專利名稱：神經(jīng)延長促進(jìn)劑及延長抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)延長促進(jìn)劑以及延長抑制劑。具體地說，涉及識別 水痘-帶狀皰滲病毒立即早期抗原的抗體用于神經(jīng)突的延長促進(jìn)、神經(jīng)再 生或神經(jīng)突的延長抑制的用途。
背景技術(shù)：
腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是被認(rèn)識到在發(fā)育中和成人中，對存 活、分化、突觸可塑性以及末梢和中樞神經(jīng)元的選擇延長發(fā)揮重要作用 的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員(專利文獻(xiàn)1,非專利文獻(xiàn)1、 2)。 BDNF的 cDNA編碼由247個氨基酸殘基構(gòu)成的前體蛋白質(zhì)。前體蛋白質(zhì)具有信 號肽和前蛋白，切斷它們生成119個氨基酸殘基的成熟BDNF。生物活 性的BDNF (27kDa)為通過強(qiáng)的疏水性相互作用由兩個相同亞單位形成 的二聚物。熟知BDNF與突觸的長期增強(qiáng)、學(xué)習(xí)以及記憶等頻率依賴性 可塑性機(jī)理相關(guān)。BDNF與形成臨床上的痛覺過敏癥的原因的可塑性相 關(guān)(非專利文獻(xiàn)3)。
水痘-帶狀皰滲病毒(VZV)感染導(dǎo)致急性小腦共濟(jì)失調(diào)癥(ACA)、帶 狀皰滲后神經(jīng)痛(PHN)等神經(jīng)學(xué)上的并發(fā)癥。ACA為伴隨水痘感染的最 經(jīng)常產(chǎn)生的神經(jīng)學(xué)上的并發(fā)癥。估計小于15歲的幼兒的每4000病例中 產(chǎn)生1例。ACA在發(fā)滲開始數(shù)日前到3周后出現(xiàn)，直至完全恢復(fù)持續(xù)2~ 4周。帶狀皰滲在沿著伴隨有感覺異常的生皮節(jié)的區(qū)域分布中出現(xiàn)水皰 滲， 一般群體的年發(fā)病率在英國每1000人為3.4(非專利文獻(xiàn)4)。 PHN 為帶狀皰疹的頻率最高的并發(fā)癥，7~35%的患者(60歲以上的患者中超 過50%)發(fā)病。PHN與急性神經(jīng)炎伴隨的疼痛不同，并發(fā)無間斷的持續(xù) 疼痛、電擊痛和異常性疼痛(非專利文獻(xiàn)5)。雖然PHN的病理生理學(xué)還 不明確，但是兩神經(jīng)學(xué)上的并發(fā)癥在病毒感染的恢復(fù)期或之后出現(xiàn)暗示 對于VZV的免疫應(yīng)答與它們的致病性過程相關(guān)。
專利文獻(xiàn)1:日本特開平5-328974號公報
非專利文獻(xiàn) 1: Nagappan G. Lu B., Trends in Neurosciences, 28:464-471,2005非專利文獻(xiàn)2: Bramham CR et al., Progress in Neurology, 76:99-125,
2005
非專利文獻(xiàn)3: Coull, J.A.M. et al., Nature 438:1017-1021, 2005
非專利文獻(xiàn)4: Johnson, R. W. et al., BMJ 326:748-750, 2003
非專利文獻(xiàn)5: Donald H, Gilden et al., Neurology 64:21-25, 200
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供有助于帶狀皰滲后神經(jīng)痛的機(jī)理的闡明， 促進(jìn)損傷的神經(jīng)再生的技術(shù)方案。此外，本發(fā)明的目的在于，提供對由 于帶狀皰滲后神經(jīng)痛、慢性疼痛、皰疹后神經(jīng)痛、腦卒中、退行性疾病 等伴隨的神經(jīng)細(xì)胞死亡所導(dǎo)致的障礙，或上述疾病的預(yù)防或治療有效且 副作用少的技術(shù)方案。
本發(fā)明人由BDNF與導(dǎo)致臨床上痛覺過敏癥的可塑性相關(guān)，建立了 可以分析PHN的病理機(jī)理的假說，對水痘-帶狀皰滲病毒(VZV)與BDNF 的免疫學(xué)上的相關(guān)性進(jìn)行了調(diào)查。VZV在潛伏感染的神經(jīng)節(jié)中表達(dá)基因 4、 21、 29、 62、 63，立即早期蛋白質(zhì)(immediate-early protein) IE62在 感染中對病毒基因的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮主要作用。包含PHN患者的水痘恢 復(fù)期血清在Western印跡分析中識別IE62和BDNF。本發(fā)明人對IE62 與BDNF的免疫學(xué)上的關(guān)系進(jìn)行了進(jìn)一步調(diào)查，在它們之間發(fā)現(xiàn)了免疫 交叉反應(yīng)性。交叉反應(yīng)的顯著性差異使用它們各自的單克隆抗體進(jìn)行檢 測。在與BDNF交叉反應(yīng)的IE62抗體中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)存在抑制BDNF 的生物活性的抗體，和顯著增加通過BDNF介導(dǎo)的trkB介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 和神經(jīng)突的延長的其它抗體，從而完成了本發(fā)明。即，本申請發(fā)明如下 所述。神經(jīng)突的延長促進(jìn)劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋 白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)的抗體作為有效成分。上述[l]記載的促進(jìn)劑，其中，上述蛋白質(zhì)為IE62，上述抗體識 別具有序列號2的414-429位的氨基酸序列的肽。上述[1]或[2]記載的促進(jìn)劑，其中，上述腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子為 二聚物。神經(jīng)性疾病的預(yù)防或治療劑，含有識別水痘-帶狀皰滲病毒立即 早期蛋白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)的抗體作為有效成分。[5]上述[4]記載的預(yù)防或治療劑，其中，上述蛋白質(zhì)為IE62,上述 抗體識別具有序列號2的414-429位的氨基酸序列的肽。上述[4]或[5]記載的預(yù)防或治療劑，其中，上述腦源性神經(jīng)營養(yǎng) 因子為二聚物。上述[4]~[6]中任意一項記載的預(yù)防或治療劑，其中，上述神經(jīng) 性疾病為伴隨有由于選自腦卒中、缺氧癥、窒息、身體損傷、暴露于毒 素、惡性新生物、癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮性側(cè)索硬化 癥中的狀態(tài)引起的損傷的神經(jīng)細(xì)胞的疾病。商業(yè)包裝，包括上述[1]~[3]中任意一項記載的神經(jīng)突的延長促
的記載物。商業(yè)包裝，包括上述[4]~[7]中任意一項記載的神經(jīng)性疾病的預(yù)
于該預(yù)防或治療劑的記載物。神經(jīng)突的延長抑制劑，含有識別水痘-帶狀皰滲病毒立即早期 蛋白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)的抗體作為有效成分。上述[10]記載的抑制劑，其中，上述蛋白質(zhì)為IE62,上述抗體 為抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的抗體。上述[ll]記載的抑制劑，其中，上述抗體識別具有選自序列號 2的268-341位的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸的肽。伴隨有由于選自帶狀皰疹后神經(jīng)痛、慢性疼痛、經(jīng)驗依賴性社 會厭惡和壓力中的狀態(tài)引起的神經(jīng)過敏的疾病的預(yù)防或治療劑，含有識 別水痘-帶狀皰滲病毒立即早期蛋白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反 應(yīng)的抗體作為有效成分。上述[13]記載的預(yù)防或治療劑，其中，上述蛋白質(zhì)為IE62,上 述抗體為抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的抗體。上述[14]記載的預(yù)防或治療劑，其中，上述抗體識別具有選自 序列號2的268-341位的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸的肽。商業(yè)包裝，包括上述[10]~[12]中任意一項記載的神經(jīng)突的延
該抑制劑的記載物。商業(yè)包裝，包括上述[13]~ [l習(xí)中任意一項記載的預(yù)防或治療后神經(jīng)痛、慢性疼痛、經(jīng)驗依賴性社會厭惡和壓力中的狀態(tài)引起的神經(jīng) 過敏的疾病的關(guān)于該預(yù)防或治療劑的記載物。制備上述[l]-[7]中任意一項記載的抗體的方法，包括使用具
有選自序列號2的414-429位的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸的
肽作為抗原、篩選抗體文庫的步驟。上述[18]記載的方法，其中，上述抗體文庫為人抗體文庫。 [20]制備上述[IO] ~ [15]中任意一項記載的抗體的方法，包括使用
具有選自序列號2的268-341位的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸
的肽作為抗原、篩選抗體文庫的步驟。上述[20]記載的方法，其中，上述抗體文庫為人抗體文庫。 [22]神經(jīng)性疾病的預(yù)防或治療方法，包括向?qū)ο蠼o予有效量的識別
水痘-帶狀皰瘆病毒立即早期蛋白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)
的抗體。上述[22]記載的預(yù)防或治療方法，其中，上述蛋白質(zhì)為IE62, 上述抗體識別具有序列號2的414-429位的氨基酸序列的肽。上述[22]記載的預(yù)防或治療方法，其中，上述腦源性神經(jīng)營養(yǎng) 因子為二聚物。上述[22]記載的預(yù)防或治療方法，其中，上述神經(jīng)性疾病為伴 隨有由于選自腦卒中、缺氧癥、窒息、身體損傷、暴露于毒素、惡性新 生物、癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮性側(cè)索硬化癥中的狀態(tài) 引起的損傷的神經(jīng)細(xì)胞的疾病。伴隨有由于選自帶狀皰滲后神經(jīng)痛、慢性疼痛、經(jīng)驗依賴性社 會厭惡和壓力中的狀態(tài)引起的神經(jīng)過敏的疾病的預(yù)防或治療方法，包括 向?qū)ο蠼o予有效量的識別水痘-帶狀皰滲病毒立即早期蛋白質(zhì)、且與腦源 性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)的抗體。上述[26]記載的預(yù)防或治療方法，其中，上述蛋白質(zhì)為IE62, 上述抗體為抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的抗體。上述[27]記載的預(yù)防或治療方法，其中，上述抗體識別具有選 自序列號2的268-341位的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸的肽。
根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)突的延長促進(jìn)劑，由于通過增強(qiáng)BDNF的作用可 以促進(jìn)神經(jīng)突的延長，即使在少量BDNF存在下也可以期待有效地發(fā)揮效果。上述延長促進(jìn)劑中含有的抗體由于與BDNF本身相比在生物體內(nèi) 的半衰期長，持續(xù)BDNF的增強(qiáng)作用的同時，活化BDNF的自分泌系統(tǒng)， 促進(jìn)BDNF自身的產(chǎn)生和分泌，持續(xù)地對神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生作用的BDNF活 性升高。隨著時間的進(jìn)一步推移，BDNF本身的活性降低，但是通過半 衰期長的抗體帶來的持續(xù)性效果，可以持續(xù)提高BDNF的作用。根據(jù)本 發(fā)明的神經(jīng)性疾病的預(yù)防或治療劑，可以使迄今為止沒有有效技術(shù)方案 的神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生。此外，本發(fā)明的神經(jīng)突的延長抑制劑，由于 通過抑制BDNF的作用可以抑制神經(jīng)突的延長，期待對迄今為止沒有有 效技術(shù)方案的帶狀皰瘆后神經(jīng)痛、慢性疼痛等發(fā)揮效果。上述延長抑制 劑中含有的抗體通過中和BDNF的作用，可以抑制BDNF的自分泌系統(tǒng) 的活化，進(jìn)一步地，通過這種協(xié)同或相加的抑制效果，還可以抑制由于 分泌的BDNF而導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生BDNF的二次反應(yīng)。進(jìn)
馬全依賴性牙土?xí)拹?experience-dependent social aversion)、壓力等4半隨 有神經(jīng)過敏的疾病。


圖1A為表示水痘-帶狀皰滲病毒(VZV)的立即早期(IE)62蛋 白質(zhì)的片段的位置關(guān)系的簡圖。圖1B為IE62片段-GST融合蛋白質(zhì)的電泳照片。圖1C為表示調(diào)查帶狀皰滲和PHN患者的血清對IE62和 BDNF的反應(yīng)性的Western印跡的總結(jié)。圖1D表示調(diào)查帶狀皰滲和PHN患者的血清對正62和 BDNF的反應(yīng)性的Western印跡的 一例。圖2A為表示抗IE62單克隆抗體和抗BDNF單克隆抗體對 IE62片段的反應(yīng)性的電泳照片。圖2B表示使用抗IE62單克隆抗體和抗BDNF單克隆抗體 的VZV感染細(xì)胞的免疫組織染色。圖2C為BDNF蛋白質(zhì)的SDS-PAGE照片以及使用抗正62 單克隆抗體和抗BDNF單克隆抗體的Western印跡的照片。圖3為確定抗正62單克隆抗體和抗BDNF單克隆抗體的表 位的電泳照片。[圖4A]圖4A表示抗IE62單克隆抗體提高BDNF外顯子3 ~ 5的轉(zhuǎn)
錄以及Arc的轉(zhuǎn)錄。圖4B表示通過(a)不添加和(b)添加IEW和BDNF培養(yǎng)的皮
質(zhì)(GABA性)神經(jīng)元的神經(jīng)突的形態(tài)。比例尺表示40pm。圖4C表示抗IE62單克隆抗體增加神經(jīng)細(xì)胞體的面積。 [圖4D]圖4D表示抗IE62單克隆抗體增加神經(jīng)分枝點(diǎn)的數(shù)目。 [圖4E]圖4E表示抗IE62單克隆抗體增加樹突的總長度。 [圖5A]圖5A表示抗IE62單克隆抗體增加脊髓神經(jīng)細(xì)胞體的面積。 [圖5B]圖5B表示抗IE62單克隆抗體增加脊髓神經(jīng)元的分枝點(diǎn)的數(shù)目。圖5C表示抗IE62單克隆抗體增加脊髓神經(jīng)元的神經(jīng)突的 總長度。圖5D表示通過(a)不添力口(對照)以及(b)添加IE62和BDNF 培養(yǎng)的脊髓后角神經(jīng)元的神經(jīng)突的形態(tài)。比例尺(scal bar)表示40^m。圖6A為使用單克隆抗體KSG1的大腦皮質(zhì)細(xì)胞的免疫染色 的照片。倍率為1000倍。圖6B為使用單克隆抗體KSG1的中腦細(xì)胞的免疫染色的照 片。倍率為1000倍。圖6C為使用單克隆抗體KSG4的大腦皮質(zhì)細(xì)胞的免疫染色 的照片。倍率為400倍。圖6D為使用單克隆抗體KSG4的中腦細(xì)胞的免疫染色的照 片。倍率為1000倍。圖7為表示往大鼠胎兒原代培養(yǎng)大腦皮質(zhì)中添加用PHN患者 血清處理過的BDNF時的BDNFmRNA表達(dá)量的變動結(jié)果的圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的神經(jīng)突的延長促進(jìn)劑含有識別水痘-帶狀皰滲病毒立即早 期蛋白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)的抗體作為有效成分。該 抗體與后述的本發(fā)明的神經(jīng)突的延長抑制劑中含有的抑制抗體區(qū)別時 稱為促進(jìn)抗體。
上述抗體為識別水痘-帶狀皰滲病毒立即早期蛋白質(zhì)的抗體。其中， 水痘-帶狀皰滲病毒(VZV)為a皰滲病毒屬的成員，是水痘(varicella)和帶狀皰滲(zoster)的病原介質(zhì)。VZV基因組為直鏈狀雙鏈DNA分子，例如 J. Gen Viro1.(1986), 67, 1759-1816中公開了其全部核苷酸序列以及編碼 的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。此外，作為VZV(人皰疹病毒3)，在Genbank Accesion No: Nc—001348中，公開了全部基因組的核苷酸序列和由該基 因組編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。VZV基因組編碼約70種蛋白質(zhì)。認(rèn) 為VZV的全部基因在立即早期(immediate-early)(IE)、早期(E)和后期(L) 的三個寬動態(tài)類另'J(dynamic class)中，在受感染細(xì)月包中表達(dá)。VZV IE62 蛋白質(zhì)參與VZV蛋白質(zhì)的三個動態(tài)類別的所有表達(dá)的活化。
上述抗體是在VZV編碼的蛋白質(zhì)中，將立即早期蛋白質(zhì)、更優(yōu)選 IE62作為抗原制備的。作為抗原的IE62蛋白質(zhì)在上述文獻(xiàn)和Genbank 等中也公開了其氨基酸序列。例如，人皰滲病毒3 VZV-Oka抹的情況下， 在Genbank Accession No: AY016449中公開了 IE62的核苷酸序列(序列 號l)和氨基酸序列(序列號2)。此外，人皰滲病毒3 VZV-野生林 (Kawaguchi抹)參照J(rèn)ournal of Virology 2002 pi 1447-144459。
上述促進(jìn)抗體優(yōu)選識別具有序列號2的IE62的氨基酸序列中 414-429位氨基酸序列(PGYRSISGPDPRIRKT:序列號3)的肽。上述識 別所述肽的促進(jìn)抗體由于更顯著地具有與后述BDNF的交叉反應(yīng)性，所 以優(yōu)選。上述肽發(fā)揮作為本發(fā)明中的促進(jìn)抗體的表位的功能，只要不喪 失作為抗原決定簇的功能，則可以從序列號3的氨基酸序列的N末端和 /或C末端缺失1 ~3個左右的氨基酸。此外，上述肽只要不喪失作為抗 原決定簇的功能，則可以在其N末端或C末端具有1個~數(shù)個(通常1~ 5個、優(yōu)選為1 ~3個)追加的氨基酸序列。作為追加的氨基酸殘基，可 以舉出為了與后述高分子化合物(蛋白質(zhì))結(jié)合而導(dǎo)入的半胱氨酸殘基等。
上述抗體的特征在于，可以高靈敏度且高特異性地識別立即早期蛋 白質(zhì)、優(yōu)選為正62,并且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)交叉反應(yīng)。
腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)， 在 GenBank Accession No.NM—170731-170735、NM—001709中^>開的是人BDNF的核苷酸序列 和氨基酸序列。與上述促進(jìn)抗體交叉反應(yīng)的BDNF為成熟體，優(yōu)選為成 熟體的二聚物。
本說明書所稱的"抗體，，中，包括多克隆抗體、單克隆抗體等天然型 抗體，使用基因重組技術(shù)制備的嵌合抗體、人源化抗體或單鏈抗體，可以使用產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物等制備的人抗體，通過噬菌體展示制備 的抗體及它們的結(jié)合性片段。
結(jié)合性片段指的是上述抗體的一部分的區(qū)域，具體地說，可以舉出
例如F(ab，)2、 Fab，、 Fab、 Fv(抗體的可變區(qū))、sFv、 dsFv(二硫鍵穩(wěn)定性 Fv)、 dAb(單域抗體)等(Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456， 1996)。
對抗體類別不特別限定，還包括具有IgG、 IgM、 IgA、 IgD或IgE 等任意同種型的抗體。優(yōu)選為IgG或IgM,若考慮到純化的容易性等， 則更優(yōu)選為IgG。
多克隆抗體或單克隆抗體可以通過已知的常規(guī)制備方法來制備。具 體地，例如將免疫原、根據(jù)需要與弗氏佐劑一起免疫接種到哺乳動物中， 例如多克隆抗體的情況下，免疫接種到小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、 貓、狗、豬、山羊、馬或牛等，優(yōu)選小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、山羊、 馬或兔，單克隆抗體的情況下，免疫接種到小鼠、大鼠、倉鼠。
在一個實施方式中，作為免疫原的IE62肽可以通過公知的方法制 備。例如，可以根據(jù)常規(guī)方法合成含有序列號3的氨基酸序列的肽，與 牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、卵白蛋白(OVA)、匙孔蜮血 藍(lán)蛋白(KLH)、曱狀腺球蛋白(TG)或免疫球蛋白等高分子化合物(蛋白質(zhì)) 形成復(fù)合體后，用作免疫原。
為了形成上述IE62肽與高分子化合物的復(fù)合體和其它目的，可以 附加l個或數(shù)個氨基酸。對附加的氨基酸的數(shù)目不特別限定，但是若考 慮到所制備的抗體的特異性，優(yōu)選為1~10個、更優(yōu)選為1~5個、進(jìn) 一步優(yōu)選為1~2個、最優(yōu)選為l個。附加的氨基酸的位置可以為多肽 的N末端或C末端中的任意一端，但是優(yōu)選為C末端。
復(fù)合體可以通過公知的方法形成，不特別限定。例如，可以通過混
合酸酐法或活性酯法等使上述IE62肽的羧基與上述高分子化合物的官 能團(tuán)反應(yīng)，形成復(fù)合體。此外，也可以向上述IE62肽的C末端導(dǎo)入半 胱氨酸殘基，通過該半胱氨酸的側(cè)鏈SH基使上述肽與上述高分子化合 物結(jié)合。
在另一實施方式中，例如，可以使用將編碼含有序列號3的氨基酸 序列的肽的核普酸與編碼其它的蛋白質(zhì)(例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)) 的核苷酸連結(jié)而成的表達(dá)載體，通過常規(guī)方法作為與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)在宿主中表達(dá)，進(jìn)行純化，將純化物用作免疫原。
多克隆抗體具體地說可以如下制備。即，對小鼠、大鼠、倉鼠、豚 鼠、山羊、馬或兔，優(yōu)選山羊、馬或兔，更優(yōu)選兔，皮下、肌內(nèi)、靜脈 內(nèi)、足墊內(nèi)或腹腔內(nèi)注射1次~數(shù)次免疫原，實施免疫致敏。通常，從 初次免疫起約每1天~ 14天進(jìn)行1次~ 5次免疫，從最終免疫起約1天~
5天后，從免疫致敏的該哺乳動物取得血清。
雖然血清可以用作多克隆抗體，但是優(yōu)選通過超濾、硫酸銨分級分
離、優(yōu)球蛋白沉淀法、己酸法、辛酸法、離子交換色譜(DEAE或DE52 等)，使用抗免疫球蛋白色譜柱、蛋白A/G色譜柱、或免疫原交聯(lián)而成 的色譜柱等的親和柱色譜進(jìn)行分離和/或純化。
單克隆抗體如下制備通過由上述免疫致敏動物得到的產(chǎn)生該抗體 的細(xì)胞和無自身抗體產(chǎn)生能力的骨髓瘤細(xì)胞制備雜交瘤，克隆該雜交
性、且表現(xiàn)出與BDNF的交叉反應(yīng)性的單克隆抗體的克隆。
單克隆抗體具體地說可以如下制備。即，對小鼠、大鼠或倉鼠(包括 產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠等制成產(chǎn)生來自其它動物的抗體的轉(zhuǎn)基因動 物)的皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、足墊內(nèi)或腹腔內(nèi)注射1次~數(shù)次免疫原或移 植免疫原，實施免疫致敏。通常，從初次免疫起約每1天~ 14天進(jìn)行1 次~4次免疫，從最終免疫起約1天~5天后，從免疫致敏的該哺乳動 物取得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
分泌單克隆抗體的雜交瘤(融合細(xì)胞)的制備可以通過Kohler和 Milstein等的方法(Nature, Vol.256, p.495-497, 1975)以及基于此的修飾方 法來進(jìn)行。即，通過使如上所述從免疫致敏的哺乳動物取得的脾臟、淋 巴結(jié)、骨髓或扁桃體等，優(yōu)選脾臟中含有的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與優(yōu)選來自 小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人等哺乳動物，更優(yōu)選來自小鼠、大鼠 或人的無自身抗體產(chǎn)生能力的骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合來制備。
細(xì)胞融合中使用的骨髓瘤細(xì)胞的例子包括來自小鼠的骨髓瘤 P3/X63-AG8.653(653; ATCC No.CRL1580) 、 P3/NSI/l-Ag4國l(NS畫l)、 P3/X63國Ag8.Ul(P3Ul)、 SP2/0誦Agl4(Sp2/0、 Sp2)、 PAI、 F0或BW5147, 來自大鼠的骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.,來自人的骨髓瘤U-266AR1 、 GM1500誦6TG-A1國2、 UC729-6、 CEM誦AGR、 D1R11或CEM國T15。
產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤克隆的篩選可以如下進(jìn)行將雜交瘤例如在微量滴定板中培養(yǎng)，對于已經(jīng)見到增殖的孔的培養(yǎng)上清對在上述免疫
致敏中使用的免疫原的反應(yīng)性、以及上述上清對BDNF的反應(yīng)性，例如 通過ELISA等的酶免疫測定法進(jìn)4亍測定。
上述雜交瘤可以使用培養(yǎng)基(例如，含有10%胎牛血清的DMEM) 進(jìn)行培養(yǎng)，將該培養(yǎng)液的離心上清作為單克隆抗體溶液。此外，可以通
過將該雜交瘤注入到其來源的動物的腹腔中，生成腹水，將得到的腹水 作為單克隆抗體溶液。單克隆抗體與上述多克隆抗體同樣地優(yōu)選進(jìn)行分 離和/或純化。
此夕卜，嵌合抗體例如可以參考《實驗醫(yī)學(xué)(臨時增刊號)，Vo1.6, No.lO, 1988》、日本特公平3-73280號公報等來制備，人源化抗體例如可以參 考曰本特表平4-506458號公報、日本特開昭62-296890號公報等來制備。 人抗體可以參考例如《Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997》、 《Nature Genetics, Vol.7, p. 13-21, 1994》、日本特表平4-504365號公報、 國際申請公開W094/25585號公報、《Nikken Science、 6月號、第40 頁~第50頁、1995年》、《Nature, Vol.368, p.856-859, 1994》、日本特 表平6-500233號公報等來制備。
通過噬菌體展示進(jìn)行的抗體制備中，由為了篩選抗體而制備的噬菌 體文庫，例如通過生物淘篩(biopanning)回收、濃縮對抗原具有親和性的 噬菌體，可以容易地得到Fab等抗體。此時，優(yōu)選使用具有選自序列號 2的414-429位的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸的肽作為抗原， 對抗體文庫進(jìn)行篩選。對于優(yōu)選的抗體文庫和抗體的篩選方法，參照國 際公開第01/062907號小冊子、日本特開2005-185281號。
在噬菌體文庫中，存在可以與所有抗原反應(yīng)的克隆。因此，若抗原 為IE62,則得到對于IE62中存在的所有表位的抗IE62抗體的克隆。對 于該克隆組，若使用BDNF作為第二抗原進(jìn)行篩選，則得到交叉的抗體。 基于對BDNF活性的作用，可以選擇具有抑制或促進(jìn)人型BDNF活性的 機(jī)能的抗體。所得到的人型抗體對人的應(yīng)用是有利的。
F(ab，)2和Fab，可以通過分別用作為蛋白分解酶的胃蛋白酶或木瓜蛋 白酶對免疫球蛋白進(jìn)行處理來制備。Fab可以通過對Fab表達(dá)噬菌體文 庫與通過上述噬菌體展示進(jìn)行的抗體制備法同樣地進(jìn)行篩選來制備。
如此得到的識別IE62蛋白質(zhì)的抗體可以通過利用通常的抗原-抗體 反應(yīng)的方法對IE62蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測或定量。上述方法不特別限定，可以舉出放射性同位素免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(例如ELISA)、熒 光或發(fā)光測定法、凝聚法、Western印跡法、免疫色鐠法等(Meth. Enzymol., 92, p. 147-523(1983), Antibodies Vol. IIIRL Press Oxford(1989))。
為止已知的VZV的抗體不同，具有促進(jìn)通過BDNF的神經(jīng)突的延長的 作用。其中，神經(jīng)突包括形成在神經(jīng)細(xì)胞外側(cè)的軸突、樹狀突和軸突側(cè) 枝。神經(jīng)突的延長促進(jìn)指的是，在顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞測定神經(jīng)突的 總長度時，其總長度與對照相比增加。此時的對照指的是，除了未添加 本發(fā)明的促進(jìn)劑之外，置于相同條件下的神經(jīng)細(xì)胞。
本發(fā)明的促進(jìn)劑中含有的抗體的量只要發(fā)揮上述作用和效果則不 特別限定，但是通常為0.001 ~ 90重量％、優(yōu)選為0.005 ~ 50重量％、更 優(yōu)選為0.01 ~ 10重量％。
體，可以使用在制劑領(lǐng)域中通常使用的載體，可以舉出例如，蔗糖、淀 粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、磷酸鈣、碳酸鈣等賦形劑，苯 甲酸鈉、亞辟u酸氬鈉、羥苯甲酸曱酯、羥苯曱酸丙酯等保存劑，檸檬酸、 檸檬酸鈉、乙酸等穩(wěn)定劑，曱基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鋁等 懸浮劑，表面活性劑等分散劑，水、生理鹽水等稀釋劑，甘油、聚乙二 醇等底蠟等，但是不限于此。
作為本發(fā)明的促進(jìn)劑作用的細(xì)胞，可以舉出神經(jīng)細(xì)胞，特別是損傷 的神經(jīng)細(xì)胞等。
本發(fā)明的促進(jìn)劑可以用作研究用試劑。此外，可以在體內(nèi)促進(jìn)神經(jīng) 細(xì)胞的突起的延長。為了體內(nèi)應(yīng)用，可以舉出例如，通過將本發(fā)明的促 進(jìn)劑添加到培養(yǎng)基中使其與培養(yǎng)中的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行接觸，并繼續(xù)適當(dāng)培 養(yǎng)的方法。
本發(fā)明的促進(jìn)劑可以向生物體給藥，以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的突起的延 長。作為向生物體給藥的方法不進(jìn)行限定，可以舉出例如，皮下注射、 肌肉注射、腹腔內(nèi)注射、點(diǎn)滴注射等。除了口服給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌 內(nèi)給藥等全身給藥之外，還可以舉出向腦內(nèi)或髓腔內(nèi)(脊髓液中)、 一側(cè) 背側(cè)海馬的局部給藥。向腦內(nèi)局部給藥時，本發(fā)明的促進(jìn)劑可以包含在
含膠原的載體中。
具有促進(jìn)神經(jīng)突延長的作用的上述促進(jìn)抗體期待使神經(jīng)細(xì)胞、特別是損傷的神經(jīng)細(xì)胞再生。本發(fā)明提供含有上述抗體作為有效成分的神經(jīng) 性疾病的預(yù)防或治療劑。
本發(fā)明的預(yù)防或治療劑中含有的促進(jìn)抗體的量只要發(fā)揮上述作用
效果則不特別限定，但是通常為0.001 ~ 90重量％、優(yōu)選為0.005 ~ 50 重量％、更優(yōu)選為0.01 ~ 10重量％。
本發(fā)明的預(yù)防或治療劑除了上述促進(jìn)抗體之外，還可以含有載體。 作為上述載體，可以舉出上述促進(jìn)劑中舉出的載體。
適用本發(fā)明的預(yù)防或治療劑的神經(jīng)性疾病，是通過促進(jìn)神經(jīng)突的延 長，可以期待病理的改善的疾病?？梢耘e出例如，伴隨有由于腦卒中、 缺氧癥、窒息、身體損傷、暴露于毒素、惡性新生物、癡呆、糖尿病相 關(guān)的末梢神經(jīng)障礙、神經(jīng)退行性疾病(帕金森病、阿爾茨海默病、亨延頓 舞蹈癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、脊髓小腦變性癥等)、免疫性神經(jīng)疾病(多 發(fā)性硬化癥、格-巴綜合征、重癥肌無力、肌炎等)、感染性疾病(腦炎、 腦膜炎等)、血管障礙(腦梗塞、腦出血等)、其它的神經(jīng)性疾病(肌營養(yǎng)不 良、癲癇、線粒體性腦肌病等)等狀態(tài)引起的損傷的神經(jīng)細(xì)胞的疾病。優(yōu) 選為缺氧癥、窒息、身體損傷、暴露于毒素、惡性新生物、癡呆、阿爾 茨海默病、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥。
作為本發(fā)明的促進(jìn)劑、預(yù)防或治療劑的給藥對象，可以舉出小鼠、 大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、馬、綿羊、猴、人等哺乳動物。
由于腦卒中發(fā)病時血腦屏障局部被破壞，可以期待本發(fā)明的促進(jìn)劑 容易地運(yùn)送到腦中。作為血腦屏障開放劑，可以同時給予甘露糖醇、阿 拉伯糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗果低聚糖(fructoligosaccharide)、葡糖 醛酸、甘油、蔗糖、亞戊基四唑(metrazol)、依托泊普(etopside)、合成膽 汁鹽、膽酸類、二曱基亞砜、腺苷酸類、無機(jī)鹽類或有機(jī)酸類。
促進(jìn)劑、預(yù)防或治療劑可以以口服、直腸內(nèi)、胃腸外、腦池內(nèi) (intracistemally)、陰道內(nèi)、腹腔內(nèi)、局部(以粉末、軟膏、凝膠、點(diǎn)滴注 射劑或透皮貼劑等形式)、口內(nèi)、經(jīng)口或鼻腔噴霧的形式給藥。本說明書 中使用的用語"胃腸外"指的是包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮 下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射以及注入的給藥方式。
促進(jìn)劑、預(yù)防或治療劑還可以通過緩釋性系統(tǒng)適當(dāng)?shù)亟o藥。緩釋性 試劑的適當(dāng)?shù)睦?，包含適當(dāng)?shù)木酆衔镂镔|(zhì)(例如，成型品(例如，膜或 微嚢)形態(tài)的半透性聚合物基質(zhì))、適當(dāng)?shù)氖杷晕镔|(zhì)(例如，可以接受的質(zhì)量的油中的乳液的形式)或離子交換樹脂、以及難溶性衍生物(例如， 難溶性鹽)。
使用本發(fā)明的促進(jìn)劑、預(yù)防或治療劑，考慮到各患者的臨床狀態(tài)、 給藥部位、給藥方法、給藥方案以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它因素，
因此:本說日書^ ，所需的"有效量"進(jìn)行這種考i來決定。、作為通;的 提案，胃腸外給藥的單位劑量的治療劑中總的藥學(xué)有效量為患者體重的
約lpg/kg/天-10mg/kg/天，但是如上所述其依賴于治療上的考慮。進(jìn)一 步優(yōu)選該用量至少為O.Olmg/kg/天，最優(yōu)選對于人為約0.01mg/kg/天與 約lmg/kg/天之間。連續(xù)給藥時，代表性地以約liiig/kg/小時~約50pg/kg/ 小時的給藥速度通過每天1次~ 4次的注射或連續(xù)皮下注入(例如使用凝: 型泵)中的任意一種給予治療劑。此外還可以使用靜脈給藥用的袋溶液。 為了觀察變化，根據(jù)所需的效果改變必要的處置時間和產(chǎn)生應(yīng)答的處置 后的間隔。
本發(fā)明的神經(jīng)突的延長抑制劑含有識別水痘-帶狀皰滲病毒立即早 期蛋白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)交叉反應(yīng)的抗體作為有效成 分。上述抑制劑中作為有效成分含有的抗體，與迄今為止已知的VZV 的抗體不同，是通過與BDNF交叉反應(yīng)抑制BDNF的作用，具有抑制神 經(jīng)突的延長的作用的抗體。上述抗體也簡稱為抑制抗體。
上述抑制抗體，優(yōu)選識別具有選自序列號2的正62的氨基酸序列 中，268-341位的氨基酸序列
SSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSP:序列號18)中的至少7個連續(xù)氨 基酸的肽。識別上述肽的抗體由于與BDNF交叉反應(yīng)且抑制BDNF的作 用，所以優(yōu)選。上述肽發(fā)揮作為本發(fā)明中的抗體的表位的功能。
上述抑制抗體，除了使用由序列號18的氨基酸序列構(gòu)成的肽或具 有選自序列號18的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸的肽來替代由 序列號3的氨基酸序列構(gòu)成的肽之外，可以與上述促進(jìn)抗體的制備方法 同樣地制備。
本發(fā)明的抑制劑中含有的抑制抗體的量只要發(fā)揮上述作用效果則 不特別限定，通常為0.001 ~ 90重量°/。、優(yōu)選為0.005 ~ 50重量％、更優(yōu) 選為0.01 ~ 10重量％。載體，可以使用在制劑領(lǐng)域中通常使用的載體，可以舉出例如，蔗糖、 淀粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、磷酸鈣、碳酸鈣等賦形劑， 苯曱酸鈉、亞硫酸氫鈉、羥苯曱酸甲酯、羥苯曱酸丙酯等保存劑，檸檬 酸、檸檬酸鈉、乙酸等穩(wěn)定劑，甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸 鋁等懸浮劑，表面活性劑等分散劑，水、生理鹽水等稀釋劑，甘油、聚 乙二醇等底蠟等，但是不限于此。
作為本發(fā)明的抑制劑作用的細(xì)胞，可以舉出神經(jīng)細(xì)胞，特別是損傷 的神經(jīng)細(xì)胞等。
本發(fā)明的抑制劑可以用作研究用試劑。此外可以在體內(nèi)抑制神經(jīng)細(xì) 胞的突起的延長。為了適用于體內(nèi)，可以舉出例如，通過將本發(fā)明的抑 制劑添加到培養(yǎng)基中使其與培養(yǎng)中的神經(jīng)細(xì)胞接觸，并繼續(xù)適當(dāng)培養(yǎng)的 方法。
本發(fā)明的抑制劑可以向生物體給藥，以抑制神經(jīng)細(xì)胞的突起的延 長。作為向生物體給藥的方法不進(jìn)行限定，可以舉出例如，皮下注射、 肌肉注射、腹腔內(nèi)注射、點(diǎn)滴注射等。除了口服給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌 內(nèi)給藥等全身給藥之外，還可以舉出向腦內(nèi)或髓腔內(nèi)(脊髓液中)、 一側(cè) 背側(cè)海馬的局部給藥。向腦內(nèi)局部給藥時，本發(fā)明的抑制劑可以包含在 含膠原的載體中。
的預(yù)防或治療劑。
本發(fā)明的預(yù)防或治療劑中含有的抑制抗體的量只要發(fā)揮上述作用
效果則不特別限定，通常為0.001 ~ 90重量％、優(yōu)選為0.005 ~ 50重量％、 更優(yōu)選為0.01 ~ 10重量％。
本發(fā)明的預(yù)防或治療劑除了上述抑制抗體之外，還可以含有載體。 作為上述載體，可以舉出上述抑制劑中舉出的載體。
作為適用本發(fā)明的抑制劑、預(yù)防或治療劑的疾病，是通過抑制神經(jīng) 突的延長，可以期待病理的改善的疾病。可以舉出例如，帶狀皰滲后神 經(jīng)痛、慢性疼痛、經(jīng)馬全依賴性社會厭惡、壓力等。慢性疼痛分類為
(1) 認(rèn)為傷害性感受器被持續(xù)刺激而產(chǎn)生的傷害性疼痛，
(2) 由與疼痛傳遞或抑制機(jī)理相關(guān)的神經(jīng)纖維的功能異常引起的神經(jīng)源性疼痛，以及
(3)感情或情緒方面受到負(fù)荷的心因性疼痛。本說明書中的慢性疼 痛指的是神經(jīng)源性疼痛(神經(jīng)的損傷、壓迫等引起的疼痛)、傷害性疼痛 (癌癥、風(fēng)濕等中的疼痛)兩種。經(jīng)驗依賴性社會厭惡(社會的挫折壓力)
是指中腦緣多巴胺路徑中的BDNF發(fā)揮必需的作用的狀態(tài)。
作為本發(fā)明的抑制劑、預(yù)防或治療劑的給藥對象，可以舉出小鼠、 大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、馬、綿羊、猴、人等哺乳動物。
抑制劑、預(yù)防或治療劑可以以口服、直腸內(nèi)、胃腸外、腦池內(nèi) (intracistemally)、陰道內(nèi)、腹腔內(nèi)、局部(以粉末、軟膏、凝膠、點(diǎn)滴注 射劑或透皮貼劑等形式)、口內(nèi)、經(jīng)口或鼻腔噴霧的形式給藥。本說明書 中使用的用語"胃腸外"指的是包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮 下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射以及注入的給藥方式。
抑制劑、預(yù)防或治療劑還可以通過緩釋性系統(tǒng)適當(dāng)?shù)亟o藥。緩釋性 試劑的適當(dāng)?shù)睦?，包含適當(dāng)?shù)木酆衔镂镔|(zhì)(例如，成型品(例如，膜或 微嚢)形態(tài)的半透性聚合物基質(zhì))、適當(dāng)?shù)氖杷晕镔|(zhì)(例如，容許品質(zhì)油 中的乳液的形式)或離子交換樹脂、以及難溶性衍生物(例如，難溶性鹽)。
使用本發(fā)明的抑制劑、預(yù)防或治療劑，在考慮各患者的臨床狀態(tài)、 給藥部位、給藥方法、給藥方案以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它因素的 基礎(chǔ)上，以遵守醫(yī)療實施基準(zhǔn)(Good Medical Practice)的方式制定處方以 及給藥。因此，本說明書中，所需的"有效量"進(jìn)行這種考慮來決定。作 為通常的提案，胃腸外給藥的單位劑量的治療劑的總藥學(xué)有效量為患者 體重的約1(ig/kg/天 10mg/kg/天，但是如上所述其依賴于治療上的考 慮。進(jìn)一步優(yōu)選該用量至少為O.Olmg/kg/天，最優(yōu)選對于人為約 O.Olmg/kg/天與約lmg/kg/天之間。連續(xù)給藥時，代表性地以約lpg/kg/ 小時~約50pg/kg/小時的給藥速度通過每天1次~4次的注射或連續(xù)皮 下注入(例如使用微型泵)中的任意一種給予治療劑。此外還可以使用靜 脈給藥用的袋溶液。為了觀察變化，根據(jù)所需的效果改變必要的處置時 間和產(chǎn)生應(yīng)答的處置后的間隔。
實施例
以下通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的說明，但是本發(fā)明不被這些實 施例所限定。病毒和細(xì)"包培養(yǎng)
使VZV的Oka抹(用來自減毒水痘病毒Oka抹(日本特公昭53-41202 號或美國專利第3985615號)的病毒作為種子來制備，在世界各國廣泛供 于實用(Requirements for Varicella Vaccine(Live) Adopted 1984; Revised 1993: WHO Technical Report Series, No. 848, pp. 22-38, 1994)。該減毒 Oka抹以保藏編號VR-795于1975年3月14日保藏在ATCC。)和VZV 的Kawaguchi抹(Journal of Virology, Nov. 2002, P. 11447-11459)在人胚胎 肺細(xì)胞或人肺癌細(xì)胞抹A549細(xì)胞中增殖。上述細(xì)胞分別在補(bǔ)加有10% 和2%胎牛血清的Eagle's最低必須培養(yǎng)基中生長、維持。
大鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)已經(jīng)報道的方法(Tabuchi, A., et al., J. Biol. Chem. 277, 35920-35931(2002)),由17 ~ 18天齡大鼠胚胎 (Sprague-Dawley)的大腦皮質(zhì)制備。簡要地說，將大腦皮質(zhì)的小片依次通 過酶(DNase I(Sigma)處理和胰蛋白酶(Sigma))處理以及機(jī)械分離形成片 斷，將該細(xì)胞以5xl(^個的密度接種到60mm的培養(yǎng)皿(Iwaki)中。使上 述細(xì)胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco，s改良Eagle's培養(yǎng)基(Nissui)中 生長48小時，接著將培養(yǎng)基更換為含有葡萄糖(4.5mg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白 (5(ig/ml)、胰島素(5pg/ml)、亞顧酸鈉(5pg/ml)、牛血清白蛋白(lmg/ml) 和硫酸卡那霉素(100pg/ml)的無血清Dulbecco，s改良Eagle，s培養(yǎng)基(TIS 培養(yǎng)基)。加入阿糖胞苷(Sigma)2nM,抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。在DNA 轉(zhuǎn)染的2小時前，將培養(yǎng)基更換為新鮮的TIS培養(yǎng)基(不含阿糖胞普)。
實施例1
GST-IE62融合蛋白質(zhì)的表達(dá)和多克隆抗體的產(chǎn)生 將VZV的IE蛋白質(zhì)的 一部分分割成片段，合成為GST融合蛋白質(zhì)。 上述GST融合蛋白質(zhì)如圖1A所示，相互重疊覆蓋分子整體。表達(dá)谷胱 甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-IE62融合蛋白質(zhì)的重組質(zhì)粒通過擴(kuò)增VZV基因的 IE62基因，并將擴(kuò)增DNA片段插入到載體pGEX-4T-l(Pharmacia)中來 構(gòu)建。
1) RNA的分離和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)
全RNA使用ISOGEN(日本Gene)從培養(yǎng)細(xì)胞中提取。RT-PCR根據(jù) 已經(jīng)報道的方法(Kawasaki, E.S., et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27(1991))進(jìn)行。簡要地說，將全RNA ( lpg)在的lx第一鏈緩沖液中逆轉(zhuǎn)錄到cDNA。上述緩沖液含有下述物質(zhì)
作為引物的0.5^M 01igo(dT)15 (5，誦AAGCTTTTTTTTTTV國3，)(序歹iJ 號6)， 200單位的SuperScriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)， 400pM dNTPs, 以及10單位的RNase抑制劑(Invitrogen)。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，對反應(yīng)混合物用1.1單位的RNase H(Invitrogen)在 37。C下處理20分鐘，作為cDNA溶液用于PCR。PCR在含有l(wèi)pl的cDNA 溶液、1.25單位的AmpliTaq Gold DNA聚合酶(PerkinElmer Life Sciences), 1.5mM MgCl2、 200pM dNTPs和0.5pM引物對的50nl的 lxPCR緩沖液中進(jìn)行。為了區(qū)別大鼠BDNF基因的四個外顯子(夕卜顯子I、 外顯子II、外顯子III和外顯子IV),使用 E-l(5，-ACTCAAAGGGAAACGTGTCTCT-3，)(序列號7)、 E-II(5，-CGGTGTAGGCTGGAATAGACT-3，)(序列號8)、 E-III(5，-CTCCGCCATGCAATTTCCACT-3，)(序列號9)、 E-IV(5，-GTGACAACAATGTGACTCCACT國3，)(序列號IO)和
E-Vas(5，-GCCTTCATGCAACCGAAGTA-3，)(序列號11)。
作為內(nèi)標(biāo)，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)cDNA用GAPDH正義 (5'國TCCATGACAACTTTGGCATTGTGG誦3，)(序歹'J號 12)和反義 (5，-GTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC-3，)(序列號13)引物對進(jìn)行擴(kuò) 增。BDNF cDNA的擴(kuò)增中，PCR條件為，在95°C下預(yù)熱10分鐘后， 如下進(jìn)行以在94。C變性1分鐘，在55。C退火1分鐘，在72。C延長1.5 分鐘作為一個循環(huán)，進(jìn)行32個循環(huán)(外顯子1)、 31個循環(huán)(外顯子11)、 26個循環(huán)(外顯子III)和29個循環(huán)(外顯子IV),并在72。C最終延長10 分鐘。GAPDH的擴(kuò)增在與上述相同的條件下進(jìn)行31個循環(huán)。PCR產(chǎn)物 通過2%瓊脂糖凝膠上的電泳分離，用溴化乙錠染色的DNA的帶的密度， 使用Bit-Map loader(ATTO)和軟件(NIH Image 1.52)分析。 2) GST-IE62融合蛋白質(zhì)的表達(dá)
將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，得到轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng)該 轉(zhuǎn)化體，并往其中添加lmM IPTG(異丙基-(3-D-硫代吡喃半乳糖苷)，在 37。C下培養(yǎng)4小時或在室溫下培養(yǎng)一夜，由此誘導(dǎo)融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。 誘導(dǎo)的融合蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE確認(rèn)(圖1B)。誘導(dǎo)的融合蛋白質(zhì)，使 用谷胱甘肽瓊脂糖4B(Pharmacia)基于制造者的指令及用SDS-PAGE確 認(rèn)的分子量進(jìn)行純化。重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過它們的序列確認(rèn)。IE62融合蛋白質(zhì)的抗原性通過免疫印跡程序確認(rèn)。 3)多克隆抗體的產(chǎn)生
根據(jù)常規(guī)方法，將融合蛋白質(zhì)1 5免疫接種到兔中，將其免疫血 清用于免疫印跡和對于VZV感染細(xì)胞的免疫熒光抗體試馬全。 實施例2
IE62的單克隆抗體的產(chǎn)生
IE62的單克隆抗體，使用GST-IE62融合蛋白質(zhì)，本質(zhì)上根據(jù)已經(jīng) 報道的方法(Okuno et al, Virology 129, 357-368(1983))進(jìn)行制備。通過對 于GST蛋白質(zhì)的ELISA和對于VZV感染細(xì)胞的免疫熒光抗體，篩選雜 交瘤的培養(yǎng)上清，克隆產(chǎn)生IE62單克隆抗體的雜交瘤。
實施例3
免疫熒光抗體(IFA)分析
在-20。C下用丙酮固定VZV感染細(xì)胞，分別使用BDNF或IE62的 單克隆抗體以及與熒光素結(jié)合的抗小鼠IgG血清作為一次抗體和二次抗 體進(jìn)行染色。所產(chǎn)生的GST-IE62融合蛋白質(zhì)的兔抗血清使用與熒光素 結(jié)合的抗兔IgG血清(Jackson)作為二次抗體，通過VZV感染細(xì)胞的免疫 焚光抗體來確認(rèn)。
實施例4
Western印跡
將GST-IE62融合蛋白質(zhì)或VZV感染細(xì)胞的溶解液負(fù)載在SDS凝 膠上，通過電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜(Millipore)上。上述膜 通過GST-IE62融合蛋白質(zhì)的兔抗血清、抗IE62單克隆抗體(1:10000稀 釋、阪大微生物學(xué)病研究所制)或抗人BDNF單克隆抗體(稀釋成 0.5pg/ml、 R&D Systems制)進(jìn)行探針標(biāo)記。與過氧化物酶結(jié)合抗兔IgG 血清或山羊抗小鼠IgG血清一起進(jìn)一步培養(yǎng)1小時后，通過ECL法 (Nacalai Tesque)展開免疫印跡。
實施例5
-故抗IE62單克隆抗體識別的IE62的表位的決定
被抗IE62單克隆抗體識別的IE62的表位，通過使用合成肽的IE62 的Western印跡的封閉進(jìn)行分析。表位為圖1A所示的融合蛋白質(zhì)C與 F之間的重復(fù)區(qū)域，對應(yīng)于正62的414-447位的氨基酸。
將上述區(qū)域分為三個部分，使用含有下述氨基酸序列的三種肽肽I: PGYRSISGPDPRIRKT(序列號3) 肽II: KRLAGEPGRQRQKSF(序列號4),和 肽III: SLPRSRTPIIPPVSG(序列號5)
在Western印跡中封閉抗正62單克隆抗體與IE62的相互作用。 實施例6
BDNF和抗IE62抗體對于原代培養(yǎng)神經(jīng)元的作用 用氯胺酮(50mg/kg, i.p.)麻醉Sprague-Dawley大鼠(出生后0 ~ 1天)， 接著通過頸推脫臼處死。全部的努力是為了使所用的動物數(shù)目和它們的 痛苦為最低限度來進(jìn)行的。實驗方法符合大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)部的動物管理委 員會規(guī)則以及涉及實驗動物的處理的NIH的指南。通過通常的微島法 (Kimura et al., J Neurophysiol. May; 77(5). 2805-2815， 1997),培養(yǎng)孤立神 經(jīng)元。從腦取出視覺皮質(zhì)的一片，用木瓜蛋白酶(20U/ml)進(jìn)行酶解離， 用磨光玻璃移液管進(jìn)行粉碎。在置于瓊脂糖片上的膠原點(diǎn)上，在前面制 備的膠質(zhì)細(xì)胞微島上載置神經(jīng)元，在以補(bǔ)加有B27(Gibco)的神經(jīng)基礎(chǔ)A 培養(yǎng)基(Gibco)為基本的溶液中發(fā)育。如此將由相同的動物培養(yǎng)的神經(jīng)元 分為兩組，以規(guī)定的濃度向培養(yǎng)基中添加BDNF(在大腸桿菌中表達(dá)的重 組蛋白質(zhì)Sigma制、在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)R&D Systems 制)和實施例2中制備的抗IE62單克隆抗體，由日齡一致的姐妹培養(yǎng)物 得到數(shù)據(jù)。平板接種后10 ~ 15天進(jìn)行記錄。
接著，就BDNF和抗IE62抗體以及作為TrK受體酪氨酸激酶的抑 制劑的K252a對脊神經(jīng)后根神經(jīng)元的作用進(jìn)行研究。結(jié)果如圖5A-5D所 示。
實施例7 形態(tài)的分析
記錄熒光圖像后，將神經(jīng)元和與生物素結(jié)合的抗小鼠IgGl —起在 37。C下培養(yǎng)1小時。然后，使用ABC試劑盒(Vector Laboratories),使 MAP2可視化。使用設(shè)置在倒置顯微鏡(TE300 ; Nikon)上的 Neurolucida(MicroBrightField),描繪神經(jīng)元的神經(jīng)突。神經(jīng)突的形態(tài)的 定量評1^介4吏用分析4欠件Neuroexplore(MicroBrightField)進(jìn)4亍。
實施例8
通過抗IE62單克隆抗體實現(xiàn)的Arc(Activity-regulated
23cytoskeleton-associated protein)和BDNF的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)
由實施例6中使用的大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元，使用ISOGEN(日本 GENE)提取全RNA。定量PCR如下進(jìn)行。對于大鼠BDNF基因的外顯 子III ~ V(Imamura L. et al., J Pharmacol., Exp. Ther 316: 136-143, 2006)Arc cDNA和卩-肌動蛋白 cDNA , 分別使用 Arc正義 (5，-CGCTGGAAGAAGTCCATCAA-3，)(序歹'J號 14) 、 Arc 反義 (5，-GGGCTAACAGTGTAGTCGTA-3，)(序列號15)、卩-肌動蛋白正義 (5，-TTTGAGACCTTCAACACCCC-3，)(序列號16)、卩-肌動蛋白反義 (5'-ACGATTTCCCTCTCAGCTGT-3，)(序列號17)引物，進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增。
PCR的溫度分布是在95。C預(yù)變性IO分鐘后如下所述以在95。C變 性45秒，在55。C退火45秒以及在72。C延長1分鐘作為1個循環(huán)，進(jìn) 行45個循環(huán)(外顯子1)、 31個循環(huán)(外顯子11)、 26個循環(huán)(外顯子m)和 29個循環(huán)(外顯子IV)，并在72匸最終延長10分鐘。BDNF基因的外顯 子III V的擴(kuò)增使用57。C的退火溫度。熒光在各72。C的延長步驟的最 終階l殳獲得。各mRNA的表達(dá)水平使用P-肌動蛋白mRNA的水平進(jìn)行 歸一化。
結(jié)果
融合蛋白質(zhì)
重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過它們的序列確認(rèn)。GST-IE62融合蛋白質(zhì)1~5 的免疫原性通過使用VZV抗血清的Western印跡確認(rèn)。該抗血清通過 IFA試驗確認(rèn)VZV感染細(xì)胞的核染色為陽性，用Western印跡檢出IE62 蛋白質(zhì)。接著，對IE62-GST融合蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，作為IE62蛋白質(zhì)進(jìn) 一步用于特性評價。圖1A表示含有整個IE62分子和它們的產(chǎn)物的 GST-IE62融合蛋白質(zhì)1 ~ 5和A ~ G的簡圖。
通過帶狀皰滲恢復(fù)期血清識別IE62和BDNF
圖1C和圖1D表示來自帶狀皰滲患者的血清與BDNTF、 GST-IE62 融合蛋白質(zhì)2反應(yīng)的總結(jié)，以及Western印跡的代表性圖案的一例。帶 狀皰滲患者血清(No.23)在Western印跡中識別IE62的片段2和F以及 BDNF。另一方面，患者血清(No.28)識別IE62的片段2，但是未識別IE62 的片段F或BDNF。 6名患者的血清與BDNF反應(yīng)，其中5名患者的血 清識別IE62融合 白質(zhì)。2名患者的血清識別IE62，但是未識別BDNF。IE62與BDNF的識別雖然在全部患者中不相關(guān)，但是來自6名患者的血 清表現(xiàn)出與對IE62和BDNF的抗體應(yīng)答的相關(guān)。
通過各單克隆抗體進(jìn)行的BDNF和IE62的交叉識別 本發(fā)明人制備了 IE62-GST融合蛋白質(zhì)的單克隆抗體。該單克隆抗 體對于覆蓋整個IE62分子的IE62-GST融合蛋白質(zhì)的反應(yīng)性如圖2A所 示。如圖2A所示，抗BDNF單克隆抗體和抗VZV IE62單克隆抗體兩 者都同樣地識別VZV IE62的相同區(qū)域。圖2B表示通過抗BDNF單克 隆抗體和抗VZV IE62單克隆抗體染色的IFA圖案，兩抗體主要染色受 感染細(xì)胞的核。通過Western印跡和IFA確認(rèn)抗BDNF單克隆抗體識別 IE62蛋白質(zhì)。
如圖2C所示，BDNF蛋白質(zhì)被抗VZVIE62單克隆抗體和抗BDNF 單克隆抗體兩者印跡、探針標(biāo)記，兩抗體同樣地識別BDNF。用抗IE62 單克隆抗體探針標(biāo)記BDNF時，與BDNF的二聚物反應(yīng)，而不是與其單 體反應(yīng)。這暗示了抗IE62單克隆抗體識別通過BDNF 二聚物形成的立 體結(jié)構(gòu)的表位。識別IE62的抗BDNF單克隆抗體與抗IE62單克隆抗體 同樣地，與BDNF的二聚物反應(yīng)，而不是與BDNF的單體反應(yīng)。VZV IE62 與BDNF的這種免疫學(xué)交叉反應(yīng)性通過各自的單克隆抗體確認(rèn)。
BDNF與IE62的交叉反應(yīng)表位的鑒定
抗IE62單克隆抗體除了識別GST融合蛋白質(zhì)2之外，還識別區(qū)域 C和F(圖2A)。區(qū)域C和F的重疊區(qū)域表示IE62蛋白質(zhì)的氨基酸414-447 位，使用含有該區(qū)域的3個構(gòu)建肽，在Western印跡中封閉反應(yīng)，由此 決定VZV IE62的表位。含有414位~ 429位氨基酸的肽封閉抗VZV IE62 抗體與抗BDNF抗體兩抗體的相互作用。這表示IE62的氨基酸414-447 位的肽的表位被抗VZVIE62抗體和抗BDNF抗體識別(圖3)。但是，該 肽不能在Western印跡中封閉抗IE62和抗BDNF單克隆抗體與BDNF 的反應(yīng)。因此，兩單克隆抗體的表位為IE62的氨基酸414-447位的線狀 的表位，但任意一種單克隆抗體都不能在相同條件下封閉通過二聚物形 成的BDNF的立體結(jié)構(gòu)的表位。
以上的結(jié)果暗示了交叉反應(yīng)表位為VZV IE62的氨基酸414 ~ 429位。
本發(fā)明人使用培養(yǎng)神經(jīng)元，將抗VZV IE62單克隆抗體對BDNF的 生物活性的作用特征化?？筕ZVIE62單克隆抗體如圖4A所示，顯著地促進(jìn)Arc和BDNF外顯子3-5的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步地，抗VZV IE62單克隆 抗體顯著地增加神經(jīng)細(xì)胞體的面積、分枝點(diǎn)、被BDNF刺激的神經(jīng)突的 長度(圖4C 圖4E)。因此，抗VZV正62單克隆抗體從生物學(xué)和生化學(xué) 標(biāo)志方面考慮，未中和反而增大BDNF的活性。因此，2個生物活性BDNF 作為二價BDNF通過抗VZV IE62單克隆抗體連接，該二價的BDNF可 能與兩個相鄰的TrkB分子結(jié)合，與一價的BDNF-TrkB相互作用相比傳 遞更強(qiáng)的信號，其結(jié)果是促進(jìn)Arc和BDNF的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的神 經(jīng)突的發(fā)展?；蛘?，認(rèn)為抗體與BDNF的結(jié)合使BDNF的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化， 促進(jìn)與TrkB受體的結(jié)合。
通過BDNF促進(jìn)GABA性神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)發(fā)展
為了評價BDNF對神經(jīng)元的發(fā)育抑制的效果，本發(fā)明人對確認(rèn)與抗 GAD65抗體反應(yīng)的皮質(zhì)(GABA性)神經(jīng)元的形態(tài)進(jìn)行了定量分析。如圖 4B(a)和圖4B(b)所示，與抗VZV IE62單克隆抗體和BDNF —起培養(yǎng)的 皮質(zhì)神經(jīng)元與其它的對照神經(jīng)元相比具有大的細(xì)胞體，具有更多的神經(jīng) 突的分枝。
為了對該發(fā)現(xiàn)進(jìn)行定量，本發(fā)明人對體細(xì)胞區(qū)域和各神經(jīng)元的神經(jīng) 突形態(tài)的三個參數(shù)進(jìn)行計算(圖4C~圖4E)。與BDNF—起培養(yǎng)的10個 神經(jīng)元的體細(xì)胞的平均區(qū)域與11個對照神經(jīng)元的平均區(qū)域相比顯著增 大(PO.Ol、 ANOVA)(圖4C)。 BDNF處理過的神經(jīng)元的原代神經(jīng)突的平 均數(shù)目與對照神經(jīng)元的數(shù)目相比顯著增大(PO.Ol、 ANOVA)。此外，處 理神經(jīng)元的神經(jīng)突的總長度的平均值與對照神經(jīng)元相比顯著增大 (P<0.01、 ANOVA)(圖4E)。最后，BNDF處理神經(jīng)元的神經(jīng)突的分枝點(diǎn) 的平均數(shù)目與對照神經(jīng)元的數(shù)目相比顯著增大(PO.Ol、 ANOVA)(圖 4D)。這些結(jié)果暗示了 BDNF促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元的體細(xì)胞神經(jīng)元和神經(jīng)突 的發(fā)育。
通過BDNF促進(jìn)脊神經(jīng)后根神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)的發(fā)展 為了確認(rèn)BDNF的這種作用通過TrkB受體的活化引起，將Trk受 體酪氨酸激酶的抑制劑K252a適用于用BDNF處理過的脊神經(jīng)后根神經(jīng)
用。這在神經(jīng)突的體細(xì)胞區(qū)域和三個參數(shù)的定量分析中表現(xiàn)出來(圖 5A~圖5D、從各圖(panel)的右側(cè)開始第三個柱)。用K252a處理過的10 個神經(jīng)元的體細(xì)胞的平均區(qū)域與對照神經(jīng)元的平均區(qū)域無顯著性差異。此外，K252a處理神經(jīng)元的一次神經(jīng)突的數(shù)目與對照神經(jīng)元的值無顯著 性差異。K252a處理神經(jīng)元的神經(jīng)突的總長度與對照神經(jīng)元的值無顯著 性差異。K252a處理神經(jīng)元的神經(jīng)突的分枝點(diǎn)的平均數(shù)目與對照神經(jīng)元 的值無顯著性差異?？芍狵252a抑制BDNF的作用的同時抑制IE62抗 體(IE10)的增強(qiáng)作用(圖5A-圖5D、各圖的右邊三個柱)。脊神經(jīng)后根神 經(jīng)元為興奮性神經(jīng)元，該神經(jīng)元直接傳遞痛感，因此可知本發(fā)明的抗體 通過BDNF的活化促進(jìn)脊髓后角的興奮性神經(jīng)元的神經(jīng)突的延長。 實施例9
抑制BDNF活性的抗體的制備
1) GST-IE62融合蛋白質(zhì)的表達(dá)
作為IE62蛋白質(zhì)，使用VZV的野生林(Kawaguchi抹)來替代VZV 的Oka林，通過PCR擴(kuò)增編碼序列號2的268-341位的氨基酸序列的 DNA,并與編碼GST的DNA連結(jié)，除此之外與實施例1中記載的方法 同樣地操作，制備GST-IE62融合蛋白質(zhì)。
2) 單克隆抗體的制備和篩選
使用上述l)中得到的GST-IE62融合蛋白質(zhì)，本質(zhì)上根據(jù)已經(jīng)報道 的方法(Okuno et al, Virology 129， 357-368(1983))制備單克隆抗體。通過 對于GST蛋白質(zhì)的ELISA和對于VZV感染細(xì)胞的免疫熒光抗體篩選雜 交瘤的培養(yǎng)上清，克隆產(chǎn)生IE-62單克隆抗體的雜交瘤。以BDNF作用 的抑制作為指標(biāo)對所得到的單克隆抗體(KSG1 ~ 13)進(jìn)行的篩選，根據(jù)實 施例6記載的方法通過記錄神經(jīng)元的神經(jīng)突的延長來進(jìn)行，由此得到本 發(fā)明的抑制抗體。
3) 單克隆抗體與IE62肽的反應(yīng)性
通過Western印跡確認(rèn)得到的單克隆抗體(KSG1 ~ 6、 8、 12和13) 與IE62肽(圖1A的片段A或片段E)或GST蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。得到的所 有單克隆抗體都不與GST蛋白質(zhì)反應(yīng)。KSG1、 2和6與片段A反應(yīng)， 其它的單克隆抗體與片段A和片段E反應(yīng)。
接著，通過斑點(diǎn)印跡確認(rèn)單克隆抗體(KSG1 ~ 8、 10、 12和13)與正62 肽的反應(yīng)性。即，通過斑點(diǎn)印跡確認(rèn)分別用胰蛋白酶、蛋白酶K、凝血 酶或V8蛋白酶切斷IE62肽片段A或片段E的GST融合蛋白質(zhì)得到的 切斷物與上述單克隆抗體的反應(yīng)性。其結(jié)果推測是，KSG1、 2和6的表 位存在于正62肽片段A的N末端側(cè)，KSG3、 4、 5、 12和13的表位存在于IE62肽片段A的中央部并且是片段E的N末端側(cè)，KSG8的表位 存在于IE62肽片段A的中央部并且是片段E的N末端側(cè)和其C末端側(cè) 的兩部位。
接著，合成選自序列號
RSSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSP)中的兩種肽，肽1: GRSSGGKPRAFLALP(序列號19)和肽2: DTRPRKHDARGITPR(序列號 20),用這些肽吸收上述單克隆抗體進(jìn)行Western印跡后，KSG8被肽2 吸收，而KSG3、 4、 5、 12和13不能^皮肽1和2吸收。 4) 4吏用抑制BDNF活性的抗體的神經(jīng)染色
從大鼠胎兒腦取出大腦皮質(zhì)和中腦進(jìn)行原代培養(yǎng)，使用單克隆抗體 KSG1和4進(jìn)行免疫染色。結(jié)果如圖6A~圖6D所示?？芍种艬DNF 活性的抗體將神經(jīng)細(xì)胞染色。
實施例10
往大鼠胎兒原代培養(yǎng)大腦皮質(zhì)中添加用PHN患者血清處理過的 BDNF時BDNF mRNA表達(dá)量的變動
進(jìn)行大鼠胎兒的大腦皮質(zhì)的原代培養(yǎng)，對由于添加用PHN患者血 清處理過的BDNF蛋白質(zhì)而引起的BDNF mRNA表達(dá)量的變動進(jìn)行調(diào) 查。在妊娠的第17天從10只大鼠的胎兒取出大腦皮質(zhì)，用胰島素和 DNase處理，在用聚-L-賴氨酸涂布的6孔板中，在含有10%FCS的 Dulbecco，s MEM存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，將培養(yǎng)基更換為不含有血 清的Dulbecco，s培養(yǎng)基，進(jìn)一步培養(yǎng)3天。使PHN患者血清(IO倍稀釋 的血清20pl)與BDNF蛋白質(zhì)10ng(10ng/pl、 lpl)在水中反應(yīng)4小時后， 將反應(yīng)混合物添加到大鼠胎兒大腦皮質(zhì)原代培養(yǎng)細(xì)胞中，進(jìn)一步培養(yǎng)3 小時。細(xì)胞用水冷卻的PBS洗滌2次后，提取RNA。向得到的RNA中 加入PolydT(15)和逆轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行cDNA合成。將所得到的cDNA用由 BDNF的外顯子3與外顯子5的序列設(shè)計的引物和作為內(nèi)標(biāo)的|3-肌動蛋 白的引物分別進(jìn)行實時(real time) PCR,進(jìn)行BDNF的mRNA的定量。
結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，將用PHN患者的血清處理過的BDNF 蛋白質(zhì)添加到大鼠胎兒大腦皮質(zhì)中時，與單獨(dú)使用BDNF蛋白質(zhì)時相比， BDNF mRNA的表達(dá)量增大。
實施例11
28人型抗體的產(chǎn)生
由于與BDNF免疫交叉的IE62的部位已經(jīng);陂鑒定，〗吏用人抗體文 庫(AIMS4)和表達(dá)該部位的IE62-GST融合蛋白，篩選對于該表位的人型抗體。
將IE62-GST融合蛋白涂布到試管上，與AIMS4噬菌體文庫反應(yīng)， 洗滌未反應(yīng)的噬菌體，向反應(yīng)的噬菌體中加入大腸桿菌，使該噬菌體增 殖。然后，對增殖的噬菌體進(jìn)一步在涂布IE62-GST融合蛋白的試管中 通過洗淘法進(jìn)行選擇，重復(fù)此操作。該增殖的噬菌體在用BDNF涂布的 試管中選擇增殖。通過Western印跡檢查所選擇的噬菌體產(chǎn)生的CP3-Fab 對于IE62-GST融合蛋白和BDNF的反應(yīng)性。選擇表現(xiàn)出與和BDNF交 叉反應(yīng)的抗IE62抗體同樣的反應(yīng)性的抗體克隆。Fab抗體的BDNF活性 調(diào)節(jié)作用用神經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行研究。IgG抗體結(jié)合到具有活性的克隆上。 比較Fab抗體與IgG抗體的調(diào)節(jié)作用，將適當(dāng)?shù)囊环綖榱伺R床應(yīng)用而用 于實驗中。
實施例12
對于小腦的浦肯野細(xì)胞的神經(jīng)突的延長和發(fā)育的影響
給出生后1天的小鼠或大鼠接種本發(fā)明的抗體，3周后對小腦的浦 肯野細(xì)胞的神經(jīng)突進(jìn)行染色，研究對于神經(jīng)突的延長和發(fā)育的影響。由 于浦肯野細(xì)胞是在小腦內(nèi)均勻分布的細(xì)胞，可以對神經(jīng)突的延長進(jìn)行定 量化，并且適合作為評價對神經(jīng)細(xì)胞的影響的體系。
由對接種實施例2中得到的抗體后的神經(jīng)突的平均長度、分枝點(diǎn)進(jìn) 行調(diào)查得到的腦的病理數(shù)據(jù)的評價，來評價實施例2的抗體促進(jìn)神經(jīng)突 的延長。因此，該抗體與通過BDNF的神經(jīng)細(xì)胞的活化，神經(jīng)聯(lián)系的促 進(jìn)、再生等神經(jīng)疾病的治療相關(guān)。
由對接種實施例9中得到的抑制抗體后的神經(jīng)突的平均長度、分枝 點(diǎn)進(jìn)行調(diào)查得到的腦的病理數(shù)據(jù)的評價，來評價實施例9的抗體抑制神 經(jīng)突的延長。因此如下評價，1)由于抑制通過BDNF的神經(jīng)突的延長， 在帶狀皰滲后神經(jīng)痛時形成的過量的神經(jīng)聯(lián)系^^皮限制，因此，可以抑制 痛覺過敏的發(fā)病；2)慢性疼痛時，同樣地通過抑制利用BDNF的作用 形成神經(jīng)聯(lián)系，可以抑制慢性疼痛的形成。
實施例13
在阿爾茨海默病才莫型小鼠中抗IE62單克隆抗體對記憶障礙、軸突的萎縮、突觸減少的恢復(fù)
為了機(jī)能性地修復(fù)癡呆的神經(jīng)回路網(wǎng)的障礙，以神經(jīng)突延長促進(jìn)作
用為指標(biāo)進(jìn)行合適的抗IE62單克隆抗體的篩選。有些抗IE62單克隆抗 體(例如IE62B)具有神經(jīng)突延長活性，為了研究表現(xiàn)出神經(jīng)突延長活性 的單克隆抗體對癡呆的記憶障礙是否具有作用，使用單次腦室內(nèi)給予作 為阿爾茨海默病的原因物質(zhì)的淀粉樣蛋白(amyloid)b(Ab)的活性部分序 列25-35肽制備的阿爾茨海默病的模型小鼠。
給予Ab(25-35)的小鼠中，空間記憶的獲得和保持與對照組相比， 顯著減弱。對腦切片進(jìn)行免疫染色后，在大腦皮質(zhì)和海馬中，觀察到軸 突和突觸顯著減少。
給予Ab(25-35) 7天后給予抗IE62單克隆抗體(例如IE62B)的組中， 記憶獲得、保持能力都維持在對照組的水平，確認(rèn)軸突和突觸保持正常 水平、樹突的再形成。
接著，對原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中的抗IE62單克隆抗 體(例如IE62B)的作用進(jìn)行研究?？笽E62單克隆抗體特異性地使大腦 皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的軸突延長。即使在通過處置Ab(25-35)，誘發(fā)軸突和樹 突萎縮的狀態(tài)下使抗IE62單克隆抗體發(fā)揮作用時，抗IE62單克隆抗體 也特異性地促進(jìn)軸突延長。由以上的結(jié)果暗示了抗IE62單克隆抗體(例 如IE62B)抑制Ab(25-35)誘發(fā)的軸突的萎縮、突觸減少，有可能由此恢 復(fù)記憶障礙，對神經(jīng)回路網(wǎng)的再構(gòu)建是有效的。
實施例14
腦卒中易發(fā)性高血壓大鼠(SHRSP)的腦卒中預(yù)防效果的研究 使用腦卒中易發(fā)性高血壓大鼠(Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rat, SHRSP),對腦卒中預(yù)防效果進(jìn)行研究。作為SHRSP 的腦卒中發(fā)病時的主要癥狀，可見一側(cè)前肢的抬起運(yùn)動、步行異常、過 敏、自主運(yùn)動量的減少、立毛、體重減少、攝食量減少等。作為特征性 的組織變化，確認(rèn)有腦軟化、腦出血、血管壞死、心臟肥大、腎硬化癥、 腸系膜動脈的結(jié)節(jié)性多發(fā)性血管炎、睪丸萎縮等。 (方法)
對SHRSP(IO周齡)的雄性大鼠給予1%食鹽水或自來水，以規(guī)定的 用量靜脈內(nèi)給予抗IE62單克隆抗體(IE62B)，進(jìn)行觀察。實驗期間中， 每周測定攝食量、飲水量、體重l次的同時，記錄腦卒中發(fā)病日和死亡日。血壓使用小動物自動血壓測定裝置(Ueda制作所、UR-5000),通過 tail cuff法進(jìn)行測定。 (結(jié)果)
1. 食鹽負(fù)荷的影響
可知1%食鹽負(fù)荷幾乎不影響體重而促進(jìn)血壓升高，與自來水飼養(yǎng) 相比存活時間縮短至1/2以下。
2. 腦卒中預(yù)防效果
可知抗IE62單克隆抗體(IE62B)才及其顯著地延長存活時間，表現(xiàn)出 食鹽負(fù)荷組的約3.5倍、比自來水飼養(yǎng)組進(jìn)一步長期存活100天的顯著 效果。
實施例15
對于Gerbil大鼠腦血管障礙才莫型的抗IE62抗體的神經(jīng)細(xì)胞死亡抑 制作用、再生促進(jìn)作用
由于Gerbil大鼠為不受橈動脈影響的大鼠，預(yù)先給予抗IE62抗體， 結(jié)扎頸內(nèi)動脈5分鐘，引起血管障礙(由于血腦屏障的破壞使抗體浸滲到 腦內(nèi))，再次打開。l周后，通過尼氏染色，對神經(jīng)細(xì)胞死亡進(jìn)行研究。 以對缺血敏感性高、BDNF的表達(dá)強(qiáng)的海馬CA1區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞的脫落 為指標(biāo)，對該抗體的影響進(jìn)行研究。
(結(jié)果)
確認(rèn)通過抗IE62抗體改善CA1區(qū)域的細(xì)胞死亡。 實施例16
大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的BDNP和Arc基因的持續(xù)性表達(dá)的研究 (目的)
有報告指出，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對神經(jīng)細(xì)胞的存活、可塑 性的維持是重要的,Arc(Activity畫regulated cytoskeleton-associated protein) 與突觸可塑性相關(guān)。對于對大鼠給予抗IE62單克隆抗體(IE62B)后的 BDNF以及Arc基因的持續(xù)性表達(dá)控制系統(tǒng)進(jìn)行研究。
(方法)
E17大鼠大腦皮質(zhì)原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞用2.5xl()S個細(xì)胞/35mm皿進(jìn) 行培養(yǎng)。在培養(yǎng)第6天添加BDNF， 3小時后更換培養(yǎng)基(BDNF清除 (washout))。通過定量的RT-PCR測定BDNF和Arc mRNA表達(dá)量。
(結(jié)果、考察)在原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中，BDNF和Arc mRNA表達(dá)量，從BDNF清 除后48小時后顯著增加。具體研究的結(jié)果可知，BDNF mRNA表達(dá)的 持續(xù)性主要依賴于神經(jīng)活動。
另一方面，暗示了 Arc mRNA表達(dá)的持續(xù)性依賴于BDNF信號。進(jìn) 一步地，BDNF增加與突觸密度存在相關(guān)性的細(xì)胞內(nèi)釣變動的頻率。由 以上結(jié)果認(rèn)為，BDNF基因的神經(jīng)活動依賴且持續(xù)性的表達(dá)控制機(jī)構(gòu)， 通過對Arc基因表達(dá)附加持續(xù)性，在維持突觸機(jī)能上發(fā)揮基本的作用。
實施例17
大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的BDNF的自主、持續(xù)性的表達(dá)控制系統(tǒng)的
研咒
(目的)
為了明確給予抗IE62單克隆抗體后的BDNF的mRNA表達(dá)量持續(xù) 性增加，進(jìn)一步地，對于報告與突觸可塑性相關(guān)的Arc的mRNA表達(dá)量 進(jìn)行分析，與BDNF mRNA表達(dá)的情況進(jìn)行比較。
(，法) 成 人，、、；，、z .々/、 、、>、、
35mm皿上、以2.5><106個細(xì)胞/2mL進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)第6天添加 BDNF(100ng/mL), 3小時后更換3次培養(yǎng)基(清除BDNF)。通過定量 RT-PCR法測定BDNF mRNA和Arc mRNA表達(dá)量。
(結(jié)果、考察)
在原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中，BDNF添加組、BDNF清除組的BDNF mRNA表達(dá)量在24小時~ 72小時與對照組相比都持續(xù)性增加約2倍。 此時，Arc mRNA表達(dá)量與對照組相比24小時增加約20倍，在48小時、 72小時維持約2倍的表達(dá)量。這些mRNA增加在TrkB抑制劑K252a 的存在下被抑制。此外，若使用BDNF中和抗體，則BDNF mRNA表達(dá) 量不變化，但是Arc mRNA表達(dá)量顯著減少。
進(jìn)一步地，使用各種抑制劑的結(jié)果是，得到表現(xiàn)出實現(xiàn)BDNF mRNA 和Arc mRNA的持續(xù)性表達(dá)的信號傳遞不同的結(jié)果。
由以上結(jié)果暗示通過利用BDNF的自主性基因表達(dá)而合成、分泌的 BDNF活化通過TrkB的多個信號傳遞路徑，由此持續(xù)地活化BDNF和 Arc基因表達(dá)。
以神經(jīng)細(xì)胞中具有的BDNF為中心的自主性、持續(xù)性表達(dá)控制機(jī)理，發(fā)揮在維持神經(jīng)可塑性時發(fā)揮基本作用。實施例18本發(fā)明的抗體在導(dǎo)入有人APP基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中的作用 若對強(qiáng)力表達(dá)人型APP基因、隨著年齡的增加產(chǎn)生腦的老年斑的PD-APP小鼠(Tg2576小鼠)給予抗IE62單克隆抗體，則預(yù)防老年斑的形成。給予抗IE62單克隆抗體(IE62B、 KSG1 ~ 13)的小鼠的學(xué)習(xí)機(jī)能恢復(fù)。對Tg2576小鼠一次給予抗IE62單克隆抗體(IE62B、 KSG1 ~ 13)。 接種小鼠中老年斑淀粉樣蛋白的沉積顯著減少，看不到腦炎等副作用。 該方法期待可以作為阿爾茨海默病的預(yù)防、治療方法應(yīng)用于人。對上述Tg2576小鼠注射本發(fā)明的抗體(與BDNF交叉反應(yīng)的抗IE62 抗體)，通過記憶水池的淺位置的"水迷宮"的實驗對1個月后的記憶力進(jìn) 行研究。給予本發(fā)明抗體的小鼠，在給藥前未能記憶淺灘的位置的記憶力恢 復(fù)至與野生型小鼠相似的水平。工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)突的延長促進(jìn)劑、神經(jīng)性疾病的預(yù)防或治療劑， 可以使迄今為止無有效技術(shù)方案的神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生。此外，根據(jù) 本發(fā)明的神經(jīng)突的延長抑制劑，期待對迄今為止無有效技術(shù)方案的帶狀 皰滲后神經(jīng)痛或慢性疼痛等發(fā)揮效果。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防或 治療劑，期待改善經(jīng)驗依賴性社會厭惡、壓力等伴隨有神經(jīng)過敏的疾病。本申請以在日本申請的日本特愿2006-312236(申請日2006年11 月17日)為基礎(chǔ)，其內(nèi)容全部包含在本說明書中。
權(quán)利要求
1.神經(jīng)突的延長促進(jìn)劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)的抗體作為有效成分。
2. 如權(quán)利要求1所述的促進(jìn)劑，其中，所述蛋白質(zhì)為IE62,所述 抗體識別具有序列號2的414-429位的氨基酸序列的肽。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的促進(jìn)劑，其中，所述腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因 子為二聚物。
4. 神經(jīng)性疾病的預(yù)防或治療劑，含有識別水痘-帶狀皰滲病毒立即 早期蛋白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)的抗體作為有效成分。
5. 如權(quán)利要求4所述的預(yù)防或治療劑，其中，所述蛋白質(zhì)為IE62, 所述抗體識別具有序列號2的414-429位的氨基酸序列的肽。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的預(yù)防或治療劑，其中，所述腦源性神經(jīng) 營養(yǎng)因子為二聚物。
7. 如權(quán)利要求4~6中任意一項所述的預(yù)防或治療劑，其中，所述 神經(jīng)性疾病為伴隨有由于選自腦卒中、缺氧癥、窒息、身體損傷、暴露 于毒素、惡性新生物、癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮性側(cè)索 硬化癥中的狀態(tài)引起的損傷的神經(jīng)細(xì)胞的疾病。
8. 商業(yè)包裝，包括權(quán)利要求1 ~3中任意一項所述的神經(jīng)突的延長劑的記載物。
9. 商業(yè)包裝，包括權(quán)利要求4~7中任意一項所述的神經(jīng)性疾病的 預(yù)防或治療劑、以及記載該預(yù)防或治療劑可以或應(yīng)該用于神經(jīng)性疾病的 關(guān)于該預(yù)防或治療劑的記載物。
10. 神經(jīng)突的延長抑制劑，含有識別水痘-帶狀皰滲病毒立即早期蛋 白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)的抗體作為有效成分。
11. 如權(quán)利要求10所述的抑制劑，其中，所述蛋白質(zhì)為IE62,所 述抗體為抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的抗體。
12. 如權(quán)利要求11所述的抑制劑，其中，所述抗體識別具有選自序 列號2的268-341位的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸的肽。
13. 伴隨有由于選自帶狀皰滲后神經(jīng)痛、慢性疼痛、經(jīng)-驗依賴性社 會厭惡和壓力中的狀態(tài)引起的神經(jīng)過敏的疾病的預(yù)防或治療劑，含有識 別水痘-帶狀皰滲病毒立即早期蛋白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)的抗體作為有效成分。
14. 如權(quán)利要求13所述的預(yù)防或治療劑，其中，所述蛋白質(zhì)為IE62, 所述抗體為抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的抗體。
15. 如權(quán)利要求14所述的預(yù)防或治療劑，其中，所述抗體識別具有 選自序列號2的268-341位的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸的肽。
16. 商業(yè)包裝，包括權(quán)利要求10~ 12中任意一項所述的神經(jīng)突的延該抑制劑的記載物。
17. 商業(yè)包裝，包括權(quán)利要求13~15中任意一項所述的預(yù)防或治療后神)痛、慢性疼痛:經(jīng)驗依;性;土:惡和壓力中的狀態(tài)引起的神纟i過敏的疾病的關(guān)于該預(yù)防或治療劑的記載物。
18. 制備權(quán)利要求1 ~7中任意一項所述的抗體的方法，包括使用具 有選自序列號2的414-429位的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸的 肽作為抗原、篩選抗體文庫的步驟。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述抗體文庫為人抗體文庫。
20. 制備權(quán)利要求10~ 15中任意一項所述的抗體的方法，包括使用 具有選自序列號2的268-341位的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸 的肽作為抗原、篩選抗體文庫的步驟。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述抗體文庫為人抗體文庫。
22. 神經(jīng)性疾病的預(yù)防或治療方法，包括向?qū)ο蠼o予有效量的識別 水痘-帶狀皰滲病毒立即早期蛋白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng) 的抗體。
23. 如權(quán)利要求22所述的預(yù)防或治療方法，其中，所述蛋白質(zhì)為 正62,所述抗體識別具有序列號2的414-429位的氨基酸序列的肽。
24. 如權(quán)利要求22所述的預(yù)防或治療方法，其中，所述腦源性神經(jīng) 營養(yǎng)因子為二聚物。
25. 如權(quán)利要求22所述的預(yù)防或治療方法，其中，所述神經(jīng)性疾病 為伴隨有由于選自腦卒中、缺氧癥、窒息、身體損傷、暴露于毒素、惡 性新生物、癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮性側(cè)索硬化癥中的 狀態(tài)引起的損傷的神經(jīng)細(xì)胞的疾病。
26. 伴隨有由于選自帶狀皰滲后神經(jīng)痛、慢性疼痛、經(jīng)驗依賴性社會厭惡和壓力中的狀態(tài)引起的神經(jīng)過敏的疾病的預(yù)防或治療方法，包括 向?qū)ο蠼o予有效量的識別水痘-帶狀皰滲病毒立即早期蛋白質(zhì)、且與腦源 性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)的抗體。
27. 如權(quán)利要求26所述的預(yù)防或治療方法，其中，所述蛋白質(zhì)為 IE62，所述抗體為抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的抗體。
28. 如權(quán)利要求27所述的預(yù)防或治療方法，其中，所述抗體識別具 有選自序列號2的268-341位的氨基酸序列中的至少7個連續(xù)氨基酸的肽。
全文摘要
本發(fā)明提供有助于帶狀皰疹后神經(jīng)痛的機(jī)理的闡明，促進(jìn)損傷的神經(jīng)再生的技術(shù)方案，還提供對由于帶狀皰疹后神經(jīng)痛、慢性疼痛、皰疹后神經(jīng)痛、腦卒中、退行性疾病等伴隨的神經(jīng)細(xì)胞死亡所導(dǎo)致的障礙，或上述疾病的預(yù)防或治療有效且副作用少的技術(shù)方案。神經(jīng)突的延長促進(jìn)劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質(zhì)、且與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子交叉反應(yīng)的抗體作為有效成分，神經(jīng)性疾病的預(yù)防或治療劑，含有上述抗體作為有效成分，神經(jīng)突的延長抑制劑，含有識別水痘-帶狀皰疹病毒立即早期蛋白質(zhì)、且抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的抗體作為有效成分，伴隨有由于選自帶狀皰疹后神經(jīng)痛、慢性疼痛、經(jīng)驗依賴性社會厭惡和壓力中的狀態(tài)引起的神經(jīng)過敏的疾病的預(yù)防或治療劑，含有上述抑制抗體作為有效成分。
文檔編號A61K39/395GK101626785SQ20078005010
公開日2010年1月13日 申請日期2007年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月17日
發(fā)明者吉田與志博, 津本忠治, 津田正明, 浜結(jié)香, 白木公康, 遠(yuǎn)藤俊郎, 高橋理明 申請人:財團(tuán)法人阪大微生物病研究會