專利名稱：一種抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽系列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)醫(yī)藥領(lǐng)域，本發(fā)明更具體涉及了一種抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽系列 及其應(yīng)用。
技術(shù)背景在癌癥發(fā)生與治療的過程中，化學(xué)治療一直屬于主體部分?，F(xiàn)有的臨床使用的化療藥物， 如環(huán)磷酰胺、順鉑、阿糖胞苷、阿霉素和長春新堿等，它們主要是用來破壞細(xì)胞的周期的， RNA、 DNA和蛋白質(zhì)都是此類藥物的靶向目標(biāo)。這些化療藥物，其本身都有自己的毒性，不管 是一種化療藥物單獨(dú)使用還是幾種化療藥物結(jié)合運(yùn)用在臨床治療上，其在對(duì)癌癥有明顯療效， 殺傷殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)損害病人的正常細(xì)胞。化療藥物的副作用最普遍的就是對(duì)病人 的骨髓產(chǎn)生極度抑制，造成病人的極大痛苦，甚至引起死亡。到目前，除了早發(fā)現(xiàn)癌癥病情 并實(shí)行手術(shù)切除腫瘤包塊外，對(duì)于已經(jīng)擴(kuò)散的腫瘤仍沒有特效藥物去治療[Cancer Biology癌 生物學(xué)，R.J.B金著，劉以訓(xùn)主譯，科學(xué)出版社，2002]，現(xiàn)有臨床上用于癌癥治療的藥物 大都是化合物，而短肽在癌癥方面的直接治療上的應(yīng)用尚無文獻(xiàn)報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是針對(duì)上述問題，提供一種抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽系列及其應(yīng)用。本發(fā)明的一種抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽，其特征在于組成短肽的氨基酸主序列〈1〉和編 碼短肽的核苷酸主序列〈2〉如下<1> J-Val-B-Trp-0-Arg其中，J代表氨基酸Pro, Asn或His; B代表氨基酸Ser或Gin; 0代表氨基酸Leu或Thr; <2> caq gtt或gtc或gta或gtg gam tgg ctn cgt或cgc或cgg或cga 其中，H代表核苷酸G,A或C; Q代表核苷酸G，T或C; M代表核苷酸A或G; N代表核苷酸C， A， G或T;所述短肽的氨基酸主序列為氨基酸位置固定的主序列，其間隔的位置選擇排列相對(duì) 應(yīng)的氨基酸。本發(fā)明的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽片段，其氨基酸主序列具有與該短肽氨基酸主序列》 70%的相同性，》90%的相似性，片段為把所述的6個(gè)氨基酸的序列從任意位置截取成3個(gè) 或4個(gè)或5個(gè)氨基酸組成的與所述短肽具有同樣生物活性的短肽。本發(fā)明的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽類似物具有與所述短肽相同的生物活性，所述類似物 是指在用所述短肽和另一種化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白質(zhì)而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白質(zhì)。本發(fā)明的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽衍生物，其氨基酸序列具有與短肽氨基酸主序列》 70%的相同性，》90%的相似性，該衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一個(gè)或者 幾個(gè)氨基酸的某個(gè)基團(tuán)用另外的基團(tuán)取代后與所述短肽具有同樣生物活性的短肽。本發(fā)明的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽變體，其氨基酸序列具有與短肽氨基酸主序列》70% 的相同性，》90%的相似性，該變體是指一種具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸 序列或編碼它的核苷酸序列，所述改變包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中間的任 一位置缺失、插入或替換氨基酸或核苷酸，或在序列兩端添加氨基酸或核苷酸。本發(fā)明的短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有 治療人實(shí)體腫瘤癌細(xì)胞增殖的肝癌癌細(xì)胞無限增殖引發(fā)的一切癌癥、診斷與檢測(cè)癌癥的發(fā)生 以及癌癥發(fā)生的惡性程度藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的短肽或核苷酸用于制備具有作為蛋白酶抑制劑或者促進(jìn)劑或者親和試劑的藥物 或者檢測(cè)試劑的應(yīng)用。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的短肽來自于運(yùn)用生物信息學(xué)的方法把國際蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 的蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出來的一種新型的具有活性功能的生物活性肽，運(yùn)用本發(fā)明的短 肽抑制或殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞無顯著傷害作用，解決了現(xiàn)有癌癥藥物在抑制或殺死 癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)人體正常細(xì)胞也有嚴(yán)重傷害的缺陷。
具體實(shí)施方式
短肽的制備方法采用化學(xué)合成的方法，即本領(lǐng)域熟知的已經(jīng)非常成熟的固相肽合成方法， 既可以采用Boc方法也可以采用Fmoc方法。具體做法就是將被保護(hù)的氨基酸逐個(gè)偶聯(lián)到惰性 固相載體上去，然后利用強(qiáng)酸將肽鏈從載體上裂解下來，同時(shí)去除側(cè)鏈保護(hù)。短肽的氨基酸主序列為氨基酸位置固定的主序列，其間隔的位置選擇排列相對(duì)應(yīng)的氨基 酸，例如，在J位置的氨基酸有3種Pro， Asn或His，此3種氨基酸都可以單一地安放在〈1〉 中J的位置上，不管選擇其中任何一種，該短肽仍具有其原有的生物活性，即抑制惡性肝腫 瘤細(xì)胞增長，同樣地B和0所代表的位置的氨基酸也有如此特性。核苷酸采用人工合成方法制備；編碼短肽的核苷酸包含下組中的一種(a) 編碼具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、類似物、衍生物或其變體的核苷酸；(b) 與(a)所述核苷酸互補(bǔ)的核苷酸；(c) 與(a)或(b)中所述核苷酸有》75%相同性的核苷酸；該核苷酸基本由編碼具有〈1〉氨基酸序列短肽的核苷酸組成，本發(fā)明的核苷酸序列包括〈2〉中的核苷酸序列，其形式為DNA形式包括cDNA或人工合成的DNA。 DNA可以是單鏈的也可 以是雙鏈的。編碼短肽的編碼區(qū)序列可以和〈2〉中的核苷酸相同，也可以不同，稱為變異體， 其中變異體是指具有編碼〈1〉中的氨基酸序列的編碼，但可以和〈2〉中的核苷酸不同。變異體 可以是一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代、插入、缺失的核苷酸序列，但不會(huì)改變編碼〈1〉中氨基酸序列 的短肽的活性功能。該短肽或核苷酸的"變體"是指一種具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列 或編碼它的核苷酸序列。改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插 入、添加或替換。變體可具有"保守性"改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的 結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，也可以有"非保守性"改變，其中替換的氨基酸不具有與原氨基酸相類似 的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)。"缺失"是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸的 缺失；"插入"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的中間任意位置插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸；"添 加"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的N端或C端添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸；"替換"是指用不 同的氨基酸或核苷酸替換一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸。該短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有抑制與 治療包括但不限于下述疾病的藥物的用途1.實(shí)體腫瘤癌癥肝癌以及其他的惡性細(xì)胞增殖類型的癌癥疾病。在計(jì)算短肽片段、短肽衍生物和短肽變體的氨基酸主序列具有與短肽氨基酸主序列的相 同性和相似性時(shí)，"相同性百分率"是指兩種或多種氨基酸或核酸序列比較中序列相同的百 分率。根據(jù)Cluster法(Higging D. G. & Sharp P. M. ， Gene 1988， 73:234-237 )通過檢査 所有配對(duì)之間的距離將各組序列排列成簇，然后將各簇以成對(duì)或成組分配。兩個(gè)氨基酸序列 如序列A和序列B之間的相同性百分率通過下式計(jì)算_序列A與序列B之間匹配的殘基個(gè)數(shù)X 100%序列A的殘基個(gè)數(shù)_序列A中間隔的殘基個(gè)數(shù)-序列B中間隔的殘基個(gè)數(shù) "相似性"是指在確定兩條氨基酸序列比對(duì)中相同氨基酸序列位置確定后，在相同氨基 酸之間排列的對(duì)應(yīng)的氨基酸的保守性取代程度。根據(jù)生物信息技術(shù)領(lǐng)域周知的氨基酸得分PAM 250 scoring matrix (Dayhoff, M. Schwartz, R. M. and Orcutt, B. C. Atlas of Protein Structure 1978, 345-352; DeLisi, C. and Kanehisa, M. Mathematical Biosciences 1984.69: 77-85; Schwartz, R. M. and Dayhoff, M. O. Atlas of Protein Structure, 1979. 353-358)，當(dāng)相對(duì)應(yīng)的不同氨基酸比 較得分》0時(shí)，該兩個(gè)氨基酸相似；當(dāng)不同氨基酸得分<0時(shí)，兩個(gè)氨基酸不相似。兩個(gè)氨 基酸序列如序列C和序列D之間的相似性百分率通過下式計(jì)算(序列C與序列D之間匹配的殘基個(gè)數(shù)+序列C與序列D之間相似的殘基個(gè)數(shù))X 100% 序列C的殘基個(gè)數(shù)-序列C中間隔的殘基個(gè)數(shù)-序列D中間隔的殘基個(gè)數(shù) 其中，序列C中間隔的殘基個(gè)數(shù)和序列D中間隔的殘基個(gè)數(shù)都不包括相似氨基酸的個(gè)數(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施舉例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列所有列舉實(shí)施例所涉及的所有合成短肽都具有本發(fā)明涉及的藥物功能而不 限于所列舉功能。實(shí)施例l抑制肝癌細(xì)胞的試驗(yàn)(合成本發(fā)明涉及的短肽Pro-Val-Ser-Trp-Leu-Arg)人肝癌細(xì)胞系H印g2細(xì)胞的培養(yǎng)是用含有10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基來培養(yǎng)， 以5Xl()5/孔的細(xì)胞密度種植入96孔細(xì)胞板，24小時(shí)后，把本發(fā)明涉及的短肽按照不同的濃 度加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，以等體積的PBS為對(duì)照組，24、 48、 72小時(shí)后用MTT方法檢驗(yàn)活細(xì) 胞成活率，給藥組和對(duì)照組比較，獲得肝癌細(xì)胞的抑制率可達(dá)71%。實(shí)施例2抑制肝癌細(xì)胞的試驗(yàn)(合成本發(fā)明涉及的短肽Pro-Val-Ser;^Trp-Leu-Arg)人肝癌細(xì)胞系Bel-7402細(xì)胞的培養(yǎng)是用含有10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基來培 養(yǎng)，以5乂105/孔的細(xì)胞密度種植入96孔細(xì)胞板，24小時(shí)后，把本發(fā)明涉及的短肽按照不同 的濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，以等體積的PBS為對(duì)照組，24、 48、 72小時(shí)后用MTT方法檢驗(yàn) 活細(xì)胞成活率，給藥組和對(duì)照組比較，獲得肝癌細(xì)胞的抑制率可達(dá)75%。核苷酸或氨基酸序列表 〈110〉福州大學(xué)<120>—種抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽系列及其應(yīng)用<160〉 17<210〉 1<211〉 6<212〉 PRT<213〉人工序列<220>〈223> J代表氨基酸Pro, Asn或His; B代表氨基酸Ser或Gin; 0代表氨基酸Leu或Thr <400> 1J-Va卜B-Trp-O-Arg<210> 2 <211> 18 <212> DNA 〈213>人工序列 〈220>〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 2caq gtg gam tgg ctn cgs〈210> 3 <211> 18 <212> DNA 〈213>人工序列 <220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c， a， g或t〈400> 3caq gtg gam tgg ctn egg<210> 4 〈211> 18 〈212> DNA 〈213>人工序列 〈220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 4caq gtg gam tgg ctn cgc<210> 5 <211> 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; ra代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400> 5caq gtg gam tgg ctn cgt〈210> 6 〈211〉 18 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 6caq gta gam tgg ctn cga〈210> 7 〈211〉 18 〈212〉薩 〈213〉人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400〉 7caq gta gam tgg ctn egg〈210〉 8 〈211〉 18 <212>畫 〈213〉人工序列 <220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 8caq gts gam tgg ctn cgc〈210〉 9 〈211〉 18 〈212〉腿 〈213>人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 9caq gta gam tgg ctn cgt<210〉 10 〈211〉 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400〉 10caq gtc gam tgg ctn cga〈210〉 11 <211〉 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400> 11caq gtc gam tgg ctn egg〈210〉 12 〈211〉 18 <212〉 ■ <213>人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 12caq gtc gam tgg ctn cgc〈210〉 13 〈211> 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c,a， g或t 〈400> 13caq gtc gam tgg ctn cgt<210〉 14 〈211〉 18 <212> ■ <213〉人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400> 14caq gtt gam tgg ctn cga〈210〉 15 〈211〉 18 〈212>腿 〈213>人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 15caq gtt gam tgg ctn egg 〈210〉 16〈211〉 18 〈212>醒 <213>人工序列 <220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 16caq. gtt gam tgg ctn cgc<210> 17 〈211〉 18 〈212>薩 <213>人工序列 〈220〉〈223〉 h代表核苷酸g, a或c; q代表核苷酸g， t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 2caq gtt gam tgg ctn cgt
權(quán)利要求
1.一種抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽，其特征在于組成短肽的氨基酸主序列<1>和編碼短肽的核苷酸主序列<2>如下<1>J-Val-B-Trp-O-Arg其中，J代表氨基酸Pro，Asn或His；B代表氨基酸Ser或Gln；O代表氨基酸Leu或Thr；<2>CAQ GTT或GTC或GTA或GTG GAM TGG CTN CGT或CGC或CGG或CGA其中，H代表核苷酸G，A或C；Q代表核苷酸G，T或C；M代表核苷酸A或G；N代表核苷酸C，A，G或T；所述短肽的氨基酸主序列為氨基酸位置固定的主序列，其間隔的位置選擇排列相對(duì)應(yīng)的氨基酸。
2. —種如權(quán)利要求1所述的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽片段，其特征在于短肽片段的氨基酸主序列具有與所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述片段為把 所述的6個(gè)氨基酸的序列從任意位置截取成3個(gè)或4個(gè)或5個(gè)氨基酸組成的與所述短肽 具有同樣生物活性的短肽。
3. —種如權(quán)利要求1所述的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽類似物，其特征在于所述短肽類似 物具有與所述短肽相同的生物活性，所述類似物是指在用所述短肽和另一種化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白質(zhì)而形成具有生物活性的多fik序 列或蛋白質(zhì)。
4. 一種如權(quán)利要求1所述的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽衍生物，其特征在于所述短肽衍生 物的氨基酸主序列具有與所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述 衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸的某個(gè)基團(tuán)用另外的 基團(tuán)取代后與所述短肽具有同樣生物活性的短肽。
5. —種如權(quán)利要求1所述的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽變體，其特征在于所述短肽變體的氨基酸主序列具有與所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述變體 是指一種具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列，所述改變包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中間的任一位置缺失、插入或替換氨 基酸或核苷酸，或在序列兩端添加氨基酸或核苷酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2、 3、 4或5所述的一種抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽，其特征在于所述編碼短肽的核苷酸包含下組中的一種(a) 編碼具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、類似物、衍生物或其變體的核苷酸；(b) 與(a)所述核苷酸互補(bǔ)的核苷酸；(c)與(a)或(b)中所述核苷酸有》75y。相同性的核苷酸； 所述核苷人工合成方法制備。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽，其特征在于所述的短肽采用化學(xué)合 成方法制備；所述核苷酸采用人工合成方法制備。
8. —種如權(quán)利要求l、 2、 3、 4或5所述的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽的應(yīng)用，其特征在于 所述短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有治療 實(shí)體腫瘤人肝癌癌細(xì)胞無限增殖引發(fā)的癌癥、診斷與檢測(cè)肝癌癥的發(fā)生以及癌癥發(fā)生的 惡性程度藥物的應(yīng)用。
9. 一種如權(quán)利要求6所述的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽的應(yīng)用，其特征在于所述核苷酸用 于制備具有治療人實(shí)體腫瘤癌細(xì)胞增殖的肝癌癌癥、診斷與檢測(cè)肝癌癥的發(fā)生以及癌癥 發(fā)生的惡性程度藥物的應(yīng)用。
10. —種如權(quán)利要求6所述的抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽的應(yīng)用，其特征在于所述短肽或核苷酸用于制備具有作為蛋白酶抑制劑或者促進(jìn)劑或者親和試劑的藥物或者檢測(cè)試劑的應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抑制肝癌細(xì)胞生長的短肽系列及其應(yīng)用，該短肽的短肽片段、類似物、衍生物、變體的氨基酸主序列具有與該短肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性；短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有治療治療人實(shí)體腫瘤癌細(xì)胞增殖的肝癌癌癥、診斷與檢測(cè)癌癥的發(fā)生以及癌癥發(fā)生的惡性程度藥物的應(yīng)用，短肽或核苷酸用于制備具有作為蛋白酶抑制劑或者促進(jìn)劑或者親和試劑的藥物或者檢測(cè)試劑的應(yīng)用。該技術(shù)能夠解決現(xiàn)有癌癥藥物在抑制或殺死癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)人體正常細(xì)胞也有嚴(yán)重傷害的缺陷。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101235079SQ200810070699
公開日2008年8月6日 申請(qǐng)日期2008年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日
發(fā)明者昊 李, 饒平凡 申請(qǐng)人:福州大學(xué)