專利名稱：谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作為藥物的用途，用于加快皮膚創(chuàng)傷愈合過程，減少 炎癥發(fā)生幾率，縮短創(chuàng)傷愈合時(shí)間之目的。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase, 簡(jiǎn)稱TG, Y-glutaminyl-peptide amine' Y-glutamyl transferase; EC 2. 3. 2.13)是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，它可使 蛋白分子間和分子內(nèi)產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，從而可進(jìn)一步改善蛋白質(zhì)的持水性及穩(wěn)定性等 功能特性。由于該酶的相關(guān)催化特性，在食品工業(yè)、紡織工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)上具有廣泛的 應(yīng)用前景及優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是用于生產(chǎn)新型蛋白食品的最重要酶種之一，引起了國內(nèi)外研 究者的高度重視和興趣，國內(nèi)剛剛起步，國外對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的研究較多也較為深入， 所報(bào)道的主要有在食品方面的應(yīng)用以及在抗體工程上的應(yīng)用，在促傷口愈合方面尚未研 究。創(chuàng)傷愈合(wound healing)是指機(jī)體遭受外力作用，皮膚等組織出現(xiàn)離斷或缺損(包 括割傷，刀傷，劃傷，燒傷和外科手術(shù)切口)后的愈復(fù)過程，是一個(gè)非常復(fù)雜的病理過 程，基本可以可分為三個(gè)相互區(qū)別而又重疊聯(lián)系的時(shí)期(階段)①炎癥反應(yīng)期，即炎癥 反應(yīng)、溶解、清除壞死組織；②肉芽組織形成期，為結(jié)締組織細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞游動(dòng)、 增殖、形成肉芽組織；③肉芽組織改建期，即新生結(jié)締組織基質(zhì)沉積和新生組織改造、 改建,而這些過程往往是重疊進(jìn)行的。其中最關(guān)鍵的步驟是肉芽組織形成期，肉芽組織數(shù)量的多少和質(zhì)量的好壞直接影響 著創(chuàng)面的修復(fù)愈合程度；結(jié)締組織具有很強(qiáng)的再生能力，創(chuàng)傷的愈合多通過它的增生而 完成。而在創(chuàng)面修復(fù)過程中，形成的結(jié)締組織主要是成纖維細(xì)胞及其產(chǎn)生的膠原蛋白， 膠原蛋白為創(chuàng)傷面上皮化提供基質(zhì)支架。蛋白多糖(proteoglycan)是由蛋白質(zhì)與大量多 糖結(jié)合成的大分子復(fù)合物，是結(jié)締組織基質(zhì)、線粒體、核膜、質(zhì)膜等的重要組成成分。 其中多糖均是以含有氨基已糖與糖醛酸(硫酸角質(zhì)素為半乳糖)組成的二糖單位重復(fù)聚 合而成的直鏈多糖，總稱為糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAGs)。蛋白多糖復(fù)合物的立 體構(gòu)型形成有許多微孔隙的分子篩，小于孔隙的水和溶于水的營養(yǎng)物、代謝產(chǎn)物、激素、 氣體分子等可以通過，便于血液與細(xì)胞之間進(jìn)行物質(zhì)交換，大于孔隙的大分子物質(zhì)，如細(xì)菌等不能通過，使基質(zhì)成為限制細(xì)菌擴(kuò)散的防御屏障，近來發(fā)現(xiàn)其與皮膚的生物學(xué)功 能有著極為密切的關(guān)系，對(duì)傷口愈合亦有重要影響，并參與了創(chuàng)傷愈合過程。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的用途，其特征在于谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作為皮膚創(chuàng) 傷愈合促進(jìn)劑或其活性成分。如上所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的用途，其特征在于包含O. lU/ml 100U/ml或者0. l 100%干重的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作為皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑的活性成分。如上所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的用途，其特征在于所述創(chuàng)傷包括擦傷、割傷、外科手術(shù)傷口或者燒傷。如上所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的用途，其特征在于谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶是利用微生物所產(chǎn)。在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人用試驗(yàn)證明，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的 作用。在傷口部位涂抹谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶或者以其為組分的制劑，可以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，加 快傷口愈合速率。本發(fā)明人選擇健康SD品系大鼠體質(zhì)量(200土20) g， IO個(gè)月大小，雌雄不限，所有 大鼠分為兩組，實(shí)驗(yàn)組大鼠用剃刀將背部凈毛，面積為2cmX2cm，待消毒后在麻醉?xiàng)l 件下用手術(shù)刀在大鼠背部處，切割l個(gè)l cmXl cm正方形創(chuàng)面，形成創(chuàng)傷動(dòng)物模型， 所有大鼠傷口暴露并單籠喂養(yǎng)，充足給水，對(duì)照組涂抹生理鹽水。記錄大鼠在創(chuàng)傷和給 藥后，創(chuàng)面紅腫、感染、結(jié)癡情況，并記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間。創(chuàng)面愈合率術(shù)后用創(chuàng)面照 像、透明膜描記稱量法記錄傷后第2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16天創(chuàng)面面積，傷后不 同天沿創(chuàng)緣劃線，將動(dòng)物創(chuàng)面大小描印在透明膜上，然后用TECBIAS-6803型真彩色生 物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量創(chuàng)面面積，創(chuàng)傷愈合率按如下公式計(jì)算侖厶申原創(chuàng)面面積-現(xiàn)創(chuàng)面面積，證 愈合率=-^國^^化-xl00%原創(chuàng)面面積用注水法測(cè)量傷腔容積；術(shù)后第5、 10、 15、 20天，每組各處死10只老鼠，取創(chuàng) 面組織，先稱濕重，在60'C烘干24小時(shí)后，再稱得干重，并測(cè)定其中總蛋白質(zhì)，羥脯氨酸，氨基已糖和己糖醛酸的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶可明顯提高手術(shù)創(chuàng)傷大鼠的愈合率，增加肉芽組織的干濕重、蛋白質(zhì)含量、羥脯氨酸含量和促使創(chuàng)傷組織中膠原的合成和積累。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷外科和燒傷整形外科手術(shù)患者的外用治療藥劑或藥劑的 組分、外用敷料的藥劑組分、家用的小傷口包扎敷料藥劑成分和噴劑成分，作為傷口恢 復(fù)的促進(jìn)劑或促進(jìn)劑之一，在損傷修復(fù)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶是利用微生物所產(chǎn)，具有成本低廉，易于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
下面用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例l1. 谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的生產(chǎn)取一環(huán)產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的菌種接至50ml種子培養(yǎng)基中(0. 2%K2HP04， 0. l%MgS04, 0.2%蛋白胨，0.5%葡萄糖，pH7.0)， 28°C, 100rpm/min培養(yǎng)24小時(shí);轉(zhuǎn)接至新鮮配置 的發(fā)酵培養(yǎng)基(接種量4%, 1%甘油，1.5%酵母膏，0.2%K2HPO4, 0. l%MgS04， pH7. 0), 28°C， 100 rpm/min培養(yǎng)96小時(shí)，離心取發(fā)酵上清夜作為粗酶液。2. 谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的分離純化發(fā)酵離心后的初酶液用35%的硫酸銨對(duì)其進(jìn)行第一次沉淀(4'0，將混合液用低速 大容量冷凍離心機(jī)離心，4800r/min， 15分鐘，取上清液。然后將上清液中硫酸銨濃度 提高到75%,同上條件離心，取沉淀，即得粗酶。用蒸餾水對(duì)硫酸銨鹽析所得到的粗酶 樣品透析過夜，其間換水若干次，以除去沉淀中高濃度的硫酸銨，使酶恢復(fù)活性。將透 析好的酶液上02.6X20cm的CM-纖維素52層析柱，先用0. 02mol/L的p朋.5磷酸 緩沖液洗脫，流速約lmL/min，后用0. 02mol/L-0. 5mol/L ( pH6. 5)磷酸緩沖液進(jìn)行梯 度洗脫，用部分收集器收集活性部分，再過O1.6X80cm的S印hadex G-75層析柱， 以0.05M的Tris緩沖液(pH 6.0)洗脫，用部分收集器分部收集活性部分，冷凍干燥 成干粉狀，-20'C備用。3. 皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑本實(shí)施例是以溶于生理鹽水的純酶作為創(chuàng)傷愈合劑，故促進(jìn)劑為純的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。4. 創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)方法(1) 動(dòng)物創(chuàng)傷模型健康SD品系大鼠，體質(zhì)量(200土20) g, IO個(gè)月大小，雌雄不限，分為兩組，實(shí)驗(yàn) 當(dāng)日禁食，用剃刀將動(dòng)物背部凈毛，面積為2cmX2cm，待消毒后在麻醉?xiàng)l件下用手術(shù) 刀在大鼠背部處，切割l個(gè)l cmXl cm正方形創(chuàng)面，形成創(chuàng)傷動(dòng)物模型，所有大鼠傷 口暴露并單籠喂養(yǎng)。(2) 觀察指標(biāo)記錄大鼠在創(chuàng)傷和給藥(皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑)后，創(chuàng)面紅腫、感染、結(jié)癡情況， 并記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間。創(chuàng)面愈合率術(shù)后用創(chuàng)面照像、透明膜描記稱量法記錄傷后第2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16天創(chuàng)面面積，傷后不同天沿創(chuàng)緣劃線，將動(dòng)物創(chuàng)面大小描印 在透明膜上，然后用TECBIAS-6803型真彩色生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量創(chuàng)面面積，創(chuàng) 傷愈合率按如下公式計(jì)算愈合率=原、包価皿禾只—m@MM@xioo% 原創(chuàng)面面積用注水法測(cè)量傷腔容積；術(shù)后第5、 10、 15、 20天，每組各處死10只老鼠，取創(chuàng)面 組織，先稱濕重，在6(TC烘干24小時(shí)后，再稱得干重，并測(cè)定其中總蛋白質(zhì)，羥脯氨 酸，氨基巳糖和己糖醛酸的含量。 5.試驗(yàn)結(jié)果(1) 創(chuàng)傷一般觀察實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組之間創(chuàng)面修復(fù)情況有明顯差別。術(shù)后48 h，實(shí)驗(yàn)組傷口開始出現(xiàn)少 許紅暈，表明肉芽組織已在生長，而對(duì)照組傷口仍然較濕潤；傷后5天，實(shí)驗(yàn)組肉芽 組織生長明顯，局部已長出薄層或點(diǎn)狀上皮，創(chuàng)傷邊緣皮膚收縮明顯；傷后IO天，實(shí) 驗(yàn)組傷口干燥、無感染，創(chuàng)面已基本為肉芽組織所填充，而對(duì)照組傷口濕潤，有滲出物， 收縮不明顯，僅見薄層肉芽，未見明顯的新生上皮。傷后18天，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面基本愈合， 而對(duì)照組創(chuàng)面愈合修復(fù)欠佳。(2) 肉芽組織的干濕重及總蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在整個(gè)創(chuàng)傷愈合過程中(第5 20天)，實(shí)驗(yàn)組肉芽組織的干濕重及總 蛋白質(zhì)含量明顯高于對(duì)照組(尸〈0.05);由此可以說明谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在創(chuàng)傷愈合過 程中可促進(jìn)肉芽組織的代謝和內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。(3) 肉芽組織膠原蛋白及蛋白多糖的代謝情況結(jié)締組織具有很強(qiáng)的再生能力，創(chuàng)傷的愈合多通過它的增生而完成。而在創(chuàng)面修復(fù)過程中，形成的結(jié)締組織主要是成纖維細(xì)胞及其產(chǎn)生的膠原蛋白，膠原蛋白為創(chuàng)傷面上 皮化提供基質(zhì)支架。因此創(chuàng)面愈合過程中膠原蛋白代謝的狀況可反映創(chuàng)面愈合的情況。 羥脯氨酸(Hyp)是膠原蛋白的主要成分之一，且所占比例相對(duì)恒定(約12.5%)，因此羥 脯氨酸含量可反映膠原含量，是創(chuàng)面愈合的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在創(chuàng)傷中后期， 實(shí)驗(yàn)組羥脯氨酸含量明顯高于對(duì)照組，第15天時(shí)達(dá)到峰值，表明新生膠原代謝合成旺 盛，說明谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶可促使創(chuàng)傷組織中膠原的合成和積累。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在創(chuàng)傷愈合過程中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶影響著創(chuàng)傷修復(fù)的整個(gè)過程。谷 氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在創(chuàng)面局部通過復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程促進(jìn)創(chuàng)面愈合，同時(shí)刺激加快創(chuàng)傷組織代 謝速率，造成創(chuàng)傷組織中蛋白質(zhì)含量增加；另一方面促進(jìn)了蛋白多糖合成進(jìn)程；再一方 面，促進(jìn)Hyp代謝，加快膠原的積累從而促使肉芽組織迅速生長，促使創(chuàng)傷組織再上皮 化，從而加快創(chuàng)傷愈合過程。實(shí)施例2谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶20 U的粉劑 松蘿酸鈉 0.5mg溶于100ml生理鹽水 組方解釋松蘿酸是長松蘿(te/7朋A /^i^i/7a^c/ .)的主要成分，據(jù)報(bào)道，其不僅具有抗菌 消炎作用，還具有促傷口愈傷作用。長松蘿屬地衣植物，具有清熱解毒、止咳化痰、殺 菌消炎等功效。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作為同樣一種促創(chuàng)傷愈合的物質(zhì)，其合用在一起具有更 佳的促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用。實(shí)施例3制劑的組方2谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶400 U的粉劑 胰島素 0.05g生理鹽水 100 ml組方解釋由實(shí)施例l可知谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶可作為促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的因子，而研究顯 示胰島素也具有一定的促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用，故主要以二者配伍，溶于生理鹽水做成溶 液，可涂于創(chuàng)傷口，動(dòng)物創(chuàng)傷模型煩的試驗(yàn)結(jié)果顯示其具有加快創(chuàng)傷愈合的作用，且創(chuàng)傷愈合率明顯高于單個(gè)促愈合因子。實(shí)施例4制劑的組方3谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶8000 U的粉劑重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子(rh-aFGF)凍干粉制劑，160 U生理鹽水 100ml組方解釋成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)是體內(nèi)分布極為廣泛的生長 因子之一，主要分酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) 兩大類，均具有促進(jìn)哺乳動(dòng)物多種來源于中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì) 胞、肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分裂增殖作用。大量基礎(chǔ)及臨床研究表明，bFGF能促進(jìn)燒創(chuàng) 傷、潰瘍等的修復(fù)與愈合，故本配伍中添加了成纖維細(xì)胞生長因子。由案例1可知谷氨 酰胺轉(zhuǎn)胺酶也是一種促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的因子，二者溶于生理鹽水做成溶液，可涂于創(chuàng)傷口， 試驗(yàn)結(jié)果顯示其具有加快創(chuàng)傷愈合的作用，創(chuàng)傷愈合率明顯高于施用單個(gè)促愈合因子。
權(quán)利要求
1. 谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的用途，其特征在于谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作為皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑或其活性成分。
2、 如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的用途，其特征在于包含O. lU/ml 100U/ml 或者0.1 100%干重的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作為皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑的活性成分。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的用途，其特征在于所述創(chuàng)傷包括 擦傷、割傷、外科手術(shù)傷口或者燒傷。
4、 如權(quán)利要求1或2所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的用途，其特征在于谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶 是利用微生物所產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的用途，其特征在于谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作為皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑或其活性成分。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶對(duì)如刀割傷、擦傷、外科手術(shù)切傷口、皮膚潰瘍和燒傷等皮膚創(chuàng)傷的愈合表現(xiàn)出了明顯的促進(jìn)作用，因此施用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶或是含有該酶的混合制劑，可以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，加快傷口愈合速率。
文檔編號(hào)A61K38/45GK101264321SQ200810047588
公開日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2008年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月6日
發(fā)明者李冬生, 王金華, 丹 談, 雄 陳 申請(qǐng)人:湖北工業(yè)大學(xué)