專利名稱：蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白多肽類藥物緩釋制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白多肽類高值生化藥物與其他化學(xué)合成藥物相比，具有毒副作用小、用 量少、療效好等優(yōu)勢，受到廣大醫(yī)生和患者的普遍歡迎。隨著基因工程技術(shù)的 發(fā)展，胰島素、干擾素等很多多肽藥物已能夠通過基因重組技術(shù)得到有效的開 發(fā)，具有廣闊的發(fā)展前景。由于蛋白多肽類藥物分子大且常以多聚體形式存在， 因此大多數(shù)蛋白多肽類藥物不能經(jīng)胃腸道吸收，并且極易引起機(jī)體的免疫反 應(yīng)，而且蛋白多肽類藥物存在穩(wěn)定性差、生物利用度低、體內(nèi)生物半衰期短、 極易被生物體內(nèi)的酶分解、易于從血液循環(huán)中清除等缺點(diǎn)，使它們在治疔學(xué)領(lǐng) 域的應(yīng)用受到很大限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決蛋白多肽類藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性差、極易變性失活等缺 陷，而提供了蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法。
本發(fā)明中蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法是按下述步驟進(jìn)行的
一、 按0.01 100mg蛋白質(zhì)多肽類藥物與lmL鹽酸溶液的比例將蛋白質(zhì)多 肽類藥物溶于濃度為0.001 10Ommol/L的鹽酸溶液中，并調(diào)節(jié)pH值為1 7之 間，再加入無機(jī)鹽，使無機(jī)鹽濃度為0.01 1Omol/L，并以10 600r/min的速度 磁力攪拌0.1 100min，然后用功率5 200W的超聲波處理0.01 100min，再離 心分離或過濾后取固體，即得到蛋白多肽類藥物微粒；
二、 將聚陰離子溶于濃度為0.01 1Omol/L的無機(jī)鹽溶液中，其中聚陰離 子濃度為0.01~100mg/mL，然后調(diào)節(jié)pH值為1 7,再按蛋白多肽類藥物微粒 與聚陰離子的質(zhì)量比為l: 0.01 100的比例加入蛋白多肽類藥物微粒，然后以 10~600 r/min的速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng)0.1 100min，再用功率5 200W的 超聲波處理0.01 100min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的聚陰離子)，固 相物再用濃度O.01~10mol/L 、 pH值為1 6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌
0.1 100 min;
三、 將上一步驟處理后的蛋白多肽類藥物微粒置于濃度為 0.01 100mg/mL、 pH值為1 7的多價(jià)金屬陽離子鹽溶液中，其中多價(jià)金屬陽 離子與蛋白多肽類藥物微粒的質(zhì)量比為1: 0.01 100，然后以10 600 r/min的 速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng)0.1 100min，然后用功率5 200W的超聲波處理 0.01 100 min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的多價(jià)金屬陽離子)，用 0.01 1Omol/L 、 pH值為1~6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌0.1 100 min;
四、 重復(fù)步驟三的操作一次；
五、 將聚陽離子溶于濃度為0.01 1Omol/L的無機(jī)鹽溶液中，其中聚陽離 子濃度為0.01~100mg/mL，然后調(diào)節(jié)pH值為1 7，再按蛋白多肽類藥物微粒 與聚陰離子的質(zhì)量比為1: 0.01 100的比例加入經(jīng)步驟四處理的蛋白多肽類藥 物微粒，然后以10 600r/min的速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng)0.1 100min，然后 用功率10 200W的超聲波處理0.01 100min，離心或過濾(目的是去除未被吸 附的聚陽離子)，用濃度O.01~10mol/L、 pH值為1 6的鹽溶液洗滌一至十次， 每次洗滌0.1 100min;即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊；其中步驟一至步驟 五反應(yīng)溫度控制5~10°C，所得蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊中蛋白多肽類藥物 占30%~60%。
本發(fā)明步驟一中的無機(jī)鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、 硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本發(fā)明的步驟一中所述的蛋白多肽類藥物為胰島素、干擾素、水蛭素、降 鈣素、生長激素、環(huán)孢菌(環(huán)肽)、促紅素等葡萄糖氧化酶、凝血因子W1、神 經(jīng)垂體素、縮宮素、增血壓素、促黑色素細(xì)胞素、胸腺素、胸腺肽、胸腺生成 素、促皮質(zhì)素、胰蛋白酶抑制劑、絨毛膜促性激素、尿激酶、魚精蛋白、人丙 種球蛋白、白蛋白、胃膜素、表皮生長因子、紅細(xì)胞生成素或白細(xì)胞介素-2。
本發(fā)明的步驟二中所述的聚陰離子為海藻素鈉、葡聚糖、硫酸葡聚糖 (DS)、硫化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、聚谷氨酸、全氟磺酸(Nafion)、羧甲 基纖維素鈉、聚陰離子纖維素、聚苯乙烯磺酸、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)、硫 酸軟骨素、肝磷脂、尿激酶、聚丙烯酸、聚丙烯酸鈉、透明質(zhì)酸、聚甲基丙烯 酸中的一種或幾種的混合物；聚陰離子為混合物時(shí)，各種聚陰離子間可按任意 比混合。
本發(fā)明步驟二中的無機(jī)鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、 硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本發(fā)明的步驟三中所述的多價(jià)金屬陽離子為Zn2+、 Cu2+、 Fe3+、 Ru3+、 Os3+、 Rh3+、 Sc3+、 Al3+、 Cr3+、 Y3+、 La3+、 Ce3+、 Pr3+、雨3+、 Pm3+、 Sm3+、 En3+、 Ga3+、 Tb3+、 Dy3+、 Ho3+、 Er3+、 Tm3+、 Yb3+、 Li^+中的一種或幾種的混合物; 多價(jià)金屬陽離子為混合物時(shí)，各種多價(jià)金屬陽離子間可按任意比混合。
本發(fā)明的步驟五中所述的聚陽離子為殼聚糖(CS)、聚陽離子為魚精蛋白 (PRO)、聚精氨酸、聚乙烯亞胺、質(zhì)子化的聚乙烯亞胺、聚乙烯基亞胺鹽酸 鹽、季胺烷基醚化陽離子聚乙烯醇、聚烯丙基銨鹽酸鹽(PAH)、聚二烯丙基 二甲季銨鹽、膠原、多聚賴氨酸、陽離子葡聚糖、聚2-羥基-3-甲基丙烯酸酯 基三甲基氯化銨、聚丙烯基氨、多熔素、明膠、二苯胺-4-重氮樹脂、取代二 苯胺重氮樹脂中的一種或幾種的混合物；聚陽離子為混合物時(shí)，各種聚陽離子 間可按任意比混合。
本發(fā)明歩驟五中的無機(jī)鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、 硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本發(fā)明的步驟一、二、三和五中洗滌用的鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶 液、氯化銨溶液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本發(fā)明蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法還能在進(jìn)行步驟四操作之 前依次重復(fù)步驟二和三的操作一至三十九次。
本發(fā)明蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法還能在步驟五中完成用無 機(jī)鹽溶液洗滌之后，依次重復(fù)步驟二和三的操作內(nèi)容一至三十九次，即得 到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。
本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)
1)本發(fā)明通過靜電吸引層層自組裝技術(shù)，使多價(jià)金屬陽離子(如三價(jià)鐵 離子、二價(jià)鋅離子等)與多聚陰離子(如硫酸葡聚糖、葡聚糖、肝素、海藻酸 鈉等) 一層緊貼一層結(jié)合在一起，將蛋白多肽類藥物包裹在里面形成微膠囊。 另外，多價(jià)金屬陽離子與聚陰離子的結(jié)合不僅依靠靜電吸引，而且還通過多價(jià) 金屬陽離子與聚陰離子的配位絡(luò)合作用，從而得到相對穩(wěn)定的載藥微膠囊。
2) 在微膠囊的外層，用具有生物相容性和特殊功能的多聚陽離子進(jìn)行修 飾。從而使制備的微膠囊最外層帶有穩(wěn)定的正電荷，能夠與黏膜內(nèi)壁上的負(fù)電 荷相互作用，阻礙微膠囊的流動(dòng)，最終起到延緩藥效的作用。
3) 在微膠囊中引入了在人體中具有特殊生物學(xué)作用的金屬元素(如人體 不可缺少的鐵和鋅等)，在一定程度上能夠補(bǔ)充人體對這些物質(zhì)的需要。
4) 本發(fā)明通過改變組成微膠囊囊壁的材料和包裹層數(shù)控制囊壁的厚度， 進(jìn)一步調(diào)節(jié)微膠囊的藥物釋放速度。
5) 本發(fā)明的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊具有較高的包封率和載藥量。包 封率達(dá)50%以上，蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊中蛋白多肽類藥物占30%~60%。
6) 本發(fā)明工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易操作，重現(xiàn)性好，環(huán)境友好，為蛋 白多肽類藥物緩控釋制劑的研制提供了物質(zhì)基礎(chǔ)與技術(shù)保障，具有良好的應(yīng)用 刖景。
本發(fā)明微膠囊在中性介質(zhì)中能夠逐漸釋放出蛋白多肽藥物，從而長時(shí)間保 持藥效緩慢發(fā)揮作用。此外，把多肽藥物微膠囊分散于水性或非水性液體溶液 中可構(gòu)成多種類型的微納米蛋白多肽類藥物注射液或口服液，把微米級或亞微 米級多肽藥物微膠囊與腸溶包衣混合，可構(gòu)成多肽藥物口服膠囊、片劑、噴劑 等，可通過肺吸入、注射、口服、經(jīng)皮吸入等多種方式給藥。


圖1是具體實(shí)施方式
二十三中外層包裹了(Fe"DS)4的聚苯乙烯實(shí)心微膠 囊的激光共聚焦圖片。圖2是具體實(shí)施方式
二十三中(Fe"DS)4空心微膠囊的 激光共聚焦圖片。圖3是具體實(shí)施方式
二十三中(Fe^DS)2空心微膠囊的原子 力圖片。圖4是具體實(shí)施方式
二十三中(F^VDS)3空心微膠囊的原子力圖片。 圖5是具體實(shí)施方式
二十三中(F^+ZDS)4空心微膠囊的原子力圖片。圖6是具 體實(shí)施方式二十三中(F^+ZDS)5空心微膠囊的原子力圖片。圖7是具體實(shí)施方 式二十三中多層膜(Fe"DS)n (n = 2,3,4，5)的壁厚隨雙層數(shù)目的變化關(guān)系圖。 圖8是包裹層數(shù)對三價(jià)鐵離子為最外層的胰島素釋放速率的影響效果圖，圖中 4-表示胰島素微粒的體外釋放胰島素的曲線，-o-表示包裹了(DS/Fe,4胰島素 微膠囊的體外釋放胰島素的曲線，-T -表示包裹了 (DS/Fe3+)7胰島素微膠囊的體 外釋放胰島素的曲線，-令-表示包裹了(DS/Fe、。胰島素微膠囊的體外釋放胰
島素的曲線。圖9為包裹層數(shù)對魚精蛋白為最外層的胰島素釋放速率的影響效 果圖；圖中-*-表示胰島素微粒的體外釋放胰島素的曲線，-o-表示包裹了 (DS/Fe3+)3/DS/PRO胰島素微膠囊的體外釋放胰島素的曲線，-T-表示包裹了 (DS/Fe3+)7/DS/PRO胰島素微膠囊的體外釋放胰島素的曲線，-A-表示包裹了 (DS/F^+VDS/PRO胰島素微膠囊的體外釋放胰島素的曲線。圖IO為在胰島素 微粒上組裝上帶電物質(zhì)的zeta電位隨組裝層數(shù)增加的變化關(guān)系圖。圖11是最 外層為魚精蛋白的胰島素微膠囊的共聚焦圖片。圖12是最外層為三價(jià)鐵離子 的胰島素微膠囊的共聚焦圖片。圖13是以不同材料為最外層包裹的胰島素微 膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果圖；圖中-*-表示胰島素溶液對糖尿病大鼠 的血糖影響效果曲線，-0-表示包裹了(08/ 63+)3/08/ 110胰島素微膠囊對糖尿 病大鼠的血糖影響效果曲線，-1表示包裹了(08/ ^+)4/08胰島素微膠囊對糖 尿病大鼠的血糖影響效果曲線，-^-表示包裹了(08/ 63+)3/08/ 110/08胰島素 微膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果曲線，-■-表示包裹了(DS/Fe3、胰島素 微膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果曲線。圖14是不同包裹層數(shù)的胰島素微 膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果圖；圖中-*-表示胰島素溶液對糖尿病大鼠 的血糖影響效果曲線，-^-表示包裹了(08^^+)2/08/ 110胰島素微膠囊對糖尿 病大鼠的血糖影響效果曲線，-T-表示包裹了 DS/F^+)3/DS/PRO胰島素微膠囊 對糖尿病大鼠的血糖影響效果曲線，-0-表示包裹了(08^^+)7/08"!10胰島素 微膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果曲線，-國-表示包裹T(DS/Fe3+)9/DS/PRO 胰島素微膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果曲線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方 式間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式中蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法是
按下述步驟進(jìn)行的 一、按0.01 100mg蛋白質(zhì)多肽類藥物與lmL鹽酸溶液的 比例將蛋白質(zhì)多肽類藥物溶于濃度為0.001~100mmol/L的鹽酸溶液中，并調(diào)節(jié) pH值為1~7之間，再加入無機(jī)鹽，使無機(jī)鹽濃度為0.01~10mol/L，并以 10~600r/min的速度磁力攪拌0.1 100min，然后用功率5 200W的超聲波處理 0.01 100min，再離心分離或過濾后取固體，即得到蛋白多肽類藥物微粒；
二、 將聚陰離子溶于濃度為0.01~10mol/L的無機(jī)鹽溶液中，其中聚陰離 子濃度為0.01~100mg/mL，然后調(diào)節(jié)pH值為1 7，再按蛋白多肽類藥物微粒 與聚陰離子的質(zhì)量比為l: 0.01 100的比例加入蛋白多肽類藥物微粒，然后以 10-600 r/min的速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng)0.1 100min，再用功率5 200W的 超聲波處理0.01 100min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的聚陰離子)，固 相物再用濃度O.01~10mol/L 、 pH值為1 6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌 O.卜勵(lì)min;
三、 將上一步驟處理后的蛋白多肽類藥物微粒置于濃度為 0.01~100mg/mL、 pH值為1~7的多價(jià)金屬陽離子鹽溶液中，其中多價(jià)金屬陽 離子與蛋白多肽類藥物微粒的質(zhì)量比為h 0.01~100，然后以10 600 r/min的 速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng)0.1 100min，然后用功率5~200W的超聲波處理 0.01~100 min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的多價(jià)金屬陽離子)，用 O.01~10mol/L 、 pH值為1~6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌0.1 100 min;
四、 重復(fù)步驟三的操作一次；
五、 將聚陽離子溶于濃度為0.01 1Omol/L的無機(jī)鹽溶液中，其中聚陽離 子濃度為0.01~100mg/mL，然后調(diào)節(jié)pH值為1 7，再按蛋白多肽類藥物微粒 與聚陰離子的質(zhì)量比為1: 0.01 100的比例加入經(jīng)步驟四處理的蛋白多肽類藥 物微粒，然后以10 600r/min的速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng)0.1 100min，然后 用功率10 200W的超聲波處理0.01 100min，離心或過濾(目的是去除未被吸 附的聚陽離子)，用濃度0.O卜10mol/L、 pH值為1 6的鹽溶液洗滌一至十次， 每次洗滌0.1 100min;即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊；其中步驟一至步驟 五反應(yīng)溫度控制5 10°C，所得蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊中蛋白多肽類藥物 占30%~60o/o。
本實(shí)施方式蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的大小均勻，粒徑大小平均為
本實(shí)施方式的步驟一中所述的無機(jī)鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯 化銨溶液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本實(shí)施方式的步驟一中所述的蛋白多肽類藥物為胰島素、干擾素、水蛭素、 降鈣素、生長激素、環(huán)孢菌(環(huán)肽)、促紅素等葡萄糖氧化酶、凝血因子WI、
神經(jīng)垂體素、縮宮素、增血壓素、促黑色素細(xì)胞素、胸腺素、胸腺肽、胸腺生 成素、促皮質(zhì)素、胰蛋白酶抑制劑、絨毛膜促性激素、尿激酶、魚精蛋白、人 丙種球蛋白、白蛋白、胃膜素、表皮生長因子、紅細(xì)胞生成素或白細(xì)胞介素-2。 本實(shí)施方式的步驟二中所述的聚陰離子為海藻素鈉、葡聚糖、硫酸葡聚糖
(DS)、硫化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、聚谷氨酸、全氟磺酸(Nafion)、羧甲 基纖維素鈉、聚陰離子纖維素、聚苯乙烯磺酸、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)、硫 酸軟骨素、肝磷脂、尿激酶、聚丙烯酸、聚丙烯酸鈉、透明質(zhì)酸、聚甲基丙烯 酸中的一種或幾種的混合物；聚陰離子為混合物時(shí)，各種聚陰離子間可按任意 比混合。
本實(shí)施方式步驟二的無機(jī)鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、 硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本實(shí)施方式的步驟三中所述的多價(jià)金屬陽離子為Zr^+、 Cu2+、 Fe3+、 Ru3+、 Os3+、 Rh3+、 Sc3+、 Al3+、 Cr3+、 Y3+、 La3+、 Ce3+、 Pr3+、 Nd3+、 Pm3+、 Sm3+、 Eu3+、 Ga3+、 Tb3+、 Dy3+、 Ho3+、 Er3+、 Tm3+、 Yb3+、 1^3+中的一種或幾種的混 合物；多價(jià)金屬陽離子為混合物時(shí)，各種多價(jià)金屬陽離子間可按任意比混合。
本實(shí)施方式的步驟五中所述的聚陽離子為殼聚糖(CS)、聚陽離子為魚精 蛋白(PRO)、聚精氨酸、聚乙烯亞胺、質(zhì)子化的聚乙烯亞胺、聚乙烯基亞胺 鹽酸鹽、季胺烷基醚化陽離子聚乙烯醇、聚烯丙基銨鹽酸鹽(PAH)、聚二烯 丙基二甲季銨鹽、膠原、多聚賴氨酸、陽離子葡聚糖、聚2-羥基-3-甲基丙烯 酸酯基三甲基氯化銨、聚丙烯基氨、多熔素、明膠、二苯胺-4-重氮樹脂、取
代二苯胺重氮樹脂中的一種或幾種的混合物；聚陽離子為混合物時(shí)，各種聚陽
離子間可按任意比混合。
本實(shí)施方式步驟五中的無機(jī)鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶 液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本實(shí)施方式的步驟一、二、三和五中洗滌用的鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸 鈉溶液、氯化銨溶液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本實(shí)施方式中通過調(diào)節(jié)磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速、超聲功率或超聲時(shí)間來控制蛋 白多肽類藥物微粒及蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的粒子大小，磁力攪拌器的轉(zhuǎn) 速、超聲功率或超聲時(shí)間增大均能使所得粒子的粒徑變小。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)為在進(jìn)行步驟 四操作之前依次重復(fù)步驟二和三的操作一至三十九次。其它步驟及參數(shù)與具體 實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)為在進(jìn)行步驟 四操作之前依次重復(fù)步驟二和三的操作二至十次。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí) 施方式一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一、二或三的不同點(diǎn)為步 驟五中完成用無機(jī)鹽溶液洗滌之后，依次重復(fù)步驟二和三的操作內(nèi)容一至 三十九次，即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí) 施方式一、二或三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一、二或三的不同點(diǎn)為步 驟五中完成用無機(jī)鹽溶液洗滌之后，依次重復(fù)步驟二和三的操作內(nèi)容二至 十次，即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方 式一、二或三相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中磁力
攪拌速度為200 400r/min，磁力攪拌時(shí)間為5 30min。其它步驟及參數(shù)與具體 實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中磁力 攪拌速度為300r/min，磁力攪拌時(shí)間為15min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方 式一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中超聲 波的功率為20~100W，超聲處理1 50min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一 相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中超聲
波的功率為50W，超聲處理5min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中磁力
攪拌速度為200~400r/min，磁力攪拌時(shí)間為5 30min。其它步驟及參數(shù)與具體 實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中磁
力攪拌速度為300r/min，磁力攪拌時(shí)間為15min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施 方式一相同。
具體實(shí)施方式
十二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中超 聲波的功率為20 100W，超聲處理1 50min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中超 聲波的功率為50W，超聲處理5min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中磁 力攪拌速度為200~400r/min，磁力攪拌時(shí)間為5 30min。其它步驟及參數(shù)與具 體實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中磁 力攪拌速度為300r/min，磁力攪拌時(shí)間為15min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施 方式一相同。
具體實(shí)施方式
十六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中超 聲波的功率為20~100W，超聲處理1 50min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中超 聲波的功率為50W，超聲處理5min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟五中磁
力攪拌速度為200~400r/min，磁力攪拌時(shí)間為5 30min。其它步驟及參數(shù)與具 體實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
十九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟五中磁 力攪拌速度為300r/min，磁力攪拌時(shí)間為15min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施 方式一相同。
具體實(shí)施方式
二十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟五中超
聲波的功率為20~100W，超聲處理1 50min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟五中
超聲波的功率為50W，超聲處理5min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十二本實(shí)施方式中胰島素緩釋微膠囊的制備方法是按下
述步驟進(jìn)行的 一、將胰島素溶于濃度為O.OOlmol/L的鹽酸溶液中，胰島素 的濃度為20mg/mL，并調(diào)節(jié)pH值為3.0，再加入無機(jī)鹽，使無機(jī)鹽的濃度為 0.5mol/L溶液，以300r/min的速度磁力攪拌60min，然后用功率50W的超聲 波處理5min，再離心分離或過濾后取固體，即得到胰島素微粒；
二、 將0.01 100mg胰島素微粒置于1 2mL濃度為10mg/mL、pH值為1 7 硫酸葡聚糖(DS)的NaCl溶液中，硫酸葡聚糖的NaCl溶液中NaCl溶液的 濃度為0.01~10mol/L，然后以100r/min的速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng)15min， 再用功率50W的超聲波處理5min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的聚陰 離子)，再用濃度0.5mol/L 、 pH值為3.0的NaCl溶液洗滌三次，每次洗滌1 min;
三、 將經(jīng)步驟二處理后的胰島素微粒置于l 2mL濃度為5mg/mL、 pH值 為3.0的三價(jià)鐵離子溶液中，然后以100 r/min的速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng) 15min，然后用功率50W的超聲波處理5min，離心或過濾(目的是去除未被 吸附的多價(jià)金屬陽離子)，用0.5mol/L 、 pH值為3.0的NaCl溶液洗滌三次， 每次洗滌1 min;
四、 重復(fù)步驟三的操作一次；
五、 將經(jīng)步驟四處理的胰島素微粒置于l 2mL濃度為5mg/mL、 pH值為 3.0魚精蛋白(PRO)的NaCl溶液中，聚陽離子的無機(jī)鹽溶液中NaCl溶液的 濃度為0.5mol/L，然后以300 r/min的速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng)15min，然 后用功率50W的超聲波處理5min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的聚陽 離子)，用濃度0.5mol/L、 pH值為3.0的NaCl溶液洗滌三次，每次洗滌1 min; 即得到胰島素緩釋微膠囊。
具體實(shí)施方式
二十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十二的不同點(diǎn)為在 進(jìn)行步驟四操作之前依次重復(fù)步驟二和三的操作一至九次。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十二相同。
本實(shí)施方式方式得到的胰島素緩釋微膠囊胰島素外層結(jié)構(gòu)表達(dá)式
(DS/Fe3+)n/DS/PRO，其中n表示個(gè)數(shù)，為2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9。
為了證明三價(jià)鐵離子與硫酸葡聚糖形成的復(fù)合物能夠作為胰島素的載體
材料，采用聚苯乙烯小球?yàn)槟０澹苽淞薖S(Fe"DS)4微膠囊，然后用四氫呋 喃溶去其中的PS小球，得到(DS /Fe3+) 4的空心微膠囊。從圖1和2中可以看 出，空心微膠囊(DS/F^+)4在水中依然能夠保持原來的球形，而在干燥狀態(tài) 下由于內(nèi)外壓力差變?yōu)楦砂T多褶皺形態(tài)(圖3、 4、 5和6所示)。在干燥狀態(tài) 下，利用原子力顯微鏡測定空心微膠囊的壁厚，隨著(DS/F^+)層數(shù)的增加， 其厚度呈線性關(guān)系增長(圖7所示)，這表明可以通過改變包裹層數(shù)來改變外 殼厚度，從而改變胰島素的釋放速度。隨著包裹層數(shù)增加，藥物釋放速度減慢， 最外層為Fe"(圖8)禾nPRO (圖9)的胰島素微膠囊均表現(xiàn)出較好的釋放效 果。
在包裹胰島素微膠囊的過程中，每包裹完一層，取出少量測定Zeta電位， 通過最外層Zeta電位的正負(fù)交叉變化證明每一層的成功包裹。從圖10可以看 出Zeta電位正負(fù)交叉變化，從而證明帶有正負(fù)電荷的兩種物質(zhì)均成功包裹在 胰島素微聚體的表面。另夕卜，從圖中還可以看出F浐的Zeta電位的絕對值明 顯低于DS或PRO的Zeta電位的絕對值。此外，從圖11和12還可以看出， 超聲處理后，最外層為魚精蛋白的胰島素微膠囊比最外層為鐵離子的胰島素微 膠囊的分散性更好。這可能是由于所帶電荷的穩(wěn)定性影響了其穩(wěn)定性的緣故， 因?yàn)槿齼r(jià)鐵離子所帶的電荷不穩(wěn)定，而魚精蛋白由于含有大于70%的精氨酸而 帶有足夠多的正電荷，使得微粒分散性更好。另外，鐵與多糖容易形成納米顆 粒狀復(fù)合物的表面不規(guī)整，不利于其保存，影響其在體外保存時(shí)的穩(wěn)定性。因 此采用多聚陽離子修飾微膠囊的表面。
圖13和14為鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠皮下注射給藥后血糖隨時(shí). 間的變化情況。結(jié)果表明，糖尿病大鼠皮下注射后，胰島素微膠囊混懸液具有 較好的降血糖效果。其中，圖13為以不同材料為最外層包裹的胰島素微膠囊 對糖尿病大鼠的血糖影響，從圖中可以看出，與最外層為DS、 F^+的胰島素 微膠囊相比，皮下注射最外層為PRO (—o—)的胰島素微膠囊能夠使糖尿病 大鼠的降血糖效果持續(xù)在40%以下6個(gè)小時(shí)，而且非常穩(wěn)定。這是因?yàn)?，人體 內(nèi)的黏膜和細(xì)胞外壁上具有很多陰離子，這樣可以同最外層為PRO的胰島素 微膠囊的外層聚陽離子PRO通過靜電作用相互吸引，從而減慢了胰島素微膠
囊的流動(dòng)，使得胰島素微膠囊的藥效能夠穩(wěn)定發(fā)揮較長時(shí)間。圖14為以魚精 蛋白為最外層，皮下注射不同層數(shù)包裹的胰島素微膠囊對糖尿病大鼠的血糖影 響。從圖14中可以看出，隨著層數(shù)的增加，胰島素微膠囊對糖尿病大鼠的降 血糖效果更加明顯。這與釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)論是一致的，隨著包裹層數(shù)增加，藥物
釋放速度減慢，從而使藥效的發(fā)揮時(shí)間越長。其中，皮下注射包裹io個(gè)雙層
(DS/F^+)9/DS/PRO的胰島素微膠囊使降血糖效果達(dá)到了 IO個(gè)小時(shí)，降血糖效 果非常顯著。
胰島素是一種具有生物活性的多肽類藥物，容易被胃蛋白酶分解而失去藥 效，所以臨床上多以注射針劑給藥。但是由于這類藥物半衰期短，必須長期頻 繁注射，不但費(fèi)用高、麻煩大，而且注射部位會(huì)引起硬結(jié)和皮下脂肪萎縮，給 患者造成極大的痛苦和精神壓力。通過本實(shí)施方法可實(shí)現(xiàn)此類藥物口服化，從 而減輕患者的痛苦。由于口服藥具有方便、安全以及費(fèi)用低的有點(diǎn)，因而具有 廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
二十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十二的不同點(diǎn)為在 進(jìn)行步驟四操作之前依次重復(fù)步驟二和三的操作十至三十九次。其它步驟及參 數(shù)與具體實(shí)施方式
二十二相同。
具體實(shí)施方式
二十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十二、 二十三或二十 四的不同點(diǎn)為步驟五中完成用無機(jī)鹽溶液洗滌之后，依次重復(fù)步驟二和 三的操作內(nèi)容一至三十九次，即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。其它步 驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十二、 二十三或二十四相同。
權(quán)利要求
1、蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特征在于蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法是按下述步驟進(jìn)行的一、按0.01～100mg蛋白質(zhì)多肽類藥物與1mL鹽酸溶液的比例將蛋白質(zhì)多肽類藥物溶于濃度為0.001～100mmol/L的鹽酸溶液中，并調(diào)節(jié)pH值為1～7之間，再加入無機(jī)鹽，使無機(jī)鹽濃度為0.01～10mol/L，并以10～600r/min的速度磁力攪拌0.1～100min，然后用功率5～200W的超聲波處理0.01～100min，再離心分離或過濾后取固體，即得到蛋白多肽類藥物微粒；二、將聚陰離子溶于濃度為0.01～10mol/L的無機(jī)鹽溶液中，其中聚陰離子濃度為0.01～100mg/mL，然后調(diào)節(jié)pH值為1～7，再按蛋白多肽類藥物微粒與聚陰離子的質(zhì)量比為1:0.01～100的比例加入蛋白多肽類藥物微粒，然后以10～600r/min的速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng)0.1～100min，再用功率5～200W的超聲波處理0.01～100min，離心或過濾，固相物再用濃度0.01～10mol/L、pH值為1～6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌0.1～100min；三、將上一步驟處理后的蛋白多肽類藥物微粒置于濃度為0.01～100mg/mL、pH值為1～7的多價(jià)金屬陽離子鹽溶液中，其中多價(jià)金屬陽離子與蛋白多肽類藥物微粒的質(zhì)量比為1:0.01～100，然后以10～600r/rain的速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng)0.1～100min，然后用功率5～200W的超聲波處理0.01～100 min，離心或過濾，用0.01～10mol/L、pH值為1～6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌0.1～100min；四、重復(fù)步驟三的操作一次；五、將聚陽離子溶于濃度為0.01～l0mol/L的無機(jī)鹽溶液中，其中聚陽離子濃度為0.01～100mg/mL，然后調(diào)節(jié)pH值為1～7，再按蛋白多肽類藥物微粒與聚陰離子的質(zhì)量比為1:1:0.0l～100的比例加入經(jīng)步驟四處理的蛋白多肽類藥物微粒，然后以10～600 r/min的速度磁力攪拌進(jìn)行吸附反應(yīng)0.1～100min，然后用功率10～200W的超聲波處理0.01～100min，離心或過濾，用濃度0.01～10mol/L、pH值為1～6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌0.1～100min即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊；其中步驟一至步驟五反應(yīng)溫度控制5～10℃，所得蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊中蛋白多肽類藥物占30％～60％。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于在進(jìn)行步驟四操作之前依次重復(fù)步驟二和三的操作一至三十九次。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法， 其特征在于步驟五中完成用鹽溶液洗滌之后，依次重復(fù)步驟二和三的操作 內(nèi)容一至三十九次，即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟一中所述的蛋白多肽類藥物為胰島素、干擾素、水蛭素、降鈣素、生長激素、環(huán)孢菌、促紅素等葡萄糖氧化酶、凝血因子Vffl、神經(jīng)垂體素、縮宮素、增血壓素、促黑色素細(xì)胞素、胸腺素、胸腺肽、胸腺生成素、促皮質(zhì)素、 胰蛋白酶抑制劑、絨毛膜促性激素、尿激酶、魚精蛋白、人丙種球蛋白、白蛋白、胃膜素、表皮生長因子、紅細(xì)胞生成素或白細(xì)胞介素-2。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟二中所述的聚陰離子為海藻素鈉、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫化葡聚 糖、肝素、硫酸肝素、聚谷氨酸、全氟磺酸、羧甲基纖維素鈉、聚陰離子纖維 素、聚苯乙烯磺酸、聚苯乙烯磺酸鈉、硫酸軟骨素、肝磷脂、尿激酶、聚內(nèi)烯 酸、聚丙烯酸鈉、透明質(zhì)酸、聚甲基丙烯酸中的一種或幾種的混合物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟一中的無機(jī)鹽為氯化鈉、氯化銨、硫酸銨、氯化鉀、磷酸鈉、磷酸 鉀。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟三中所述的多價(jià)金屬陽離子為Zn2+、 Cu2+、 Fe3+、 Ru3+、 Os3+、 Rh3+、 Sc3+、 Al3+、 Cr3+、 Y3+、 La3+、 Ce3+、 Pr3+、 Nd3+、 Pm3+、 Sm3+、 Eu3+、 Ga3+、 Tb3+、 Dy3+、 Ho3+、 Er3+、 Tm3+、 Yb3+、 1^3+中的一種或幾種的混合物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟五中所述的聚陽離子為殼聚糖、聚陽離子為魚精蛋白、聚精氨酸、 聚乙烯亞胺、質(zhì)子化的聚乙烯亞胺、聚乙烯基亞胺鹽酸鹽、季胺烷基醚化陽離 子聚乙烯醇、聚烯丙基銨鹽酸鹽、聚二烯丙基二甲季銨鹽、膠原、多聚賴氨酸、 陽離子葡聚糖、聚2-羥基-3-甲基丙烯酸酯基三甲基氯化銨、聚丙烯基氨、多 熔素、明膠、二苯胺-4-重氮樹脂、取代二苯胺重氮樹脂中的一種或幾種的混 合物。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟二中的無機(jī)鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、硫酸 銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀；步驟五中的無機(jī)鹽溶液為氯化鈉 溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷 酸鉀。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟二、三、五中洗滌所用的鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化 銨溶液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
全文摘要
蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，它涉及蛋白多肽類藥物緩釋制劑的制備方法。本發(fā)明解決了蛋白多肽類藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性差、極易變性失活等缺陷。本發(fā)明方法步驟如下一、鹽析法制蛋白多肽類藥物微粒；二、吸附聚陰離子；三、吸附多價(jià)金屬陽離子；四、吸附聚陰離子；五、吸附聚陽離子，得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。本發(fā)明產(chǎn)品中多價(jià)金屬陽離子與聚陰離子通過靜電引力及配位絡(luò)合作用相互結(jié)合，大大提高了產(chǎn)品在體內(nèi)穩(wěn)定性；通過體外釋放實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明產(chǎn)品釋放緩慢，通過藥理活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明產(chǎn)品具有生物活性，并且能夠在體內(nèi)緩慢發(fā)揮藥效，持續(xù)12小時(shí)～24小時(shí)以上，同時(shí)為人體補(bǔ)充所需的微量元素。
文檔編號(hào)A61K47/38GK101361963SQ20081013712
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月16日
發(fā)明者劉紹琴, 岳秀麗, 戴志飛, 洋 王, 健 鄭, 閻秀峰 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)