專(zhuān)利名稱(chēng)：：毛冬青總黃酮在制備防治短暫腦缺血綜合癥藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種毛冬青總黃酮在制備防治短暫腦缺血綜合癥(TIA)藥物的應(yīng)用。二
背景技術(shù)：
：毛冬青為冬青科植物毛冬青的根，含有多種黃酮類(lèi)、酚性成分、甾醇、氨基酸、糖類(lèi)、鞣質(zhì)和三萜成分，具有清熱解毒、活血通脈之功用，主要用于治風(fēng)熱感冒、肺熱喘咳、喉頭水腫、扁桃體炎、痢疾、冠心病、腦血管意外所致的偏癱，血栓閉塞性脈管炎，丹毒、燙傷、中心性視網(wǎng)膜炎，葡萄膜炎，以及皮膚急性化膿性炎癥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究還表明毛冬青對(duì)心血管有影響，臨床上有應(yīng)用于降壓，緩慢而持久，隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，毛冬青的醫(yī)用藥物價(jià)值有了新開(kāi)始，但毛冬青在防治短暫腦缺血綜合癥的應(yīng)用中末見(jiàn)有報(bào)導(dǎo)，特別是毛冬青有效成分總黃酮作為制備治療短暫腦缺血綜合癥藥物應(yīng)用無(wú),有報(bào)導(dǎo)。三
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述情況，本發(fā)明之目的就是提供一種由毛冬青提取的毛冬青總黃酮在制備防治短暫腦缺血綜合癥藥物的應(yīng)用，有效解決防治短暫腦缺血綜合癥的藥物問(wèn)題，其解決的技術(shù)方案是，取毛冬青藥材，粉碎，用8倍量的70%乙醇加熱回流提取兩次，合并提取液，濾過(guò)，回收乙醇，并濃縮至在5(TC時(shí)測(cè)定相對(duì)密度為1.10-1.20，濃縮液用水分散為藥液藥材=1:i的溶液，靜置，濾過(guò)，濾液離心，離心液超濾，通過(guò)聚酰胺柱，先用2倍柱體積的水洗脫，棄去水液，再用8倍柱體積50%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液備用，合并兩次的洗脫液，另?yè)QpH值為9-10的碳酸鈉水溶液洗脫，收集洗脫液，用鹽酸調(diào)pH為中性，減壓濃縮，6CTC干燥粉碎，得毛冬青總黃酮，其中，總黃酮以蘆丁計(jì)不少于54.0%，總皂苷以人參皂苷Re計(jì)不得超過(guò)5.0%，該毛冬青總黃酮有效用于制備治療防治短暫腦缺血綜合癥的藥物，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦缺血綜合癥的治療，造福于人類(lèi)。四具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體情況對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。在制備毛冬青總黃酮時(shí)，本發(fā)明采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，選取對(duì)影響提取效果的主要因素如乙醇濃度、加醇量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，以總黃酮和總皂苷的含量為測(cè)定指標(biāo)，確定最佳提取工藝為取毛冬青粗粉，故取毛冬青藥材，粉碎，用8倍量的70%乙醇加熱回流提取兩次，合并提取液，濾過(guò)，回收乙醇，并濃縮至在5(TC時(shí)測(cè)定相對(duì)密度為1.101.20,濃縮液用水分散為藥液藥材=1:i的溶液，靜置，濾過(guò)，濾液離心，離心液超濾，通過(guò)聚酰胺柱，先用2倍柱體積的水洗脫，棄去水液，再用8倍柱體積50%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液備用，合并兩次的洗脫液，另?yè)QpH值為910的碳酸鈉水溶液洗脫，收集洗脫液，用鹽酸調(diào)pH為中性，減壓濃縮，6(TC干燥粉碎，得毛冬青總黃酮。所說(shuō)的藥液藥材=1:i的溶液是指將濃縮液用水分散成與藥材重量體積相等的溶液，如100g總藥材料，將濃縮液分散成(稀釋成)100ml。本發(fā)明的毛冬青總黃酮有效解決用于制備防治短暫腦缺血綜合癥的藥物，并經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)，毛冬青總黃酮對(duì)防治短暫腦缺血綜合癥有顯著療效，有關(guān)試驗(yàn)情況如下實(shí)驗(yàn)l、毛冬青總黃酮對(duì)小鼠急性腦缺血模型的影響l.實(shí)驗(yàn)材料1.1藥物和試劑毛冬青總黃酮，河南中醫(yī)學(xué)院化學(xué)室，含量〉60%;華佗苒造丸，廣州奇星藥業(yè)有限公司，批號(hào)060629;尼莫地平片，山東新華制藥股份有限公司，批號(hào)0609118;生理鹽水，鄭州化學(xué)藥業(yè)有限公司，批號(hào)060712。1.2儀器電子天平，由上海民橋精密儀器有限公司生產(chǎn)。1.3動(dòng)物小鼠KM，清潔級(jí)，體重1820g;由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)DK0508068。1.4數(shù)據(jù)分析用SPSS11.5forwindows醫(yī)用統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)^f學(xué)處理,計(jì)量資料用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(S士s)表示，組間比較采用方差分析。2.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果取1820g雄性小鼠60只，隨機(jī)分為6組，即毛冬青總黃酮(0.4g/kg，0.2g/kg，0.lg/kg，配成濃度為20mg/ml，10mg/ml，5mg/ml,)，尼莫地平組(為臨床用量的10倍，20mg/kg,藥液濃度為lmg/ml，給藥體積0.2ml/10g)，華佗再造丸組(為臨床用量的10倍，2.67g/kg，藥液濃度0.134g/ml，給藥體積0.2ml/10g)，空白對(duì)照組(每天灌同樣體積的生理鹽水)。每天給藥l次，連續(xù)給藥7天。于最后一次給藥后lh，用剪刀于耳后2mm處迅速斷頭，造成急性腦缺血模型，然后記錄小鼠的呼吸次數(shù)及呼吸維持時(shí)間(所有小鼠均以無(wú)張口喘息為標(biāo)準(zhǔn))。結(jié)果斷頭時(shí)的實(shí)驗(yàn)室溫度為2rc,時(shí)間是上午8點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)表l。表1毛冬青總黃酮對(duì)急性腦缺血小鼠呼吸次數(shù)及呼吸時(shí)間的影響(X±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注與空白對(duì)照組比，*尸<0.05;**尸<0.01從上表可以看出與空白對(duì)照組比較，大、中、小劑量毛冬青總黃酮組、和華佗再造丸組均可明顯延長(zhǎng)小鼠斷頭后的呼吸持續(xù)時(shí)間(代0.05)，尼莫地平組可顯著延長(zhǎng)小鼠呼吸持續(xù)時(shí)間(代0.01);與空白對(duì)照組比較，大、中劑量毛冬青總黃酮組、尼莫地平組均可明顯增加小鼠斷頭后呼吸次數(shù)(代0.05)。說(shuō)明毛冬青總黃酮能顯著增加斷頭小鼠的呼吸次數(shù)和呼吸時(shí)間。4.結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，毛冬青總黃酮能顯著增加斷頭小鼠的呼吸次數(shù)和呼吸時(shí)間。實(shí)驗(yàn)2、毛冬青總黃酮對(duì)小鼠短暫性腦缺血再灌注模型的影響1.實(shí)驗(yàn)材料1.1藥物和試劑毛冬青總黃酮，河南中醫(yī)學(xué)院化學(xué)室，含量〉60%;華佗再造丸，廣州奇星藥業(yè)有限公司，批號(hào)060629;尼莫地平片，山東新華制藥股份有限公司，批號(hào)0609118;生理鹽水，鄭州化學(xué)藥業(yè)有限公司，批號(hào)060712;水合氯醛，由上海山浦化工有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20060517;甲醛溶液，由萊陽(yáng)市雙雙有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20060801;ATP檢測(cè)試劑盒，由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)20070713;LD檢測(cè)試劑盒，由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)20070725;考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒，由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)200707251.2儀器UV_2000分光光度計(jì)，由尤尼柯(上海)儀器有限公司生產(chǎn)；FA(N)/JA(N)系列電子天平，由上海民橋精密儀器有限公司生產(chǎn)；TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋，由北京市永光明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；可調(diào)式移液器，由上海雷勃分析儀器有限公司生產(chǎn)。1.3動(dòng)物小鼠KM，清潔級(jí)。體重1820g;由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，小鼠合格證號(hào)DK0508068。1.4數(shù)據(jù)分析用SPSS11.5forwindows醫(yī)用統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(S士s)表示，組間比較用方差分析；等級(jí)資料采用Ridit檢驗(yàn)。2.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果2.1動(dòng)物分組及給藥方式取體重為1820g左右的小鼠70只，雄性，隨機(jī)均勻分為7組，其中6組造腦缺血再灌注模型，另設(shè)1組假手術(shù)組。造模型6組分別灌毛冬青總黃酮(0.4g/kg，0.2g/kg，0.lg/kg，配成濃度為20mg/ml，10mg/ml，5mg/ml,)、陽(yáng)性對(duì)照組尼莫地平(為臨床人的10倍，20mg/kg，藥液濃度lmg/ml，給藥體積0.2ml/10g)和華佗再造丸組(為臨床用量的10倍，2.67g/kg，藥液濃度0.134g/ml，給藥體積0.2ml/10g)，模型組(灌同體積的生理鹽水)，空白對(duì)照組作為假手術(shù)組。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。2.2造模方法及取材于第10天給藥后lh，禁食后12h，4%水合氯醛0.1ml/10g腹腔注射麻醉(小鼠的翻正反射消失)，然后用剪刀剪取頸部的毛，用酒精擦拭干凈頸部，用手術(shù)刀作頸部正中切口，逐漸分離周?chē)∪?，直到?jiàn)到雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，再用彎頭小鑷子剝離周?chē)窠?jīng)，分離CCA,每個(gè)動(dòng)脈下各置一條5cm長(zhǎng)度的手術(shù)線(xiàn)，把直徑約為0.3mm的針灸針與血管一起結(jié)扎，然后松開(kāi)小鼠的四條腿的繩子，使其斜躺在籠子里，此過(guò)程注意其保溫，室溫保持在25'C。10min后輕輕抽出針灸針，完成再灌注，其中空白組作假手術(shù)處理，即除了不結(jié)扎CCA外，其它操作同造模各組。再灌15min后快速斷頭取腦，立即用毛細(xì)血管吸取血液測(cè)定凝血時(shí)間；同時(shí)立即在冰盤(pán)中分離腦，把腦從矢狀線(xiàn)分開(kāi)成對(duì)稱(chēng)的腦，一半取出海馬區(qū)，迅速放于倒有10%福爾馬林溶液中的瓶子中浸泡固定；另外一半放在濾紙上吸干凈上面的血跡，然后用天平稱(chēng)量其重量，根據(jù)此重計(jì)算該加入的冰冷的生理鹽水量，以腦組織(g):生理鹽水(m1)4:9的比例在盛有冰塊的玻璃勻漿機(jī)中勻漿。4°C，3000r/min離心20min。取上清液于-2(TC以下低溫保存。制成10%的腦勻漿按測(cè)試盒說(shuō)明操作，分別測(cè)定LD、Na+-K+-ATPaSe、CaW-ATPase、Mg，ATPase和Ca氣MgW-ATPase活力。2.3結(jié)果毛冬青總黃酮對(duì)小鼠短暫性腦缺血再灌注模型血液凝血時(shí)間的影響，結(jié)果見(jiàn)表2,對(duì)腦能量代謝的影響，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。表2毛冬青總黃酮對(duì)小鼠短暫性腦缺血再灌注模型凝血時(shí)間的影響(I±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從上表可看出，與假手術(shù)組比，模型組凝血時(shí)間顯著縮短(尸<0.01)，說(shuō)明造腦缺血再灌注模型后凝血時(shí)間顯著縮短。與模型組比，小劑量毛冬青總黃酮組和華佗再造丸組均可明顯延長(zhǎng)模型動(dòng)物的凝血時(shí)間(P<0.05)，其他個(gè)劑量組有延長(zhǎng)趨勢(shì)。表3毛冬青總黃酮對(duì)小鼠短暫性腦缺血再灌注模型腦勻漿Na+-K+-ATP和Ca"-!^^*+-八1活力的影響(1±3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與模型組比較，*戶(hù)<0.05;林尸<0.01從上表可以看出與假手術(shù)組(空白組)比較，模型組小鼠腦勻漿中ATP酶活力顯著降低(尸O.Ol)，說(shuō)明細(xì)胞膜的Na+-K+-ATP、Ca^—Mg氣ATP酶活性降低，ATP耗竭，腦細(xì)胞能量代謝嚴(yán)重障礙，損傷機(jī)體腦功能。與模型組比，大、中、小劑量毛冬青總黃酮組可明顯升高模型動(dòng)物腦組織勻漿中的Na+—K+-ATP酶活力(/><0.05)，尼莫地平組和華佗再造丸組可顯著升高腦組織勻漿中Na+—K+-ATP酶活力(戶(hù)O.01);大劑量毛冬青總黃酮組和華佗再造丸組可顯著升高腦組織勻漿中Ca++—Mg++-ATP酶活力顯著升高(戶(hù)O.Ol)，中劑量毛冬青總黃酮組和尼莫地平組可明顯升高腦組織勻漿中Ca++—Mg++-ATP酶活力(/><0.05)。表明毛冬青總黃酮對(duì)小鼠短暫性腦缺血再灌注模型的1^+—K+-ATP、Ca++—Mg++-ATP活力有升高作用。表4毛冬青總黃酮對(duì)小鼠短暫性腦缺血再灌注模型腦勻槳Ca^-ATP和MgW-ATP活力的影響(I±s)組別動(dòng)物數(shù)劑量Ca"-ATPMg"-ATP(只)(g/kg)(ymolPi/mgprot/h)(iimolPi/mgprot/h)手術(shù)組10—6.597±1.397"7.129±1.465**模型組10—4.512±1.3174.483±1.191大劑量毛冬青總黃酮組100.46.604±1.156**6.919±1.023"中劑量毛冬青總黃兩組100.25.987±1.3518*5.800±1.375*小劑量毛冬青總黃酮組100.15.125±1.8255.528±1.863尼莫地平組100.026.374±1.472*6,842±1.634"華佗再造丸組102.677.968±2.174**8,246±2.558**注與模型組比較，*尸<0.05:**尸<0.01從上表可以看出與假手術(shù)組(空白組)比較，模型組小鼠腦勻漿中ATP酶活力顯著降低(尸O.Ol)，說(shuō)明細(xì)胞膜的C-ATP和Mg氣ATP酶活性降低，ATP耗竭，腦細(xì)胞能量代謝嚴(yán)重障礙，損傷機(jī)體腦功能。與模型組比，大劑量毛冬青總黃酮組和華佗再造丸組可顯著升高模型動(dòng)物腦組織勻漿中的Ca^-ATP酶活力(尸O.Ol)，中劑量毛冬青總黃酮組和尼莫地平組可明顯升高腦組織勻漿中(^++-八1酶活力(/><0.05);大劑量毛冬青總黃酮組、尼莫地平組和華佗再造丸組可顯著升高腦組織勻漿中MgW-ATP酶活力(尸<0.01)，中劑量毛冬青總黃酮組可明顯升高腦組織勻漿中^^++41酶活力(尸<0.05)。表明毛冬青總黃酮對(duì)小鼠短暫性腦缺血再灌注模型的Ca^-ATP、Mg^-ATP活力有升高作用。毛冬青總黃酮對(duì)小鼠短暫性腦缺血再灌注模型腦勻漿中乳酸含量的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。表5毛冬青總黃酮對(duì)小鼠短暫性腦缺血再灌注模型腦勻漿乳酸含量的影響(^±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注與模型組比較，VO.05;**尸<0.01從表5可以看出與假手術(shù)組(空白對(duì)照組)比，模型組乳酸含量明顯升高(尸<0.05)，說(shuō)明腦缺血使糖無(wú)氧代謝產(chǎn)生的乳酸增多，可引起酸中毒；與模型組比，大、中、小毛冬青總黃酮?jiǎng)┝拷M乳酸含量顯著降低(尸O.01);尼莫地平組和華佗再造丸組乳酸含量明顯降低(尸<0.05)。說(shuō)明毛冬青總黃酮能減少小鼠短暫性腦缺血再灌注時(shí)的乳酸堆積。毛冬青總黃酮對(duì)小鼠短暫性腦缺血再灌注模型腦部海馬區(qū)組織形態(tài)學(xué)觀察的影響，結(jié)果見(jiàn)表6。假手術(shù)組(空白對(duì)照組)小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞均正常，神經(jīng)細(xì)胞胞漿豐富，核及核仁均清晰可見(jiàn)，均為正常。模型組動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞大部分呈萎縮改變，細(xì)胞體積縮小，胞漿明顯減少，核明顯固縮等病理改變，部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)水腫病理改變，細(xì)胞胞漿增多而透明。大劑量毛冬青總黃酮組動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞大部分細(xì)胞胞漿豐富，明顯恢復(fù)；中劑量毛冬青總黃酮組部分動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞得到明顯的恢復(fù)，細(xì)胞體積增大，胞漿豐富；部分動(dòng)物的腦神經(jīng)細(xì)胞仍然呈萎縮狀態(tài)，核固縮。小劑量毛冬青總黃酮組的大部分動(dòng)物的腦神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的萎縮現(xiàn)象，胞漿不同程度的減少，細(xì)胞核固縮。華佗再造丸組動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞大部分細(xì)胞胞漿豐富，部分細(xì)胞發(fā)生萎縮現(xiàn)象，細(xì)胞體積縮小，核固縮。尼莫地平組多數(shù)動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞體積明顯縮小，核固縮；小部分細(xì)胞胞槳豐富，體積改變不大，細(xì)胞核均正常。_表6毛冬青總黃酮對(duì)大鼠腦缺血模型腦組織病理變化的影響(只)_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>假手術(shù)組10—10000模型組10一0127大劑量毛冬青總黃爾組100.42530中劑量毛冬青總黃酮組100.21630小劑量毛冬青總黃酮組100.10361尼莫地平組100.021630華佗再造丸組102.670640"一"動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞均正常，細(xì)胞胞漿豐富，核及核仁清晰可見(jiàn)；"+"動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞20%呈現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，其它80%細(xì)胞正常；"++"動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞50%呈萎縮現(xiàn)象，其它細(xì)胞呈不同程度的恢復(fù)；"+++"動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞80%呈現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，其它細(xì)胞得到不同程度的恢復(fù)。根據(jù)半定量指標(biāo)對(duì)實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。由上表可以看出經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，假手術(shù)組與模型組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)意義，假手術(shù)組腦神經(jīng)細(xì)胞均正常，模型組腦神經(jīng)細(xì)胞大部分呈萎縮改變，細(xì)胞體積縮小，胞槳減少，核固縮，說(shuō)明造模小鼠出現(xiàn)顯著的腦神經(jīng)細(xì)胞病理改變。與模型組比較，大、中劑量毛冬青總黃酮、尼莫地平和華佗再造丸組均可顯著減輕缺血再灌注所致小鼠腦組織的損傷(尸O.Ol),大部分腦神經(jīng)細(xì)胞胞漿豐富，核及核仁清晰可見(jiàn)；小劑量毛冬青總黃酮組均可明顯減輕缺血再灌注所致小鼠腦組織的損傷(尸<0.05)。4.結(jié)論毛冬青總黃酮能改善大鼠短暫性腦缺血一再灌注模型的腦細(xì)胞能量代謝，預(yù)防酸中毒的發(fā)生；能減輕模型腦部海馬區(qū)組織形態(tài)學(xué)的病變；提示毛冬青總黃酮對(duì)短暫性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ陀休^好的作用。實(shí)驗(yàn)3、毛冬青總黃酮對(duì)大鼠腦缺血模型的影響1.實(shí)驗(yàn)材料1.1試劑與藥品毛冬青總黃酮，河南中醫(yī)學(xué)院化學(xué)室，含量〉60%;華佗再造丸，廣州奇星藥業(yè)有限公司，批號(hào)060629;尼莫地平片，山東新華制藥股份有限公司，批號(hào)0609118;生理鹽水，鄭州化學(xué)藥業(yè)有限公司，批號(hào)060712;MDA檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20070405;ATP檢測(cè)試劑盒，批號(hào)南京建成生物工程研究所，20070311;考馬斯良蘭蛋白測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20070418。1.2儀器75-2分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；玻璃勻漿器，上海玻璃儀器廠；恒溫水浴鍋，北京市光明儀器廠。1.3動(dòng)物大鼠Wistar，雄性，體重180200g，由河南醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，SCXK(豫)20060231。2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果取大鼠70只，wistar，體重180-200g，雄性，隨機(jī)均勻分為7組，分別灌服大、中、小劑量毛冬青總黃酮(0.2g/kg，0.1g/kg，0.05g/kg，配成濃度為10mg/ml，5mg/ml，2.5mg/ml，)、尼莫地平(0.01g/kg,配成0.5mg/ml，)、華佗再造丸(0.67g/kg,配成33.25mg/ml)及同體積(灌胃體積均為2ml/100g)的生理鹽水(2組)，每天給藥1次，連續(xù)給藥7天，于第7天給藥后lh，禁食后10h，水合氯醛麻醉，分離并結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈30min后斷頭取血,取腦作病理切片及勻漿測(cè)ATP、LD、LDH、MDA等指標(biāo)。對(duì)腦能量代謝的影響取大鼠腦勻漿(腦重生理鹽水體積=1:9或再稀釋成2%的腦勻漿)按測(cè)試盒說(shuō)明操作分別測(cè)定Na乂、ATPase、Mg氣ATPase、Ca^-ATPase、Ca氣Mg^-ATPase活力，結(jié)果見(jiàn)表1，LD含量、LDH活力，結(jié)果見(jiàn)表2。表1毛冬青總黃酮對(duì)大鼠血瘀合并腦缺血模型腦勻漿能量代謝的影響(^土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>林:表示與模型組比PO.01;"表示與模型組比PO.05從上表可以看出，與假手術(shù)組比，模型組Na乂、ATPase、Mg^-ATPase、Ca"-ATPase活力均明顯降低(P〈0.05)，Ca^-Mg^-ATP活力均顯著降低(PO.Ol),說(shuō)明造腦缺血模型成功。與模型組比，大、中、小劑量毛冬青總黃酮組可顯著提高腦勻漿Na+K+-ATPase活力(PO.Ol)，華佗再造丸組可明顯提高腦勻漿Na+K+-ATPaSe活力(PO.05);中、小劑量毛冬青總黃酮組可顯著提高腦勻漿C-ATPase活力(PO.Ol)，大劑量毛冬青總黃酮組和華佗再造丸組可明顯提高腦勻漿Ca^-ATPase活力(PO.05);大、中劑量毛冬青總黃酮組可顯著提高腦勻漿Mg++-ATPaSe活力(PO.Ol)，小劑量毛冬青總黃酮組和華佗再造丸組可明顯提高腦勻漿MgW-ATPase活力(P<0.05);中、小劑量毛冬青總黃酮組可顯著提高腦勻漿Ca^-MgW-ATPase活力(PO.Ol)，大劑量毛冬青總黃酮組可明顯提高腦勻漿Ca"-MgW-ATPase活力(P<0.05)。表明毛冬青總黃酮對(duì)大鼠腦缺血模型的各種ATP活力有改善作用。表2毛冬青總黃酮對(duì)大鼠血瘀合并腦缺血模型腦勻漿乳酸含量和乳酸脫氫酶活性的影響(i士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>**:表示與模型組比PO.01;&表示與模型組比P<0.05從上表可以看出，與假手術(shù)比，模型組乳酸含量顯著增高(PO.Ol)，說(shuō)明造腦缺血模型成功。與模型組比，中、小劑量毛冬青總黃酮組和尼莫地平組和華佗再造丸組均可明顯降低腦勻漿乳酸含量(P<0.05)，大劑量毛冬青總黃酮組、尼莫地平組和華佗再造丸組均可顯著降低腦勻漿乳酸脫氫酶活力(PO.Ol)。表明毛冬青總黃酮對(duì)大鼠血瘀合腦缺血模型的乳酸含量和乳酸脫氫酶活力有改善作用。對(duì)腦組織中抗氧化物質(zhì)及氧自由基的影響取大鼠腦勻漿(腦重生理鹽水體積=1:9〗按測(cè)試盒說(shuō)明測(cè)定MDA，結(jié)果見(jiàn)表3。表3毛冬青總黃酮對(duì)大鼠腦缺血模型腦勻漿MDA水平的影響(^土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>神:表示與模型組比P〈0.01;+:表示與模型組比P<0.05從上表可以看出，與假手術(shù)組比，模型組腦勻漿MDA含量明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明造腦缺血模型成功。與模型組比，大、中、小劑量毛冬青總黃酮組可顯著降低模型MDA水平(PO.01)，尼莫地平組和華倫再造丸腦勻漿MDA含量明顯降低(PO.Ol)。表明毛冬青總黃酮對(duì)大鼠腦缺血模型的MDA有明顯降低作用。對(duì)大鼠腦缺血模型腦部組織的病理觀察結(jié)果假手組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞均正常，細(xì)胞體積大，胞漿豐富，核及核仁清晰可見(jiàn)；模型組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞胞漿與細(xì)胞核已分界模糊不清，呈現(xiàn)明顯的萎縮和自溶現(xiàn)象；大劑量毛冬青總黃酮組動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞多數(shù)得到恢復(fù)，細(xì)胞體積增大，胞漿豐富；中劑量毛冬青總黃酮組部分腦神經(jīng)細(xì)胞得到不同程度的恢復(fù)，但一部分腦神經(jīng)細(xì)胞仍然呈萎縮狀態(tài)；小劑量毛冬青總黃酮組大部分動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞仍然呈萎縮及水腫狀態(tài)，細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞核模糊不清。華佗再造丸組部分腦神經(jīng)細(xì)胞得到一定的恢復(fù)；尼莫地平組動(dòng)物部分腦神經(jīng)細(xì)胞呈萎縮狀態(tài)，細(xì)胞體積明顯縮小，有的核固縮，有的核模糊不清。結(jié)果見(jiàn)表4。_表4毛冬青總慌酮對(duì)大鼠腦缺血模型腦組織病理變化的影響(只)_組另U動(dòng)物數(shù)劑量(g/kg)^+++~~"一"動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞均正常，細(xì)胞胞漿豐富，核及核仁清晰可見(jiàn)。"+"動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞20%出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，細(xì)胞胞漿減少，體積縮小，核固縮或自溶,核模糊不清。"++"動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞50%出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，細(xì)胞胞漿減少，體積縮小，核固縮或自溶，核模糊不清。"+++"動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞80%出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，細(xì)胞胞漿減少，體積縮小，核固縮或自溶現(xiàn)象，核模糊不清，有的出現(xiàn)水腫，核消失。根據(jù)半定量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)物腦祌經(jīng)病理改變進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，與假手術(shù)組比，模型組腦神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)顯著的便利變化(PO.Ol)，神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞胞漿與細(xì)胞核已分界模糊不清，呈現(xiàn)明顯o7oo11oo233345o145543o1o32o12517o5oSo5c5riooooooo且經(jīng)組組組平造地再手型劑劑劑莫倫假模大中小尼華的萎縮和自溶現(xiàn)象，說(shuō)明造模大鼠出現(xiàn)腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷。與模型組比較，大、中劑量毛冬青總黃酮組、尼莫地平組和華佗再造丸組均可顯著減輕缺血所致的腦組織損傷(PO.Ol)，腦神經(jīng)細(xì)胞部分得到明顯的恢復(fù)，細(xì)胞體積增大，胞漿豐富；小劑量毛冬青總黃酮組可明顯減輕缺血所致的腦組織損傷(P<0.05)。毛冬青總黃酮能拮抗腦缺血損傷的病理改變，使大部分神經(jīng)細(xì)胞得到恢復(fù)，隨著劑量的增加作用增強(qiáng)。3.結(jié)論毛冬青總黃酮能改善大鼠腦缺血腦細(xì)胞的能量代謝，預(yù)防酸中毒的發(fā)生；減輕缺血造成的腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷；減少氧自由基的生成，增加抗氧化物質(zhì)的生成，具有抗氧化作用；能改善腦組織的能量代謝；可顯著改善腦缺血所致的腦組織病理改變。權(quán)利要求1.一種毛冬青總黃酮在制備防治短暫腦缺血綜合癥藥物的應(yīng)用，其特征在于，該毛冬青總黃酮是由取毛冬青藥材，粉碎，用8倍量的70％乙醇加熱回流提取兩次，合并提取液，濾過(guò)，回收乙醇，并濃縮至在50℃時(shí)測(cè)定相對(duì)密度為1.10-1.20，濃縮液用水分散為藥液:藥材＝1∶1的溶液，靜置，濾過(guò)，濾液離心，離心液超濾，通過(guò)聚酰胺柱，先用2倍柱體積的水洗脫，棄去水液，再用8倍柱體積50％乙醇溶液洗脫，收集洗脫液備用，合并兩次的洗脫液，另?yè)QpH值為9-10的碳酸鈉水溶液洗脫，收集洗脫液，用鹽酸調(diào)pH為中性，減壓濃縮，60℃干燥粉碎，得毛冬青總黃酮，其中，總黃酮以蘆丁計(jì)不少于54.0％，總皂苷以人參皂苷Re計(jì)不得超過(guò)5.0％。2、權(quán)利要求1所述的毛冬青總黃酮，其特征是毛冬青總黃酮在制備防治短暫腦缺血綜合癥藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及毛冬青總黃酮在制備防治短暫腦缺血綜合癥藥物的應(yīng)用，有效解決防治短暫腦缺血綜合癥的藥物問(wèn)題，其解決的技術(shù)方案是，取毛冬青藥材，粉碎，用乙醇加熱回流提取兩次，合并提取液，濾過(guò)，回收乙醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.10-1.20，濃縮液用水分散為藥液∶藥材＝1∶1的溶液，靜置，濾過(guò)，濾液離心，離心液超濾，通過(guò)聚酰胺柱，先用水洗脫，棄去水液，再用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液備用，合并兩次的洗脫液，另?yè)Q碳酸鈉水溶液洗脫，收集洗脫液，用鹽酸調(diào)pH為中性，減壓濃縮，干燥粉碎，得毛冬青總黃酮，該毛冬青總黃酮有效用于制備治療防治短暫腦缺血綜合癥的藥物，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦缺血綜合癥的治療，造福于人類(lèi)。文檔編號(hào)A61P9/00GK101366738SQ20081014158公開(kāi)日2009年2月18日申請(qǐng)日期2008年10月9日優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日發(fā)明者苗明三申請(qǐng)人:河南中醫(yī)學(xué)院