專利名稱：：一種用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說涉及一種感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的生物制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：重建或恢復(fù)皮膚屏障是受傷創(chuàng)面治療的最終目標(biāo)，一個性能優(yōu)良的創(chuàng)面覆蓋物可暫時起到皮膚屏障功能的部分作用，提供一個有利于創(chuàng)面愈合的環(huán)境。理想的創(chuàng)面敷料首先應(yīng)該有效阻止細(xì)菌感染尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的感染，提高植皮的成功率和加速創(chuàng)面愈合，同時應(yīng)有良好的生物相容性、控制和吸收創(chuàng)面滲液、適合氣體和水蒸氣透過、保護新生組織、加速創(chuàng)面愈合等特性。現(xiàn)有敷料的種類很多，大致分為以下三種1、惰性敷料即傳統(tǒng)性敷料，如紗布。但是紗布不能持久保持創(chuàng)面濕潤，有可能造成創(chuàng)面延遲愈合，而且浸透的敷料容易使病原體通過，引起繼發(fā)感染。另外，敷料纖維易脫落，造成異物反應(yīng)，影響了創(chuàng)面的愈合。2、雙相作用性敷料，這類敷料可利用它所造成的局部環(huán)境促進傷口愈合。(1)半通透性膜(塑膠類敷料)由多氨基甲酸乙酪材料制成的吸收膜，其中敷料的一側(cè)加有粘性材料；(2)多氨基甲酸乙醋泡沫；(3)水凝膠敷料是由明膠、多糖、多種電解質(zhì)復(fù)合物和甲基丙烯酸樹脂組成的三維立體網(wǎng)狀吸水性多聚體。雙相作用性敷料普遍存在吸水性較差，與創(chuàng)面的粘附能力較差，更主要的是缺少抗感染能力的缺點。3、生物活性敷料(密閉性敷料)，這類敷料因能與創(chuàng)周緊密粘連，防止創(chuàng)面干燥又稱為密閉性敷料。它是一種維持傷口濕潤環(huán)境的敷料，它的吸收性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。它可與局部應(yīng)用的藥劑和機體內(nèi)源性分子相作用，促進傷口愈合，但對于細(xì)菌感染性創(chuàng)面的殺菌效果也較差，無法有效治療此類創(chuàng)面。上述敷料普遍存在不能有效殺滅引起創(chuàng)面感染的病原菌，或者不能有效控制和吸收創(chuàng)面滲液等的缺點。因此，開發(fā)一種既能有效殺菌，特別是MRSA，同時又能有效的控制和吸收創(chuàng)面滲液，保護新生組織、加速創(chuàng)面愈合的外用感染創(chuàng)面治療和修復(fù)制劑顯得非常迫切。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之一是提供一種用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的生物制劑，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。本發(fā)明需要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的生物制劑的制備方法。本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思是這樣的溶葡萄球菌酶(lysost即hin)是一種含鋅的金屬蛋白酶，專一降解細(xì)胞壁的甘氨酸肽鍵，能裂解金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁，從而起到徹底殺死細(xì)菌的目的，不易產(chǎn)生耐藥性，尤其對目前燒傷臨床感染率最高的耐藥性金黃色葡萄球菌等難以根除的致病菌的效果非常好。生物敷料是當(dāng)前被重視的創(chuàng)面覆蓋物，其中殼聚糖是由甲殼素經(jīng)脫乙酰后得到的線性黏多糖。它是一種結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分糖胺聚糖十分類似的優(yōu)良天然生物材料，也是現(xiàn)今所發(fā)現(xiàn)的惟一帶有正電荷的天然多糖。殼聚糖及其衍生物制成的人造皮膚是比較理想的，它比較柔軟、舒適，與創(chuàng)面的貼合性好，既透氣、又吸水，具有抑制疼痛和止血功能，有抑菌消炎作用，隨著創(chuàng)傷慢慢愈合和自身皮膚生長，它能自行溶解被機體吸收，免除了解除時流血多及病人的痛苦，也不會留下碎屑而延緩傷口的愈合，相反會促進皮膚的再生，對治療高熱創(chuàng)傷特別有效。但殼聚糖類物質(zhì)的保濕性和強度相對較差，對創(chuàng)面滲出液的吸收效果不好。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有低抗原性、可被人體吸收、體內(nèi)降解產(chǎn)物無毒副作用的優(yōu)點，在作為生物材料方面的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。它支持很多不同種類的組織生長，能賦予它們良好的特性，如機械強度。膠原敷料有多種形式，如膜片、海綿狀及粒狀等，能重新溶解，能吸收創(chuàng)傷滲出液，可與宿主細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，以促進細(xì)胞在新結(jié)締組織上的粘附、移動、生長和沉積；能誘導(dǎo)分化、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的趨化性，延遲傷口收縮，加速創(chuàng)傷修復(fù)。但是其在水溶液中降解速度太快，從而限制了它的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的—種用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的制劑，以重量百分比計，包括溶葡萄球菌酶0.1_30%，殼聚糖或殼聚糖衍生物3-50%，膠原蛋白30-95%。優(yōu)選的制劑組分及重量百分含量包括溶葡萄球菌酶1_20%，殼聚糖或殼聚糖衍生物8_30%，膠原蛋白50-90%。所述及的用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的制劑，還包含水，水的用量為溶葡萄球菌酶、殼聚糖或殼聚糖衍生物和膠原蛋白總重量的3-50倍。所述及的殼聚糖衍生物為殼聚糖鹽酸鹽、殼聚糖乳酸鹽、殼聚糖季銨鹽、谷胺酸鹽、羧甲基殼聚糖或羧化殼聚糖的一種以上。所述及的膠原蛋白為I、II或III型膠原蛋白的一種以上。制備所述及的用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)制劑的方法，包括如下步驟(1)先將殼聚糖或殼聚糖衍生物溶解于水中，加入膠原蛋白，攪拌，加入交聯(lián)劑碳二亞胺鹽酸鹽或京尼平，使得溶液中碳二亞胺鹽酸鹽或京尼平的濃度達(dá)到0.01mol/L0.lmol/L，制得殼聚糖-膠原蛋白水凝膠。(2)將溶葡萄球菌酶加入步驟(1)制得的殼聚糖-膠原蛋白水凝膠中，攪拌，即制得載溶葡萄球菌酶殼聚糖_膠原蛋白水凝膠。還可將上述制備步驟制得的載溶葡萄球菌酶殼聚糖_膠原蛋白水凝膠冷凍干燥，制得載溶葡萄球菌酶殼聚糖_膠原蛋白水凝膠支架。所述及的用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)制劑的應(yīng)用，當(dāng)感染創(chuàng)面的滲出液較少或沒有滲出液時，可將上述步驟(2)制得的載溶葡萄球菌酶殼聚糖-膠原蛋白水凝膠直接涂抹在創(chuàng)面上；當(dāng)感染創(chuàng)面的滲出液量較多時，可將上述經(jīng)冷凍干燥制得的載溶葡萄球菌酶殼聚糖_膠原蛋白水凝膠固體支架直接敷于創(chuàng)面，載溶葡萄球菌酶殼聚糖_膠原蛋白水凝膠支架具有較高的膨脹度，能有效吸收創(chuàng)面的滲出液，形成的水凝膠體系也有利于溶葡萄球菌酶和膠原蛋白對創(chuàng)面的殺菌及修復(fù)作用的發(fā)揮。本發(fā)明制得的載溶葡萄球菌酶殼聚糖-膠原蛋白水凝膠及載溶葡萄球菌酶殼聚4糖-膠原蛋白水凝膠支架，由于溶葡萄球菌酶蛋白分子被分散包裹在殼聚糖和膠原蛋白所形成的體系中，避免了創(chuàng)面組織中存在的分解蛋白的酶類物質(zhì)對溶葡萄球菌酶的降解，同時水凝膠體系所形成的濕潤環(huán)境也使得溶葡萄球菌酶的殺菌活性得到有效保持。另一方面，殼聚糖經(jīng)溶脹形成的水凝膠形態(tài)，能顯著減緩膠原蛋白的降解速率，并且有效降低膠原蛋白與創(chuàng)面組織中存在的分解膠原蛋白的酶類物質(zhì)的接觸幾率，使得膠原蛋白能夠在創(chuàng)面維持較長時間的修復(fù)作用。本發(fā)明的用于感染創(chuàng)面修復(fù)的制劑，具有良好的生物相容性、吸濕性、保濕性和生物黏附性，既能有效殺滅MRSA等致病菌，又能促進成纖維細(xì)胞的增長，加速創(chuàng)面修復(fù)，加快傷口愈合，是一種高效、安全的新型的感染創(chuàng)面修復(fù)制劑。本發(fā)明的感染創(chuàng)面治療和修復(fù)制劑的制備方法簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)，所使用的材料易得，成本低廉，產(chǎn)品使用方便。圖1不同殼聚糖與膠原蛋白質(zhì)量比制備的水凝膠支架掃描電鏡照片ai:i;bi:3;ci:6;di:8圖2載溶葡萄球菌酶水凝膠支架的掃描電鏡照片圖3殼聚糖與膠原蛋白質(zhì)量比(1:l)制備的水凝膠的模量圖4殼聚糖與膠原蛋白質(zhì)量比(1:6)制備的水凝膠的模量圖5不同殼聚糖與膠原蛋白質(zhì)量比制備的水凝膠水中的膨脹比圖6不同殼聚糖與膠原蛋白質(zhì)量比制備的水凝膠在飽和硫酸銨溶液中的吸濕性圖7MTT法測定殼聚糖_膠原蛋白水凝膠與人肺成纖維細(xì)胞作用后的細(xì)胞活力具體實施例方式實施例1載溶葡萄球菌酶殼聚糖_膠原蛋白水凝膠的制備稱取0.lg的殼聚糖鹽酸鹽溶解于10ml水中，加入0.3g水解膠原蛋白(分子量3000Da)，攪拌均勻，加入0.12g水溶性碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)，室溫攪拌反應(yīng)2h。將O.lg的溶葡萄球菌酶加入制得的殼聚糖-膠原蛋白水凝膠中，攪拌均勻，制得載溶葡萄球菌酶殼聚糖_膠原蛋白水凝膠。實施例2載溶葡萄球菌酶殼聚糖_膠原蛋白水凝膠支架的制備將實施例1制得的載溶葡萄球菌酶殼聚糖-膠原蛋白水凝膠傾入培養(yǎng)皿(40X25mm)中，冷凍干燥得水凝膠支架。實施例3:殼聚糖-膠原蛋白水凝膠支架掃描電鏡取殼聚糖-膠原蛋白水凝膠支架(其中殼聚糖與膠原蛋白的質(zhì)量比分別為l:1、i:3、i:6和i:8)和載溶葡萄球菌酶水凝膠支架(i:6)噴金，掃描電鏡觀察，拍照。結(jié)果如圖1和圖2所示。可見水凝膠支架中有較多的孔隙(圖1)，而溶葡萄球菌酶均勻地分散于孔隙中(圖2)。實施例4:殼聚糖-膠原蛋白水凝膠流變學(xué)性質(zhì)表征將殼聚糖-膠原蛋白水凝膠(殼聚糖與膠原蛋白的質(zhì)量比分別為i:i和i:6)其中經(jīng)流變擴展系統(tǒng)，35t:，圓筒法測定，結(jié)果如圖3和4所示。圖3所示的比例為1:1時，在整個頻率范圍內(nèi)粘性模量均大于彈性模量。圖4可見比例為i:6的水凝膠中，彈性模量在整個頻率范圍內(nèi)均大于粘性模量。實施例5:水凝膠支架的膨脹度測定取不同配比的冷凍干燥樣品，稱重(Wd)，置于水中。于不同時間點取出樣品，稱重(Ws)。按凝膠溶脹率定義計算不同時間的溶脹率(Q):Q=(Ws_Wd)/Wd，其中Ws是溶脹后的水凝膠膜質(zhì)量，Wd是干水凝膠膜質(zhì)量結(jié)果見圖5。可見比例為l:6時，膨脹比最大，為60。實施例6:水凝膠支架吸濕性試驗將水凝膠支架分別置于由飽和硫酸銨的干燥器中，精確稱取干燥試樣(W。)，不同時間點稱取各試樣質(zhì)量(Wt)，用下式求出吸濕度吸濕度(％)=100X(Wt-W。)/W。。結(jié)果見圖6。可見殼聚糖與膠原蛋白的質(zhì)量比為i:3和i:6時，其吸濕性較質(zhì)量比為i:i和i:8時高。實施例7:水凝膠殺菌率試驗將含有不同溶葡萄球菌酶重量比的載溶葡萄球菌酶水凝膠與含菌膜分別接觸10min和lh后，測定殺菌率，結(jié)果如表l?？梢姾胁煌芷咸亚蚓钢亓勘鹊妮d溶葡萄球菌酶水凝膠對金黃色葡萄球菌的殺菌率均為95%以上。表1載溶葡萄球菌酶殼聚糖_膠原蛋白水凝膠殺菌率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>a載溶葡萄球菌酶殼聚糖-膠原蛋白水凝膠中溶葡萄球菌酶的重量百分比b未計數(shù)實施例8:細(xì)胞相容性將殼聚糖_膠原蛋白水凝膠與人肺成纖維細(xì)胞直接接觸，即將人肺成纖維細(xì)胞次代培養(yǎng)于多孔組織培養(yǎng)板上，細(xì)胞以匿EM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長到單層細(xì)胞是，分別將0、10、30和50iU水凝膠加入，培養(yǎng)24h后，以MTT法測定。結(jié)果如圖7?？梢姎ぞ厶莀膠原蛋白水凝膠可促進細(xì)胞的增長，48h時加入30和50iU水凝膠組，細(xì)胞增長太高，以致無法權(quán)利要求一種用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的制劑，其特征在于，以重量百分比計，包括溶葡萄球菌酶0.1-30％，殼聚糖或殼聚糖衍生物3-50％，膠原蛋白30-95％。2.如權(quán)利要求l所述的用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的制劑，其特征在于，優(yōu)選的組分及重量百分含量包括溶葡萄球菌酶0.1-20%，殼聚糖或殼聚糖衍生物8-30%，膠原蛋白50-90%。3.如權(quán)利要求1所述的用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的制劑，其特征在于，還包含水，水的用量為溶葡萄球菌酶、殼聚糖或殼聚糖衍生物和膠原蛋白總重量的3-50倍。4.如權(quán)利要求1或3所述的用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的制劑，其特征在于，所述的殼聚糖衍生物為殼聚糖鹽酸鹽、殼聚糖乳酸鹽、殼聚糖季銨鹽、谷胺酸鹽、羧甲基殼聚糖或羧化殼聚糖中的一種以上。5.如權(quán)利要求1或3所述的用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的制劑，其特征在于，所述的膠原蛋白為I、II或III型膠原蛋白的一種以上。6.制備如權(quán)利要求1或3所述的用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的制劑的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)先將殼聚糖或殼聚糖衍生物溶解于水中，加入膠原蛋白，攪拌，加入交聯(lián)劑碳二亞胺鹽酸鹽或京尼平，使得溶液中碳二亞胺鹽酸鹽或京尼平的濃度達(dá)到0.01mol/L0.lmol/L，制得殼聚糖-膠原蛋白水凝膠；(2)將溶葡萄球菌酶加入步驟(1)制得的殼聚糖-膠原蛋白水凝膠中，攪拌，即制得載溶葡萄球菌酶殼聚糖_膠原蛋白水凝膠。7.如權(quán)利要求6所述的制備用于感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的制劑的方法，其特征在于，將制得的載溶葡萄球菌酶殼聚糖_膠原蛋白水凝膠冷凍干燥，制得載溶葡萄球菌酶殼聚糖-膠原蛋白水凝膠支架。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說涉及一種感染創(chuàng)面治療和修復(fù)的生物制劑及其制備方法。本發(fā)明公開的制劑組成及其重量百分含量包括溶葡萄球菌酶0.1-30％，殼聚糖或殼聚糖衍生物3-50％，膠原蛋白30-95％。本發(fā)明以天然可生物降解的殼聚糖衍生物和膠原蛋白為敷料進行交聯(lián)，形成水凝膠作為載體，將溶葡萄球菌酶載入水凝膠中，制備既具有促進創(chuàng)面愈合功能又具有殺菌作用的新型制劑。文檔編號A61K31/716GK101721691SQ20081004390公開日2010年6月9日申請日期2008年11月4日優(yōu)先權(quán)日2008年11月4日發(fā)明者崔福英,黃青山申請人:上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司