專利名稱：一種腫瘤靶向重組dna疫苗及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬基因工程領域，涉及一種腫瘤靶向重組DNA疫苗。更具體的說，本發(fā)明 涉及一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關C0X-2的DNA疫苗，該疫苗在患者體內誘導產生對腫瘤 耙向殺傷的CTL反應，實現(xiàn)腫瘤治療的目標。
背景技術：
腫瘤在其癌變歷程中，需要促進因子加快癌變速度，在眾多腫瘤促進因子中環(huán)氧 合酶-2 (Cyclooxygenase-2， C0X-2)是一種重要的促進因子之一。C0X-2與其同工酶 C0X-l是分解花生四烯酸(Arachidonic acid)生成各種內源性前列腺(Prostaglandins, PGs)過程中關鍵的限速酶(Cell， 1995, 83(3): 493-501; Cell, 1996, 87(5): 803-809; Cell, 1998, 93(5): 705-716)。 COX酶(EC 1.14. 99.1)具有環(huán)氧合酶和過氧化酶兩種 活性，COX-l在正常組織中組成型表達，而C0X-2在組織中為誘導型表達(Cell, 1996， 87(5): 803-809)。 COX-2主要參與細胞的生長分化，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉 移中發(fā)揮重要作用。相關研究顯示環(huán)氧合酶-2 (Cyclooxygenase-2， COX-2)在肺癌、 乳腺癌、胃癌、肝癌、直腸癌、結腸癌、前列腺癌與宮頸癌等腫瘤組織中高表達，而 正常組織不表達或低表達。敲除尸^s^(C0X-2基因)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)C0X-2有利于腫瘤 的產生，而C0X-2抑制劑可抑制腫瘤的形成。C0X-2通過下述多種途徑參與腫瘤的發(fā)生 發(fā)展1)促進細胞生長與增殖；2)抑制癌細胞凋亡；3)促進腫瘤侵襲轉移；4)促 進腫瘤血管的形成；5)抑制免疫反應；6)參與致癌物代謝；7)提高多藥抗藥性。因 此，C0X-2可作為腫瘤防治的一個重要靶點。此外，C0X-2己是炎癥治療與癌痛治療的 靶點。流行病調查發(fā)現(xiàn)，長期使用非甾體抗炎藥能有效預防腫瘤發(fā)生。
目前腫瘤免疫治療可分為主動免疫治療和被動免疫治療，主要采用單克隆抗體、 蛋白疫苗、基因疫苗、噬菌體疫苗和細胞疫苗等。生產商已開發(fā)了一系列產品，如抗 EGF單克隆抗體商品名為ABX-EGF (N Engl J Med， 2003 ， 349 (5) :427-34)，抗EGFR單 克隆抗體商品名為ERBITUX，又名Cetuximab, IMC-C225 (Semin Oncol， 2003， 30(6): 39-50)， HER2的人源化單克隆抗體商品名Herc印tin (http:〃www. herc印tin. com)等。主動免疫治療通過接種疫苗如蛋白與DNA疫苗誘導體內產生抗體、CTL及ADCC反應，達 到免疫殺傷作用。2002年4月Niethammer等報道了構建以VEGF受體2作為新型口服DNA疫 苗的動物實驗，結果表明，該DNA疫苗能使小鼠耐受致死劑量腫瘤細胞的接種而不長腫 瘤，并縮小已成長的腫瘤。在不同的動物試驗中均確認了其抗腫瘤的效果(Nat Med, 2002,8(12): 1369-1375)。英國生物技術公司Plotherics PL開發(fā)的VEGF基因疫苗目前 巳進入了預臨床試驗階段。
目前已有用腫瘤細胞內特異促進因子的DNA疫苗的抗腫瘤作用的報道，如人端粒酶 逆轉錄酶(Human telomerase reverse tanscriptase, hTERT)與凋亡抑制蛋白
(Survivin)，其抗原表位肽是經細胞內蛋白酶體加工的產物，能在體外誘導特異性細 胞毒性CD8+Th細胞(Immunity, 1999,10(6): 673-679; Cancer Res， 2000,60:4845 -4849)?；蛞呙缈鼓[瘤的機理雖然還沒有定論，但本領域研究者們共識為基因疫苗 在細胞內表達抗原，部分抗原在細胞蛋白酶體加工，經MHCI呈遞在細胞表面，誘導特 異性細胞毒性CD8+細胞；另一部分抗原分泌到胞外被其它免疫細胞攝取，在溶酶體作 用下加工成多肽，與MHCII分子結合，轉運到細胞表面被CD4+細胞識別，進一步產生體 液免疫與細胞免疫。COX-2在腫瘤細胞中高表達，在正常組織不表達或低表達。腫瘤細 胞所表達的COX-2同樣可被蛋白酶體加工，部分MHC I限制方式呈遞在細胞表面，產生 CTL細胞反應。COX-2的DNA疫苗可誘導CTL細胞特異殺傷C0X-2異常表達的腫瘤細胞。但 尚未見關于C0X-2 DNA疫苗的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤靶向重組DNA疫苗，具體涉及一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展 相關COX-2的DNA疫苗。該疫苗能在在患者體內誘導產生對腫瘤靶向殺傷的CTL反應， 實現(xiàn)腫瘤治療的目標。
本發(fā)明的另一個目的是提供所述的腫瘤耙向重組DNA疫苗的制備方法。 本發(fā)明的進一步目的是提供所述的腫瘤靶向重組DNA疫苗在腫瘤預防與治療中的 應用。
本發(fā)明采用基因工程技術，將腫瘤細胞異常表達C0X-2、 5'-AACGTT-3'序列(免疫 刺激DNA序列Immunostimulatory DNA sequence, ISS)、鼠源泛素蛋白(MJbi)及其 pVAXl載體重組成為pVAXl-/rfJbi-ISS-COX-2-ISS;目的DNA疫苗在原核細胞擴增后， 制備無內毒素高純的DNA疫苗，免疫小鼠，刺激機體產生CTL反應，殺傷C0X-2異常表達腫瘤細胞，實現(xiàn)腫瘤靶向治療的目的。
本發(fā)明所述的疫苗的DNA序列包括鼠源泛素蛋白(/ziJbi)、 5'-AACGTT-3'序列 (I匪nostimulatory DNA sequence, ISS)、 COX-2蛋白的DNA序列及pVAXl載體。
本發(fā)明提供的腫瘤靶向重組DNA疫苗，其特征是，用于制備該疫苗的蛋白是環(huán)氧 合酶-2 (COX-2)的功能片段，其編碼序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0 2所示；為了加快目標蛋白C0X-2的加工與呈遞，在C0X-2蛋白的N端連接一段鼠 源的泛素蛋白』bi，其編碼序列如SEQ ID NO 3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 4所 示；機體產生較強的免疫反應，需要免疫原的刺激，免疫刺激DNA序列ISS可激活T 細胞、B細胞及NK細胞，誘導Thl細胞免疫功能，在//Ubi序列與COX-2交接處及COX-2 的3'端均有ISS序列，其序列如SEQ ID NO 5所示。
本發(fā)明提供的腫瘤靶向重組DNA疫苗在基本載體pVAXl的多克隆位點MCS處插入 SEQ ID NO 7的片段/zUbi-ISS-COX-2-ISS，構建成編碼鼠源泛素蛋白/dJbi與COX-2融 合蛋白抗原，融合蛋白抗原之間由SEQ ID NO 6的柔性接頭連接，制得腫瘤耙向重組 DNA疫苗，命名為pVAXl-yziJbi-ISS-COX-2 - ISS。
本發(fā)明的腫瘤耙向重組DNA疫苗通過下述方法制備
1) 以pVAXl (購自Invitrogen公司)為基本載體，該載體含有卡那霉素抗性基因 的表達框與多克隆位點(Multiple cloning site, MCS);
2) 在pVAXl的MCS位點插入C0X-2表達框，所述COX-2表達框的構成是從5' 端到3'端方面依次為(I )轉錄調控區(qū)的巨細胞病毒早期啟動子/增強子P^v， (II) MJbi序列，(III) ISS序列，(IV) C0X-2基因序列，(V) ISS序列，(VI)牛生長激素 的多聚腺苷酰化信號(BGHpA)，
所得DNA疫苗載體命名為pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS。
所述的疫苗，其中的PcMv使重組蛋白高水平表達、Wbi加快COX-2抗原加工與呈 遞、ISS序列作為免疫佐劑激活機體免疫系統(tǒng)，誘導腫瘤靶向CTL產生、殺傷COX-2 異常表達的腫瘤細胞。
本發(fā)明中涉及的各種細菌擴增、培養(yǎng)、轉化、鑒定、純化等方法采用本領域公知 的常規(guī)條件與步驟。
本發(fā)明所涉及的原核細胞為大腸桿菌DH5a 。
本發(fā)明的腫瘤靶向的DNA疫苗載體pVAXl-MJbi-ISS-COX-2-ISS轉化大腸桿菌DH5ci可得到含有該疫苗載體的大腸桿菌轉化子。
本發(fā)明通過擴大培養(yǎng)上述含pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗載體的大腸桿菌轉化 子，經提取純化得pVAXl-y iJbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗并測定濃度，通過動物實驗等檢驗 疫苗的效果，如DNA疫苗免疫動物，接種腫瘤細胞，觀察殺傷效應(預防性實驗)，或 者在長有腫瘤的動物體內注射該疫苗，觀察抗腫瘤效果(治療性實驗)。
預防性實驗結果表明預防組比對照組全部成瘤性晚9天，接瘤后的第21天全部 成瘤，對照組為接瘤后的第12天全部成瘤，表明，該腫瘤靶向DNA疫苗可明顯降低B16 黑色素瘤細胞的小鼠成瘤性。
本發(fā)明腫瘤靶向DNA疫苗可強烈殺傷B16腫瘤細胞，抑制腫瘤生長，在接瘤后的 第30天，抑瘤率為63.4%，治療組動物成活率明顯高于對照組，生成期可達60天。治 療性實驗結果表明治療組比對照組全部成瘤性晚2天，為接瘤后15天；本發(fā)明腫瘤 靶向DNA疫苗能降低B16黑色素瘤細胞動物成瘤性；該DNA疫苗在B16腫瘤細胞接瘤 后的第25天，抑瘤率為58.9%，且治療組動物成活率明顯高于對照組，其生成期可超 過45天；上述結果證實本發(fā)明的腫瘤靶向重組DNA疫苗，免疫動物后具有良好預治 腫瘤效果。
本發(fā)明還提供了一種腫瘤靶向重組DNA疫苗的應用，其特征是，將該疫苗應用于 制備腫瘤預防與治療的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種腫瘤靶向重組DNA疫苗的應用，其特征是，將該疫苗應用于 制備炎癥治療的藥劑，這主要是通過該疫苗殺傷炎癥細胞。
本發(fā)明還提供了一種腫瘤耙向重組DNA疫苗的應用，其特征是，將該疫苗應用于 制備癌痛治療的藥劑。
本發(fā)明制備的腫瘤靶向DNA疫苗具有以下特點
1、 本發(fā)明以腫瘤細胞異常表達的C0X-2分子為DNA疫苗的靶基因，免疫實驗動物 并誘導產生針對異常表達C0X-2的腫瘤細胞的CTL反應、導致腫瘤細胞生長受到抑制 和促進腫瘤細胞凋亡，實現(xiàn)腫瘤生物靶向治療的目標。
2、 5'-AACGTT-3'序列為ISS序列，ISS作為免疫佐劑激活機體免疫系統(tǒng)，可作用 與T細胞、B細胞及NK細胞等免疫效應細胞，并促進IL-6、 IL-12、 IL-18及IFN等多 種細胞因子的分泌，具有較強誘導Thl細胞免疫功能。
3、泛素/ziJbi與C0X-2融合表達連接可增強C0X-2蛋白在蛋白酶體中的降解、呈遞，
6提高并加快抗原誘導的CTL免疫應答。
4、 本疫苗易構建、易改造、制備成本低廉并可大規(guī)模生產。
5、 本疫苗物理化學性質穩(wěn)定，20-25'C下可保存、便于運輸與使用。
6、 本疫苗可長時間誘導免疫反應，與常規(guī)的多肽(蛋白疫苗)相比，免疫接種量 與接種次數(shù)少。
7、 本疫苗含有/HUbi序列與ISS序列，既加快了DNA疫苗的免疫效能，同時避免各 種對人體有害的免疫佐劑。
以下通過


與具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明

圖1 pVAXl-zsUbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗結構示意圖。
圖2含有』bi的片段的質粒pVAXl-MJbi結構示意圖。
圖3 pVAXl-/zDbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗構建示意圖。
圖4 pVAXl-/ziUbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗抗腫瘤作用(免疫治療)。
圖5 pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗對腫瘤生長的影響(免疫治療)。
圖6 pVAXl-/wUbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗抗腫瘤作用(免疫預防)。
圖7 PVAXl-/sUbi-ISS-C0X-2-ISS腫瘤耙向DNA疫苗對腫瘤生長的影響(免疫預防)。
具體實施方式
實施例l C0X-2基因克隆 A549細胞總mRNA提取
A549細胞培養(yǎng)于含10X小牛血清的完全1640培養(yǎng)液，置37'C、 5%0)2培養(yǎng)箱，胰蛋 白酶消化后離心收集細胞，棄上清，按照Trizol提取試劑盒(華舜公司)進行總mRNA 提取，電泳檢測。
弓I物設計與RT-PCR擴增 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫BC013734登陸號提供的C0X-2基因序列及pVAXl載體上的酶切 位點設計引物，在上下引物中分別引入)9aMn和&oRI酶切位點，引物由上海賽百盛
基因技術有限公司合成
上游引物(SEQ ID NO 8 ) : 5、 -CGGGATCCGGTGGGGGCGG，Cg77CCTTGCTGTTCCAACCCA
TGTC-3'(下劃線為"a/rfU位點，加粗的為部分柔性接頭序列，斜體為ISS序列)；下游引物(SEQ ID NO 9):
5、-CGGAATTCTTA雄6T7CAGTTCAGTCGAACGTTCTTTTAG-3'(下劃線為AcoR I位點，斜 體為ISS序列)。
按Promega公司RT試劑盒說明進行C0X-2基因cDNA合成。
PCR反應體系為50uL:
cDNA為模板 1 u L,
5U/ u L ￡r7a<7 DNA聚合酶 0. 3 u L，
10XPCR Buffer 5n L，
10 ,1 / L d證 4 ix 1，
10 pmol /L上游引物 2nL，
10 pmol/L下游引物 2uL，
雙蒸水 35. 7 u L
總體積 50uL。
循環(huán)參數(shù)為
94'C預變性 5 min;
94'C變性 30 S，
58。C退火 60 S，
72。C延伸 120 S， 30個循環(huán);
72'C延伸 10 min, l個循環(huán);
4'C保存 ~。 PCR擴增產物在l. 0%的瓊脂糖凝膠電泳。
用PCR產物回收試劑盒(TaKaRa公司)回收大小約1. 8 kb左右上述產物，用TJ)NA 連接酶(TaKaRa公司)將PCR純化C0X-2 DNA片段與pMD19-T (TaKaRa公司)載體片 段相連，其質粒載體命名為pMD19-ISS-C0X-2-ISS。
連接反應體系20 uL
COX-2DNA片段 5 u L
pMD19-T載體片段 8uL
T4DNA連接酶 0. 5 p L
T4DNA連接酶Buffer 2 u L雙蒸水 4. 5 u L
總體積 20 uL
16'C連接過夜。
將連接產物轉化DH5a感受態(tài)大腸桿菌，藍白篩選，陽性克隆接種于含5 mL Amp 的LB培養(yǎng)液中，37'C振搖過夜，提取質粒DNA行PCR與酶切鑒定(具體操作按照《分 子克隆實驗指南》第三版(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著黃培堂等譯2000)相關方 法進行)，并送上海捷瑞生物工程公司測序。測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫BC013734登 陸號提供的C0X-2基因的序列一致，序列見SEQ ID NO 1。
實施例2 鼠源MJbi基因克隆 小鼠睪丸組織總mRNA提取
無菌條件下C57BL/6雄性小鼠(中科院上海實驗動物中心)的睪丸組織，并用DEPC 處理的雙蒸水清洗2次，取0.5克組織、搗碎，按照Trizol提取試劑盒(華舜公司)進 行總mRNA提取，電泳檢測。 引物設計與RT-PCR擴增
按GenBank數(shù)據(jù)庫X51703登陸號提供的MJbi基因序列及pVAXl載體上的酶切位點設 計引物，在上下引物中分別引入AVwffl和ife/rfil酶切位點，引物由上海賽百盛基因技 術有限公司合成
上游引物(SEQ ID NO 10) : 5'-CGAAGCTTGCCACCATGCAGATCTTCGTGAAAACC-3'(下 劃線為歷/70ffl位點)；
下游引物(SEQ ID NO 11): 5' -CGGGATCCGCCACCGCCTCCGCCACCTCTCAGGCGAAGGACCA-3' (下劃線為5』I位點，加粗的為柔性接頭序列)。
按Pr omega公司RT試劑盒說明進行/riJb i基因cDNA合成。
PCR反應體系為50nL:
cDNA為模板 0.5uL，
5U/ii L ￡r7"a<7 DNA聚合酶. 0. 3 u L，
10XPCR Buffer 5uL，
10腸l /L d酵 4ti 1，
10 pmol /L上游引物 2uL,
1Opmol/L下游引物 2pL，5 min; 30 S， 30 S，
30 S， 30個循環(huán); 7 min， l個循環(huán)；
雙蒸水 36. 2 u L
總體積 50uL。 循環(huán)參數(shù)為
94'C預變性 94'C變性 58'C退火 72'C延伸 72'C延伸
4'C保存 oo。 PCR擴增產物在2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳。
用PCR產物回收試劑盒(TaKaRa公司)回收大小約230 bp左右上述產物，用T4DNA 連接酶將PCR純化MJbi DNA片段與PMD19-T載體片段相連，其質粒載體命名為 p腿9-暴i。
連接反應、連接產物轉化DH5a及其測序的實驗方法同1.2方案中相應部分。測 序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫X51703登陸號提供的MJbi基因的序列一致，序列見SEQ ID NO 3。
實施例3構建pVAXl-zzUbi-ISS-COX-2-ISS腫瘤靶向DNA疫苗重組載體 pVAXl-zzUbi重組載體的構建 在含20u g/mL Amp抗性的LB培養(yǎng)5mL, 37。C震蕩過夜培養(yǎng)含pMD19-MJbi質粒的 DH5a感受態(tài)大腸桿菌，按《分子克隆實驗指南》第三版提取pMD19-MJbi質粒DNA。
同樣在含50 u g/mL Kan抗性的LB培養(yǎng)5mL， 37。C震蕩過夜培養(yǎng)含pVAXl質粒的DH5 a 感受態(tài)大腸桿菌，按《分子克隆實驗指南》第三版提取pVAXl質粒DNA。
用歷'"dll和Aa/zH I (TaKaRa公司)分別雙酶切pMD19-/ Ubi質粒DNA與pVAXl質粒 DNA (Invitrogen公司)，酶切反應體系為80uL: 質粒DNA 20 yL
幼'慮 3uL fe/zH I 3 P L
10Xbuffer K 8u L雙蒸水 46 u L
總體積 80uL。 37"C水浴酶切過夜。
PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳。用DNA凝膠回收試劑盒分別回收230bp的/ziJbi DNA片段與3. Okb的pVAXl DNA片段，T4 DNA連接酶連接上述片段 連接反應體系20uL
/sUbi DNA片段5nL
pVAXl DNA片段8"
T4DNA連接酶0.5uL
T4DNA連接酶Buffer2uL
雙蒸水4. 5nL
總體積
16'C連接過夜。
將連接產物轉化DH5a感受態(tài)大腸桿菌，涂布在50ug/mL Kan抗性的LB固體培 養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，陽性克隆接種于含50ug/mL Kan抗性5 mL LB培養(yǎng)液中，37。C振搖 過夜，提取質粒DNA行PCR與A'/7cffl和5』I酶切鑒定(具體操作按照《分子克隆實 驗指南》第三版(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著黃培堂等譯2000)相關方法進行)。
pVAXl-znUbi-ISS-COX-2-ISS重組載體的構建
在含20 P g/mL Amp抗性的LB培養(yǎng)5mL， 37。C震蕩過夜培養(yǎng)含pMD19-ISS-COX-2-ISS 質粒的DH5a感受態(tài)大腸桿菌，按《分子克隆實驗指南》第三版提取 pMD19-ISS-COX-2-ISS質粒DNA。
同樣在含50 u g/mL Kan抗性的LB培養(yǎng)5mL， 37。C震蕩過夜培養(yǎng)含pVAXl-/dJbi質 粒的DH5 a感受態(tài)大腸桿菌，按《分子克隆實驗指南》第三版提取pVAXl-Wbi質粒DNA。 用fe/ziU和fcoRl (TaKaRa公司生產)分別雙酶切pVAXl-MJbi質粒DNA與 pMD19-ISS-C0X-2-ISS質粒DNA (Invitrogen公司)，酶切反應體系為80uL (酶切反 應體系與酶切條件同重組載體的構建)
PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳。用DNA凝膠回收試劑盒分別回收l. 8kb的ISS-COX-2-ISS DNA片段與3. 2kb的pVAXl-zzUbi DNA片段，T4 DNA連接酶連接上述片段(連接 反應體系與酶切反應條件同上述)。
11連接產物pVAXl-』bi-ISS-COX-2-ISS轉化DH5 a感受態(tài)大腸桿菌、Kan抗性轉化 子大規(guī)模培養(yǎng)、堿裂解法制備pVAXl-/BUbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗DNA。yW〃^dlI和5』I 酶切鑒定MJbi DNA片段，用5a/zH I和ScoR I鑒定ISS-COX-2-ISS DNA片段， 和￡coR I鑒定Wbi-ISS-COX-2-ISS DNA片段，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳依次可獲 得230bp， 1.8kb及2.0kb地下的片段，鑒定結果與預期相符合(具體反應體系與反應 條件參見3. 1方案)。酶切鑒定后并送上海鼎安生物公司測序，其測序結果見SEQ ID NO 7。
實施例4 大量制備與純化pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS疫苗DNA
采用堿裂解法大量制備pVAXl-/*bi-ISS-COX-2-ISS疫苗及對照pVAXl質粒DNA， TritonX-IOO去除內毒素，PEG8000沉淀后溶于生理鹽水中，測定八26。〃28。值為1. 8，調 整濃度為lug/uL(具體操作按照《分子克隆實驗指南》第三版(J.薩姆布魯克，D.W. 拉塞爾著黃培堂等譯2000)相關方法進行)。
實施例5腫瘤靶向DNA疫苗實驗治療腫瘤
1) 建立動物實驗腫瘤模型 體外培養(yǎng)小鼠B16黑色素瘤細胞
小鼠B16黑色素瘤細胞預活化，B16黑色素瘤細胞接種在含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置37'C、 5%0)2培養(yǎng)箱；
小鼠B16黑色素瘤細胞培養(yǎng)，胰蛋白酶消化預活化后B16黑色素瘤細胞，離心收集 細胞用無小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中清洗2-3次，接種在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng) 液中，置37'C、 5%(:02培養(yǎng)箱4-5天，備用；
荷黑色素瘤B16小鼠C57BL/6為模型
實驗用鼠6~8周齡、體重18 22g、健康雌性C57BL/6純系小鼠(早)(購至中科 院上海實驗動物中心)，在動物房培養(yǎng)3-4天(以小鼠適應新的環(huán)境)，
胰蛋白酶消化B16黑色素瘤細胞，用PBS (pH7.4)清洗2-3次，經細胞計數(shù)后，在 C57BL/6純系小鼠右前肢腋下皮下接種5 X 106-7 X106，選取9-10天內腫瘤大小為1-3mm 的小鼠作為實驗用鼠。
2) 黑色素瘤的免疫治療實驗治療組(IO只)C57BL/6接種B16黑色素瘤后的第3天注射100ug本發(fā)明腫瘤靶 向DNA疫苗在小鼠大腿股四頭肌注射25%蔗糖高滲溶液15-20min后，再注射 1 u g/u LpVAXl-函i-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗100 ^L，每周1次，共3次；
對照組(IO只)C57BL/6接種B16黑色素瘤后的第3天注射100 u g本腫瘤靶向DNA 疫苗在小鼠大腿股四頭肌注射25%蔗糖高滲溶液15-20min后，再注射1 u g/y L pVAXl DNA疫苗100;/L，每周1次，共3次；
接種腫瘤細胞后10天，觀察成瘤性；觀察腫瘤大小，測定腫瘤長徑與短徑，腫瘤 體積(國3)=(長徑/2) X短徑、計算抑瘤率=(對照組瘤體積-實驗組瘤體積)/對照組 瘤體積X10(E，觀察小鼠的生存期；
實驗結果顯示，治療組比對照組全部成瘤性晚2天，為接瘤后15天；開始成瘤為
接瘤后的第12天，而對照組為接瘤后的第10天，本發(fā)明腫瘤靶向DNA疫苗可降低B16 黑色素瘤細胞動物成瘤性；腫瘤體積大小表明pVAXl-yrfJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗 具有明顯的抗腫瘤作用，能抑制B16腫瘤細胞生長，在接瘤后的第25天，抑瘤率為58. 9% (圖4與圖5),治療組動物成活率明顯高于對照組，其生成期超過45天。實驗結果證 實本pVAXl-zriJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗具有良好的抗腫瘤作用。
表1是pVAXl-/dJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗免疫治療對B16黑色素瘤細胞動物成 瘤性的影響。
表2是pVAXl-MJbi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗免疫治療對B16黑色素瘤細胞動物生 存期的影響(活動物)。
表1
接瘤后時間(d)10111213141516
對照組(n=10)14910101010
治療組(n=10)001791010
表2接瘤后時間(d)15202530354045
對照組(n=10)101071000
治療組(n=10)101010101092
實施例6腫瘤靶向DNA疫苗對腫瘤的免疫預防實驗
1)建立荷黑色素瘤B16小鼠C57BL/6為動物實驗腫瘤模型方法同實施例5;2)黑色素瘤的免疫預防實驗
實驗組在C57BL/6小鼠大腿股四頭肌注射25%蔗糖高滲溶液15-20min后，再注射 1 u g/u L pVAXl-滿i-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗100 ^L,每周1次，共4次，末次免 疫結束后，在C57BL/6純系小鼠右前肢腋下皮下接種5X1(T-7X106， 10天觀察腫瘤大 小，測定腫瘤長徑與短徑，腫瘤體積=(長徑/2) X短徑2，計算抑瘤率=(對照組瘤體 積-實驗組瘤體積)/對照組瘤體積X 100%，觀察小鼠的生存期；
對照組在C57BL/6小鼠大腿股四頭肌注射25%蔗糖高滲溶液15-20min后，再注射 lug/ixLpVAXl DNA疫苗100;/L，每周1次，共4次，末次免疫結束后，在C57BL/6 純系小鼠右前肢腋下皮下接種5XlCf-7X106。 IO天觀察腫瘤大小，腫瘤測定與體積計 算方法與實驗組的相同。
實驗結果顯示，預防組比對照組全部成瘤性晚9天，為接瘤后21天；開始成瘤期 為16天，而對照組為10天，表明，該腫瘤耙向DNA疫苗可明顯降低B16黑色素瘤細 胞的小鼠成瘤性。腫瘤體積結果表明pVAXl-』bi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗具有明顯 的抗腫瘤作用，可強烈殺傷B16腫瘤細胞，抑制腫瘤生長，在接瘤后的第30天，抑瘤 率為63.4% (圖6與圖7)，治療組動物成活率明顯高于對照組，生成期可達60天。 實驗證實pVAXl-Wbi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗具有良好的腫瘤預防作用。 表3 pVAXl-MJbi-ISS-C0X-2-ISS DNA疫苗免疫預防對B16黑色素瘤細胞動物成瘤 性的影響。
表4 pVAXl-/zUbi-ISS-COX-2-ISS DNA疫苗預防治療對B16黑色素瘤細胞動物生存 期的影響(活動物)。
表3
接瘤后時間(d)101112131416182021
對照組(n=10)2810101010101010
治療組(n=10)0000013910
表4接瘤后時間(d)20253035 4045505560 65
對照組(n=10)10930 00000 0
治療組(n=10)10101010 109721 0序列表
SEQUENCE LISTING <110>同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院 <120〉 一種腫瘤靶向重組DNA疫苗及其制備與應用 <130〉 81 <160〉 11
<170> Patentln version 3.1
<210> 1 <211〉 1764 <212〉 DNA <213> Homo sapiens
<220〉 <221〉 CDS <222〉 ("..(1764) <223>
<400〉 1
cct tgc tgt tec aac cca tgt caa aac cga ggt gta tgt atg agt gtg 48 Pro Cys Cys Ser Asn Pro Cys Gin Asn Arg Gly Val Cys Met Ser Val 15 10 15
gga ttt gac cag tat aag tgc gat tgt acc egg aca gga ttc tat gga 96 Gly Phe Asp Gin Tyr Lys Cys Asp Cys Thr Arg Thr Gly Phe Tyr Gly 20 25 30
gaa aac tgc tea aca ccg gaa ttt ttg aca aga ata aaa tta ttt ctg 144 Glu Asn Cys Ser Thr Pro Glu Phe Leu Thr Arg lie Lys Leu Phe Leu 35 40 45aaa ccc act cca aac aca gtg cac tac ata ctt acc cac ttc aag gga 192 Lys Pro Thr Pro Asn Thr Val His Tyr lie Leu Thr His Phe Lys Gly 50 55 60
ttt tgg aac gtt gtg aat aac att ccc ttc ctt cga aat gca att atg 240 Phe Trp Asn Val Val Asn Asn lie Pro Phe Leu Arg Asn Ala lie Met 65 70 75 80
agt tat gtg ttg aca tec aga tea cat ttg att gac agt cca cca act 288 Ser Tyr Val Leu Thr Ser Arg Ser His Leu lie Asp Ser Pro Pro Thr 85 90 95
tac aat get gac tat ggc tac aaa age tgg gaa gcc ttc tct aac etc 336 Tyr Asn Ala Asp Tyr Gly Tyr Lys Ser Trp Glu Ala Phe Ser Asn Leu 100 105 110
tec tat tat act aga gcc ctt cct cct gtg cct gat gat tgc ccg act 384 Ser Tyr Tyr Thr Arg Ala Leu Pro Pro Val Pro Asp Asp Cys Pro Thr 115 120 125
ccc ttg ggt gtc aaa ggt aaa aag cag ctt cct gat tea aat gag att 432 Pro Leu Gly Val Lys Gly Lys Lys Gin Leu Pro Asp Ser Asn Glu lie 130 135 140
gtg gaa aaa ttg ctt eta aga aga aag ttc ate cct gat ccc cag ggc 480 Val Glu Lys Leu Leu Leu Arg Arg Lys Phe lie Pro Asp Pro Gin Gly 145 150 155 160
tea aac atg atg Ut gca ttc ttt gcc cag cac ttc acg cat cag ttt 528 Ser Asn Met Met Phe Ala Phe Phe Ala Gin His Phe Thr His Gin Phe 165 170 175
ttc卿aca gat cat aag cga ggg cca get ttc acc aac ggg ctg ggc 576 Phe Lys Thr Asp His Lys Arg Gly Pro Ala Phe Thr Asn Gly Leu Gly 180 185 190
cat ggg gtg gac tta aat cat att tac ggt gaa act ctg get aga cag 624 His Gly Val Asp Leu Asn His lie Tyr Gly Glu Thr Leu Ala Arg Gin 195 200 205
cgt aaa ctg cgc ctt ttc aag gat gga aaa atg aaa tat cag ata att 672 Arg Lys Leu Arg Leu Phe Lys Asp Gly Lys Met Lys Tyr Gin .lie lie 210 215 220
gst gga gag atg tat cct ccc aca gtc aas gat act csg ges gsg atg 720 Asp Gly Glu Met Tyr Pro Pro Thr Val Lys Asp Thr Gin Ala Glu Met 225 230 235 240
ate tac cct cct caa gtc cct gag cat eta egg ttt get gtg ggg cag 768 lie Tyr Pro Pro Gin Val Pro Glu His Leu Arg Phe Ala Val Gly Gin 245 250 255
gag gtc ttt ggt ctg gtg cct ggt ctg atg atg tat gcc aca ate tgg 816 Glu Val Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Met Met Tyr Ala Thr lie Trp 260 265 270ctg egg gaa cac aac aga gta tgc gat gtg ctt aaa cag gag cat cct 864 Leu Arg Glu His Asn Arg Val Cys Asp Val Leu Lys Gin Glu His Pro 275 280 285
gaa tgg ggt gst gag cag ttg ttc cag aca age agg eta ata ctg ata 912 Glu Trp Gly Asp Glu Gin Leu Phe Gin Thr Ser Arg Leu lie Leu lie 290 295 300
gga gag act att aag att gtg att gaa gat tat gtg caa cac ttg agt 960 Gly Glu Thr lie Lys lie Val lie Glu Asp Tyr Val Gin His Leu Ser 305 310 315 320
ggc tat cac ttc aaa ctg aaa ttt gac cca gaa eta ctt ttc aac aaa1008 Gly Tyr His Phe Lys Leu Lys Phe Asp Pro Glu Leu Leu Phe Asn Lys 325 330 335
caa ttc cag tac caa aat cgt att get get gaa ttt aac acc etc tat1056 Gin Phe Gin Tyr Gin Asn Arg lie Ala Ala Glu Phe Asn Thr Leu Tyr 340 345 350
cac tgg cat ccc ctt ctg cct gac acc ttt caa att cat .gac cag aaa1104 His Trp His Pro Leu Leu Pro Asp Thr Phe Gin lie His Asp Gin Lys 355 360 365
tac aac tat caa cag ttt ate tac aac aac tct ata ttg ctg gaa cat1152 Tyr Asn Tyr Gin Gin Phe lie Tyr Asn Asn Ser lie Leu Leu Glu His 370 375 380
gga att acc cag ttt gtt gaa tea ttc acc agg caa att get ggc agg 1200 Gly lie Thr Gin Phe Val Glu Ser Phe Thr Arg Gin lie Ala Gly Arg 385 390 395 400
gtt get ggt ggt agg aat gtt cca ccc gca gta cag aaa gta tea cag1248 Val Ala Gly Gly Arg Asn Val Pro Pro Ala Val Gin Lys Val Ser Gin 405 410 415
get tec att gac cag age agg cag atg aaa tac cag tct ttt aat gag 1296 Ala Ser He Asp Gin Ser Arg Gin Met Lys Tyr Gin Ser Phe Asn Glu 420 425 430
tac cgc aaa cgc ttt atg ctg aag ccc tat gaa tea ttt gaa gaa ctt 1344 Tyr Arg Lys Arg Phe Met Leu Lys Pro Tyr Glu Ser Phe Glu Glu Leu 435 440 445
aca gga gaa sag gaa atg tct gca gag ttg gas gca etc t3t ggt gac 1392 Thr Gly Glu Lys Glu Met Ser Ala Glu Leu Glu Ala Leu Tyr Gly Asp 450 455 460
ate gat get gtg gag ctg tat cct gcc ctt ctg gta gaa aag cct egg 1440 lie Asp Ala Val Glu Leu Tyr Pro Ala Leu Leu Val Glu Lys Pro Arg 465 470 475 480
cca gat gcc ate ttt ggt gaa acc atg gta gaa gtt gga gca cca ttc1488 Pro Asp Ala lie Phe Gly Glu Thr Met Val Glu Val Gly Ala Pro Phe 485 490 495
17tcc ttg aaa gga ctt atg ggt aat gtt ata tgt tct cct gcc tac tgg 1536 Ser Leu Lys Gly Leu Met Gly Asn Val lie Cys Ser Pro Ala Tyr Trp 500 505 510
aag cca age act ttt ggt gga gaa gtg ggt ttt caa ate ate aac act1584 Lys Pro Ser Thr Phe Gly Gly Glu Val Gly Phe Gin lie lie Asn Thr 515 520 525
gcc tea att cag tct etc ate tgc aat aac gtg aag ggc tgt ccc ttt1632 Ala Ser lie Gin Ser Leu lie Cys Asn Asn Val Lys Gly Cys Pro Phe 530 535 540
act tea ttc agt gtt cca gat cca gag etc att. aaa aca gtc acc ate1680 Thr Ser Phe Ser Val Pro Asp Pro Glu Leu lie Lys Thr Val Thr lie 545 550 555 560
犯t gca agt tct tcc cgc tcc gga cta gat gst 3tc aat ccc aca gta1728 Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Leu Asp Asp lie Asn Pro Thr Val 565 570 575
cta cta aaa gaa cgt teg act gaa ctg aac gtt taa 1764
Leu Leu Lys Glu Arg Ser Thr Glu Leu Asn Val 580 585
<210〉 2
<211〉 587
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Pro Cys Cys Ser Asn Pro Cys Gin Asn Arg Gly Val Cys Met Ser Val 15 10 15
Gly Phe Asp Gin Tyr Lys Cys Asp Cys Thr Arg Thr Gly Phe Tyr Gly 20 25 30
Glu Asn Cys Ser Thr Pro Glu Phe Leu Thr Arg lie Lys Leu Phe Leu 35 40 45
Lys Pro Thr Pro Asn Thr Val His Tyr lie Leu Thr His Phe Lys Gly 50 55 60
Phe Trp Asn Val Val Asn Asn lie Pro Phe Leu Arg Asn Ala lie Met 65 70 75 80Ser Tyr Val Leu Thr Ser Arg Ser His Leu lie Asp Ser Pro Pro Thr 85 90 95
Tyr Asn Ala Asp Tyr Gly Tyr Lys Ser Trp Glu Ala Phe Ser Asn Leu 100 105 110
Ser Tyr Tyr Thr Arg Ala l_eu Pro Pro Val Pro Asp Asp Cys Pro Thr 115 120 125
Pro Leu Gly Val Lys Gly Lys Lys Gin Leu Pro Asp Ser Asn Glu lie 130 135 140
Val Glu Lys Leu Leu Leu Arg Arg Lys Phe lie Pro Asp Pro Gin Gly 145 150 155 160
Ser Asn Met Met Phe Ala Phe Phe Ala Gin His Phe Thr His Gin Phe 165 170 175
Phe Lys Thr Asp His Lys Arg Gly Pro Ala Phe Thr Asn Gly Leu Gly 180 185 190
His Gly Val Asp Leu Asn His lie Tyr Gly Glu Thr Leu Ala Arg Gin 195 200 205
Arg Lys Leu Arg Leu Phe Lys Asp Gly Lys Met Lys Tyr Gin lie lie 210 215 220
Asp Gly Glu Met Tyr Pro Pro Thr Val Lys Asp Thr Gin Ala Glu Met 225 230 235 240
lie Tyr Pro Pro Gin Val Pro Glu His Leu Arg Phe Ala Val Gly Gin 245 250 255
Glu Val Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Met Met Tyr Ala Thr lie Trp 260 265 270
Leu Arg Glu His Asn Arg Val Cys Asp Val Leu Lys Gin Glu His Pro 275 280 285
Glu Trp Gly Asp Glu Gin Leu Phe Gin Thr Ser Arg Leu lie Leu lie 290 295 300Gly Glu Thr lie Lys lie Val lie Glu Asp Tyr Val Gin His Leu Ser 305 310 315 320
Gly Tyr His Phe Lys Leu Lys Phe Asp Pro Glu Leu Leu Phe Asn Lys 325 330 335
Gin Phe Gin Tyr Gin Asn Arg lie Ala Ala Glu Phe Asn Thr Leu Tyr 340 345 350
His Trp His Pro Leu Leu Pro Asp Thr Phe Gin lie His Asp Gin Lys 355 360 365
Tyr Asn Tyr Gin Gin Phe lie Tyr Asn Asn Ser lie Leu Leu Glu His 370 375 380
Gly lie Thr Gin Phe Val Glu Ser Phe Thr Arg Gin lie Ala Gly Arg 385 390 395 400
Val Ala Gly Gly Arg Asn Val Pro Pro Ala Val Gin Lys Val Ser Gin 405 410 415
Ala Ser lie Asp Gin Ser Arg Gin Met Lys Tyr Gin Ser Phe Asn Glu 420 425 430
Tyr Arg Lys Arg Phe Met Leu Lys Pro Tyr Glu Ser Phe Glu Glu Leu 435 440 445
Thr Gly Glu Lys Glu Met Ser Ala Glu Leu Glu Ala Leu Tyr Gly Asp 450 455 460
lie Asp Ala Val Glu Leu Tyr Pro Ala Leu Leu Val Glu Lys Pro Arg 465 470 475 480
Pro Asp Ala lie Phe Gly Glu Thr Met Val Glu Val Gly Ala Pro Phe 485 490 495
Ser Leu Lys Gly Leu Met Gly Asn Val lie Cys Ser Pro Ala Tyr Trp 500 505 510
Lys Pro Ser Thr Phe Gly Gly Glu Val Gly Phe Gin lie lie Asn Thr 515 520 525
20Ala Ser lie Gin Ser Leu Ne Cys Asn Asn Val Lys Gly Cys Pro Phe 530 535 540
Thr Ser Phe Ser Val Pro Asp Pro Glu Leu lie Lys Thr Val Thr lie 545 550 555 560
Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Leu Asp Asp lie Asn Pro Thr Val 565 570 575
Leu Leu Lys Glu Arg Ser Thr Glu Leu Asn Val 580 585
<210〉 <211> <212> <213>
<220〉 <221〉 <222> <223>
3
228
DNA
小鼠
CDS
(1)..(228)
<400〉 3
8tg cag ate ttc gtg 3ag sec ctg 8cc ggc sag sec 3tc sec cts gag 48 Met Gin lie Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr lie Thr Leu Glu 15 10 15
gtg gag ccc sgt gsc sec 3tc gsg sac gtg犯g gcc 33g 3tc csg gst 96 Val Glu Pro Ser Asp Thr lie Glu Asn Val Lys Ala Lys lie Gin Asp 20 25 30
aaa gag ggc ate ccc cct gac cag cag柳ctg ate ttt gcc ggc卿 Lys Glu Gly lie Pro Pro Asp Gin Gin Arg Leu lie Phe Ala Gly Lys 35 40 45
144
csg ctg gas gat ggc cgc see etc tct gat tac asc ate csg卿gag 192 Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn lie Gin Lys Glu 50 55 60
tea acc ctg cac ctg gtc ctt cgc ctg aga ggt ggc 228Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 65 70 75
<210〉 4
<211〉 76
<212> PRT <213〉小鼠
<400> 4
Met Gin lie Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr lie Thr Leu Glu 15 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr lie Glu Asn Val Lys Ala Lys lie Gin Asp 20 25 30
Lys Glu Gly lie Pro Pro Asp Gin Gin Arg Leu lie Phe Ala Gly Lys 35 40 45
Gin Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn He Gin Lys Glu 50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 65 70 75
<210> 5 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial
<400> 5 6 83cgtt
<210〉 6 <211> 36 <212> DNA
22<213> Artificial
<400〉 6
ggaggcggtg gcggatccgg tgggggcggt aacgtt 36
<210> 7 <211〉 2028 <212〉 DNA <213〉 Artificial
<400> 7
atgcagatct tcgtgssgac cctgaccggc 3agaccatca ccctsgaggt ggagcccagt 60
gsc3cc3tcg sgsscgtgss ggcc33g3tc csggstsssg sgggcstccc ccctgsccsg 120
cagaggctga tctttgccgg caagcagctg gaagatggcc gcaccctctc tgattacsac 180
3tccsgaagg sgtcasccct gcscctggtc cttcgcctga gsggtggcgg sggcggtggc 240
ggatccggtg ggggcggtss cgttccttgc tgttccsacc cstgtcsssa ccgsggtgts 300
tgtatgagtg tgggatttga ccagtataag tgcgattgta cccggacagg attctatgga 360
gaaaactgct caacaccgga atttttgaca agaataaaat tatttctgaa acccactcca 420
aacacagtgc actacatact tacccacttc aagggatttt ggaacgttgt gaataacatt 480
cccttccttc gaaatgcaat tatgagttat gtgttgacat ccagatcaca tttgattgac 540
agtccacc犯cttscsatgc tgsctstggc tscsaaagct ggg犯gcctt ctctsacctc 600
tcctatt3ta ctegagccct tcctcctgtg cctgstgatt gcccgsctcc cttgggtgtc 660
3aaggt8aa3 agcsgcttcc tg愈3犯t gagattgtgg 8asaattgct tctssgasga 720
aagttcatcc ctgatcccca gggctcaaac atgatgtttg cattctttgc ccagcacttc 780
acgcatcagt加caagac agatcataag cgagggccag ctttcaccaa cgggctgggc 840
catggggtgg acttaaatca tatttacggt gaaactctgg ctagacagcg taaactgcgc 900cttttcaagg atgga3333t g333tatcag at3attgatg g3gagatgt3 tcctcccaca 960
gtca3agat8 ctcaggcsgs gstgatctsc cctcctcasg tccctgagcs tctscggttt 1020
gctgtggggc aggaggtctt tggtctggtg cctggtctga tgatgtatgc cacaatctgg 1080
ctgcggg犯c 3c3ac3g3gt stgcgstgtg ctt333c3gg sgcstcctgs stggggtgat 1140
gagcagttgt tccagacaag caggctaata ctgataggag agactattaa gattgtgatt 1200
g3agattatg tgc38C3ctt g3gtggctat cscttcaaac tg333tttg3 cccagascta 1260
cttttcaaca ascaattcca gtacca33at cgtattgctg ctg33ttta3 caccctctat 1320
cactggcstc cccttctgcc tgacaccttt caaattcatg accagasats C38ct3tcs3 1380
cagtttatct acaacaactc tatattgctg gaacatggaa ttacccagtt tgttgaatca 1440
ttcaccaggc aaattgctgg cagggttgct ggtggtagga atgttccacc cgcagtacag 1500
a33gtatc3c 3ggcttccat tgsccsgagc 3ggcag8tg3 astaccsgtc ttttsatgsg 1560
taccgcaasc gctttstgct gasgccctst g83tcatttg sagaacttsc 3ggaga333g 1620
gaaatgtctg csgagttggs sgcsctctat ggtgacatcg 3tgctgtgg3 gctgtatcct 1680
gcccttctgg t3g犯3agcc tcggccagat gcc3tctttg gtg3犯cc8t ggtsg卿tt 1740
ggagcaccat tctccttgaa aggacttatg ggtaatgtta tatgttctcc tgcctactgg 1800
sagccaagca cttttggtgg 3g3agtgggt tttcsaatca tcaacactgc ctcaattcag 1860
tctctcatct gcaataacgt gaagggctgt ccctttactt cattcagtgt tccagatcca 1920
gsgctcstta 333cagtc3c C3tc3atgc3 agttcttccc gctccggsct agatgatstc 1980
aatcccacag tactactaaa agaacgttcg actgaactga acgtttaa 2028
<210> 8 <211> 48 <212> DNA <213〉 Artificial<400〉 8
cgggatccgg tgggggcggt aacgttcctt gctgttccaa cccatgtc 48
<210> 9<211> 41<212〉 DNA<213〉 Artificial
<400〉 9
cggaattctt aaacgttcag ttcagtcgaa cgttctttta g 41
<210〉 10<211〉 35<212> DNA<213〉 Artificial
<400〉 10
cgasgcttgc caccatgcsg 3tcttcgtgs犯3cc 35
<210〉 11
<2"〉 43
<212〉 DNA
<213> Artificial
<400> 11
cgggstccgc csccgcctcc gccscctctc 8ggcg33gg3 ccs 4權利要求
1、一種腫瘤靶向重組DNA疫苗，其特征是，含有環(huán)氧合酶-2蛋白(COX-2)，鼠源泛素蛋白mUbi，免疫刺激DNA序列ISS及載體pVAX1。
2、 按權利要求1所述的腫瘤靶向重組DNA疫苗，其特征是所述的環(huán)氧合酶-2蛋白具有SEQ ID NO 1的編碼序列及SEQ ID NO 2的氨基酸序列；所述的鼠源泛素蛋白mUbi具有SEQ ID NO 3的編碼序列及SEQ ID NO 4的氨基酸序列；所述的免疫刺激DNA序列ISS DNA序列如SEQ ID NO 5。
3、 權利要求l的腫瘤靶向重組DNA疫苗的制備方法，其特征是，在基本載體pVAXl的多克隆位點MCS處插入SEQ ID NO 7的片段/wUbi-ISS-COX-2-ISS，構建成編碼鼠源泛素蛋白mUbi與COX-2融合蛋白抗原，融合蛋白抗原之間由SEQIDN0 6的柔性接頭連接，制得腫瘤靶向重組DNA疫苗，命名為pVAXl-wUbi-ISS-COX-2 —ISS。
4、 按權利要求3所述的方法，其特征是所述的載體pVAXl的MCS位點插入COX-2表達框，所述的COX-2表達框的構成是從5'端到3'端方面依次為(I )轉錄調控區(qū)的巨細胞病毒早期啟動子/增強子PcMV, (II)mUbi序列，(III) ISS序列，(IV) COX-2基因序列，(V) ISS序列，(VI)牛生長激素的多聚腺苷?；盘?BGHpA)，所得DNA疫苗載體命名為pVAXl-wUbi-ISS-COX-2-ISS。
5、 腫瘤靶向重組DNA疫苗在制備腫瘤預防與治療藥劑中的用途。
6、 腫瘤靶向重組DNA疫苗在制備治療炎癥的藥劑中的用途。
7、 腫瘤靶向重組DNA疫苗在制備治療癌痛藥劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，涉及腫瘤靶向重組DNA疫苗及其制備、應用。本發(fā)明利用基因工程方法，將鼠源泛素mUbi、COX-2及免疫刺激DNA序列ISS進行重組。在基本載體pVAX1的多克隆位點MCS處插入片段mUbi-ISS-COX-2-ISS，構建成編碼鼠源泛素蛋白mUbi與COX-2融合蛋白抗原，融合蛋白抗原之間由柔性接頭連接，制得腫瘤靶向重組DNA疫苗，本發(fā)明疫苗免疫動物體后，能激活機體免疫反應，在體內快速誘導COX-2特異的高效CTL反應，靶向殺傷COX-2異常表達的腫瘤細胞，實現(xiàn)腫瘤靶向治療的目標。本發(fā)明制備簡單、安全性高、生產成本低、可大規(guī)?；a、免疫應答持久，還可用于炎癥治療與癌痛治療領域。
文檔編號A61K39/00GK101648011SQ20081004158
公開日2010年2月17日 申請日期2008年8月11日 優(yōu)先權日2008年8月11日
發(fā)明者周彩存, 亮 唐, 王和勇, 恒 羅, 趙應敏 申請人:同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院