專利名稱：南海真菌中新鹿角縮酮類化合物在制備胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的南海內(nèi)生真菌鹿角菌X;;/oran》w. 2508中已分離鑒定并篩選到一系列鹿 角縮酮(xyloketals)類化合物在高血壓預(yù)防治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從1929年從真菌中發(fā)現(xiàn)青霉素以來，真菌的代謝產(chǎn)物成為了藥物的豐富來源，絕大 多數(shù)臨床應(yīng)用的抗生素都來源于真菌和細(xì)菌，真菌的代謝產(chǎn)物還有其他的藥用價(jià)值，如抗腫 瘤，治療心血管疾病，免疫調(diào)節(jié)劑等。由于海洋環(huán)境的特殊性，海洋微生物種類繁多，來源 廣泛，篩選獲得率高，根據(jù)John教授在2005年《Natural Product Reports》的報(bào)道，2003年 發(fā)現(xiàn)海洋天然產(chǎn)物新化合物中，海洋微生物是主要來源之一 (另外包括海綿和腔腸動(dòng)物)。 海洋真菌能提供陸生真菌無法提供的代謝產(chǎn)物。
植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)生活在高等植物的組織中，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然 組成成分，在進(jìn)化過程中與宿主建立了和諧的共生關(guān)系，據(jù)保守的估計(jì)內(nèi)生真菌的種類繁多， 大約有1.5><106種，由于數(shù)量龐大，而且與其他生物之間緊密的生態(tài)關(guān)系，使這類真菌成為 潛在的具有產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物的來源。國(guó)際上這方面的研究從八十年代以來呈加速發(fā) 展的趨勢(shì)，國(guó)內(nèi)從海洋微生物也發(fā)現(xiàn)一批新的活性物質(zhì)(Lin YC et al, J. Org. Chem.; Lin YC et al. Tetrahedron 2000)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類新的來源于海洋真菌的具有潛在藥用價(jià)值的化合物在抗氧 化應(yīng)激及影響血管重構(gòu)方面的應(yīng)用價(jià)值。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下 從南海內(nèi)生真菌鹿角菌Xy/oran'a w. 2508中已分離鑒定并篩選到一系列鹿角縮酮 (xyloketalA—F)類化合物中，結(jié)構(gòu)分別如下
3,、、、
XyloketalD Xyloketal E Xyloketal F
本發(fā)明的化合物可以從真菌2508的發(fā)酵液中提取分離得到，所用的真菌2508已保藏 于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC,中國(guó)武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號(hào)為CCTCC NO: M202029,保藏日為2002年08月03日。
本發(fā)明化合物鹿角縮酮化合物A—F (xyloketal A—F)可從真菌2508的發(fā)酵培養(yǎng)液中 提取分離得到，制備方法的具體步驟如下
a. 真菌2508的種子培養(yǎng)
培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，瓊脂1-1.5, 氯化鈉3-5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35°C培養(yǎng)5-7天；
b. 真菌250S的發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，瓊脂1-1.5， 氯化鈉3-5，水100，將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25-35'C靜置1-2個(gè) 月，或者于200L全自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)90小時(shí)；
c. 將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾除去菌體；
d. 將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取 液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以1% — 100%乙酸乙酯/石油醚為洗脫劑梯度洗脫。
e.收集8%—30%的乙酸乙酉旨/石油醚洗脫，純化得到Xyloketal A—F化合物. 本發(fā)明的化合物對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)氧化應(yīng)激影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)xyloketals能抑制AngII誘發(fā)的HUVECs胞內(nèi)&02生成增多，同時(shí)也可以誘發(fā)HUVECs胞內(nèi)NO生成，說明 這類化合物還具有強(qiáng)烈的胞內(nèi)抗氧化作用。因此，xyloketals系列化合物有可能通過上述有 益機(jī)制，影響心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)的血管重構(gòu)(vascularremodeling)。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1是預(yù)孵不同濃度Xyloketal B對(duì)KC1引起大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)收縮反應(yīng)的影響； 圖2是預(yù)孵Xyloketal B(20pM)禾卩L-NAME (lOO^M)對(duì)Phe誘發(fā)的去內(nèi)皮血管環(huán)收縮 反應(yīng)的影響；
圖3是Xyloketal B抑制Angll誘發(fā)的HUVECs的胞內(nèi)H202生成增多化合物B預(yù)孵 30min后，加Angll處理24小時(shí)，以H2DCF負(fù)載30分鐘后,激光共聚焦顯微鏡隨機(jī)攝取3 個(gè)視野(400x), Image J 1.37計(jì)算其平均熒光強(qiáng)度.(n=3， *vs control ,# v s group Aug II, PO.05,TTest);
圖4(A)是激光共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)檢測(cè)xyloketal B對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO生成作用。 yloketalB能濃度依賴性剌激內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成。圖下端藍(lán)色曲線示熒光基線(fluorescence baseline);
圖4(B)是L-NAME(100nM)預(yù)孵lOmin后，激光共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)檢測(cè)不同濃度 xyloketal B對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO生成作用。xyloketal B濃度依賴性刺激NO生成效應(yīng)被
L-NAME所抑制。圖下端藍(lán)色曲線示熒光基線(fluorescence baseline);
圖5是Xyloketal B HUVECs NO生成的影響。Xyloketal B刺激內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成， 而預(yù)孵L-NAME (lOOuM)后能抑制該效應(yīng)。(n=3來自17個(gè)細(xì)胞)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
化合物可以通過以下步驟制備得到 a a.真菌250S的種子培養(yǎng)
培養(yǎng)基按重量比為:葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，瓊脂1-1.5， 氯化鈉3-5,水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35°C培養(yǎng)5-7天；
d.真菌250S的發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5,酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3,瓊脂1-1.5， 氯化鈉3-5，水100，將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25-35'C靜置1-2個(gè)月，或者于200L全自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)90小時(shí)； e.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾除去菌體；
d.將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取 液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以1%_100%乙酸乙酯/石油醚為洗脫劑梯度洗脫。 e.收集8% —30%的乙酸乙酯/石油醚洗脫，純化得到Xyloketal A—F化合物.
Xyloketal A:無色塊狀晶體；mp 164-166 °C; [a]25D = -4.88。 (c 0.205, CHC13); IR (KBr) cm—1 : 2955,2930, 2905,2844， 1622， 1459, 1383, 1327， 1299, 1180, 1112， 1099, 1046, 1018， 931,868, 699; UV義max (CHC13) 222 (e 14 370), 224 (e 14 300), 228 (e 14 000), 272 (e 1274); NMR (500 MHz， CDCl3)cn.05 (d,J-6.5Hz, H-ll)， 1.50 (s, H-10), 1.89 (dd, ,/= 6.5， 11.0 Hz, H-6)， 2.14 (ddd， ■/= 6.5, 8.5, 8.5 Hz, H-5)， 2.64 (dd, /= 3.5， 18.0 Hz, H-7a), 2.85 ((!,■/= 18.0 Hz， H-7b), 3.53 (m, H-4a), 4.17 (m， H-4b); 13C NMR (125 MHz, CDC13) "16.1, 18.9, 22.9， 35.5， 47.6, 74.0, 98.9, 107.4, 149.8; FABMS w/z45 (M + 1), 456， 441， 397, 359, 315， 299, 259,245,217, 175, 163， 111, 83,55. Anal. Calcd for C27H3606: C, 71.05; H， 7.95. Found: C 71.13, H 7.74. Xyloketal B::白色粉狀固體；mp 84-86 。C;[a]25 D = +8.2。 (c 0.061, CHC13); IR (KBr) cm"
3356, 2962, 2935， 2891, 1622, 1508, 1454， 1342， 1190, 1117, 1069, 876, 818, 612; UV義max (CHC13) 215 (e 68 790), 228 (e 41 620), 274 (e 9827); 'H NMR (500 MHz, CDC13) c/1.05 (d, ■/= 7.0 Hz, H-11), 1.07 (d,,/=7.0 Hz，H-ll，)， 1.50 (s, H-10), 1.52 (s, H-IO，)， 1.88 (ddd,/= 1.0, 4.0, 6.5 Hz, H-6)， 1.91 (ddd,/= 1.0, 4.5, 7.0 Hz, H-6'), 2.13 (m， H-5), 2.14 (m， H-5,), 2.62 (dd,/= 6.5， 17.0 Hz, H-7), 2.80 (d, >/= 17.0 Hz, H-7)， 2.82 (d， /= 16.0 Hz, H-7，)， 2.69 (dd， ■/= 7.0， 16.0 Hz, H-7，)， 3.50 (dd, /= 8.5, 17.0, H-4)， 4.17 (dd, /= 7.5 Hz, H-4), 3.55 (dd， /= 8.5， 17.0 Hz, H陽(yáng)4'),4.10 (dd，>/= 6.5, 17.0 Hz, H-4，)， 6.13 (s, H-13)， 6.14 (s, H-14); 13CNMR (125 :隨z， CDC13) 15.9, 16.1, 18.4， 18.6, 22.8, 23.1， 35.5, 35.3, 47.5,47.8， 74.0, 74.0， 95.9， 98.5, 99.4, 107.4, 107.7, 152.0, 152.1, 153.2; FABMS附/z 347 (M + 1)， 346, 289,249, 205, 189, 151， 111,97， 83, 55. Anal, Calcd for C20H26O5: C, 69.36; H, 7.52, Found: C, 69.39; H, 7.35.
Xyloketal C::無色針狀結(jié)晶；mp > 260 °C; [a]25D = -52.4° (c 0.038, CHC13); IR (KBr) cm—1
3357, 3056，2982, 2953,2905, 1627, 1595, 1491, 1450, 1381, 1337，1223, 1191, 1113,1077, 987, 877， 810, 598， 569; UV義max (CHC13) 215 (e 15 060)， 227 (e 9758), 275 (e 1515); 'H NMR (500 MHz, CDC13) c/0.99 (<!， /= 6.0 Hz， H-11)， 1.37 (s， H-10), 1.86 (overlap, H-6), 1.89 (overlap, H-5), 2.65 (dd,>/= 6.0, 17.0 Hz， H-7), 2.76 ((!,■/= 17.0 Hz, H-7), 3.36 (t, J= 8.0 Hz, H-4), 3.96 (t，</= 8.0 Hz, H-4), 5.65 (s， H-14); 13C NMR (125 MHz, CDC13) 8.39, 15.4, 18.6, 22.8, 34.8, 47.1, 72.8， 95.8, 99.2， 106.6, 151.9, 153.0; FABMS m/z 347 (M +'), 346, 329, 289, 249， 205, 189, 176,149, 111, 89, 77, 57. Anal. Calcd forC20H26O5: C， 69.36; H, 7.52. Found: C, 68.81; H, 7.82. Xyloketal D::無色塊狀結(jié)晶；mp 111-113 °C; [a]25 D = -119.5° (c 0.113, CHC13); IR (KBr) cm-1 3479, 3416,3089， 3056, 2954, 2921, 2879, 1615，1492，1420, 1381, 1332，1261，1117，1070，1002, 854, 831, 804, 641， 609; UV義max (CHC13) 22017 450)， 228 (e 10 720)， 280 (e 18 040), 307 (e 8766); 'HNMR(500 MHz, CDCl3)dl.07 ((!，■/= 7.0 Hz， H-ll)， 1.53 (s, H-10), 1.98 (ddd,J= 1.0， 6.5, 11.0 Hz, H-6), 2.15 (m， H-5), 2,54 (s, H-17), 2.72 ((!(!, /= 6.5, 18.0 Hz, H-7)， 2.97
18.0 Hz, H-7), 3.57 (t, /= 8.0 Hz, H-4)， 4.20 (t, ■/= 8.0 Hz, H-4)， 6.36 (d, J = 9.0 Hz, H-15), 7.51 (d, J = 9.0 Hz, H-14), 13.09 (s, H-18); 13C NMR (125 MHz, CDC13) d 15.8, 18.0, 22.7, 26.1, 35.1， 47,0,74.3, 106.2, 108.3, 108.8, 113.2, 130.0, 159.5, 162.9,202.6; FABMSm/z263 (M + 1)，247，203, 177, 165, 147, 111, 97, 83, 55. Anal. Calcd for C15H1804: C, 68,70; H, 6.87. Found: C, 68.80;
H, 7.20.
Xyloketal E::無色塊狀結(jié)晶；mp 170-172 °C; [a]25D = +5.35° (c 0.374, CHC13); 'H NMR (CDC13) d 1.00 6.5 Hz， 3H), 1.04 ((!,■/= 6.5 Hz, 3H), 1.08 (d，>/= 6.5 Hz, 3H), 1.48 (s),
I. 50 (s, 3H)， 1.53 (s， 3H), 1.78 (m， H)， 1.84 (m, H), 1.90 (dd，J- 7， 12 Hz, H), 2.06 (m, H)， 2.17 (m， H), 2.38 (m, H)， 2.58 ((!(!， /= 17.0, 7.0 Hz， H)， 2.64 (dd, /= 17.0， 7.0 Hz， H), 2.81 (d, /= 17.0 Hz, H), 2.83 (d, ■/= 17.0 Hz， H)， 2.86 (dd, ■/= 6.0, 12.0 Hz, H), 3.38 (dd, ■/= 8.0, 10.5 Hz, H), 3.46 ((!， /= 8.5 Hz， H), 3.54 ( /= 8.5 Hz， H), 4.06 ((!(!,■/= 7.0, 10.5 Hz, H), 4.08 (t,J- 8.5 Hz, H), 4.16C8.5Hz， H)， 10.81 (s, OH), 13CNMR (CDC13) 15.5, 16.3, 16.2, 19.1， 18.7， 22.5,23.0， 28.4， 32.7, 35,4， 35.7, 47.0， 47.7, 49.3， 73.9 , 74.0， 74.2， 89.1， 98.2, 98.8， 107.3， 107.5, 110,8, 148.3, 150.2， 152.0; FABMS 445 (M + '), 444,429， 385, 347， 331, 287, 249; UV義max (CHC13) 216 (e 17 510), 226 (el 1 390), 273 (e 1450). Anal. Calcd forC20H26O5: C, 70.27; H, 8.11. Found: C, 70.53; H, 8.42.
Xyloketal F:無色針狀結(jié)晶，m.p. 160—162°C. [a]D25—50.6 (c = 0.2， CH3OH). IR (KBr): 1 = 3351, 2955,2929, 1615, 1460, 1381, 1340， 1311, 1207， 1115, 1076, 1004， 869 cm—、 UV/Vis (CH3OH): 義max (e) = 226 (15411)， 273 nm (2475). 'H NMR'H NMR (500 MHz, CDC1》d 1.02 (d， ■/= 6.5 Hz， H-11), 1.04 (d，>7=6.5 Hz,H-ll')， 1.48 (s， H-10), 1.58 (s, H-IO，)， 1.87 11.0 Hz，
H-6), 1.91 (dd,J-7.0， 11.0 Hz, H隱6，)，2.13 (m, H-5), 2.13 (m, H-5，)，2.60 ((!(!, /= 7.0, 18.0 Hz, H-7), 2.84 (d, /= 18.0 Hz, H-7), 2.86 (d， >/= 18.0 Hz， H-7，)， 2.72 (dd, /= 7.0， 18.0 Hz, H-7，)， 3.50 (t， /= 8.0, H-4)， 4.14 (t, /= 8.0 Hz, H-4), 3.61 (t， /= 8.0 Hz, H-4，)， 4.30 (t, /= 6.0 Hz, H-4，), 3.72 (s, H-14), 8.40 (s, OH); 13C NMR (125 MHz， CDC13) d 15,8, 15.9, 17.2, 19.2, 19.2， 22.3, 22.9,, 35.2， 35.3， 47.5， 47.5, 74.0， 74.5, 98.1， 100.1， 106.2, 107.5， 109.3, 148.1, 150,2, 152.5; FABMS (70eV) 705 (M + '). HRMS (EI) calcd. For [C41H52Om + Na]: w/2 = 727.3458， found 727.3279.
實(shí)施例2 Xyloketal B對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮反應(yīng)的影響 (一)材料與方法
1.藥物Xyloketal B，白色粉末.溶于DMSO,貯存濃度50mmol/L，保存于4。C備用。 2'雙腎雙夾法易卒中型腎血管性高血壓大鼠(RHRSP)模型制備
選用鼠齡60~90天，體重卯~120克SD大鼠按雙腎雙夾法制備RHRSP模型，術(shù)前12 小時(shí)禁食，10%水合氯醛(3g/Kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，常規(guī)消毒鋪巾，取腹正中縱 行切口，鈍性分離雙側(cè)腎動(dòng)脈，用內(nèi)徑為0.3mm的環(huán)形銀夾分別鉗夾雙側(cè)腎動(dòng)脈起始部， 并確定使腎動(dòng)脈置于銀夾的環(huán)形結(jié)構(gòu)中。手術(shù)過程中注意不要損傷腎臟、肝臟、乳糜池、腎 動(dòng)脈及腎靜脈。逐層關(guān)腹，術(shù)后腹腔注射青霉素鈉鹽4萬單位/100克體重預(yù)防感染。假手術(shù) 對(duì)照組不上銀夾，其余處理同實(shí)驗(yàn)組[2]。高血壓組和假手術(shù)組每組術(shù)前經(jīng)尾動(dòng)脈測(cè)收縮壓， 術(shù)后每周測(cè)血壓一次。 3.血壓測(cè)量
用RBP-1B型大鼠心率血壓儀測(cè)量血壓。儀器預(yù)熱30分鐘后，將大鼠放入預(yù)熱箱,預(yù)熱10~15
7分鐘，固定于滑動(dòng)式大鼠固定臺(tái)上，尾部固定在探頭的正中槽中，待大鼠安靜后測(cè)尾動(dòng)脈收 縮壓。每只鼠每次測(cè)三個(gè)值，取其平均值。術(shù)前三天測(cè)血壓為基礎(chǔ)血壓，術(shù)后每周測(cè)血壓一 次。
4.大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)實(shí)驗(yàn)
用頸椎脫臼法處死大鼠，迅速打開胸腔，小心分離胸主動(dòng)脈，截取胸主動(dòng)脈約1.5cm， 置于冰冷的盛有Kreb，s液的平皿中，去掉血管表面結(jié)締組織，制備成約3 mm長(zhǎng)的環(huán)型血管 標(biāo)本。去內(nèi)皮標(biāo)本用小鑷子穿入血管經(jīng)滾動(dòng)破壞形成，內(nèi)皮是否去除，用10nmol/LAch能 否引起舒張反應(yīng)來判定。將血管環(huán)懸掛于37 °C Krebs液的浴槽中，通入95%02和5%C02 的混合氣體，連接張力傳感器，記錄血管環(huán)張力的變化?；A(chǔ)張力為1 g，每15min換1次 新鮮Krebs液，經(jīng)平衡lh后，加入60 mmol/LKC1作用15 min誘導(dǎo)血管環(huán)收縮，激發(fā)舒縮 活性，然后沖洗使血管環(huán)張力恢復(fù)至基線，反復(fù)3次，穩(wěn)定30 min后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，記錄 血管環(huán)張力變化數(shù)值。張力變化以血管環(huán)收縮幅度變化相對(duì)值的百分比(％)來表示。 (二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. Xyloketals系列化合物在正常大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1)對(duì)Xyloketals系列化合物的篩選
取去內(nèi)皮的血管環(huán)，在正常Kreb，s液中，加入60mmol/LKCl，待血管環(huán)收縮達(dá)到穩(wěn)定 后，采用累積加藥方法，逐步增加受試化合物濃度(0.05 100pmol/L)。以加入化合物后血 管張力幅度與KC1誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化，制作受 試化合物舒張作用量效曲線。在篩選過的9個(gè)Xyloketals系列化合物中，迄今為止已發(fā)現(xiàn) XyloketalB，F(xiàn)能抑制KCl引起的大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮，并呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。其半數(shù) 有效濃度分別為15.2±4.6nmol/L(n=6),35.7±8.4nmol/L,其中Xyloketal B作用最強(qiáng)，在 20nmol/L對(duì)KC1誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮幅度可抑制約20 30%.因此選用Xyloketal B進(jìn)行 后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并同時(shí)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。
(2) Xyloketal B對(duì)KC1和苯腎上腺素(Phenylephrine, Phe)引起血管環(huán)收縮實(shí)驗(yàn)的影響 圖1所示，在內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的血管環(huán)上進(jìn)行比較，Xyloketal B抑制KC1引起內(nèi)皮 完整血管環(huán)收縮作用更為明顯；20nmol/LXyloketal B對(duì)KC1誘發(fā)的去內(nèi)皮和內(nèi)皮完整血管 環(huán)的最大收縮幅度可分別抑制約24和52%。這提示Xyloketal B抑制血管環(huán)收縮反應(yīng)機(jī)制 中存在內(nèi)皮依賴性成分。
取內(nèi)皮完整的血管環(huán)，在正常Kreb，s液中，加入lpmol/LPhe,待血管環(huán)收縮達(dá)到穩(wěn)定后，沖洗，平衡后，分次預(yù)孵不同濃度Xyloketal B(5 20nmol/L) 10min后，再加入lfmiol/L Phe后，以其引起血管張力最大幅度與初始Phe誘發(fā)的血管張力最大幅度之間的比率反映 Xyloketal B對(duì)Phe引起的血管收縮的影響。Xyloketal B能夠劑量依賴性抑制Phe引起的大 鼠主動(dòng)脈血管環(huán)收縮，其半數(shù)有效濃度為12.7±3.7nmol/L (n=7)。由于Phe是血管平滑肌a 受體激動(dòng)劑，可激活受體操縱C^+內(nèi)流，導(dǎo)致平滑肌收縮，上述結(jié)果提示Xyloketal B阻斷 受體操縱Ca"+內(nèi)流。如圖2所示，在20jimol/L， Xyloketal B對(duì)Phe誘發(fā)的內(nèi)皮完整血管 環(huán)的最大收縮幅度可抑制約45%，預(yù)先將內(nèi)皮完整血管環(huán)和NO合成酶(eNOs)抑制劑 L-NAME共孵，能夠取消Xyloketal B對(duì)KCl引起內(nèi)皮完整血管環(huán)收縮作用的抑制,甚至在此 條件下，Phe能引起更強(qiáng)的收縮。提示該類化合物可通過內(nèi)皮依賴機(jī)制(促血管內(nèi)皮NO釋 放)機(jī)制參與抑制血管環(huán)收縮。
所測(cè)試的Xyloketals系列化合物對(duì)離體血管環(huán)均無直接松弛作用。 (三)實(shí)驗(yàn)討論及化合物評(píng)價(jià)
正常生理情況下，血壓由一定血管張力維持，而血管張力主要由血管平滑肌決定。血管 環(huán)張力實(shí)驗(yàn)反映各種因素對(duì)血管舒縮活動(dòng)的調(diào)節(jié)和對(duì)血管平滑肌功能的影響，是檢測(cè)藥物能 否是否影響血管收縮功能的經(jīng)典篩選實(shí)驗(yàn)。
KCl可以激活電壓依賴性(^2+通道，導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流而引起血管平滑肌收縮。 Xyloketal B能明顯降低KCl誘導(dǎo)的大鼠離體胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮幅度，并呈一定量效關(guān)系。 提示降壓作用可能與通過影響血管平滑肌細(xì)胞Ca"調(diào)控，從而松弛血管平滑肌有關(guān)。
Phe能夠興奮血管平滑肌a受體，通過激活受體依賴的胞外C^+內(nèi)流(經(jīng)非電壓依賴 性C^+通道)增加和細(xì)胞內(nèi)Ca"也釋放引起胞內(nèi)C濃度增高。Xyloketal B能明顯降低Phe 誘導(dǎo)的大鼠離體胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮幅度，并呈一定量效關(guān)系。提示降壓作用可能與通過影 響血管平滑肌細(xì)胞受體操縱的Ca"調(diào)控，從而松弛血管平滑肌有關(guān)。
Xyloketal B抑制KCl引起內(nèi)皮完整血管環(huán)收縮作用比去內(nèi)皮血管環(huán)的更為明顯；提示 其抑制作用有內(nèi)皮依賴性成分的存在。血管內(nèi)皮能通過釋放NO，舒張血管平滑肌，參與對(duì) 血管舒縮活動(dòng)的調(diào)節(jié)[4]。 NO合成酶是NO合成釋放通路中的一關(guān)鍵步驟[4]，我們的實(shí)驗(yàn)應(yīng) 用NO合成酶抑制劑進(jìn)一步提示Xyloketal B抑制血管環(huán)收縮機(jī)制與促NO釋放相關(guān)。這一 實(shí)驗(yàn)也提示，Xyloketal B可能存在保護(hù)血管內(nèi)皮的藥理作用。眾所周知，內(nèi)皮細(xì)胞上不存在電壓依賴性<^2+通道，因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示這一系列化合物在血管上除作用 于電壓依賴性C^+通道之外，還可能作用于其他靶點(diǎn)，如NO釋放信號(hào)通路。這些藥理作 用對(duì)多種心血管疾病防治具有極大的潛在益處(如逆轉(zhuǎn)高血壓及其并發(fā)癥過程中的血管重 構(gòu))，值得進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索。
實(shí)施例三Xyloketal B對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)氧化應(yīng)激影響的初步研究 (一)材料與方法
1. 藥物Xyloketal B ，白色粉末.溶于DMSO，貯存濃度50mmol/L,保存于4° C備用。
2. 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)分離、培養(yǎng)及鑒定參照J(rèn)affe法并加以改良。取健康產(chǎn)婦 分娩的新生兒臍帶30cm左右，于無菌條件下剪去血腫或凝血塊阻塞部分，用無菌的PBS緩沖 液洗凈臍靜脈管腔，然后注入0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)混合消 化液(1:1),使血管腔充盈，37'C消化15min后，加入血清以終止酶反應(yīng)，收集消化液，離
心后用適量HUVECs全培養(yǎng)液(M199培養(yǎng)基含20XFBS， 75昭.mL ECGs， 2 mmol七L一谷
氨酰胺，青霉素100U'mL1，鏈霉素100U'mL—1，肝素100ng'mL—1)制成細(xì)胞懸液，按lxl()6 個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37°C 、 5%C02 , 95%02) 。 12h后換液，
以后每隔兩天換液一次，約2 5天后細(xì)胞融合，呈鋪路石樣鑲嵌式單層排列，此時(shí)可傳代。 細(xì)胞鑒定用間接免疫熒光法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞VI0因子相關(guān)抗原；取3 5代增殖旺盛的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn) 行實(shí)驗(yàn).
3. 內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)過氧化氫的測(cè)定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以lx105接種于Petric皿，培養(yǎng)18小時(shí) 后，在無血清培養(yǎng)基中饑餓6小時(shí)，分別加入Xyloketal B(IO. 20, 40 ^M)預(yù)孵30分鐘后,予血管 緊張素II (2nM)作用24小時(shí)，PBS洗兩遍后，加入H2DCF (sigma， 10pM)在37'C負(fù)載20 分鐘，然后用PBS洗兩遍，在激光共聚焦顯微鏡以FITC波長(zhǎng)參數(shù)測(cè)定熒光強(qiáng)度。每組隨機(jī)獲 取3個(gè)視野(200x)， Image J1.37計(jì)算圖像的熒光強(qiáng)度。
4. 內(nèi)皮細(xì)胞NO生成的測(cè)定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以lx105接種于Petric皿，培養(yǎng)18小時(shí)后，在 無血清培養(yǎng)基中饑餓6小時(shí)，luMDAF-FMDA,37'C負(fù)載20min， PBS洗2遍后，在預(yù)孵或者 不預(yù)孵L一NAME,依次加入Xyloketal B(20,40,60nM)，在激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)以 FITC波長(zhǎng)參數(shù)，間隔5s掃描一次，動(dòng)態(tài)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化。(二) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. Xyloketal B抑制AngII誘發(fā)的HUVECs胞內(nèi)H202生成增多
如圖3B所示，AngII 2pM可引起HUVEs胞內(nèi)H2DCF熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(增強(qiáng)約350 % ),表明胞內(nèi)H202生成明顯增多。預(yù)先孵育10 40 nM Xyloketal B后,發(fā)現(xiàn)Xyloketal B可 劑量依賴性抑制AngII引起的胞內(nèi)H202生成增多，如圖3C-F所示，在10nM,20nM，40nM其 抑制率分別為38% ， 68% ， 95% 。40pM Xyloketal B幾乎完全抑制2pM AngII誘發(fā)的HUVECs 胞內(nèi)H202生成增多。溶劑DMSO對(duì)于H2DCF熒光無干擾作用。
2. Xyloketal B誘發(fā)HUVECs胞內(nèi)NO生成
在負(fù)載了指示胞內(nèi)NO生成的熒光染料(DAF-FM DA)的HUVECs中加入20jiM,40jiM， 60 Xyloketal B,可檢測(cè)到給藥后DAF-FM DA熒光隨劑量增加而明顯增強(qiáng)(如圖4A所 示)，提示Xyloketal B有促胞內(nèi)NO生成的作用。預(yù)孵NO合成酶(eNOs)抑制劑L-NAME (100nM)后，則Xyloketal B劑量依賴性增強(qiáng)熒光的效應(yīng)被抑制(如圖4B所示)，提示Xyloketal B劑量依賴性地誘發(fā)HUVECs胞內(nèi)NO生成的作用是特異性的。圖5A-C示，給予20jiM Xyloketal B后，DAF-FM DA熒光隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，給予5min后即可觀測(cè)到熒 光明顯增強(qiáng)，15min后熒光最為顯著，提示Xyloketal B可時(shí)間依賴性地誘發(fā)HUVECs胞內(nèi) NO生成增多。圖5D-F示，如預(yù)孵lOO^M L-NAME后，，則Xyloketal B時(shí)間依賴性誘發(fā) HUVECs胞內(nèi)NO生成的效應(yīng)可被完全抑制，提示Xyloketal B時(shí)間依賴性地誘發(fā)HUVECs 胞內(nèi)NO生成的作用是特異性的。
溶劑DMSO對(duì)于DAF-FM DA熒光無干擾作用。
(三) 實(shí)驗(yàn)討論及化合物評(píng)價(jià)
上述研究提示Xyloketal B具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞NO生成，并抑制血管活性物質(zhì)Ang II誘發(fā) 的胞內(nèi)11202生成增多的藥理作用。
高血壓早期，血壓升高即可直接引發(fā)血管內(nèi)皮損傷[2]。其典型病理生理改變包括血管內(nèi) 皮細(xì)胞損傷或凋亡，血管內(nèi)皮合成一氧化氮(NO)等舒張血管因子減少而合成AngII等縮 血管因子增多，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能下降；縮血管因子促血管收縮和促血管平滑 肌增殖效應(yīng)增強(qiáng)，引發(fā)血管重構(gòu)；破損的血管內(nèi)皮還觸發(fā)炎癥反應(yīng)和血栓形成等過程；由血 管內(nèi)皮損傷引發(fā)的上述病理過程啟動(dòng)和促進(jìn)了多種高血壓并癥合的發(fā)生發(fā)展。高血壓的發(fā)生 發(fā)展過程伴隨著細(xì)胞內(nèi)高氧化應(yīng)激狀態(tài)，即氧自由基生成增加和(或)清除能力降低，導(dǎo)致活 性氧簇(reactive oxygen species, ROS)在細(xì)胞內(nèi)和組織間蓄積，引起細(xì)胞氧化損傷。血管內(nèi) 皮細(xì)胞損傷過程中胞內(nèi)生成的ROS包括過氧化氫(H20x)。
11以往研究常以2nMAnglI誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作為研究血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的模型。本 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2nM AngII誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡時(shí)伴隨的胞內(nèi)生成11202增多可被Xyloketal B完全抑 制，提示XyloketalB有可能通過胞內(nèi)抗氧化機(jī)制，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或凋亡。由于血管 內(nèi)皮細(xì)胞是血管抵御心血管疾病危險(xiǎn)因子的初始屏障，而氧化應(yīng)激介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷 在高血壓、糖尿病等多種心血管疾病早期血管病變中起關(guān)鍵作用[3， 4]， Xyloketal B在血管 內(nèi)皮細(xì)胞上顯現(xiàn)的胞內(nèi)抗氧化作用值得進(jìn)一步確證其是否具有血管內(nèi)皮保護(hù)作用。下一步實(shí) 驗(yàn)將確定這類化合物對(duì)AngII誘導(dǎo)的HUVECs凋亡是否有影響,以及闡明其胞內(nèi)抗氧化和抑 制細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
另外，結(jié)合血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，xyloketals系列化合物也能影響血管平滑肌細(xì)胞的生理和病理 功能。
權(quán)利要求
1.鹿角縮酮類化合物A-F(xyloketal A-xyloketal F)化合物的結(jié)構(gòu)式
2. 權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟a. 真菌2508的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，瓊脂1-1.5，氯 化鈉3-5,水100，以上數(shù)值均為質(zhì)量比。制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35°C培 養(yǎng)5-7天;b. 真菌250S的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖5-15,酵母提取物l-4，蛋白胨0.5-4,氯化鈉3-5,水100， 將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25-35'C靜置l-2個(gè)月，或者于200L全自 動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)90小時(shí)；c. 將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾除去菌體；d. 將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取 液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以1% — 100%乙酸乙酯/石油醚為洗脫劑梯度洗脫。e.收集8%—30%的乙酸乙酯/石油醚洗脫，純化得到XyloketalA—F化合物.
3. 權(quán)利要求l所述的化合物在制備胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明從南海內(nèi)生真菌鹿角菌Xyloraria sp.2508中已分離鑒定并篩選到一系列鹿角縮酮(xyloketal A-F)類化合物中，發(fā)現(xiàn)該類化合物對(duì)某些心血管疾病具有良好的治療前景，本發(fā)明公開了該類化合物在高血壓預(yù)防治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的化合物對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)氧化應(yīng)激有影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)xyloketals能抑制AngII誘發(fā)的HUVECs胞內(nèi)H₂O₂生成增多，同時(shí)也可以誘發(fā)HUVECs胞內(nèi)NO生成，說明xyloketals系列化合物具有強(qiáng)烈的細(xì)胞內(nèi)抗氧化作用，并有可能通過上述有益機(jī)制，發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮保護(hù)作用，并影響與心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的血管重構(gòu)(vascular remodeling)過程。
文檔編號(hào)A61P9/00GK101580511SQ20081002812
公開日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2008年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月15日
發(fā)明者捷 劉, 龐冀燕, 林永成, 王冠蕾, 煜 解, 艷 錢, 陳文亮 申請(qǐng)人:中山大學(xué)