專(zhuān)利名稱(chēng)：包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及解酒藥的新用途，即包含有乙醛脫氫酶的解酒藥用于 心臟的保護(hù)和心臟病的治療保健食品或藥物，具體而言， 一方面，利用解酒藥中的乙醛脫氫酶(ALDH2)減輕心肌缺血/再灌注損傷，另 一方面，利用解酒藥中的乙醛脫氫酶(ALDH2)抑制心肌細(xì)胞調(diào)亡， 使得解酒藥能夠抗心力衰竭。
背景技術(shù)：
心臟被稱(chēng)為人體"發(fā)動(dòng)機(jī)"，心臟是一個(gè)健壯、不知疲倦、努 力工作的強(qiáng)力泵。心臟之于身體，如同發(fā)動(dòng)機(jī)之于汽車(chē)。如果按一 個(gè)人心臟平均每分鐘跳70次、壽命70歲計(jì)算的話(huà)， 一個(gè)人的一生 中，心臟就要跳動(dòng)26億次。 一旦心臟停止跳動(dòng)而通過(guò)搶救不能復(fù)跳， 那就意味著， 一個(gè)人的生命終止了。心臟是人類(lèi)健康的頭號(hào)殺手， 全世界l/3的人口死亡是因心臟引起的，而我國(guó)，每年有幾十萬(wàn)人 死于心臟病。由是可見(jiàn)，心臟之于人類(lèi)的重要意義。保護(hù)心臟的方式很多， 比如培養(yǎng)健康合理的生活習(xí)慣，保持平和的心態(tài)，堅(jiān)持適量運(yùn)動(dòng)， 如果萬(wàn)一患上心臟病，不得不進(jìn)行治療，目前常用的心臟病藥物有 速效救心丸、復(fù)方丹參片、地奧心血康和天士力復(fù)方丹參滴丸，這 些藥物藥效顯著，但是其副作用也不容忽視。解酒藥發(fā)揮解酒防醉作用的重要成分就是ALDH2，由生物酶技術(shù) 生產(chǎn)，它是快速分解乙醛的酶，而乙醛是酒精代謝過(guò)程中對(duì)人體危害 最大的物質(zhì)。通過(guò)研究結(jié)果證實(shí)乙醛脫氫酶2 (aldehyde dehydrogenase2，ALDH2)高表達(dá)可以發(fā)揮心肌保護(hù)作用，減少缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞 凋亡。心力衰竭是各種心臟病發(fā)展的終末結(jié)果，也是最主要的死亡原 因之一，而心肌細(xì)胞凋亡是心力衰竭發(fā)生的重要機(jī)制。心力衰竭時(shí)心 肌細(xì)胞凋亡使細(xì)胞大量喪失，當(dāng)心肌細(xì)胞數(shù)量減少到一定程度必然 導(dǎo)致心力衰竭進(jìn)行性惡化。包括干細(xì)胞移植在內(nèi)的各種治療心力衰竭 的方法都是為了抑制或減少心肌細(xì)胞凋亡，減少心力衰竭時(shí)心肌細(xì) 胞的缺失，從而減緩或治療心力衰竭。我們實(shí)驗(yàn)證實(shí)乙醛脫氫酶 (ALDH2)抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗心力衰竭作用。解酒藥能提 高乙醛脫氫酶(ALDH2)活性或補(bǔ)充乙醛脫氫酶(ALDH2)，抑制心 肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗心力衰竭作用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供解酒藥的新用途，具體而言，就 是將包含有乙醛脫氫酶的解酒藥用于心臟的保護(hù)和心臟病的治療保 健食品或藥物。具體表現(xiàn)為 一方面，利用解酒藥中的乙醛脫氫酶 (ALDH2)減輕心肌缺血/再灌注損傷，另一方面，利用解酒藥提高 乙醛脫氫酶(ALDH2)的活性或補(bǔ)充乙醛脫氫酶(ALDH2)，從而抑 制心肌細(xì)胞調(diào)亡，發(fā)揮抗心力衰竭的作用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下 一種包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用 途，將含有乙醛脫氫酶的解酒藥用于心臟的保護(hù)和心臟病的治療保健 食品或藥物。在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，所述的包含有乙醛脫氫酶的解酒藥是指 含有乙醛脫氫酶的保健品或藥物，包括海王金樽，安體普，或解酒神 茶等。在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，所述的心臟病包括冠狀動(dòng)脈粥樣硬化 性心臟病以及心力衰竭。其中，所述的心力衰竭是指各種原因引起如缺血性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、瓣膜性心臟病、原發(fā)性擴(kuò)張性心 肌病等。本發(fā)明的原理之一是由于解酒藥能通過(guò)補(bǔ)充ALDH2而減輕心肌 缺血/再灌注損傷。以下通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)說(shuō)明選擇市面上一種能提高ALDH2的解酒藥(以下簡(jiǎn)稱(chēng)藥物組)，比較該藥物與辛伐他汀(他汀類(lèi) 藥物)對(duì)大鼠缺血再灌注后損傷的影響。其中，他汀類(lèi)藥物是目前臨 床上常用、有效的調(diào)脂藥物。另外，近年來(lái)，他汀類(lèi)藥物的非調(diào)脂作 用日益受到關(guān)注，臨床研究發(fā)現(xiàn)，早期應(yīng)用他汀類(lèi)藥物能明顯改善心 肌梗死及不穩(wěn)定型心絞痛患者的預(yù)后，降低發(fā)病率、死亡率。本發(fā)明的原理之二是通過(guò)解酒藥提高ALDH2的活性或者補(bǔ)充 ALDH2，抑制心肌細(xì)胞調(diào)亡，發(fā)揮抗心力衰竭作用。藥物組采用海王金樽(海王集團(tuán))，主要成分為牡蠣提取物，提 高乙醛脫氫酶活性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明含有乙醛脫氫酶的解酒藥對(duì)心臟的 保護(hù)和心臟病的治療有效。本發(fā)明所稱(chēng)的解酒藥除海王金樽外，還包括1.安體普(原蘇聯(lián)特工使用解酒藥RU21):安體普所含的活性 物質(zhì)激勵(lì)體內(nèi)產(chǎn)生乙醛脫氫酶，并提高其活性，全面提升機(jī)體對(duì)乙醛 的分解能力，達(dá)到主動(dòng)解酒、清醒護(hù)體之功效。2、內(nèi)蒙古赤峰市杰恩天然生物資源研究開(kāi)發(fā)部(解酒醒神茶)解酒醒神茶所應(yīng)用的核心技術(shù)乙醛脫氫酶是用生物酶技術(shù)生產(chǎn) 的，它能快速分解乙醛所必須的酶。而乙醛是酒精代謝過(guò)程中對(duì)人體 危害最大的物質(zhì)。乙醛脫氫酶直接分解乙醒而達(dá)到解酒防醉的目的。 作為解酒醒神茶的重要成分，它在解酒防醉過(guò)程中的作用是無(wú)可取代 的。3.其它用乙醛脫氫酶制成的保健食品或藥物。


圖1為缺血再灌注模型示意圖；圖2為T(mén)TC染色法評(píng)價(jià)藥物對(duì)缺血再灌注后心肌保護(hù)的作用示 意圖；圖3為ALDH2腺病毒顆粒的轉(zhuǎn)染效率示意圖；圖4為RT-PCR測(cè)定ALDH2病毒顆粒的轉(zhuǎn)染效率示意圖；圖5為乙醛代謝法測(cè)定轉(zhuǎn)染后ALDH2酶活性示意圖；圖6為采用Hoechest 33324法檢測(cè)細(xì)胞凋亡示意圖；圖7為采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡示意圖；圖8為采用流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞凋亡示意圖。其中，圖1和圖2中的藥即指解酒藥；圖9 ( I )為心肌細(xì)胞缺氧時(shí)，反應(yīng)ALDH2活性的光密度統(tǒng)計(jì)圖； 圖9 (II)為心肌細(xì)胞缺氧時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖；圖10 ( I )為成年雄性ALDH2野生型和ALDH2基因敲除C57BL/6 小鼠LVEDP統(tǒng)計(jì)圖；圖10 ( II )為成年雄性ALDH2野生型和ALDH2基因敲除C57BL/6 小鼠EF統(tǒng)計(jì)圖；圖10 (III)為成年雄性ALDH2野生型和ALDH2基因敲除C57BL/6 小鼠的Apoptosis (%)統(tǒng)計(jì)圖；圖11 ( I )為心室注射編碼ALDH2的腺病毒小鼠(即A: ALDH2 高表達(dá)組)和注射沒(méi)有編碼ALDH2的空腺病毒的小鼠(即B:對(duì)照組) LVEDD統(tǒng)計(jì)圖；圖ll (II)為心室注射編碼ALDH2的腺病毒小鼠(即A: ALDH2 高表達(dá)組)和注射沒(méi)有編碼ALDH2的空腺病毒的小鼠(即B:對(duì)照組) FS統(tǒng)計(jì)圖；圖ll (III)為心室注射編碼ALDH2的腺病毒小鼠(即A: ALDH2 高表達(dá)組)和注射沒(méi)有編碼ALDH2的空腺病毒的小鼠(即B:對(duì)照組) EF統(tǒng)計(jì)圖；圖ll (IV)為心室注射編碼ALDH2的腺病毒小鼠(即A: ALDH2 高表達(dá)組)和注射沒(méi)有編碼ALDH2的空腺病毒的小鼠(即B:對(duì)照組) TUNEL染色實(shí)驗(yàn)效果圖；圖ll (V)為心室注射編碼ALDH2的腺病毒小鼠(即A: ALDH2 高表達(dá)組)和注射沒(méi)有編碼ALDH2的空腺病毒的小鼠(即B:對(duì)照組) TUNEL分析統(tǒng)計(jì)圖；圖12 ( I )為生理鹽水(即對(duì)照組)、解酒藥和依那普利干預(yù) 心力衰竭C57BL/6小鼠的EF統(tǒng)計(jì)圖；圖12 (II)為生理鹽水(即對(duì)照組)、解酒藥和依那普利干預(yù) 心力衰竭C57BL/6小鼠的FS統(tǒng)計(jì)圖；圖12 (III)為生理鹽水(即對(duì)照組)、解酒藥和依那普利干預(yù) 心力衰竭C57BL/6小鼠的LVEDP統(tǒng)計(jì)圖。
具體實(shí)施方式
例l:解酒藥可保護(hù)心臟，對(duì)預(yù)防心肌梗死有治療、保健作用 一、實(shí)驗(yàn)材料SD大鼠6-8周齡，體重250g (購(gòu)于中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心) 伊文思藍(lán)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 四氮唑(TTC):上海靈錦精細(xì)化工有限公司 氯胺酮手術(shù)器械眼科剪，止血鉗，鑷子，剪毛剪，持針器，三齒撐開(kāi)器，接扎線(xiàn)，縫合線(xiàn)，刀片小動(dòng)物呼吸機(jī)尼康相機(jī)二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程1. 實(shí)驗(yàn)分組-SD大鼠分成3組(生理鹽水對(duì)照組；藥物組；辛伐他汀組)，每組10只。手術(shù)前三天分別用生理鹽水(lml/kg體重)灌胃，藥物(50mg/kg) 灌胃，腹腔注射辛伐他汀(lmg/kg體重)。2. 術(shù)前準(zhǔn)備手術(shù)前半個(gè)小時(shí)，再次分別用生理鹽水(lml/kg體重)和藥物 (50mg/kg體重)灌胃組，辛伐他汀(lmg/kg體重)采用腹腔注射。 觀察大鼠狀態(tài)。3. 建立大鼠缺血再灌注模型 3.1大鼠麻醉及固定大鼠腹腔注射氯胺酮(lml/kg體重)，約2-3分鐘后，大鼠處于麻 醉狀態(tài)。此時(shí)用皮繩將大鼠四肢和頭部固定于木板上。插入氣管插管， 打開(kāi)呼吸機(jī)，呼吸機(jī)頻率90，潮氣量0.6。觀察大鼠呼吸頻率、深淺， 是否麻醉完全，根據(jù)情況再補(bǔ)注少量氯胺酮。 3.2缺血再灌注酒精清洗大鼠開(kāi)胸部位，左胸4-5肋間隙處開(kāi)口，游離表皮和胸 大肌和胸小肌，小心避開(kāi)肋間動(dòng)脈以防止大量出血，直至清楚暴露4-5 肋間隙。鈍性分離肋間隙，撐開(kāi)器撐開(kāi)，此時(shí)可觀察到跳動(dòng)的心臟。 撕開(kāi)心包膜，完全暴露心臟。在距冠狀動(dòng)脈前降支根部l-2mm處(即 左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間)，采用6/0線(xiàn)結(jié)扎，系一個(gè)活結(jié)，拉緊結(jié)， 結(jié)扎線(xiàn)以下心肌組織外觀蒼白，心前壁跳動(dòng)減弱。心電圖顯示ST段抬 高，放松后心肌組織顏色恢復(fù)，ST段回落，表明模型建立成功。結(jié)扎 30min后，松開(kāi)結(jié)扎線(xiàn)，使冠狀動(dòng)脈血流再通，再灌注時(shí)間為3小時(shí)。 i伊文思藍(lán)和四氮唑(TTC)染色評(píng)估梗死面積大鼠經(jīng)30min缺血和3小時(shí)再灌注后，再度開(kāi)胸，將原結(jié)扎線(xiàn)收緊， 以10g/L的伊文思藍(lán)經(jīng)心尖部注入心腔，以區(qū)分缺血區(qū)和非缺血區(qū)， 染成藍(lán)色的組織為非缺血區(qū)，未著色組織即紅色組織為缺血區(qū)。迅速 取下心臟，用生理鹽水洗出心腔和冠脈內(nèi)的血液，吸凈表面水分。在 結(jié)扎線(xiàn)水平下將心臟切成lmm左右的薄片5片，將切片浸入O. 5mg/ml 的TTC磷酸緩沖液中，37。C孵育30min，以區(qū)分缺血區(qū)(缺血心肌，包 括缺血梗死區(qū)和缺血未梗死區(qū)心肌)和梗死區(qū)。 5.拍照統(tǒng)計(jì)心臟組織用10X的甲醛固定24h，以增強(qiáng)染色顏色對(duì)比。經(jīng)以上 處理，心肌組織被分區(qū)藍(lán)色為正常心肌，淺紅色為缺血區(qū)未梗死心 肌，灰白色為缺血梗死心肌。拍照并通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析軟件計(jì)算缺 血區(qū)心肌占整個(gè)心肌面積的百分比，大于30%者表示模型建立成功， 進(jìn)一步計(jì)算梗死心肌占缺血區(qū)心肌的面積百分比來(lái)表示梗死程度。數(shù) 學(xué)統(tǒng)計(jì)分析藥物和辛伐他汀對(duì)缺血再灌后心肌細(xì)胞損傷的影響。三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1缺血再灌注模型示意圖所示，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，缺血區(qū)占全 心面積的百分比均大于30%，說(shuō)明建立模型成功。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯 示各組之間缺血區(qū)占全心面積的百分比無(wú)顯著差異，說(shuō)明三組間心肌 缺血的程度是相當(dāng)?shù)模淮嬖诮Y(jié)扎程度不同而帶來(lái)的結(jié)果偏倚。如圖2 TTC染色法評(píng)價(jià)藥物對(duì)缺血再灌注后心肌保護(hù)的作用示 意圖所示，圖中分別為辛伐他汀、藥物與生理鹽水(n=6)對(duì)照組在 缺血再灌注后的梗死區(qū)/缺血區(qū)的比較。結(jié)果顯示，辛伐他汀(n=6) 和藥物組(11=6)中細(xì)胞梗死率明顯低于生理鹽水對(duì)照組(pO.OOl)， 二者均能顯著改善缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損害。四、 結(jié)論研究顯示本發(fā)明所提供的藥物與辛伐他汀具有同等的改善缺血 再灌注導(dǎo)致的心肌損害的作用。眾所周知，他汀類(lèi)藥物是羥甲基戊二酸甲酰輔酶A還原酶抑制劑。心肌缺血時(shí)，內(nèi)皮功能發(fā)生紊亂，中性粒細(xì)胞聚集，過(guò)氧化反應(yīng) 及炎癥反應(yīng)發(fā)生，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)破壞，造成血管收縮，血流變慢，局部區(qū) 域心肌梗死、心肌細(xì)胞凋亡、壞死。他汀類(lèi)藥物通過(guò)增加內(nèi)皮一氧化 氮(NO)合成，抑制中性粒細(xì)胞聚集，減輕炎癥反應(yīng)及氧化還原反 應(yīng)，有效減少梗死面積和緩解心肌缺血再灌注引起的損傷，減輕凋亡、 減少壞死細(xì)胞數(shù)目。這在本實(shí)施例中也得到體現(xiàn)，而藥物的保護(hù)作用 與辛伐他汀相當(dāng)，這預(yù)示了以該藥物為代表的解酒藥在改善心肌缺血 及心梗后改善殘存心肌功能方面具有廣闊臨床應(yīng)用前景。例2: ALDH2對(duì)心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染野生和缺失型乙醛脫氫酶2(ALDH2*1/ALDH2*2)基因，對(duì)大鼠心肌細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下發(fā)生凋 亡的影響，進(jìn)一步證明ALDH2對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。二、 材料材料與例l相同。三、 實(shí)驗(yàn)步驟(一) 建立細(xì)胞缺氧模型，采用與例l相同方法建立細(xì)胞缺氧模型。(二) 檢測(cè)細(xì)胞凋亡，比較轉(zhuǎn)染野生和缺失型乙醛脫氫酶2 (ALDH2*1/ALDH2*2)基因后，大鼠心肌細(xì)胞在對(duì)缺氧所致凋亡的變化。凋亡的測(cè)定通過(guò)用Hoechest 33324、免疫熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞 儀(FACS)和TUNEL試劑盒檢測(cè)。四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)染ALDH2野生型和缺失型基因后再缺氧，表現(xiàn)為轉(zhuǎn) 染缺失型的心肌細(xì)胞對(duì)缺氧性損傷的耐受性明顯差于野生型，細(xì)胞凋 亡的改變有Hoechest 33324染色中，細(xì)胞核溶解和核碎裂P<0.05， 在FACS和TUNEL檢測(cè)中，凋亡細(xì)胞明顯增加PO.05)。五、 結(jié)論通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，ALDH2酶活性降低可增加心肌細(xì)胞對(duì)缺氧導(dǎo)致凋亡的易感性，ALDH2對(duì)缺氧引起的細(xì)胞凋亡損傷具有保護(hù)作用。如圖3 ALDH2腺病毒顆粒的轉(zhuǎn)染效率示意圖所示，用攜帶綠熒 光蛋白的空載體轉(zhuǎn)染，得到的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率>50%。如圖4 RT-PCR測(cè)定ALDH2病毒顆粒的轉(zhuǎn)染效率示意圖所示， RT-PCR測(cè)定ALDH2病毒顆粒的轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)染 ALDH2野生型(*1)和缺失型(*2)結(jié)果，為187bp.如圖5乙醛代謝法測(cè)定轉(zhuǎn)染后ALDH2酶活性示意圖所示，用 分光光度計(jì)(340nm)測(cè)定轉(zhuǎn)染ALDH2野生型(*1)和缺失型(*2) 后的酶活性，野生型最高，缺失型最低，有顯著性差異，乙醛代謝法 測(cè)定轉(zhuǎn)染后ALDH2酶活性P<0.05。 2. ALDH2腺病毒顆粒對(duì)缺氧損傷的抗凋亡作用 2.1采用Hoechest 33324法檢測(cè)細(xì)胞凋亡如圖6采用Hoechest 33324法檢測(cè)細(xì)胞凋亡示意圖所示，經(jīng) Hoechest 33324染色，轉(zhuǎn)染缺失型ALDH2基因再缺氧的心肌細(xì)胞中， 核固縮核碎裂現(xiàn)象明顯增多。 2.2采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡如圖7采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡示意圖所示，經(jīng)TUNEL-DAB 染色，轉(zhuǎn)染缺失型ALDH2基因再缺氧的心肌細(xì)胞相對(duì)于野生型的凋 亡細(xì)胞明顯增多。2.3采用流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞凋亡如圖8采用流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞凋亡示意圖所示，經(jīng)FITC標(biāo) 記的Annexin-V測(cè)定，轉(zhuǎn)染缺失型ALDH2基因再缺氧的心肌細(xì)胞相 對(duì)于野生型的凋亡細(xì)胞明顯增多，*P<0.01相比于對(duì)照組，+PO.05相 比于缺氧組，++ <0.001相比于ALDH2*1預(yù)處理缺氧組。酒精的代謝需要人體內(nèi)的兩種酶(乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶)參 與。首先乙醇在乙醇脫氫酶的作用下，氧化成乙醛，然后，乙醛又在乙醛脫氫酶的作用下氧化成乙酸，這樣就完成了最終的代謝。乙醛具 有擴(kuò)張人體血管的作用。臉紅和醉酒，是乙醛在體內(nèi)停留引起的。不 少人缺少第二種酶，就會(huì)引起乙醛在體內(nèi)堆積。例3:心肌細(xì)胞缺氧時(shí)，ALDH2活性下降，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目增加。一、 實(shí)驗(yàn)材料SD新生鼠，培養(yǎng)基和胎牛血清，Biomerieux Genbox缺氧袋和缺氧 發(fā)生劑，可見(jiàn)光分光光度儀，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，TUNEL試劑盒等二、 實(shí)驗(yàn)方法取1 3天SD大鼠新生鼠，消毒后開(kāi)胸，取心臟組織，將心臟組織 塊消化處理、懸浮過(guò)濾和離心心肌細(xì)胞，用培養(yǎng)液重懸后，在培養(yǎng)瓶 中培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后，將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞放入缺氧袋中分別進(jìn)行不同 時(shí)相缺氧，然后用乙醛代謝實(shí)驗(yàn)法測(cè)定心肌線(xiàn)粒體ALDH2酶活性和 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。分光光度計(jì)測(cè)定ALDH2活性的具體原理為通過(guò)差速離心得到含 有ALDH2的線(xiàn)粒體斷片，然后利用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)量ALDH2對(duì) NADH(還原型輔酶I )的酶促反應(yīng)引起的吸光度的變化。三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖9 ( I )和圖9 (II)顯示心肌細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后，ALDH2 活性呈時(shí)間依賴(lài)性下降，而心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量呈時(shí)間依賴(lài)性增加。四、 結(jié)論心肌細(xì)胞缺氧時(shí)，ALDH2活性下降，心肌細(xì)胞凋亡增加。 注圖9 ( I )和圖9 (II)中，Optional Density為光密度， 用于檢測(cè)ALDH2活性值；Apoptoic cell為凋亡細(xì)胞數(shù)目。例4: ALDH2基因敲除小鼠心肌梗死后心力衰竭惡化。一、實(shí)驗(yàn)材料成年雄性C57/BL6小鼠，成年雄性ALDH2基因敲除C57/BL6 小鼠。小動(dòng)物高分辨率體內(nèi)超聲檢測(cè)儀，Millar導(dǎo)管測(cè)壓儀，冰凍切 片機(jī)和倒置熒光顯微鏡，凋亡試劑盒；二、 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)分為三組假手術(shù)組，野生型組，基因敲除組。 1.小鼠心肌梗死模型，將小鼠麻醉，連接呼吸機(jī)維持呼吸。常規(guī) 酒精消毒表皮，自頸正中切開(kāi)，斷2， 3肋骨，充分暴露心臟，用眼 科纖維手術(shù)鑷子撕開(kāi)心包膜，充分暴露心臟左室前壁，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳交界處，略靠近左心耳下方分離左冠狀動(dòng)脈前降支，穿10 號(hào)醫(yī)用縫合線(xiàn)接扎，繼續(xù)正常飲食喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4周即為心力衰竭模型。2. 超聲心動(dòng)檢測(cè)，術(shù)后2周和4周分別采用小動(dòng)物高分辨率體 內(nèi)超聲檢測(cè)儀進(jìn)行超聲心動(dòng)檢査，M型超聲心動(dòng)圖法分別測(cè)量左室舒 張末期內(nèi)徑(LVEDD)，左室短軸縮短率(FS)，射血分?jǐn)?shù)(EF)。用 Millar導(dǎo)管測(cè)量左室舒張末期壓力(LVEDP).3. 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)，術(shù)后4周處死小鼠，心臟組織用4%多 聚甲醛固定，包埋，組織石蠟切片后，采用TUNEL法染色，染色后 在光鏡下觀察并攝片，計(jì)數(shù)凋亡心肌細(xì)胞核數(shù)。三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別對(duì)上述小鼠進(jìn)行左室舒張末期壓(LIVEDP)測(cè)定、射血分 數(shù)(EF)測(cè)定和凋亡百分?jǐn)?shù)％ (Apoptosis)測(cè)定，結(jié)果如圖10 ( I )、 圖10 (II)和圖10 (III)所示。從圖10 ( I )、圖10 (II)和圖10 (III)統(tǒng)計(jì)顯示和野生型 小鼠相比，基因敲除小鼠心肌凋亡的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，心 臟射血分?jǐn)?shù)降低，左心室舒張末期壓增加。四、 結(jié)論心力衰竭時(shí)，心肌ALDH2基因敲除增加心肌細(xì)胞凋亡，心功能 惡化。注圖10 ( I )、圖10 ( II )和圖10 (III)中，WT為wild type 的縮寫(xiě)，即乙醛脫氫酶2野生型；KO為knockout的縮寫(xiě)，即乙醛脫 氫酶2基因敲除；EF為射血分?jǐn)?shù)， 一種反應(yīng)心功能的指標(biāo)；LVEDP 為左室舒張末期壓力， 一種反應(yīng)心臟功能的指標(biāo)；Apoptosis (%):為凋亡百分?jǐn)?shù)。例5: ALDH2高表達(dá)小鼠心肌梗死后心力衰竭心功能改善。一、 實(shí)驗(yàn)材料成年雄性C57/BL6小鼠，小動(dòng)物高分辨率體內(nèi) 超聲檢測(cè)儀，冰凍切片機(jī)和倒置熒光顯微鏡，凋亡試劑盒；GFP空病 毒載體和ALDH2腺病毒載體。二、 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)分為兩組GFP空腺病毒注射組，ALDH2腺病毒注射組。1. 小鼠左心室腔內(nèi)注射病毒模型，小鼠用麻醉后固定，插氣管插 管，行呼吸機(jī)維持呼吸。常規(guī)酒精消毒表皮，自頸正中切開(kāi)，斷2， 3肋骨，充分暴露主動(dòng)脈和心臟。取4號(hào)醫(yī)用縫合線(xiàn)穿過(guò)主動(dòng)脈，兩 端留線(xiàn)待用。準(zhǔn)備lml醫(yī)用注射器抽取0.1ml液體，置于冰上待用。 提拉縫合線(xiàn)使主動(dòng)脈閉合無(wú)血流通過(guò)，同時(shí)往左向心室腔內(nèi)注射液 體。閉合主動(dòng)脈持續(xù)30s后松線(xiàn)，重新縫合肌肉和表皮。2. 小鼠急性心肌梗死模型，心室腔內(nèi)注射腺病毒顆粒48小時(shí)后 建立心肌梗死模型。其他方法同上。三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別對(duì)上述小鼠進(jìn)行(LVEDD)測(cè)定、縮短分 數(shù)(FS)測(cè)定、射血分?jǐn)?shù)(EF)測(cè)定和TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，結(jié)果如圖ii (i )、圖ii (n)、圖ii (m)、圖ii (iv)和圖ii (v)所示。圖ii (i )、圖ii (n)、圖ii (m)、圖ii (iv)和圖ii (v)顯示將編碼ALDH2腺病毒注入心室腔后再造成心肌梗死模型。在 心肌梗死后4周后，心肌ALDH2高表達(dá)使心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目減少，左室舒張末直徑減小，縮短分?jǐn)?shù)增加，射血分?jǐn)?shù)升高。四、結(jié)論心力衰竭時(shí)，心肌ALDH2高表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡， 心功能改善。注-圖1 1 ( I )、圖1 1 ( II )、圖1(III)、圖1 1 (IV)和圖11 (V)中，F(xiàn)S為縮短分?jǐn)?shù)， 一種心臟功能檢測(cè)指標(biāo)；2W為兩周；lm為一個(gè)月。例6:解酒藥對(duì)心力衰竭有保護(hù)作用。一、 實(shí)驗(yàn)材料成年雄性C57/BL6小鼠，成年雄性ALDH2基 因敲除C57/BL6小鼠。小動(dòng)物高分辨率體內(nèi)超聲檢測(cè)儀，Millar導(dǎo) 管測(cè)壓儀。二、 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)分為三組對(duì)照組，解酒藥組，依那普利組。 制造大鼠心力衰竭模型給SD大鼠結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制造 心肌梗死模型，術(shù)后給予解酒藥物、依那普利(一種應(yīng)用臨床的改善心功能的藥物)、和生理鹽水干預(yù)，4周后超聲檢測(cè)心功能和Millar 導(dǎo)管測(cè)量左室舒張末期壓力(LVEDP)三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別對(duì)上述各藥物組的SD大鼠進(jìn)行射血分?jǐn)?shù)(EF)、縮短分?jǐn)?shù) (FS)和左室舒張末期壓(LVEDP)測(cè)定，結(jié)果如圖12(1)、圖12 (II)和圖12 (III)所示。圖12 ( I )、圖12 (II)和圖12 (III)顯示解酒藥干預(yù)組與 對(duì)照組相比射血分?jǐn)?shù)提高5%，縮短分?jǐn)?shù)提高3%，但沒(méi)有依那普利組 升高明顯。解酒藥組左室舒張末壓力較對(duì)照組降低，但較依那普利組 升高。四、 結(jié)論上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接證明，解酒藥物對(duì)心力衰竭具有保 護(hù)作用。注12 ( I )、圖12 (II)和圖12 (III)中，對(duì)照組為生理鹽水．
權(quán)利要求
1.一種包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途，用于心臟的保護(hù)和心臟病的治療保健食品或藥物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途， 其特征在于所述的解酒藥為含有乙醛脫氫酶保健品或藥物，包括海 王金樽，安體普，或解酒神茶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途，其特征在于所述的心臟病包括冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病以 及各種心臟病引起的心力衰竭。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途，其特征在于所述的解酒藥通過(guò)提高乙醛脫氫酶的活性或補(bǔ)充乙醛脫 氫酶，抑制心肌細(xì)胞調(diào)亡，從而實(shí)現(xiàn)抗心力衰竭。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種包含有乙醛脫氫酶的解酒藥的新用途，用于心臟的保護(hù)和心臟病的治療保健食品或藥物，其原理之一是，解酒藥能通過(guò)補(bǔ)充ALDH2而減輕心肌缺血/再灌注損傷，其原理之二是，通過(guò)解酒藥提高ALDH2的活性或者補(bǔ)充ALDH2，抑制心肌細(xì)胞調(diào)亡，發(fā)揮抗心力衰竭作用，該解酒藥為含有乙醛脫氫酶保健品或藥物，包括海王金樽，安體普，或解酒神茶等，所述的心臟病包括冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病以及各種心臟病引起的心力衰竭等。
文檔編號(hào)A61P25/32GK101244264SQ20081009053
公開(kāi)日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日
發(fā)明者俞佳艷, 孫愛(ài)軍, 徐丹令, 王克強(qiáng), 王振軍, 葛均波, 賈劍國(guó), 鄒云增 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院