專利名稱：：靈芝轉(zhuǎn)化麥秸生產(chǎn)含靈芝酸飼料的方法及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物發(fā)酵及飼料領域，具體的說本發(fā)明涉及通過藥用真菌靈芝轉(zhuǎn)化麥秸生產(chǎn)含有靈芝酸飼料的方法，所述的含靈芝酸飼料，或以這種飼料作為原料生產(chǎn)的靈芝酸可以用飼料添加劑具有多種生物學功能，可用于提高動物肌體免疫力、增強詞養(yǎng)動物抗病毒的能力。以這種飼料作為原料生產(chǎn)的靈芝酸也可作為生產(chǎn)具有調(diào)節(jié)血糖血脂，預防心腦血管疾病或支氣管炎的藥物或保健食品。
背景技術：
：隨著人們生活質(zhì)量的提高，越來越多的人們開始重視畜禽產(chǎn)品的安全，發(fā)展健康養(yǎng)殖、保證動物健康是一項復雜的系統(tǒng)工程，涉及許多方面問題。過去為了增強動物疾病抵抗力，都是依靠添加合成的化學物質(zhì)，但是人工合成的化學物質(zhì)不易被動物降解，殘留于動物體內(nèi)，最終影響人類。如何解決這一問題呢？從營養(yǎng)供給方面著手是解決動物健康問題唯一有效的辦法。靈芝，是一種稀有野生名貴食用菌和藥用菌。現(xiàn)代營養(yǎng)成分分析結(jié)果表明靈芝營養(yǎng)成分豐富且營養(yǎng)價值高，含有靈芝酸、氨基酸、脂肪酸、常量及微量元素、維生素c、E、胡蘿卜素及生物活性多糖。近年來國內(nèi)外對靈芝的研究主要集中于它的馴化栽培、營養(yǎng)成分分析、液體培養(yǎng)以及菌絲體內(nèi)多糖及藥效等方面。清華大學段明星(清華大學學報.1999,38:56-58)。等人進行了靈芝纖維酶的性質(zhì)和純化研究，證明了靈芝真菌能降解秸稈的可能性；南京理工大學孫東平(南京理工大學.2006，30:356-360)。對靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的提取及性質(zhì)分析進行了研究，證明了靈芝能夠產(chǎn)纖維素酶，從而進一步證實了靈芝真菌能降解秸稈，但是他們沒有對靈芝利用纖維素酶轉(zhuǎn)化秸稈進行深入的研究。上海市中藥研究所鄧海林(時珍國醫(yī)國藥.20065(1):141-143)。報道了靈芝能防止腫瘤的發(fā)生和抑制腫瘤的生長；靈芝實體、菌絲體、抱子粉、及靈芝水提液、多糖、蛋白均有免疫調(diào)節(jié)作用；靈芝有明顯的抗衰老作用；靈芝有鎮(zhèn)靜催眠的作用芝對大鼠血管平滑肌細胞有抗脂質(zhì)過氧化作用，其抗動脈粥樣硬化的作用機制可能與其對抗活性氧引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應，增強體內(nèi)抗氧化酶的活性有關；靈芝提取物對流感病毒FM1株感染小鼠的保護作用(廣州中醫(yī)大學學報，1998，15(3):205207)。已經(jīng)公布的550項靈芝專利主要涉及靈芝子實體提取，靈芝孢子深度加工，以及以葡萄糖為碳源，靈芝液體培養(yǎng)生產(chǎn)靈芝酸和多糖等技術，本發(fā)明與上述文獻或相關專利區(qū)別在于本發(fā)明側(cè)重于靈芝轉(zhuǎn)化秸稈資源，靈芝真菌轉(zhuǎn)化秸稈產(chǎn)生的靈芝酸的提取及其被用于生產(chǎn)詞料添加劑以及作為生產(chǎn)具有調(diào)節(jié)血糖血脂，預防心腦血管疾病或支氣管炎的藥物或保健食品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供了一種以麥秸為原料，采用靈芝進行固態(tài)發(fā)酵制備的含靈芝酸詞料的方法，得到的飼料中含有靈芝酸、多糖類等化合物。本發(fā)明所使用的靈芝菌種可選用任意一種靈芝菌種，例如江蘇、河南或常白山的野生靈芝經(jīng)常規(guī)組織分離得到的菌種。本發(fā)明含有靈芝酸的功能性詞料的發(fā)酵工藝包括以靈芝為出發(fā)菌株，進行液體搖瓶培養(yǎng)、一級種子罐培養(yǎng)和固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，得到含有靈芝酸的功能性飼料，以及以這種含靈芝酸飼料作為原料用作動物飼料的添加劑或用于制備具有調(diào)節(jié)血糖血脂，預防心腦血管疾病或支氣管炎的藥物或保健食品。更具體地，本發(fā)明涉及靈芝以麥秸為原料進行培養(yǎng)的發(fā)酵工藝，該工藝包括以下步驟[l]在本發(fā)明所述的發(fā)酵工藝中，在進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)之前，首先將靈芝的斜面菌種接入新配制的斜面培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度2040°C，培養(yǎng)時間48150小時，其中所述的斜面培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術中常用的斜面培養(yǎng)基，例如常用的是PDA培養(yǎng)基，此類培養(yǎng)基的組成和所用可參見諸葛健，王正祥，工業(yè)微生物實驗技術手冊，1994:P367;[2]將步驟(1)的斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于204(TC進行液體搖瓶培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速90200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間24150小時。其中所述培養(yǎng)基組成為(克/升》麥秸530，玉米粉1025，黃豆餅粉310，KH2P0416，MgS0414，起始pH值為5.08.0;[3]將步驟(2)得到的液體搖瓶培養(yǎng)的菌種按510%(Wv)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有一級種子培養(yǎng)基的種子罐中進行培養(yǎng)，溫度2040°C，種子罐壓力0.05Mpa，攪拌速率60200轉(zhuǎn)/分鐘，通風量l:0.3l:1.5v/v/m，培養(yǎng)時間24150小時。其中所述的種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)麥秸510，玉米粉1025，黃豆餅粉310，KH2P0416，MgS04l4，消泡劑0.10.8，起始pH值為5.08.0;[4]將上述種子罐中的菌種按520%(v/w)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵床中進行培養(yǎng)，溫度204(TC，堆厚度為630cm，發(fā)酵罐培養(yǎng)時間90180小時。其中所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成及其比例為麥秸粉2580，玉米粉520，麩皮520，黃豆餅粉310，KH2P0414，MgS04l4，CaC030.51，料7K比1:2.5，起始pH值為5.07.0。所得到的固體培養(yǎng)物即為靈芝轉(zhuǎn)化麥秸生產(chǎn)的含靈芝酸飼料。該詞料為淡黃色、有一定香味，其中含有菌絲體，該發(fā)酵產(chǎn)物中靈芝酸的含量可達0.31.5克/升。本發(fā)明的另一目的是提供了一種以麥秸為原料通過靈芝菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)得到的含靈芝酸飼料用于制備靈芝酸的用途。其特征是用10倍95%乙醇，85'C水浴回流4小時，重復4次，乙醇提取液冷卻后合并過濾，真空濃縮至干，得到凈膏。凈膏用10倍體積氯仿溶解，氯仿提取物用水萃取4次，過濾，真空濃縮至原體積1/10，緊接著用飽和碳酸氫鈉溶液萃取5次，碳酸氫鈉層用6mol/L鹽酸調(diào)pH至23之間，產(chǎn)生沉淀，所得沉淀用氯仿溶解，濃縮至干得粗靈芝酸。由此方法獲得的靈芝酸可用于飼料添加劑，或生產(chǎn)具有調(diào)節(jié)血糖血脂，預防心腦血管疾病或支氣管炎的藥物或保健食品。具體的，本發(fā)明制備靈芝酸的方法包括以下步驟(1)稱取上述含靈芝酸的飼料烘干，用90100%乙醇作為提取溶劑，料液比為1:5~15、浸提溫度50卯。C、浸提時間l~6h，浸提3次，冷卻后過濾，合并濾液，真空濃縮至干得浸膏。(2)浸膏用氯仿溶解，反復用水萃取38次，取氯仿層，過濾，濃縮至原體積的I/10左右，得到濃縮液。(3)用飽和碳酸氫鈉溶液萃取上述濃縮液2~8次，取碳酸氫鈉層，用6mol/L鹽酸調(diào)pH至23之間，產(chǎn)生沉淀。(4)所得沉淀用氯仿溶解，濃縮至干得粗靈芝酸，該靈芝酸的提取方法，其中靈芝酸的總收率可達0.31.2毫克/克干飼料，所獲得的靈芝酸純度在3065%。本發(fā)明經(jīng)試驗研究發(fā)現(xiàn)應用本發(fā)明的發(fā)酵方法生產(chǎn)的含靈芝酸飼料及以此飼料為原料提取的靈芝酸，具有顯著增加試驗動物(小鼠)體重、機體免疫力和抗病毒能力。應用本發(fā)明的靈芝固體發(fā)酵的方法，可以大規(guī)?；蚬I(yè)化轉(zhuǎn)化麥秸稈生產(chǎn)含靈芝酸飼料，以及用這種飼料作為原料提取靈芝酸，用作飼料添加劑或作為的藥物組合物。由于該飼料或其提取物在生產(chǎn)過程中沒有添加任何化工原料，所產(chǎn)生活性成分靈芝酸也是靈芝菌種代謝產(chǎn)物，因此沒有任何毒副作用，不會在動物體內(nèi)殘留，并為該飼料的應用開創(chuàng)了廣闊的前景。具體實施方式為了進一步闡述本發(fā)明的技術方案所涉及的材料及工藝，給出了下述實施例。但這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1靈芝菌種的制備取江蘇野生的正在生長的靈芝子實體，用75%乙醇進行子實體表面消毒后，移入超凈工作臺，紫外燈照射20min。將解剖刀在酒精燈火焰上灼燒后放人無菌水中降溫，確保解剖刀溫度不會損傷子實體組織。切取菌蓋邊緣的生長組織，黃豆大小的小塊，切割時不能切透子實體表面組織。用無菌鑷子接人試管斜面培養(yǎng)基(即為PDA培養(yǎng)基)，每種組織各接10支，2528X:暗培養(yǎng)，每天定時觀測菌絲生長污染情況，當長至4IO天時，用PDA培養(yǎng)基試管斜面轉(zhuǎn)接。實施例2含靈芝酸飼料的制備1、在新配制的土豆培養(yǎng)基(諸葛健，王正祥，工業(yè)微生物實驗技術手冊，1994-P367)中接入實施例1得到的靈芝菌種，培養(yǎng)溫度27。C，待菌絲體長滿斜面后，用接種鏟將斜面菌種切成5X5mm大小，接8塊到裝有60mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于27'C、150轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)72小時。其中所述搖瓶培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升)麥秸30，玉米粉10，黃豆餅粉IO，KH2P041,MgS04l，起始pH值為7.0。2、將上述培養(yǎng)的菌種1L接入裝有15L—級種子培養(yǎng)基的25L種子罐中，種子罐中發(fā)酵液的總體為48.5L;維持罐溫27'C，罐壓0.05MPa，攪拌速率120轉(zhuǎn)每分鐘，通風量1:0.6Wv/m，培養(yǎng)發(fā)酵時間85小時。其中種子罐中的一級種子培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升)麥秸30，玉米粉IO，黃豆餅粉3，KH2P041，MgS04l，消泡劑O.l，起始pH值為7.0。4、將15L—級種子菌種接入裝有150Kg固體培養(yǎng)基的4r^發(fā)酵床中。維持溫度27'C，通風量0.5:l;lg/Wm(通氣量/料重/時間)，發(fā)酵時間144小時。其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成及其比例為麥秸120，玉米粉5，麩皮17.5，黃豆餅粉5，KH2P041，MgS041，CaC030.5，料水比1:2.5，起始pH值為5.0。接種量10%(v/w)，培養(yǎng)溫度30。C，培養(yǎng)時間卯小時。經(jīng)上述步驟后得到靈芝發(fā)酵液，該含靈芝酸飼料桔黃色，具有香味，靈芝酸含量為0.4g/L，該發(fā)酵液菌絲體經(jīng)水洗、烘干，得干菌絲體，重為18Kg。實施例3含靈芝酸詞料的制備此實施例所用的菌種為實施例1得到的菌種。1、在新配制的PDA培養(yǎng)基(諸葛健，王正祥，工業(yè)微生物實驗技術手冊，1994:P367)中接入組織分離法得到的靈芝菌種，培養(yǎng)溫度32'C，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有75mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30°C、100轉(zhuǎn)每分鐘搖床培養(yǎng)172小時。其中所述搖瓶培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升)麥秸20，玉米粉15，黃豆餅粉3，KH2P046，MgS044，起始pH值為8.0。2、將搖瓶培養(yǎng)的菌種1500mL接入裝有22.5L—級種子培養(yǎng)基的50L種子罐中，培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)麥秸20，玉米粉IO，黃豆餅粉3，KH2P046，MgS044，消泡劑0.8，起始pH值為7.0。維持罐溫25'C，罐壓0.05MPa，攪拌速率90轉(zhuǎn)每分鐘，通風量1:1v/v/m，發(fā)酵時間90小時。4、將22.5L—級種子菌種接入裝有400Kg固體培養(yǎng)基的13n^發(fā)酵床中。維持溫度27'C，通風量0.5;l;lg/v/m(通氣量/料重/時間)，發(fā)酵時間144小時。其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成及其比例為含大量纖維素物質(zhì)粉末335Kg，玉米粉8Kg，麩皮25Kg，黃豆餅粉15Kg，KH2P047Kg，MgS047Kg,CaC0310Kg，料水比1:2.5，起始pH值為5.0。接種量10%(v/w)，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間90小時。實施例4含靈芝酸飼料制備此實施例所用的菌種為實施例1得到的菌種。1、在新配制的PDA培養(yǎng)基(諸葛健，王正祥，工業(yè)微生物實驗技術手冊，1994:P367)中接入實施例1得到的靈芝菌種，培養(yǎng)溫度325'C，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有750mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，25°C、120轉(zhuǎn)每分鐘搖床培養(yǎng)136小時。其中液體培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升)麥秸10，玉米粉15，黃豆餅粉8，KH2P045，MgS044，起始pH值為5.0，2、將上述搖瓶菌種接入裝有15L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量為每1L搖瓶種子，25°C、120轉(zhuǎn)每分鐘搖床培養(yǎng)130小時。培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)麥秸20，玉米粉15，黃豆餅粉3，KH2P042，MgS04l，消泡劑0.8，起始pH值為7.0。維持罐溫25°C，罐壓0.05MPa，攪拌速率卯轉(zhuǎn)每分鐘，通風量1:0.8v/v/m，發(fā)酵時間130小時。3、將15L上述種子菌種接入裝有200Kg固體培養(yǎng)基中，置于4r^發(fā)酵床上；維持溫度25'C，通風量1:0.8v/v/m，發(fā)酵時間180小時得到含靈芝酸伺料，其發(fā)酵培養(yǎng)基組成及其比例為麥秸50，玉米粉IO，麩皮15，黃豆餅粉8，KH2P042，MgS04l，CaC031，起始pH值為6.0。將上述三個實施例中蛋白質(zhì)和靈芝酸含量分析稱取上述實施例制備得到含靈芝酸的飼料烘干，用10倍95%乙醇，85。C水浴回流4小時，重復4次，乙醇提取液冷卻后合并過濾，真空濃縮至干，得到凈膏。凈膏用10倍體積氯仿溶解，氯仿提取物用水萃取4次，過濾，真空濃縮至原體積1/10，緊接著用飽和碳酸氫鈉溶液萃取5次，碳酸氫鈉層用6mol/L鹽酸調(diào)pH至23之間，產(chǎn)生沉淀，所得沉淀用氯仿溶解，濃縮至干得粗靈芝酸。蛋白質(zhì)含量分析采用Folin—酚測定法(李建武陳麗蓉余瑞元等.生物化學實驗原理和方法，北京大學出版社，1994)三次實施例結(jié)果見表1，表中數(shù)據(jù)顯示應用本發(fā)明工藝生產(chǎn)的含靈芝酸飼料蛋白質(zhì)含量和靈芝酸含量達到本發(fā)明的要求。表l:不同實施例產(chǎn)品中蛋白質(zhì)和粗靈芝酸含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>靈芝酸對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用試驗。實驗動物昆明小白鼠，雄性，體重為16-20g，由中科院上海實驗動物中心提供，68周齡，共40只,連續(xù)飼喂30天。三個實施例制得的含靈芝酸飼料或靈芝酸粗品飼喂動物試驗結(jié)果(下表)(PO.05或PO.01)。表2中結(jié)果顯示飼喂本發(fā)明生產(chǎn)的含靈芝酸飼料，實驗動物體重顯著增加，機體免疫各項指標(巨噬細胞活性、NK細胞活性、T淋巴細胞轉(zhuǎn)化OD差值以及INF—a和IL_2)均顯著增加，說明本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物具有顯著提高機體免疫功能。表2:不同實施例產(chǎn)品飼喂動物試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注:與對照組比*:p<0.05以上已詳細描述了本發(fā)明的實施方案，對本領域技術人員來說很顯然可以做很多改進和變化而不會背離本發(fā)明的基本精神。所有這些變化和改進都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。權利要求1、靈芝轉(zhuǎn)化麥秸生產(chǎn)含靈芝酸飼料的方法，其特征在于以靈芝為出發(fā)菌株，以麥秸為原料進行液體搖瓶培養(yǎng)、種子罐擴大培養(yǎng)和固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，得到富含靈芝酸的功能性飼料，其中所述的液體搖瓶培養(yǎng)工藝為將斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶培養(yǎng)基的三角瓶中，于溫度20～40℃，轉(zhuǎn)速60～200轉(zhuǎn)/分鐘搖床，培養(yǎng)24～150小時；其中所述的種子罐培養(yǎng)工藝為搖瓶菌種按5～10％v/v的接種量轉(zhuǎn)接入裝有液體種子罐擴大培養(yǎng)基的種子罐中進行擴大培養(yǎng)，溫度20～40℃，攪拌轉(zhuǎn)速60～200轉(zhuǎn)/分鐘，通風量1∶0.3～1∶1.5v/v/m，培養(yǎng)時間24～150小時；其中所述的固態(tài)發(fā)酵工藝為種子罐菌種按5～20％v/w的接種量轉(zhuǎn)接入裝有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵床上進行固態(tài)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20～40℃，培養(yǎng)基厚度為6～30cm，培養(yǎng)時間90～180小時；其中所述液體搖瓶培養(yǎng)基組成為，單位為克/升麥秸5～30，玉米粉10～25，黃豆餅粉3～10，KH2PO41～6，MgSO41～4，起始pH值為5.0～8.0；其中所述種子罐擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為，單位為克/升麥秸5～30，玉米粉10～25，黃豆餅粉3～10，KH2PO41～6，MgSO41～4，消泡劑0.1～0.8，起始pH值為5.0～8.0；其中所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成及其比例為麥秸粉25～80，玉米粉5～20，麩皮5～20，黃豆餅粉3～10，KH2PO41～4，MgSO41～4，CaCO30.5～1，料水比1∶2.5，起始pH值為5.0～7.0，所得到的固體發(fā)酵物即為含靈芝酸飼料。2、根據(jù)權利要求1所述的方法制備得到的含靈芝酸詞料用于制備靈芝酸的用途，其特征是稱取靈芝轉(zhuǎn)化麥秸生產(chǎn)的含靈芝酸的詞料用10倍95%乙醇，85。C水浴回流4小時，重復4次，乙醇提取液冷卻后合并過濾，真空濃縮至干，得到凈膏。凈膏用IO倍體積氯仿溶解，氯仿提取物用水萃取4次，過濾，真空濃縮至原體積1/10，緊接著用飽和碳酸氫鈉溶液萃取5次，碳酸氫鈉層用6mol/L鹽酸調(diào)pH至23之間，產(chǎn)生沉淀，所得沉淀用氯仿溶解，濃縮至干得粗靈芝酸。3、根據(jù)權利要求2所述的靈芝酸的用途，其特征是用作動物飼料的添加劑或用于制備具有調(diào)節(jié)血糖血脂，預防心腦血管疾病或支氣管炎的藥物或保健食a全文摘要本發(fā)明涉及生物飼料工業(yè)領域，具體的說本發(fā)明涉及藥用真菌靈芝轉(zhuǎn)化麥秸生產(chǎn)的含靈芝酸飼料的方法，以及用該方法生產(chǎn)的功能性飼料的功效。本發(fā)明以靈芝為出發(fā)菌株，以麥秸為原料進行液體搖瓶培養(yǎng)、種子罐擴大培養(yǎng)和固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，得到富含靈芝酸的功能性飼料。本發(fā)明飼料為淡黃色粉末，具有香味，飼料中粗靈芝酸含量高達0.06～0.3％，蛋白質(zhì)12～14％?？捎米鲃游镲暳系奶砑觿┗蛴糜谥苽渚哂姓{(diào)節(jié)血糖血脂，預防心腦血管疾病或支氣管炎的藥物或保健食品。本發(fā)明不僅為深度開發(fā)利用靈芝打開了一條嶄新的途徑，而且為開發(fā)功能性飼料提供理想的生物添加劑。文檔編號A61P3/06GK101326954SQ20081002088公開日2008年12月24日申請日期2008年7月30日優(yōu)先權日2008年7月30日發(fā)明者何林富,崔鳳杰,張志才,黃達明申請人:江蘇大學