhèn)痛等疾病的治療。目前國內(nèi)外對核桃的研究主要是對其植物形態(tài)分類、栽培、山核桃仁營養(yǎng)價值等 的研究，但對于其化學成分的提取分離及藥理作用等的研究報道還比較少。關(guān)于核桃提取 物的作用，絕大部分報道是關(guān)于其在抑菌方面的功效。專利200710056996. 8曾報道了核桃 殼提取物的制備及其在強心和心腦血管領(lǐng)域藥物制劑的應用，該發(fā)明是核桃殼的乙醇提取 物，并根據(jù)其藥理活性研究表明，核桃殼提取物具有一定的強心及改善心肌供血等活性，有 可能研制成為具有多種藥理活性低毒高效的天然中藥的心腦血管病治療新藥。取有效量的 提取物與藥用輔料混合制成多種不同藥物組合物的各種口服制劑。而關(guān)于核桃葉的系統(tǒng)溶 劑微波提取法以及其在改善記憶和抗腫瘤方面的運用在本發(fā)明完成之前沒有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供了一種核桃葉有效成分的提取分離方法。 本發(fā)明的目的之二是提供了以核桃葉提取物為原料研制片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒
劑、口服液等。 本發(fā)明的目的之三是提供了以核桃葉活性成分為主要藥用成分用于生產(chǎn)提高記 憶、抗腫瘤的保健品或藥品。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下 采集的核桃葉子用乙醇浸泡過夜，用微波加熱提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇得褐色 黏稠物；葉子再加乙醇浸泡過夜，回收乙醇濃縮液，合并兩次的乙醇濃縮液留存?zhèn)溆?。將?濃縮液懸浮于適量水中，充分震蕩混勻后分別采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃 取。先用石油醚萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收石油醚萃取層留存；余下液體用氯仿萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 儀回收氯仿層；再以乙酸乙酯萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯層；余下液體用水飽和正丁 醇萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收正丁醇層。余下水層離心后取水層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收留存。得石油 醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物5種提取物，將其在真空干燥箱中減壓干燥，粉碎， 即得到本發(fā)明所說的核桃葉提取物。 本發(fā)明的核桃葉提取物具有用于制備改善記憶和抗腫瘤的藥物和保健品的應用
前景。按照藥劑學的方法，可以將本發(fā)明的核桃葉提取物制備成作為改善記憶和抗腫瘤的
藥物或保健品，口服制劑或保健品選自片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液等。 本發(fā)明所得到的提取物具有制備改善記憶和抗腫瘤的藥物和保健品的應用前景，
可以通過以下的藥效試驗得到證實。 核桃提取液對腫瘤細胞的抑制作用 摘要將上述過程得到的核桃葉提取物采用MTI法觀察其對腫瘤SGC-7901增殖的
抑制作用，并采用光學顯微鏡和電鏡方法觀察乙酸乙酯提取物SGC-7901細胞凋亡的誘導
作用。結(jié)果核桃乙酸乙酯提取物抗腫瘤作用最強，并且能夠誘導腫瘤細胞凋亡。 目的采用MTI法觀察其對腫瘤SGC-7901增殖的抑制作用，為核桃葉提取物開發(fā)抗
腫瘤藥物提供理論依據(jù)。 方法步驟l.各稱取2mg的上述5種提取物，水層直接用lml RP-MI1640溶解備用； 石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物溶解于200iU二甲基亞砜中，旋渦震蕩，全部溶解 后，加入800 iURPMI 1640培養(yǎng)液旋渦震蕩混勻。將上述藥物16000r/min離心后0. 22iim
濾膜過濾除菌后放置于4t:冰箱保存?zhèn)溆谩?2.細胞培養(yǎng)方法將胃癌SGC-7901細胞接種于含10X新生小牛血清、100U/ml青霉 素和100U/ml鏈霉素的PPMI1640培養(yǎng)液中，37"C培養(yǎng)，長滿后0. 08%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。 3. MTT法觀察山核桃提取物對腫瘤細胞增殖的抑制作用 用含10% FBS的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)的胃癌細胞SGC-7901以7X103/孔接種于96 孔板，37t: 5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h后，分別加入上述配制的藥物，加入量分別為2、4、6、 8和10iU，每劑量組6復孔，不加任何藥物的為對照。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，觀察細胞形態(tài)的變 化。加入MTT孵育4h，棄去上清液，加入DMS0 150 y L震蕩10min， 570nm處測OD值。RJ(細 胞增殖抑制率)=[(對照組A值-用藥組A值)/對照組A值X100% ]。
4.乙酸乙酯提取物誘導SGC-7901細胞凋亡的觀察 光學顯微鏡觀察在6孔培養(yǎng)板中放入清洗干凈的蓋玻片，紫外線照射滅菌。每孔 接種SGC-7901細胞，4h后分別加入上述配制好的乙酸乙酯提取物96 y 1/ml，不加任何藥物 的為對照，繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出蓋玻片上細胞進行蘇木素-伊紅染色，光鏡下觀察細胞形態(tài) 變化。②透射電鏡觀在100ml培養(yǎng)瓶中接種SGC-7901細胞，4h后加入上述配制好的乙酸 乙酯提取物，濃度和對照組設(shè)立同上。處理24h后收集細胞，加2. 5%的戊二醛固定30min后，加1%四氧化鋨固定lh，包埋后超薄切片，透射電鏡下觀察細胞形態(tài)變化。
試驗結(jié)果 1.核桃的不同提取物均能抑制SGC-7901細胞的增殖；隨著藥物濃度的增加，其生 長抑制作用增強，呈量效關(guān)系；其中，乙酸乙酯提取物的抑制作用最強，隨著加入藥物濃度 的增加，其對SGC-7901細胞生長抑制率提高(同對照比較P〈0.05);氯仿提取物的作用次 之(同對照比較P < 0. 05);而其它3種提取物對SGC-7901細胞增殖的抑制作用不大(同 對照比較P > 0. 05)。

圖1是本發(fā)明的實驗用藥比較圖。 2.乙酸乙酯提取物誘導SGC-7901細胞凋亡乙酸乙酯提取物處理SGC-7901細胞，
HE染色后，光學顯微鏡下觀察，多數(shù)細胞體積變小，變形，細胞核固縮，但細胞膜完整。而對
照組SGC-7901細胞形態(tài)學無明顯變化。電子顯微鏡下可見，凋亡細胞體積變小，細胞核變
小。染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)成塊，細胞核碎裂，細胞呈典型的凋亡現(xiàn)象。而對照組SGC-7901細
胞形態(tài)學無明顯變化。 圖2是本發(fā)明的實驗對比結(jié)果 A :對照組(透射電鏡。3700X) B :用藥組(透射電鏡。3700X)胃癌細胞可見細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、固縮、碎 裂。 結(jié)論核桃葉提取物均能抑制SGC-7901細胞的增殖；隨著藥物濃度的增加，其生 長抑制作用增強，呈量效關(guān)系；其中，乙酸乙酯提取物的抑制作用最強；再通過乙酸乙酯提 取物誘導SGC-7901細胞凋亡的觀察，在光學顯微鏡下觀察，多數(shù)細胞體積變小，變形，細胞 核固縮，電子顯微鏡下可見，凋亡細胞體積變小，細胞核變小。染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)成塊，細胞 核碎裂，細胞呈典型的凋亡現(xiàn)象。 核桃葉提取液對衰老模型小鼠記憶力的影響
目的觀察核桃葉提取液對小鼠記憶功能的影響. 方法取健康小鼠，雌雄各半，適應環(huán)境1周后按體重隨機分為空白對照組、模型 組、維生素E組和核桃葉提取液大、中、小劑量組.每日給予除空白對照組外的其他各組小 鼠皮下注射半乳糖0. 12g/kg，給予空白對照組小鼠皮下注射50ml/kg生理鹽水。同時每日 分別灌胃給予核桃葉水提取液大、中、小劑量組小鼠核桃葉水提取液12、6、3g/kg，灌胃給予 維生素E組小鼠維生素E100mg/kg，模型組和空白對照組每日灌胃給予100ml/kg蒸餾水，連 續(xù)30d。于第31日起利用Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)和Dig Behv動物行為分析系統(tǒng)軟件 測試記憶能力。 結(jié)果與模型組比較，核桃葉提取液各劑量組小鼠搜索站臺的潛伏期均明顯縮短， 而穿越站臺的次數(shù)則明顯增加。 結(jié)論本研究結(jié)果表明，各劑量核桃葉提取液組小鼠在早期搜索站臺潛伏期均明顯 縮短，增加小鼠穿越站臺的次數(shù)，提示核桃葉水提取液可明顯改善衰老模型小鼠空間位置 覺和方向覺(空間定位)，改善記憶功能。
權(quán)利要求
一種核桃葉提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟采集的核桃葉子用乙醇浸泡過夜，用微波加熱提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇得褐色黏稠物；葉子再加乙醇浸泡過夜，回收乙醇濃縮液，合并兩次的乙醇濃縮液留存?zhèn)溆谩⒖倽饪s液懸浮于適量水中，充分震蕩混勻后分別采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取。先用石油醚萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收石油醚萃取層留存；余下液體用氯仿萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收氯仿層；再以乙酸乙酯萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯層；余下液體用水飽和正丁醇萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收正丁醇層。余下水層離心后取水層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收留存。得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物5種提取物，將其在真空干燥箱中減壓干燥，粉碎，即得到本發(fā)明所說的核桃葉提取物。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采集的核桃葉子用乙醇浸泡過夜，其特征在于，乙醇的濃度 為70% _80%，所用的量為核桃葉8-10倍的量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用微波加熱提取，其特征在于微波的功率為300W，溫度為 8(TC，提取時間為0. 5h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉子再加乙醇浸泡過夜，其特征在于乙醇的濃度為85%，所 用的量為核桃葉3-5倍的量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的濃縮液分別采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取， 其特征在于，每一種溶劑萃取的次數(shù)為三次，每次加入溶劑的量均為100ml。
6. 以核桃葉提取物為主要有效成分主要用于改善記憶、抗腫瘤藥物或保健產(chǎn)品之中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核桃提取物的制備及其在改善記憶、抗腫瘤領(lǐng)域的應用前景。核桃葉用乙醇浸泡過夜，用微波加熱提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇得褐色黏稠物；葉子再加乙醇浸泡過夜，回收乙醇濃縮液，合并兩次的乙醇濃縮液留存?zhèn)溆?。將總濃縮液懸浮于適量水中，充分震蕩混勻后分別采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取、減壓干燥，粉碎，得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物5種提取物。該提取物有效成分可用于生產(chǎn)改善記憶、抗腫瘤藥物或保健品。
文檔編號A61K127/00GK101757097SQ20081016296
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者吳菁, 陳群 申請人:湖州來色生物基因工程有限公司;吳菁