專利名稱：：抗notch3激動性抗體及其在治療notch3相關(guān)疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗Notch3激動性抗體及其在改善、治療、或預(yù)防Notch3相關(guān)疾病或病癥中的用途。
背景技術(shù)：
：Notch基因是在1917年首次記載的，當(dāng)時發(fā)現(xiàn)一個果蠅即黑腹果蠅(Dmyop/n7ame/a"ogaWe。品系具有缺刻翅片(Morgan,AmNat51:513(1917))。該基因幾乎70年后才被克隆出來，并被確定為一種細(xì)胞表面受體，其在果蠅許多不同細(xì)胞類型和組織的發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Wharton等，Cell43:567(1985))。不久就發(fā)現(xiàn)Notch信號傳導(dǎo)途徑是一種由細(xì)胞-細(xì)胞接觸介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)機(jī)制，且從果蠅到人類在進(jìn)化上是保守的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Notch受體參與許多細(xì)胞過程，諸如發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)過程中各種細(xì)胞類型的凋亡、分化、細(xì)胞命運(yùn)決定、干細(xì)胞維持、細(xì)胞運(yùn)動性、和增殖(參見綜述Artavanis-Tsakonas等，Science268:225(1995》。哺乳動物擁有四種Notch受體蛋白(稱為Mfc/z7至iVofc/74)和五種相應(yīng)配體(稱為德耳塔(5)樣-l(DLL-l)、德耳塔樣-3(DLL-3)、德耳塔樣-4(DLL-4)、Jagged-l和Jagged-2)。哺乳動物Notch受體基因編碼約300kD的蛋白質(zhì)，它們在轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面的過程中遭到切割且以異二聚體形式存在。Notch受體的胞外部分具有34個表皮生長因子(EGF)樣重復(fù)和3個富含半胱氨酸Notch/LIN12重復(fù)。兩個切割后的亞基之間的結(jié)合是由緊挨著位于切割位點(diǎn)N端和C端的序列介導(dǎo)的，而且這兩個亞基構(gòu)成Notch異二聚化(HD)結(jié)構(gòu)域(Wharton等，Cell43:567(1985);Kidd等，MolCellBiol6:3431(1986);Kopczynski等，GenesDev2:1723(1988);Yochem等，Nature335:547(1988))。目前，仍然不清楚Notch信號傳導(dǎo)如何受到不同受體的調(diào)節(jié)或者五種配體在它們的信號傳導(dǎo)或調(diào)節(jié)中有何不同。信號傳導(dǎo)和/或調(diào)節(jié)中的差異可能是由它們在不同組織中的表達(dá)樣式或由不同環(huán)境誘因控制的。已有記載，Notch配體蛋白(包括Jagged/Serrate和德耳塔/德耳塔樣)特異性結(jié)合EGF重復(fù)區(qū)并誘導(dǎo)受體介導(dǎo)的Notch信號傳導(dǎo)(綜述見Bray，NatureRevMolCellBiol.7:678(2006)及Kadesch,ExpCellRes.260:1(2000))。在各個EGF重復(fù)中，第IO個至第12個重復(fù)是配體結(jié)合Notch受體所要求的，而其它EGF重復(fù)可增強(qiáng)受體-配體相互作用(Xu等，JBiolChem.280:30158(2005);Shimizu等,BiochemBiophysResComm.276:385(2000))。雖然LIN12重復(fù)和二聚化結(jié)構(gòu)域不直接參與配體結(jié)合，但是它們在維持異二聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物、防止不依賴配體的蛋白酶切割、和受體活化中發(fā)揮重要作用(Sanche-Irizarry等，MolCellBiol.24:9265(2004);Vardar等，Biochem.42:7061(2003》。來自許多組織的正常干細(xì)胞(包括腸和神經(jīng)元干細(xì)胞)依賴Notch信號傳導(dǎo)來進(jìn)行自我更新和命運(yùn)決定(Fre等，Nature,435:964(2005);vanEs等,Nature,435:959(2005);Androutsellis隱Theotokis等，Nature,442:823(2006))。因此，Notch3激動性抗體可在變性性疾病中具有應(yīng)用。伴有皮層下梗死和腦白質(zhì)病的腦常染色體顯性動脈病(CADASIL,cerebralautosomaldominantarteriopathywithsubcorticalinfarcts和leukoencephalopathy)引起一類中風(fēng)和癡呆，其關(guān)鍵特征包括復(fù)發(fā)性皮層下缺血事件和血管性癡呆。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CADASIL與一種定位于19號染色體的突變基因有關(guān)(Joutel等，Nature383:707(1996))。Joutel等鑒定了CADASIL患者中引起Notch3基因嚴(yán)重破壞的突變，指明了Notch3可能是CADASIL患者中的缺陷蛋白質(zhì)。不幸的是，這種高度地使喪失能力的且常常致死的疾病仍然大量地未被診斷或誤診為多發(fā)性硬化和阿耳茨海默氏病。當(dāng)前的研究越來越顯示，它是一種比人們最初所認(rèn)為的普遍得多的疾患。Notch3相關(guān)疾病的另一個例子是家族性偏癱性偏頭痛(FHM)，即顯性常染色體形式的有先兆(aura)的偏頭痛，與Notch3基因位于19號染色體的同一區(qū)。應(yīng)當(dāng)注意，超過30。/。的患有CADASIL的患者還患有有先兆的偏頭痛。然而，后者只在約5%的人群中觀察到，此觀察結(jié)果導(dǎo)致人們發(fā)現(xiàn)此疾患的機(jī)制中涉及Notch3基因。類似地，人們已經(jīng)將家族性陣發(fā)性共濟(jì)失調(diào)與位于染色體19同一區(qū)的一種基因聯(lián)系起來，而且已經(jīng)有跡象表明Notch3與此疾患相關(guān)。已經(jīng)與Notch3聯(lián)系起來的其它疾患和疾病包括Alagille綜合征(Flynn等，JPathol204:55(2004))。正在進(jìn)行的研究致力于鑒定其它與Notch3表達(dá)和/或信號傳導(dǎo)缺陷有關(guān)的疾病和疾患。鑒于大量的人類疾病與Notch3信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)，發(fā)現(xiàn)預(yù)防和治療這些疾病的新途徑有重要意義。本發(fā)明提供了新的抗Notch3激動性抗體，它可望解決醫(yī)學(xué)上的這種亟待滿足的需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的激動性抗體及其片段，其特異性結(jié)合人Notch3受體在LIN12結(jié)構(gòu)域中的表位。本發(fā)明的另一個方面包括表位結(jié)合位點(diǎn)和與本發(fā)明的抗體結(jié)合此相同表位的抗體。本發(fā)明的抗體能經(jīng)由Notch3受體不依賴配體結(jié)合地激活Notch3介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。本發(fā)明包括抗體可變重鏈和輕鏈的氨基酸序列及其相應(yīng)核酸序列。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括這些抗體的CDR序列。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括包含本發(fā)明抗體序列的細(xì)胞系和載體。本發(fā)明還包括受本發(fā)明的激動性抗體識別的表位。本發(fā)明還包括結(jié)合此表位的抗體。本發(fā)明的實(shí)施方案包括Notch3表位，其包含與SEQIDNO:IO具有至少80%、85°/。、90%、或95。/。序列同一性的Linl2結(jié)構(gòu)域。更特別地，所述Notch3表位包含SEQIDNO:11。本發(fā)明包括結(jié)合此表位的激動性抗體。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是這些抗體用于制備藥物或組合物的用途，所述藥物或組合物用于治療與例如受體失活有關(guān)的Notch3相關(guān)疾病和病癥。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是這些抗體在治療與例如受體失活有關(guān)的Notch3相關(guān)疾病或病癥中的用途，所述治療包括激活所述缺陷，例如通過不依賴配體結(jié)合地激活Notch3信號傳導(dǎo)來激活所述缺陷。Notch3相關(guān)病癥可以包括但不限于CADASIL、家族性偏癱性偏頭痛(FHM)、家族性陣發(fā)性共濟(jì)失調(diào)(familialparoxyticataxia)、Alagille綜合征和其它變性性疾病。附圖簡述圖l描繪了Notch3的氨基酸序列。EGF重復(fù)區(qū)自氨基酸殘基43延伸至1383;LIN12結(jié)構(gòu)域自氨基酸殘基1384延伸至1503;而二聚化結(jié)構(gòu)域自氨基酸殘基1504延伸至1640。圖2(A-H)描繪了人Notch1、Notch2、Notch3、和Notch4之間的氨基酸序列比較。圖3描繪了Notch1、Notch2、Notch3、和Notch4的百分比同一性。圖4A和4B描繪了抗Notch3單克隆抗體MAb256A-13(SEQIDNO:2)的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列，其中CDR區(qū)以下劃線標(biāo)示。圖5描繪了實(shí)施例5的安光素酶報道物測定法，其顯示了抗Notch3單抗對Notch3受體的激活效應(yīng)。圖6描繪了Notch3激動性抗體對Notch3的金屬蛋白酶切割的影響。圖7描繪了用于256A-13的結(jié)合位點(diǎn)的表位定位的Notch3-Fc融合蛋白構(gòu)建物。圖8描繪了工程化Notch3前導(dǎo)肽編碼序列與天然Notch3前導(dǎo)肽編碼序列(NCBIGenBank編號NM一000435)的比較，顯示了工程化Notch前導(dǎo)肽序列的核苷酸(8A)和翻譯后的氨基酸序列(8B)的變化。圖8C描繪了LIN12結(jié)構(gòu)域，而8D描繪了LIN12的亞結(jié)構(gòu)域表位。圖9描繪了通過PCR-SOE法進(jìn)行的結(jié)構(gòu)域交換(swap)構(gòu)建物的生成。箭頭條代表PCR引物?？招臈l代表Notch3序列。實(shí)心條代表Notchl序列。圖IO描繪了單抗256A-13的Notch3LIN12結(jié)構(gòu)域表位定位中所使用的氨基酸序列。圖ll描繪了用于進(jìn)行256A-13的線性表位定位的丙氨酸掃描肽。發(fā)明詳述本發(fā)明不限于本文中所描述的具體方法學(xué)、規(guī)程、細(xì)胞系、載體、或試劑，因?yàn)樗鼈兛梢宰兓?。此外，本文中所使用的術(shù)語僅僅出于描述具體實(shí)施方案的目的，并非意圖限制本發(fā)明的范圍。在用于本文和所附權(quán)利要求書時，單數(shù)形式"一個"、"一種"、"所述，，和"該，，包括復(fù)數(shù)指稱，除非從上下文清楚地表示其它意思，例如提及"一個/種宿主細(xì)胞"包括多個/種此類宿主細(xì)胞。除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語及任何首字母縮寫具有與本發(fā)明
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員普遍理解相同的含義。雖然與本文所述方法和材料類似或等效的任何方法和材料都可用于本發(fā)明的實(shí)施，但是本文中描述了例示性的方法、裝置、和材料。7本文中提到的所有專利和出版物均以提述方式并入本申請(以法律允許為限)用于描述和公開其中所報告的、可以與本發(fā)明一起使用的蛋白質(zhì)、酶、載體、宿主細(xì)胞和方法學(xué)的目的。然而，這里不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格依據(jù)"在先發(fā)明"的原則早于此類公開內(nèi)容。定義貫穿本申請使用的術(shù)語對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員解釋為普通的和典型的含義。然而，申請人期望給予以下術(shù)語以如下文所定義的特定定義。關(guān)于抗體鏈多肽序列的短語"基本上相同"可以解釋為與參比多肽序列展示至少70%、或80%、或90%、或95%序列同一性的抗體鏈。對核S吏序列而言的該術(shù)語可以解釋為與參比核S交序列展示至少約85。/。、或90%、或95%、或97%序列同一性的序列。術(shù)語"同一性，，或"同源性"應(yīng)當(dāng)解釋為意指對比序列并在必要時引入缺口以為整個序列獲取最大百分比同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中其與所比較的相應(yīng)序列的殘基相同的氨基酸殘基的百分比。N端或C端延伸和插入都不應(yīng)解釋為降低同一性或同源性。用于對比的方法和計算機(jī)程序是本領(lǐng)域眾所周知的。序列同一性可以使用序列分析軟件來測量。術(shù)語"抗體，，以最廣義使用，具體覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性?？贵w(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。雖然抗體展現(xiàn)出對特定靶物的結(jié)合特異性，但是免疫球蛋白既包括抗體也包括其它缺乏靶物特異性的抗體樣分子。本發(fā)明的抗體可以是任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類的。天然抗體和免疫球蛋白通常是約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構(gòu)成。每條重鏈在一端具有一個可變域(VH),接著是多個恒定域。每條輕鏈在一端具有一個可變域(VO，在另一端具有一個恒定域。在用于本文時，"抗Notch3抗體"意指特異性結(jié)合人Notch3從而不依賴配體地激活Notch3信號傳導(dǎo)的抗體。術(shù)語"可變的"在抗體可變域的語境中指可變域的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性的事實(shí)。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs;即CDR1、CDR2、和CDR3)、也稱作高變區(qū)的三個區(qū)段?？勺冇蛑懈痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR區(qū)，它們大多釆取P-折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成(3-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個CDR連接。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)非常接近地保持在一起，并與另一條鏈的CDR—起貢獻(xiàn)于^t體的革巴物結(jié)合j立點(diǎn)的形成(Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,NationalInstituteofHealth,Bethesda，Md.(1987))。在用于本文時，免疫球蛋白氨基酸殘基的編號依照Kabat等的免疫球蛋白氨基酸殘基編號系統(tǒng)進(jìn)行，除非另有說明。術(shù)語"抗體片段"指全長抗體的一部分，一般是靶物結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例子包括F(ab)、F(ab')、F(ab')2和Fv片段。短語抗體的"功能性片段或類似物"指與全長抗體具有性質(zhì)上共同的生物學(xué)活性的化合物。例如，抗Notch3抗體的功能性片段或類似物指能結(jié)合Notch3受體的，從而阻止或?qū)嵸|(zhì)性降低受體的結(jié)合其配體或啟動信號傳導(dǎo)之能力的功能性片段或類似物。在用于本文時，就抗體的"功能性片段"而言，指Fv、F(ab)和F(ab')2片段。"Fv"是由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體(Vh-Vl二聚體)組成的片段。正是在這種構(gòu)型下，每個可變域的三個CDR相互作用而在Vh-Vl二聚體表面上限定了一個靶物結(jié)合位點(diǎn)。六個CDR—起賦予抗體以靶物結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或是只包含對靶物特異性的三個CDR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合靶物的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，F(xiàn)v多肽在VH與Vt結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得sFv能夠形成結(jié)合靶物所需的結(jié)構(gòu)。術(shù)語"雙抗體"指具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈中包含相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。F(ab)片段包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CH1)。F(ab')片段與F(ab)片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。F(ab')抗體片段是通過在F(ab')2胃蛋白酶消化產(chǎn)物的鉸鏈半胱氨酸處切割二硫一睫而生成的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。術(shù)語"單克隆抗體，，在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。單克隆抗體在本文中具體包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利No.4,816,567;及Morrison,etal.,ProcNatlAcadSciUSA81:6851(1984))。單克隆抗體是高度特異性的,針對單一靶位點(diǎn)。此外，與典型的包含針對不同決定蔟(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對耙物上的單一決定簇。在它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)勢在于它們可以是由雜交瘤培養(yǎng)物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語"單克隆"指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，與本發(fā)明一起使用的單克隆抗體可使用眾所周知的技術(shù)從噬菌體抗體庫分離。將依照本發(fā)明使用的親本單克隆抗體可通過最初由Kohler等,Nature256:495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組法來制備。非人(例如小鼠)抗體的"人源化，，形式指包含最少的衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab，)2或抗體的其它靶物結(jié)合亞序列)。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有CDR對應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR,且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白模板序列的FR。人源化抗體還可包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是所選擇的人免疫球蛋白模板的恒定區(qū)。術(shù)語"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"、和"細(xì)胞培養(yǎng)物"包括后代(progeny)。還應(yīng)理解，由于有意為之的或無意的突變，所有后代可能在DNA內(nèi)容上不是完全相同的。具有與最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞中所篩選的相同功能或生物學(xué)活性的變異后代包括在內(nèi)。本發(fā)明中所使用的"宿主細(xì)胞"一般是原核的或真核的宿主。用DNA"轉(zhuǎn)化"細(xì)胞生物體、細(xì)月包、或細(xì)胞系指將DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，使得該DNA可復(fù)制，或是作為染色體外元件或是通過染色體整合。用DNA"轉(zhuǎn)染"細(xì)胞或生物體指細(xì)胞或生物體對DNA(例如表達(dá)載體)的攝取，無論任何編碼序列事實(shí)上是否表達(dá)。術(shù)語"經(jīng)轉(zhuǎn)化的"和"經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞"指如下細(xì)胞，即該細(xì)胞中導(dǎo)入了DNA。所述細(xì)胞稱為"宿主細(xì)胞"，而且它可以是原核的或真核的。典型的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌的各種菌抹。典型的真核宿主細(xì)胞是哺乳動物的，諸如中國倉鼠卵巢細(xì)胞或人類起源的細(xì)自不同的物種，或者它可以是雜合DNA序列，包含一些外來DNA和一些同源DNA。術(shù)語"載體"指包含與合適控制序列可操作連接的DNA序列的DNA構(gòu)建物，所述控制序列能夠在合適宿主中實(shí)現(xiàn)所述DNA的表達(dá)。此類控制序列包括啟動子(以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄)、任選的操縱基因序列(以控制此類轉(zhuǎn)錄)、編碼合適mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆粒、或僅僅是潛在的基因組插入序列(genomicinsert)。一旦被轉(zhuǎn)化入合適宿主中，載體可以不依賴宿主基因組地復(fù)制和發(fā)揮功能，或者在有些情況中，自身整合入基因組中。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"載體"有時可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式。然而，本發(fā)明意圖包括發(fā)揮等效功能的其它形式載體，它們是本領(lǐng)域已知的或成為本領(lǐng)域已知的。為了治療的目的，"哺乳動物，，指歸入哺乳類的任何動物，包括人，家畜和牲畜，非人靈長類，及動物園、運(yùn)動或?qū)櫸飫游?，諸如犬、馬、貓、牛等。術(shù)語"標(biāo)記物"在用于本文時指可以與分子或蛋白質(zhì)(例如抗體)直接或間接偶聯(lián)的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記物可以自身是可沖企測的(例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化底物化合物或組合物的可檢測化學(xué)改變。在用于本文時，"固相"意指本發(fā)明的抗體可附著其上的非水性基質(zhì)。本文中所涵蓋的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)語境，固相可包括測定板的孔；在其它實(shí)施方案中，它指純化柱(例如親和層析柱)。在用于本文時，術(shù)語"Notch3介導(dǎo)的病癥，，指以Notch3受體有缺陷或表達(dá)不足為特征的疾患或疾病。具體而言，它可解釋為包括與變性性疾病有關(guān)的疾患，諸如CADASIL、FHM、家族性陣發(fā)性共濟(jì)失調(diào)、Alagille綜合征、和其它變性性疾病。用于生成抗體的NOTCH3受體免疫原可以使用可溶性耙物或其片段作為免疫原來生成抗體?？贵w針對感興趣的靶物。優(yōu)選地，靶物是生物學(xué)上重要的多肽，而且給患有疾病或病癥的哺乳動物施用抗體可以在該哺乳動物中導(dǎo)致治療效益?？梢允褂萌?xì)胞作為免疫原來生成抗體。免疫原可以重組生成或使用合成方法生成。免疫原還可以自天然來源分離。對于跨膜分子，諸如受體，可以使用它們的片段(例如受體的胞外結(jié)構(gòu)域)作為免疫原?；蛘?，可以使用表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞作為免疫原。此類細(xì)胞可以衍生自天然來源(例如癌細(xì)胞系)，或者可以是經(jīng)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而過表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞。可用于制備抗體的其它形式免疫原對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的?；蛘?，可以依照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，將編碼人Notch3受體的基因或cDNA克隆入質(zhì)?；蚱渌磉_(dá)載體中，并在多種表達(dá)系統(tǒng)中的任一種中表達(dá)?？寺『捅磉_(dá)Notch3的方法和人Notch3受體的核酸序列是已知的(參見例如美國專利No.5,821,332和5,759，546)。由于遺傳密碼的簡并性，可以使用多種編碼Notch3受體蛋白或多肽的核苦酸序列?？梢酝ㄟ^選擇基于可能的密碼子選項(xiàng)的組合來改變核苷酸序列。依照應(yīng)用于編碼天然存在Notch3受體的核香酸序列的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)遺傳密碼來進(jìn)行這些組合，而且可以考慮所有此類變異。可以使用這些多肽中的任一種來免疫動物以生成結(jié)合人Notch3受體的抗體。由于Notch3氨基酸序列的高度保守性，也可以使用來自其它物種的重組Notch3蛋白作為免疫原來生成抗體。人和小鼠Notch3間的比較顯示了90%以上的氨基酸序列在這兩個物種間是相同的。如果有好處，可以將免疫原Notch3受體表達(dá)成融合蛋白，其具有附接于融合區(qū)段的Notch3受體。融合區(qū)段常常幫助蛋白質(zhì)純化，例如有助于通過親12和層析來分離和純化融合蛋白，但是也可用于提高免疫原性?？梢耘囵B(yǎng)用融合核酸序列轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞來生成融合蛋白。所述融合核酸序列編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)其包含附接于其羧基和/或氨基末端的融合區(qū)段。融合區(qū)段可以包括但不限于免疫球蛋白Fc區(qū)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、(3-半乳糖苷酶、能夠結(jié)合二價金屬離子的多組氨酸區(qū)段、和麥芽糖結(jié)合蛋白。使用如實(shí)施例l所述的重組Notch3受體蛋白免疫小鼠制備了生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤。例示性的多肽包含SEQIDNO:l的全部或部分，或其變體?？贵w生成本發(fā)明的抗體可通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法來生成。本發(fā)明的抗體可包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是技術(shù)人員所知道的(Harlow等,Antibodies:aLaboratoryManual,ColdspringHarborLaboratoryPress,第2版(1988)，以^是述方式完整收入本文)。例如，可以將如實(shí)施例l所述的免疫原施用于各種宿主動物，包括但不限于家兔、小鼠、大鼠等，以引發(fā)包含對抗原特異性的多克隆抗體的血清的生成。免疫原的施用可需要一次或多次注射免疫劑和(視需要時)佐劑。根據(jù)宿主物種的不同，可使用各種佐劑來提高免疫學(xué)應(yīng)答，包括但不限于弗氏(完全和不完全)、礦物凝膠諸如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)諸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔i戚血藍(lán)蛋白、二硝基酚、和可能有用的人用佐劑諸如BCG(卡介苗(bacilleCalmette-Guerin))和短小棒狀桿菌(Cw7"e^c/en'MWparvww)?？刹捎玫淖魟┑钠渌影∕PL-TDM佐劑(單磷酰基脂質(zhì)A，合成的海藻糖二白喉菌酸酯(trehalosedicorynomycolate)。免疫規(guī)程是本領(lǐng)域眾所周知的，可以通過任何能在所選擇的動物宿主中51發(fā)免疫應(yīng)答的方法來實(shí)施。佐劑也是本領(lǐng)域眾所周知的。通常，通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射、或肌肉內(nèi)地或經(jīng)由IV將免疫原(有或無佐劑)注射入哺乳動物中。免疫原可包括Notch3多肽、其融合蛋白或變體。根據(jù)多肽的性質(zhì)(即百分比疏水性、百分比親水性、穩(wěn)定性、凈電荷、等電點(diǎn)等)，將免疫原與已知在所免疫的哺乳動物中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的。此類偶聯(lián)包括化學(xué)偶聯(lián)，即用活性化學(xué)官能基衍生化待偶聯(lián)的免疫原和免疫原性蛋白質(zhì)二者，以形成共價一睫，或者借助基于融合蛋白的方法學(xué)，或者技術(shù)人員知道的其它方法。此類免疫原性蛋白質(zhì)的例子包括但不限于匙孔威血藍(lán)蛋白、卵清蛋白、血清清蛋白、牛曱狀腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、和混在的T輔助肽。如上所述，可使用各種佐劑來提高免疫學(xué)應(yīng)答。本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體。單克隆抗體是識別單一抗原性位點(diǎn)的抗體。它們一致的特異性使得單克隆抗體比通過包含識別多種不同抗原性位點(diǎn)的抗體的多克隆抗體有用得多。單克隆抗體可以使用雜交瘤技術(shù)(諸如Kohler等，Nature256:495(1975);美國專利No.4,376,110;Harlow等，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdspringHarborLaboratoryPress,第2版(1988)及Hammerling等,MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas,Elsevier(1981))、重組DNA方法、或技術(shù)人員知道的其它方法來制備?？捎糜谏蓡慰寺】贵w的方法的其它例子包括但不限于人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，ImmunologyToday4:72(1983);Cole等，ProcNatlAcadSciUSA80:2026(1983))和EBV-雜交瘤4支術(shù)(Cole，a/.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,pp.77-96，AlanR.Liss(1985))。此類抗體可以屬于任何免疫球蛋白類(包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD)及其任何亞類。生成本發(fā)明單抗的雜交瘤可以在體外或在體內(nèi)培養(yǎng)。在雜交瘤模型中，對于宿主(諸如小鼠、人源化小鼠、具有人免疫系統(tǒng)的小鼠、倉鼠、家兔、駱駝、或任何其它適宜的宿主動物)進(jìn)行免疫以引發(fā)生成或能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，它們產(chǎn)生的抗體會特異性結(jié)合免疫所使用的蛋白質(zhì)?；蛘撸梢栽隗w外免疫淋巴細(xì)胞。然后使用合適的融合劑(諸如聚乙二醇)將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,pp.59-103(1986》。一般而言，在制備生成抗體的雜交瘤時，如果期望人源細(xì)胞的話，那么使用外周血淋巴細(xì)胞("PBL");或者，如果期望非人哺乳動物來源的話，使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后使用合適的融合劑(諸如聚乙二醇)將淋巴細(xì)月包與永生化細(xì)月包系融合以形成雜交瘤細(xì)月包(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,pp.59-103(1986))。永生化細(xì)胞系通常是已轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，特別是嚙齒類、?；蛉祟悂碓吹墓撬枇黾?xì)胞。典型的是，采用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。可以在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，所述培養(yǎng)基優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合的永生化細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)的話，那么用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型地會包含次黃。票呤、氨基喋呤、和胸苷("HAT培養(yǎng)基")，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞的生長。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是這樣的細(xì)胞系高效融合、支持所選擇的抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定地且高水平地生成抗體、且對某種培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基等敏感。在這些骨髓瘤細(xì)胞系中包括小鼠骨髓瘤系，諸如衍生自MOPC-21和MPC-l1小鼠腫瘤的小鼠骨髓瘤系(可獲自SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，Calif.美國申請No.)和SP2/0或X63-Ag8-653細(xì)胞(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Md.USA)。也有關(guān)于人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系用于生成人單克隆抗體的記載(Kozbor,/wmw"o/133:3001(1984);Brodeur，g/.，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker,Inc,pp.51-63(1987))。也可使用小鼠骨髓瘤細(xì)胞系NSO(EuropeanCollectionofCellCultures,Salisbury,Wilshire，UK)。對雜交瘤細(xì)胞在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)液測定針對Notch3的單克隆抗體的生成?？赏ㄟ^免疫沉淀或體外結(jié)合測定法(諸如力t射免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA))來測定雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。此類技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，而且在技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。單克隆抗體對Notch3的結(jié)合親和力可通過例如Scatchard分析來測定(Munson等，AnalBiochem107:220(1980》。在鑒定出生成具有期望特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可通過有限稀釋規(guī)程將該克隆亞克隆并通過標(biāo)準(zhǔn)方法來培養(yǎng)(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,pp.59-103(1986))。適合于此目的的培養(yǎng)基包括例如Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(D-MEM)或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，可以在動物中作為腹水瘤在體內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。通過常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水、或血清分開或分離，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠排阻層析、凝膠電泳、透析、或親和層析。本領(lǐng)域存在多種方法可用于生成單克隆抗體，因此，本發(fā)明不限于僅在雜交瘤中生成單克隆抗體。例如，可通過重組DNA方法來生成單克隆抗體諸如美國專利No.4,816,567中記載的那些。在此語境中，術(shù)語"單克隆抗體"指自單一真核克隆、噬菌體克隆、或原核克隆衍生的抗體。編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程來分離和測序(例如通過使用能夠與鼠源抗體重鏈和輕鏈的編碼基因或人源、人源化、或其它來源的重鏈和輕鏈的編碼基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)(Innis等，于PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,Academic(1990)，Sanger等,Ato/v4ca<i74:5463(1977))。雜交瘤細(xì)胞可作為此類DNA的來源。一旦分離DNA，可將DNA置入表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞(如原本不產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的大腸桿菌、NS0細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞)中，以在重組宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)單克隆抗體的合成。還可以修飾DNA,例如用人源重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列置換同源的鼠源序列(美國專利No.4,816,567;Morrison等,ProcNatlAcadSciUSA81:6851(1984))或?qū)⒎敲庖咔虻鞍锥嚯牡恼麄€或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接在一起。可以用這樣的非免疫球蛋白多肽替代本發(fā)明抗體的恒定域，或者用其替代本發(fā)明抗體的一個抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域來創(chuàng)建嵌合二價抗體?？贵w可以是單價抗體。用于制備單價抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和經(jīng)過修飾的重鏈的重組表達(dá)。通常在Fc區(qū)中的任何點(diǎn)處截斷重鏈，以防止重鏈交聯(lián)?；蛘?，將相關(guān)半胱氨酸殘基用另一種氨基酸殘基替代或刪除以防止交聯(lián)?？赏ㄟ^已知技術(shù)來生成識別特定表位的抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段是通過對完整抗體的蛋白水解消化得到的(參見例如Morimoto等，JBiochemBiophysMethods24:107(1992);Brennan等，Science229:81(1985))。例如，可使用酶諸如木瓜蛋白酶(用于生成Fab片段)或胃蛋白酶(用于生成F(ab，)2片段)蛋白水解切割免疫球蛋白分子來生成本發(fā)明的Fab和F(ab，)2片段。F(ab，)2片段包含可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈CH1結(jié)構(gòu)域。然而，這些片段現(xiàn)在可以由重組宿主細(xì)胞直接生成。例如，可以自抗體噬菌體文庫分離抗體片段。或者，可以自大腸桿菌直接回收F(ab，)2-SH片段，并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab，)2片段(Carter等，Bio/Technology10:163(1992))。依照另一種方法，可以自重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物直接分離F(ab，)2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對于熟練從業(yè)人員會是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，所選擇的抗體是單鏈Fv片段(Fv)(PCT專利申請WO93/16185)。對于有些用途，包括抗體在人類中的體內(nèi)使用和體外檢測測定法，使用嵌合的、人源化的、或人的抗體可能是優(yōu)選的。嵌合抗體是如下的分子，其中抗體的不同部分衍生自不同動物物種，諸如具有衍生自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。用于生成嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如Morrison,Science229:1202(1985);Oi等，BioTechniques4:214(1986);Gillies等，JImmunolMethods125:191(1989);美國專利No.5,807,715;4,816,567;和4，816397，以4是述方式完整并入本申請。人源化抗體設(shè)計成具有比衍生自動物的單克隆抗體更大的對人免疫球蛋白的同源性。人源化是一種用于生成嵌合抗體的技術(shù)，所生成的嵌合抗體化抗體是在非人物種中生成的、結(jié)合期望抗原的抗體分子，其具有一個或多個來自非人物種的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的框架(FR)區(qū)。通常，人框架區(qū)中的框架殘基會被替換為來自CDR供體抗體的相應(yīng)殘基，以改變(優(yōu)選改善)抗原結(jié)合。這些框架替代通過本領(lǐng)域眾所周知的方法來加以鑒定，例如通過對CDR和框架殘基的相互作用建模以鑒定對于抗原結(jié)合重要的框架殘基，及通過序列比較以鑒定位于位置上的不常見框架殘基。參見例如美國專利No.5,585,089;Riechmann等，Nature332:323(1988),以提述方式完整并入本申請。可使用本領(lǐng)域已知的多種方法將抗體人源化，包括例如CDR嫁接(EP239,400;PCT申請公布WO91/09967;美國專利No.5，225，539;5,530,101;和5,585，089)、鑲嵌(veneering)或表面重建(resurfacing)(EP592,106;EP519,596;Padlan，MolecularImmunology28:489(1991);Studnicka等，ProteinEngineering7:805(1994);Roguska等，ProcNatlAcadSciUSA91:969(1994))、和鏈改組(chainshuffling)(美國專利No.5,565,332)。一般而言，人源化抗體中導(dǎo)入了一個或多個自非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作"輸入，，(import)殘基，這些殘基通常取自"輸入"可變域。人源化基本上可遵循Winter及其同事的方法(Jones等，Nature321:522(1986);Riechmann等，Nature332:323(1988);Verhoeyen等，Science239:1534(1988))，用非人CDR或CDR序列替代人抗體的相應(yīng)序列來實(shí)施。因而，這樣的"人源化"抗體是嵌合抗體(美國專利No.4,816,567)，其中實(shí)質(zhì)人源化抗體通常是如下的人抗體，其中有些CDR殘基，可能還有一些FR殘基，17被來自嚙齒類抗體的類似位點(diǎn)所替代。此外，重要的是人源化抗體保留了針對抗原的較高親和力和其它有利的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)此目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性的人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是通常可獲得的，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機(jī)程序。通過檢查這些顯示圖像，可以分析某些殘基在候選免疫球蛋白序列的功能行使中的可能扮演的角色，即分析影響候選免疫球蛋白序列的能力的殘基，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體序列和輸入序列中選出FR殘基并進(jìn)行組合，使得期望的抗體特征(諸如對靶抗原的親和力提高)最大化，盡管直接且最實(shí)質(zhì)地影響抗原結(jié)合的是CDR殘基。用于構(gòu)建人源化抗體的人可變域(輕鏈可變域和重鏈可變域)的選^%對于降低抗原性是重要的。依照所謂的"最佳適配"(best-fit)方法，用非人抗體的可變域序列對整個已知人可變域序列的文庫進(jìn)行篩選。然后接受與非人親本抗體的序列最接近的人序列作為人源化抗體的人FR(Sims等，JImmunol151:2296(1993);Chothia等，JMolBiol196:901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等，ProcNatlAcadSciUSA89:4285(1992);Presta等，JImmunol151:2623(1993))。對于人類患者的治療性處理而言，完全人的抗體是尤其理想的?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的多種方法來生成人抗體，包括上文所述的使用自人免疫球蛋白序列衍生的抗體庫的噬菌體展示方法。還可參見美國專利No.4，444,887和4,716,111;及PCT申請公布WO98/46645,WO98/50433,WO98/24893，WO98/16654，WO96/34096,WO96/33735，和WO91/10741;將它們分別以提述方式完整并入本申請。也可用Cole等和Boerder等的技術(shù)制備人單克隆抗體(Cole等,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Riss(1985);及Boerner等，J7mm，o/147:86(1991))。也可以使用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫球蛋白但能表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來生成人抗體。例如，可以將人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合物隨機(jī)地或通過同源重組導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞中?；蛘撸梢栽谌酥劓満洼p鏈基因之外，還將人可變區(qū)、恒定區(qū)、和多變區(qū)導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞中?？梢栽趯⑼ㄟ^同源重組導(dǎo)入人免疫球蛋白基因座的同時或者另行使小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因非功能化。具體而言，JH區(qū)的純合刪除可阻止內(nèi)源抗體的生成。將經(jīng)過修飾的胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增并顯微注射入胚泡中以生成嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以生成表達(dá)人抗體的純合后代。參見例如Jakobovitis等，ProcNatlAcadSciUSA90:2551(1993);Jakobovitis等，Nature362:255(1993);Bruggermann等,YearinImmunol7:33(1993);Duchosal等,Nature355:258(1992))。選用抗原(例如本發(fā)明多肽的整個或部分)以正常方式免疫轉(zhuǎn)基因小鼠?？墒褂贸Ｒ?guī)雜交瘤技術(shù)自經(jīng)過免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得針對抗原的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠所包含的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化過程中進(jìn)行重排，隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。如此，使用這樣的技術(shù)，有可能生成治療上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。關(guān)于用于生成人抗體的這種技術(shù)的綜述參見Lonberg等，IntRevImmunol13:65-93(1995)。關(guān)于用于生成人抗體和人單克隆抗體的該技術(shù)和用于生成這樣的抗體的方案的詳細(xì)討i侖參見例如PCT申i青7〉布wO98/24893;WO92/01047;WO96/34096;WO96/33735;歐洲專利No.0598877;美國專利No.5,413,923;5,625,126;5,633,425;5,569,825;5,661,016;5,545,806;5,814,318;5,885,793;5,916,771;和5,939,598,以提述方式完整并入本申請。另外，可聯(lián)系諸如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)、Genpharm(SanJose,Calif.)和Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)等公司使用與上文所述類似的技術(shù)來提供針對所選擇的抗原的人抗體。還有，可通過對移植有人外周血白細(xì)胞、脾細(xì)胞或骨髓的小鼠進(jìn)行免疫來生成人單抗(例如XTL的Trioma技術(shù))?？墒褂梅Q為"導(dǎo)向選擇"(guidedselection)的技術(shù)來生成識別選定表位的完全人源抗體。這種方法使用所選擇的非人單克隆抗體(例如小鼠抗體)來指導(dǎo)識別相同表位的完全人源抗體的選擇(Jespers等，Bio/technology12:899(1988))。進(jìn)一步地，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)利用針對本發(fā)明多肽的抗體來生成"模擬"本發(fā)明多肽的抗獨(dú)特型抗體(參見例如Greenspan等，F(xiàn)ASEBJ7:437(1989);Nissinoff，JImmunol147:2429(1991))。例如，可使用結(jié)合并竟?fàn)幮砸种贫嚯牡亩嗑刍?或本發(fā)明多肽與配體的結(jié)合的抗體來生成的抗獨(dú)特型抗體，這樣的抗體"模擬"多肽的多聚化和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因而能結(jié)合并中和多肽和/或其配體。這樣的中和性抗獨(dú)特型抗體或其Fab片段19可以在治療方案中用于中和多肽配體。例如，這樣的抗獨(dú)特型抗體可用于結(jié)合本發(fā)明多肽和/或結(jié)合其配體/受體，由此阻斷其生物學(xué)活性。本發(fā)明的抗體可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選人抗體或人源化抗體。在本發(fā)明中，一種結(jié)合特異性可以是針對Notch3的，另一種可以是針對任何其它抗原的，優(yōu)選細(xì)胞表面蛋白、受體、受體亞基、組織特異性抗原、病毒衍生的蛋白質(zhì)、病毒編碼的包膜蛋白、細(xì)菌衍生的蛋白質(zhì)、或細(xì)菌表面蛋白等。用于生成雙特異性抗體的方法是眾所周知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組產(chǎn)生是基于兩對免疫球蛋白重鏈/輕鏈的共表達(dá)，其中兩條重鏈具有不同的特異性(Milstein等，Nature305:537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤)生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化通常通過親和層析步驟來實(shí)現(xiàn)。類似的規(guī)程披露于WO93/08829和Traunecker等，EMBOJ10:3655(1991)?？梢詫⒕哂衅谕Y(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進(jìn)行融合?？梢栽谥辽僖环N融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同的(separate)表達(dá)載體中，并共轉(zhuǎn)化入合適的宿主生物體中。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見例如Suresh等，MethInEnzym121:210(1986)。本發(fā)明還涵蓋異源偶聯(lián)抗體。異源偶聯(lián)抗體由兩種共價連接的抗體構(gòu)成。這樣的抗體建議例如用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利No.4,676,980)?？梢栽隗w外使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)的已知方法制備抗體，包括那些涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可以使用二石克化物交換反應(yīng)或通過形成碌^醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。適于此目的的試劑的例子包括亞氨基硫醇酯/鹽(iminothiolate)和4-3克基丁亞氨酸曱酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美國專利No.4,676,980中所公開的。另外，可生成針對Notch3的單結(jié)構(gòu)域抗體。這種技術(shù)的例子記載于W09425591(關(guān)于自Camelidae重鏈Ig衍生的抗體)以及US20030130496(記載了自噬菌體文庫分離單結(jié)構(gòu)域、完全人源的抗體)。還可以創(chuàng)建這樣的單一肽鏈結(jié)合分子，其中重鏈和輕鏈Fv區(qū)相連接。單鏈抗體("scFv，，)及其構(gòu)建方法記載于美國專利No.4,946,778。或者，可以通過類似的方式構(gòu)建和表達(dá)Fab。所有完全或部分人的抗體免疫原性小于完全鼠源的單抗，而片段和單鏈抗體免疫原性也較低?？梢宰允褂肕cCafferty等，Nature348:552(1990)中記載的技術(shù)生成的抗體噬菌體文庫分離抗體或抗體片段。Clarkson等，Nature352:624(1991)和Marks等，JMolBiol222:581(1991)分別記載了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。后續(xù)的出版物記載了通過鏈改組(Marks等，Bio/Technology10:779(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組(Waterhouse等，NucAcidsRes21:2265(1993))作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略，生成高親和力(nM范圍)的人抗體。如此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。還可以例如通過替代即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列代替同源鼠序歹寸(美國專利No.4,816,567;Morrison等，ProcNatlAcadSciUSA81:6851(1984》來修飾DNA。另一種備選方法是使用電融合(electricalfusion)而非化學(xué)融合來形成雜交瘤。這種技術(shù)已完全確立。除了融合，也可以使用例如埃巴二氏病毒或轉(zhuǎn)化基因轉(zhuǎn)化B細(xì)胞以使得其永生。參見例如""ContinuouslyProliferatingHumanCellLinesSynthesizingAntibodyofPredeterminedSpecificity",Zurawaki等，于MonoclonalAntibodies,Kennett等編，PlenumPress,pp.19-33(1980))?？赏ㄟ^用由真核或原核系統(tǒng)表達(dá)的Notch3蛋白、融合蛋白、或其片段免疫嚙齒類動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠、和豚鼠)來生成抗Notch3單抗。可以使用其它動物來進(jìn)行免疫，例如非人靈長類動物、表達(dá)免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠、和移植有人B淋巴細(xì)胞的重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠?？梢酝ㄟ^常規(guī)規(guī)程通過將來自經(jīng)免疫動物的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(例如Sp2/0和NSO)融合來生成雜交瘤，如前人所述(K6hler等，Nature256:495(1975))。另夕卜，可以通過在噬菌體展示系統(tǒng)中篩選來自人B淋巴細(xì)胞的重組單鏈Fv或Fab文庫來生成抗Notch3抗體。針對Notch3的單抗的特異性可通過ELISA、Westem免疫印跡、或其它免疫化學(xué)技術(shù)來測試?？贵w對補(bǔ)體激活的抑制活性可通過溶血測定法來評估，其中使用用于經(jīng)典補(bǔ)體途徑的敏化的雞或綿羊RBC。通過有限稀釋克隆陽性孔中的雜交瘤。純化抗體以便通過上文所述測定法確定對人Notch3的特異性?？筃OTCH3抗體的鑒定本發(fā)明提供了不依賴配體地激活Notch3介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的激動性單克隆抗體。具體而言，本發(fā)明的抗體結(jié)合并激活Notch3。本發(fā)明的抗體包括稱為256A-13的抗體。本發(fā)明還包括與256A-13結(jié)合相同表位的抗體。通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、Western免疫印跡、或其它免疫化學(xué)技術(shù)測試了候選抗Notch3抗體。實(shí)施例中描述了為了表征各種抗體而實(shí)施的測定法。本發(fā)明的抗體包括但不限于多克隆、單克隆、單價、雙特異性、異源偶聯(lián)、多特異性、人源、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fab片段、F(ab')片段、通過Fab表達(dá)文庫生成的片段、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(包括例如針對本發(fā)明抗體的抗Id抗體)、和任何上述的表位結(jié)合片段?？贵w可以是本發(fā)明的人源抗原性結(jié)合抗體片段，包括但不限于Fab、Fab'和F(ab，)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(sdFv)和包含一個VL域或一個VH域的單結(jié)構(gòu)域抗體?？乖Y(jié)合性抗體片段(包括單鏈抗體)可包含單獨(dú)的可變區(qū)，或包含可變區(qū)與整個或部分鉸鏈區(qū)、CH1、CH2、和CH3結(jié)構(gòu)域的組合。本發(fā)明還包括包含可變區(qū)與鉸鏈區(qū)、CH1、CH2、和CH3結(jié)構(gòu)域的任意組合的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的抗體可以來自任何動物起源，包括鳥類和哺乳類。優(yōu)選的是，抗體來自人類、非人靈長類、嚙齒類(例如小鼠和大鼠)、驢、綿羊、家兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬、或雞。在用于本文時，"人"抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，包括從人免疫球蛋白文庫分離的抗體或從轉(zhuǎn)基因動物(該動物轉(zhuǎn)入了一種或多種人免疫球蛋白基因且不表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白)分離的抗體，如下文所述，例如Kucherlapati等的美國專利No.5，939,598。本發(fā)明的抗體可以是單特異性的、雙特異性的、三特異性的或更多特異性的。多特異性抗體可以是對于Notch3的多個不同表位有特異性的，或者可以是既對Notch3有特異性，又對異源表位(如異源多肽或固體支持材料)有特異性的。參見例如PCT申請公布WO93/17715;WO92/08802;WO91/00360;WO92/05793;Tutt等，JImmunol147:60(1991);美國專利No.4,474,893;4,714,681;4,925,648;5,573,920;5,601,819;Kostelny等，JImmunol148:1547(1992)。分來加以描述或^見定。表位或多肽部分可以如本文所述來規(guī)定，例如通過N端和C端位置、通過以連續(xù)氨基酸殘基計的大小、或在表和圖中列出。Notch3具有至少95。/。、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%和至少50%同一性(如使用本領(lǐng)域已知的方法和本文描述的方法計算的)的Notch3多肽的抗體也包括在本發(fā)明中。抗Notch3抗體也可以以小于約1(T7M、小于約10《M、或小于約1(T5M的Kd結(jié)合其它蛋白質(zhì)，諸如來自該抗Notch3抗體所針對的物種之外的物種的抗Notch3抗體。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與Notch3的猴同源物及其相應(yīng)表位起交叉反應(yīng)。在一個特定的實(shí)施方案中，上文所述交叉反應(yīng)性是關(guān)于本文所公開的任何單一特定抗原性或免疫原性多肽、或特定抗原性和/或免疫原性多肽的組合。本發(fā)明進(jìn)一步包括這樣的抗體，它們結(jié)合由在嚴(yán)格雜交條件下與編碼Notch3的多核苷酸發(fā)生雜交的多核苷酸所編碼的多肽。本發(fā)明的抗體也可以用它們對本發(fā)明多肽的結(jié)合親和力來加以描述或規(guī)定。優(yōu)選的結(jié)合親和力包括具有10-8-1(T15M、10—8-10-12M、10-8-1(T1()M、或10"°-10"2M的平衡解離常數(shù)或Ko的結(jié)合親和力。本發(fā)明還提供了竟?fàn)幮砸种瓶贵w與本發(fā)明表位結(jié)合的抗體，所述竟?fàn)幮越Y(jié)合可由任何本領(lǐng)域已知的關(guān)于測定竟?fàn)幮越Y(jié)合的方法所測定，例如本文所述的免疫測定法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體將對表位的結(jié)合竟?fàn)幮砸种屏酥辽?5%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、或至少50%。載體和宿主細(xì)胞在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼本文所公開的抗體變體的分離的核酸序列、包含編碼本發(fā)明抗體的核香酸序列的載體構(gòu)建物、包含這樣的載體的宿主細(xì)胞、和用于生成抗體的重組技術(shù)。為了重組生成抗體變體，分離編碼抗體變體的核酸并將其插入復(fù)制型載體，用于進(jìn)一步的克隆(DNA擴(kuò)增)或用于表達(dá)。編碼抗體變體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程來分離和測序(例如通過使用能夠與編碼抗體變體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)?？墒褂糜糜诳寺『娃D(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備表達(dá)本發(fā)明抗體的細(xì)胞系。載體有許多載體可供使用。載體的組成部分一般包括但不限于以下一種或多種信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列?？墒褂帽娝苤募夹g(shù)來制備包含編碼本發(fā)明抗體的核香酸序列的重組表達(dá)載體。表達(dá)載體包含與合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)核苷酸序列(諸如衍生自哺乳動物、微生物、病毒、或昆蟲基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)核苷酸序列)可操作連接的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列的例子包括轉(zhuǎn)錄啟動子、操縱基因、增強(qiáng)子、mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)、和/或其它控制轉(zhuǎn)錄和翻if起始和終止的適宜序列。當(dāng)調(diào)節(jié)序列與適宜多肽的核苷酸序列在功能上相關(guān)時，核芬酸序列是"可操作連接的"。如此，例如，啟動子核苦酸序列與抗體重鏈序列是可操作連接的，若啟動子核香酸序列控制適宜核苦S吏序列的轉(zhuǎn)錄。另外，表達(dá)載體中可以納入編碼適宜的信號肽的序列，其中所述信號肽不與抗體重鏈和/或輕鏈序列天然相關(guān)。例如，可以以符合讀碼框的方式將信號肽(分泌前導(dǎo)序列)的核苷酸序列與多肽序列融合，使得抗體被分泌到周質(zhì)空間或培養(yǎng)基中。在目標(biāo)宿主細(xì)胞中有功能的信號肽增強(qiáng)適宜抗體的月包外分泌。信號肽可以在抗體自細(xì)胞分泌出來時被切除。這樣的分泌信號的例子是眾所周知的，包括例如美國專利No.5,698,435;5,698,417和6,204,023中記載的那些。載體可以是質(zhì)粒載體、單鏈或雙鏈?zhǔn)删w載體、或單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。可以通過眾所周知的用于將DNA和RNA導(dǎo)入細(xì)胞中的技術(shù)將這樣的載體以多核苷酸形式導(dǎo)入細(xì)胞中。在噬菌體和病毒載體的情況下，也可以通過眾所周知的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將載體以包裝的或封裝的病毒形式導(dǎo)入細(xì)胞中。病毒載體可以是能復(fù)制的或復(fù)制缺陷的。在后一種情況下，病毒繁殖一般只會在互補(bǔ)的宿主細(xì)胞中發(fā)生。也可以使用本發(fā)明DNA構(gòu)建物衍生的RNA利用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)來生成蛋白質(zhì)。這樣的載體可包括編碼抗體分子恒定區(qū)的核苦酸序歹'J(參見例如PCT申請公布WO86/05807和WO89/01036;和美國專利No.5,122,464)，而且可以將抗體可變域克隆到這樣的載體中以表達(dá)完整的重鏈或輕鏈。宿主細(xì)月包可以從任何合適的宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的抗體。在本發(fā)明中有用的宿主細(xì)胞的例子包括原核、酵母、或高等真核細(xì)胞，包括但不限于微生物，諸如經(jīng)包含抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；用包含抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過的酵母(例如糖酵母屬酵母(Saccharomyces)、畢赤酵母屬酵母(Pichia));用包含抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染過的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用包含抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)感染過的或用包含抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或攜帶含有源自哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子、痘苗病毒7.5K啟動子)的重組表達(dá)構(gòu)建物的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK、293、3T3纟田胞)?？捎米鞅景l(fā)明宿主細(xì)胞的原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，諸如大腸桿菌(五.co//)、枯草芽孢桿菌或枯草桿菌CS.wto'to)、腸桿菌屬0&7fera6acfe。、歐文氏菌屬(五nWm'a)、克雷伯氏菌屬(《/WwW/a)、變形菌屬、沙門氏菌屬(Wwo"e〃a)、沙雷氏菌屬(5^rra〃a)、和志賀氏菌屬(幼/ge〃力、以及芽孢桿菌屬CBa"，)、假單胞菌屬(尸"wcfowo"a"、和鏈霉菌屬(5^印to^yc^)。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446),盡管其它菌株諸如大腸桿菌B、大腸桿菌XH7G(ATCC31,537)、和大腸桿菌W3110(ATCC27，325)也是合適的。這些例子是例示性的而非限制性的。在原核宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體一般包含一種或多種表型選擇標(biāo)志基因。表型選擇標(biāo)志基因是例如編碼賦予抗生素抗性或供應(yīng)自養(yǎng)需求的蛋白質(zhì)的基因。對于原核宿主細(xì)胞有用的表達(dá)載體的例子包括那些自商品化質(zhì)粒書亍生的表達(dá)載體，諸如pKK223畫3(PharmaciaFineChemicals,Uppsala,Sweden)、pGEMl(PromegaBiotec,Madison,Wisconsin"USA)、和pET(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)和pRSET(Invitrogen，Carlsbad,CA)系列載體(Studier,JMolBiol219:37(1991);Schoepfer,Gene124:83(1993))。常用于重組原核宿主細(xì)胞表達(dá)載體的啟動子序列包括T7(Rosenberg等，Gene56:125(1987))、|3-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等，Nature275:615(1978);Goeddel等，Nature281:544(1979》、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等，NuclAcidsRes8:4057(1980))、和tac啟動子(Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratory(1990》。在本發(fā)明中有用的酵母或絲狀真菌包括那些來自酵母屬(Sacc/zaramyces)、畢赤氏酵母屬(尸/c/n'a)、i文線菌屬(Jc"."。mycetey)、克魯維氏酵母屬(K/wyveramycey)、裂殖酵母屬(5b/z/zas"cc/zaramyc&s)、布支絲酵母屬(C朋fi^a)、木霉屬(7Hc/zocfem7a)、脈孢霉屬(7Vewmypora)、和絲狀真菌諸如月永孑包霉屬(7Vewroy/ora)、青霉屬(/3￡"/"7//"附)、彎頸霉屬(7b/;^poc/(3WMm)、禾口曲霉屬(y^perg/〃w)。酵母載體常常會包含來自2(i酵母質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)序列、自主復(fù)制序列(ARS)、啟動子區(qū)、聚腺苷酸化序列、用于轉(zhuǎn)錄終止的序列、和選擇標(biāo)志基因。適合于酵母載體的啟動子序列包括金屬硫蛋白的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶的啟動子(Hitzeman等，JBiolChem255:2073(1980))或其它糖酵解酶(Holland等，Biochem17:4900(1978))如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動子，等等。用于酵母表達(dá)的其它合適載體和啟動子進(jìn)一步記載于Fleer等，Gene107:285(1991)。用于酵母和酵母轉(zhuǎn)化方案的其它合適啟動子和載體是本領(lǐng)域眾所周知的。酵母轉(zhuǎn)化方案是眾所周知的。一種這樣的方案記載于Hinnen等，ProcNatlAcadSci75:1929(1978)。Hinnen方案在選擇性培養(yǎng)基中選擇Trp+轉(zhuǎn)化子。也可以釆用哺乳動物或昆蟲宿主細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達(dá)重組抗體。原則上，任何高等真核細(xì)胞培養(yǎng)物都可使用，無論是來自脊推動物的培養(yǎng)物或是來自無脊推動物的培養(yǎng)物。無脊推動物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲細(xì)胞(Luckow等,Bio/Technology6:47(1988);Miller等,GeneticsEngineering,Setlow等編，Vol.8,pp.277-9，PlenamPublishing(1986);Mseda等，Nature315:592(1985))。例如，可使用桿狀病毒系統(tǒng)來生成異源蛋白。在昆蟲系統(tǒng)中，可使用苜蓿尺蠖(y^tograp/7aca/z/orw'ca)核型多角體病毒(AcNPV)作為載體來表達(dá)外來基因。該病毒在草地夜蛾0S;ofito/3fera/n^)ert/a)細(xì)胞中生長。可以將抗體編碼序列分別地克隆入病毒的非必需區(qū)(例如多角體基因)中，置于AcNPV啟動子(例如多角體啟動子)的控制之下。已經(jīng)鑒定的其它宿主26包括伊蟲丈屬(v4g(ias)、黑腹果蟲龜(Z)賜c;pMame/a"ogos妙)、和家香(B蘭xmon')。多種用于轉(zhuǎn)染的病毒抹是公眾可獲得的，例如AcNPV的L-l變體和家蠶NPV的Bm-5抹，而且這樣的病毒可用作依照本發(fā)明的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。此外，也可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物作為宿主。脊推動物細(xì)胞、和脊推動物細(xì)胞在培養(yǎng)物(組織培養(yǎng)物)中的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)規(guī)程。參見TissueCulture,Kruse等編，AcademicPress(1973)。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的例子有猴腎；人胚腎；幼倉鼠腎細(xì)胞；中國倉鼠卵巢細(xì)胞ADHFR(CHO,Urlaub等，ProcNatlAcadSciUSA77:4216(1980));小鼠塞托利(Sertoli)細(xì)胞；人宮頸癌細(xì)胞(HELA);犬腎細(xì)胞；人肺細(xì)胞；人肝細(xì)胞；小鼠乳房肺瘤；和NSO細(xì)胞。用上文所述的用于抗體生成的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在視需要進(jìn)行改良以便誘導(dǎo)啟動子、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列、選擇轉(zhuǎn)化子、或擴(kuò)增編碼期望序列的基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。常用的啟動子序列和增強(qiáng)子序列衍生自多瘤病毒、腺病毒2、猿病毒40(SV40)、和人巨細(xì)胞病毒(CMV)。為了在哺乳動物宿主細(xì)胞中表達(dá)結(jié)構(gòu)基因序列，可使用衍生自SV40病毒基因組的DNA序列來提供其它遺傳元件，例如SV40起點(diǎn)、早期和晚期啟動子、增強(qiáng)子、剪接、和聚腺苷酸化位點(diǎn)。病毒早期和晚期啟動子是特別有用的，因?yàn)樗鼈兌家子谝云蔚男问綇牟《净蚪M獲得，所述片段還可以包含病毒復(fù)制起點(diǎn)。用于在哺乳動物宿主細(xì)胞中使用的例示性表達(dá)載體是可商購的?？梢栽诙喾N培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成本發(fā)明的抗體變體的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏F10(Sigma,StLouis,MO)、基本必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma，StLouis,MO)、RPMI-1640(Sigma,StLouis,MO)、和Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM,Sigma,StLouis,MO)適合于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可以使用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Ham等，MethEnzymol58:44(1979);Bames等，AnalBiochem102:255(1980);及美國專利No.4,767,704;4,657,866;4,560,655;5,122,469;5,712,163;或6,048，728。任何這些培養(yǎng)基可根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白、或表皮生長因子)、鹽(諸如X-氯化物，其中X是鈉、鈣、鎂；和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機(jī)化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是表達(dá)所選用的宿主細(xì)胞原先使用的條件，這些條件對于普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。編碼抗體的多核苷酸本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含編碼本發(fā)明抗體及其片段的核香酸序列的多核普酸或核酸，例如DNA。例示性的多核苷酸包括編碼包含一種或多種本文所述氨基酸序列的抗體鏈的多核苷酸。本發(fā)明還涵蓋在嚴(yán)格或較低嚴(yán)格性雜交條件下與編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法獲得多核苦酸并測定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗體的核普酸序列是已知的，那么可以用化學(xué)合成的寡核普酸來裝配編碼抗體的多核苦酸(例如，如Kutmeier等，Bio/Techniques17:242(1994)中所述)，筒言之，該過程包括合成包含抗體編碼序列的部分的多個重疊的寡核苷酸，將這些寡核苷酸進(jìn)行退火和連接，然后通過PCR擴(kuò)增連接所得的寡核苷酸?；蛘?，可以用來自合適來源的核酸來生成編碼抗體的多核苷酸。如果無法得到包含編碼特定抗體的核酸的克隆，但是抗體分子的序列是已知的，那么可以化學(xué)合成編碼免疫球蛋白的核酸，或者可以從合適的來源[例如抗體cDNA文庫，或者從任何表達(dá)抗體的組織或細(xì)胞(如選用來表達(dá)本發(fā)明抗體的雜交瘤細(xì)胞)分離的核酸，優(yōu)選polyA+RNA]通過PCR擴(kuò)增或克隆獲得編碼免疫球蛋白的核酸，其中PCR擴(kuò)增使用能與序列3'和5'端雜交的合成引物，而克隆使用對特定基因序列具有特異性的寡核苷酸探針以(例如)從編碼抗體的cDNA文庫中鑒定出cDNA克隆。然后可以使用本領(lǐng)域任何/>知方法將通過PCR擴(kuò)增的核酸克隆入復(fù)制型克隆載體中。一旦確定了抗體的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列，則可使用本領(lǐng)域眾所周知的用于操作核香酸序列的方法操作抗體的核芬酸序列，這些方法例如重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)誘變、PCR等(參見例如Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratory(1990);Ausubel等編，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(1998)中記載的技術(shù)，以提述方式完整并入本申請)，以生成具有不同氨基酸序列的抗體，例如用于創(chuàng)建氨基酸替代、刪除、和/或插入。在一個特定的實(shí)施方案中，可通過眾所周知的方法檢查重鏈和Z或輕鏈可變域的氨基酸序列以鑒定CDR的序列，例如通過與其它重鏈和輕鏈可變區(qū)的已知氨基酸序列進(jìn)行比較以確定具有序列高變性的區(qū)域。使用常規(guī)重組DNA技術(shù)，可以在框架區(qū)內(nèi)插入一個或多個CDR，例如將一個或多個CDR插入人框架區(qū)中以使非人抗體人源化，如上文所述。框架區(qū)可以是天然存在的或共有的框架區(qū)，優(yōu)選人框架區(qū)(參見例如Chothia等，JMolBiol278:457(1998)中人框架區(qū)的列表)。優(yōu)選地，框架區(qū)與CDR組合而生成的多核苷酸編碼特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體。優(yōu)選地，如上文所述，可以在框架區(qū)中進(jìn)行一處或多處氨基酸替代，而且優(yōu)選地，氨基酸替代改善抗體對其抗原的結(jié)合。另外，可以用這樣的方法針對一個或多個可變區(qū)半胱氨酸殘基(特別是參與形成鏈內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基)進(jìn)行氨基酸替代或刪除，以生成缺乏一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子。本發(fā)明涵蓋對多核芬酸的其它改變，而且這些改變在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。另夕卜，可使用為生成"嵌合抗體"而開發(fā)的技術(shù)(Morrison等，ProcNatlAcadSci81:851(1984);Neuberger等，Nature312:604(1984);Takeda等，Nature314:452(1985))，即將來自具有適宜抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與來自具有適宜生物學(xué)活性的人抗體分子的基因剪接在一起。如上所述，嵌合抗體是其中不同部分衍生自不同動物物種的分子，諸如具有自鼠單抗衍生的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的嵌合抗體，例如人源化抗體?；蛘?，文獻(xiàn)記載的用于生成單鏈抗體的技術(shù)(美國專利No.4,946,778;Bird,Science242:423(1988);Huston等,ProcNatlAcadSciUSA85:5879(1988);和Ward等，Nature334:544(1989))可改造適用于生成單鏈抗體。通過用氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段，產(chǎn)生單鏈多肽而形成單鏈抗體。也可使用用于在大腸桿菌中裝配功能性Fv片段的技術(shù)(Skerra等，Science242:1038(1988》。生成抗NOTCH3抗體的方法可通過任何本領(lǐng)域已知的用于抗體合成的方法來生成本發(fā)明的抗體，特別是通過化學(xué)合成或優(yōu)選通過重組表達(dá)技術(shù)來生成本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體或其片段、衍生物、或類似物(例如本發(fā)明抗體的重鏈或輕鏈或本發(fā)明的單鏈抗體)的重組表達(dá)要求構(gòu)建包含編碼抗體或抗體片段的多核香酸的表達(dá)載體。一旦得到了編碼抗體分子的多核苷酸，可通過重組DNA技術(shù)來生成用于抗體生成的載體。構(gòu)建包含抗體編碼序列和適宜的轉(zhuǎn)錄和翻i,控制序列的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。通過常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞，然后通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以生成本發(fā)明的抗體。在本發(fā)明的一個方面，可以在宿主細(xì)胞中共表達(dá)編碼重鏈和輕鏈的載體以表達(dá)完整免疫球蛋白分子，如下文詳述的?？衫枚喾N宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)來表達(dá)本發(fā)明的抗體分子，如上文所述。這樣的宿主-表達(dá)系統(tǒng)不但代表了可用于生成隨后純化感興趣編碼序列的媒介，而且代表了在用適宜核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后可原位表達(dá)本發(fā)明抗體的細(xì)胞。常常使用細(xì)菌細(xì)胞(諸如大腸桿菌)和真核細(xì)胞來表達(dá)重組抗體分子，尤其是用于表達(dá)完整重組抗體分子。例如，哺乳動物細(xì)胞(諸如CHO)和載體(諸如來自人巨細(xì)胞病毒的主要立即早期基因啟動子元件)的組合是有效的抗體表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等，Gene45:101(1986);Cockett等，Bio/Technology8:2(1990》。另外，可選擇這樣的宿主細(xì)胞林，其以期望的特定方式調(diào)控所插入序列的表達(dá)或修飾和加工基因產(chǎn)物。這樣的蛋白質(zhì)產(chǎn)物修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對于蛋白質(zhì)的功能可能是重要的。不同宿主細(xì)胞具有特征性的和特定的蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物翻譯后加工和修飾機(jī)制?？蛇x擇適宜的細(xì)胞系或宿主細(xì)胞來確保所表達(dá)外來蛋白的正確修飾和加工。為此，可使用擁有初級轉(zhuǎn)錄物的正確加工、基因產(chǎn)物的糖基化、和磷酸化所需的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。這樣的哺乳動物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、COS、293、3T3、或骨髓瘤細(xì)胞。為了長期、高產(chǎn)量地生成重組蛋白，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。例如，可工程化產(chǎn)生(engineer)穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。可以不使用包含病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，而使用受適宜表達(dá)控制元件(例如啟動子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苦酸化位點(diǎn)等)控制的DNA和選擇標(biāo)志來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在導(dǎo)入外來DNA后，可以讓工程化細(xì)胞在富營養(yǎng)培養(yǎng)基(enrichedmedia)中生長l-2天，然后轉(zhuǎn)換成選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)志賦予對選擇的抗性，并容許細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定整合入它們的染色體中并生長以形成轉(zhuǎn)化灶(foci)，轉(zhuǎn)化灶繼而可克隆和擴(kuò)增形成細(xì)胞系。這種方法可有利地用于工程化30改造表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。這樣的工程化細(xì)胞系在直接地或間接地與抗體分子相互作用的化合物的篩選和評估中可以是特別有用的。可以使用許多選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰滲病毒胸苦激酶(Wigler等，Cell11:223(1977))、次黃嘌呤-鳥。票呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska等，ProcNatlAcadSciUSA48:202(1992))、和腺噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，Cell22:817(1980))基因分別可用于tk、hgprt或aprt-細(xì)胞。還有，抗代謝物抗性可用作選擇以下基因的基礎(chǔ)dhfr,其賦予對甲氨蝶呤的抗性(Wigler等，ProcNatlAcadSciUSA77:357(1980);O'Hare等,ProcNatlAcadSciUSA78:1527(1981));gpt，其賦予對霉酚酸的抗性(Mulligan等，ProcNatlAcadSciUSA78:2072(1981));neo，其賦予對氨基糖苷G-418的抗性(Wu等，Biotherapy3:87(1991));和hygro,其賦予對潮霉素的抗性(Santerre等，Gene30:147(1984))?？沙Ｒ?guī)應(yīng)用重組DNA
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法來選擇期望的重組克隆，這樣的方法i己載于例^口Ausubel等編,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(1993);Kriegler,GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress(1990);及Dracopoli等編,CurrentProtocolsinHumanGenetics,第12和13章，JohnWiley&Sons(1994);Colberre畫Garapin等，JMo/所o/150:1(1981),以提述方式將上述文獻(xiàn)完整并入本申請?？赏ㄟ^載體擴(kuò)增來提高抗體分子的表達(dá)水平(綜述參見Bebbington等,"Theuseofvectorsbasedongeneamplificationfortheexpressionofclonedgenesinmammaliancells,"DNACloning,Vol.3.AcademicPress(1987》。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)志物能^皮擴(kuò)增時，宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的抑制劑水平的升高會提高標(biāo)志物基因的拷貝數(shù)。由于所擴(kuò)增的區(qū)域與抗體基因相關(guān)，因此抗體的生成也會升高(Crouse等，MolCellBiol3:257(1983))。可以用兩種本發(fā)明的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中第一種載體編碼重鏈衍生的多肽，第二種載體編碼輕鏈衍生的多肽。這兩種載體可包含相同的選擇標(biāo)志，這可使得重鏈和輕鏈多肽的表達(dá)相等。或者，可使用編碼且能夠表達(dá)重鏈和輕鏈多肽二者的單一載體。在這種情況中，應(yīng)當(dāng)將輕鏈置于重鏈之前以避免有毒的游離重鏈過量(Proudfoot，Nature322:52(1986);Kohler,ProcNatlAcadSciUSA77:2197(1980))。重鏈和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。一旦由動物生成了、化學(xué)合成了、或重組表達(dá)了本發(fā)明的抗體分子，可通過本領(lǐng)域已知的用于純化免疫球蛋白分子的任何方法來純化它，例如通過層析(例如離子交換層析、親和層析、特別是通過蛋白A后對特定抗原的親和層才斤、和大小4非阻層才斤)、離心、溶解,復(fù)差異、或通過4壬4可其它用于蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。另外，可以將本發(fā)明的抗體或其片段與本文所述的或本領(lǐng)域知道的異源多肽序列融合以便于純化。本發(fā)明涵蓋與多肽重組融合或化學(xué)偶聯(lián)(包括共價和非共價偶聯(lián))的抗體。可使用本發(fā)明的融合或偶聯(lián)抗體來簡化純化。參見例如PCT申請7厶布W093/21232;EP439,095;Naramura等，ImmunolLett39:91(1994);美國專利No.5,474,981;Gillies等,ProcNatlAcadSciUSA89:1428(1992);Fell等:JImmunol146:2446(1991),以提述方式將它們完整并入本申請。此外，可以將本發(fā)明的抗體或其片段與標(biāo)志物序列(諸如肽)融合以便于純化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)志物氨基酸序列是六聚組氨酸肽，諸如pQE載體(QIAGEN，Inc.,Chatsworth，CA)中提供的標(biāo)簽等，其中許多是商品化的。如例如Gentz等，ProcNatlAcadSciUSA86:821(1989)所述，六聚組氨酸有助于方便的融合蛋白純化。對純化有用的其它肽標(biāo)簽包括但不限于"HA"標(biāo)簽，其對應(yīng)于自流感血凝素蛋白衍生的表位(Wilson等，Cell37:767(1984))和"Flag"標(biāo)簽?？贵w純化在使用重組技術(shù)時，可以在細(xì)胞內(nèi)、在周質(zhì)空間中生成抗體變體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體變體，那么作為第一步，可以通過例如離心或超濾清除宿主細(xì)胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等,Bio/Technology10:163(1992)描述了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的規(guī)程。簡單的說，在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯基曱基磺酰氟(PMSF)存在下用約30分鐘使細(xì)胞糊融化。細(xì)胞碎片可以通過離心除去。若抗體變體被分泌到培養(yǎng)基中，則通常首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元對來自這樣的表達(dá)系統(tǒng)的上清液加以濃縮。在上述任何步驟中，可以引入蛋白酶抑制劑如PMSF來抑制蛋白水解，而且可以引入抗生素來防止外來污染物的生長。從細(xì)胞制備的抗體組合物可以使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來加以純化，優(yōu)選的純化技術(shù)是親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體變體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人IgGl、IgG2或IgG4重鏈的抗體(Lindmark等，JImmunolMeth62:1(1983))。蛋白G被推薦用于所有小鼠同種型和人IgG3(Guss等，EMBOJ5:1567(1986))。親和配體所附接的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質(zhì)。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯可有助于獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。若抗體變體包含CH3結(jié)構(gòu)域，則BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)可用于純化。根據(jù)待回收的抗體變體的不同，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)諸如離子交換柱上的分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅石上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸銨沉淀。在任何初步純化步驟后，可以將包含感興趣抗體變體和污染物的化合物進(jìn)行低pH疏水相互作用層析，其中使用pH為約2.5-4.5的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(例如約0-0.25M的鹽)實(shí)施。藥物配制劑可通過將具有期望純度的多肽與任選的本領(lǐng)域典型采用的"藥學(xué)可接受的"載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(都稱為"賦形劑")混合，以凍干配制劑或水溶液的形式，制備包含多肽或抗體的治療性配制劑供貯存，所述賦形劑即緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等張劑、非離子去污劑、抗氧化劑、和其它各種添力口劑。參見Remington'sPharmaceuticalSciences,第16片反，Osol編，(1980)。這樣的添加劑在所采用的劑量和濃度對接受者必須是無毒的。緩沖劑有助于將pH維持在接近生理學(xué)條件的范圍內(nèi)。它們優(yōu)選以約2mM-約50mM的濃度范圍存在。適用于本發(fā)明的緩沖劑包括有機(jī)和無機(jī)酸及其鹽，諸如檸檬酸鹽緩沖劑(例如檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖劑(例如琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖劑(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖劑(例如富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡糖醛酸鹽緩沖劑(葡糖醛酸-葡糖醛酸鈉混合物、葡糖醛酸-氫氧化鈉混合物、葡糖醛酸-葡糖醛酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖劑(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖劑(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氬氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)、和醋酸鹽緩沖劑(例如醋酸-醋酸鈉混合物、醋酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，還有磷酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑、和三曱胺鹽諸如Tris?？商砑臃栏瘎┮匝舆t樣i生物生長，防腐劑可以以范圍為0.2%-1%(w/v)的量添加。適用于本發(fā)明的防腐劑包括苯酚、苯曱醇、間曱酚、對羥基苯曱酸曱酯、對羥基苯曱酸丙酯、氯化十八烷基二曱基芐基銨、芐烷銨(benzalkonium)卣化物(例如氯化物、溴化物、石典化物)、氯己雙胺、和多羥基苯曱酸烴基酯諸如多羥基苯甲酸曱酯或丙酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇、和3-戊醇。可添加等張劑(有時稱為"穩(wěn)定劑")以確保本發(fā)明液體組合物的等張性，等張劑包括多羥基糖醇，優(yōu)選三羥基或更高級的糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。穩(wěn)定劑指一大類賦形劑，其功能范圍從填充劑到使治療劑溶解或有助于防止變性粘附容器壁的添加劑。典型的穩(wěn)定劑可以是多羥基糖醇(上文所列)；氨基酸，諸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等，有機(jī)糖或糖醇，諸如乳糖、海藻糖、水蘇糖(stachyose)、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)多醇(cyclitols)諸如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，諸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸(thiocticacid)、巰基乙酸鈉、硫代甘油、a-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即<10個殘基)；蛋白質(zhì)，諸如人血清清蛋白、牛血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；單糖，諸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖，二糖，諸如乳糖、麥芽糖、蔗糖，和三糖，諸如棉子糖；和多肽，諸如右旋糖苷。穩(wěn)定劑可以以O(shè).l-10,000份重量每份活性蛋白質(zhì)重量的范圍存在?？梢蕴砑臃请x子型表面活性劑或去污劑(也稱為"濕潤劑")以幫助使治療劑溶解以及保護(hù)治療性蛋白質(zhì)免于攪動誘導(dǎo)的聚集(agitation-inducedaggregation),這也使得配制劑能夠暴露于剪切表面應(yīng)力而不引起蛋白質(zhì)變性。合適的非離子型表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、34Polyoxamers(184、188等)、PluronicRTM多元醇、聚氧乙烯山梨聚糖單醚(TWEEN-20、TWEEN-80⑧等)。非離子型表面活性劑可以以約0.05mg/ml-約1.0mg/ml、優(yōu)選約0.07mgZm1-約0.2mgZml的范圍存在。其它的雜類賦形劑包括填充劑(例如淀粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、曱硫氨酸、維生素E)、和助溶劑。本文中的配制劑還可應(yīng)所治療的特定適應(yīng)癥所需含有多于一種的活性化合物，優(yōu)選那些活性互補(bǔ)且彼此沒有不利影響的活性化合物。例如，可能希望進(jìn)一步提供免疫抑制劑。這樣的分子合適地以對預(yù)定目的有效的量呈組合存在?；钚猿煞诌€可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠囊)、存在于膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或存在于粗滴乳狀液中。這樣的技術(shù)4皮露于Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osal編，(1980)。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)?？芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體變體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠嚢。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)、聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No.3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子達(dá)1OO天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時間較短。當(dāng)膠囊化抗體在體內(nèi)長時間維持時，它們可能由于暴露于37。C的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變。可以根據(jù)相關(guān)機(jī)制來設(shè)計合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫-二硫化物互換的分子間S-S鍵形成，那么可通過修飾巰基殘基、自酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發(fā)特定聚合物基質(zhì)組合物來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。治療性多肽、抗體、或其片段會在特定病癥或疾患的治療中有效的量取決于病癥或疾患的性質(zhì)，而且可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來確定。若可能，理想的是在人類中進(jìn)行測試之前，首先在體外，然后在有用的動物模型中，測定劑量-應(yīng)答曲線和本發(fā)明的藥物組合物。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過皮下注射施用治療性多肽、抗體或其片段的水溶液。每劑的范圍為約0.5嗎-約50昭每千克體重，或更優(yōu)選約3jig-用于皮下施用的劑量給藥方案可以隨許多臨床因素(包括疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度和受試者對治療劑的敏感性)而變化(從每月一次到每天一次)?？筃OTCH3抗體的治療用途本發(fā)明的抗體可用于治療哺乳動物。在一個實(shí)施方案中，例如為了獲得臨床前數(shù)據(jù)的目的而將抗體施用于非人哺乳動物。待治療的例示性非人哺乳動物包括非人靈長類、犬、貓、嚙齒類和其它對其實(shí)施臨床前研究的哺乳動物。這樣的哺乳動物可以是針對要用抗體治療的疾病的已建立的動物模型，或可用于研究感興趣抗體的毒性。在這些實(shí)施方案的每一個中，可以對哺乳動物實(shí)施劑量升級研究(doseescalationstudies)?？墒褂脝为?dú)的或與因子組合的抗體作為治療劑。本發(fā)明涉及基于抗體的療法，其包含將本發(fā)明的抗體施用于動物、哺乳動物、或人類以治療Notch3介導(dǎo)的疾病、病癥、或疾患。動物或受試者可以是需要特定治療的哺乳動物，諸如已經(jīng)診斷有特定病癥(例如與Notch3有關(guān)的病癥)的哺乳動物。針對Notch3的抗體對于哺乳動物(包括但不限于牛、豬、馬、雞、貓、犬、非人靈長類等，以及人類)中的變性性疾病和其它Notch3相關(guān)疾病(包括CADASIL、FHM、Alagille綜合征、神經(jīng)學(xué)和變性性病癥)是有用的。例如，通過施用治療可接受劑量的抗Notch3抗體或本發(fā)明抗體或本發(fā)明抗體的合劑，或與不同來源的其它抗體組合使用，所治療哺乳動物(特別是人類)中的疾病癥狀可得到改善或預(yù)防。所述的其片段、類似物和衍生物)和編碼本發(fā)明抗體的核酸(如下文所述)包括如本文所述的其片段、類似物和衍生物以及抗獨(dú)特型抗體)。本發(fā)明的抗體可用于治療、抑制、或預(yù)防與Notch3的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病、病癥、或疾患，包括但不限于任何一種或多種本文所述的疾病、病癥、或疾患。與Notch3的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病、病癥、或疾患的治療和/或預(yù)防包括但不限于減輕至少一種與那些疾病、病癥、或疾患有關(guān)的癥狀。本發(fā)明的抗體可以在本領(lǐng)域已知的或如本文所述的藥學(xué)可接受組合物中提供。本發(fā)明的抗Notch3抗體可以治療性地應(yīng)用于多種疾病。本發(fā)明提供一種在p甫乳動物中預(yù)防或治療Notch3介導(dǎo)的疾病的方法該方法包括給哺乳動物施用疾病預(yù)防或治療量的抗Notch3抗體。抗Notch3抗體結(jié)合Notch3并激動化(agonize)其功能。人們已經(jīng)將Notch3信號傳導(dǎo)與多種疾病如CADASAL、FHM、家族性陣發(fā)性共濟(jì)失調(diào)、Alagille綜合征和其它變性性疾病和神經(jīng)學(xué)病癥聯(lián)系起來(Joutel等，Nature383:707(1996);Flynn等,JPathol204:55(2004))。預(yù)計抗Notch3抗體對預(yù)防上述疾病也會是有效的。在與Notch3的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病或病癥的治療、抑制和預(yù)防中有效的抗體量可通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來加以確定。劑量將取決于待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度和病程、抗體是為了預(yù)防目的還是治療目的而施用的、先前的療法、患者的臨床史和對抗體的響應(yīng)、及主治醫(yī)師的裁量。可以按照與病情相符的治療方案來施用抗體，例如經(jīng)一至數(shù)天時間施用單個劑量或幾個劑量以改善疾病狀態(tài)，或者在較長一段時間里定期施用多個劑量，以抑制疾病進(jìn)展和預(yù)防疾病復(fù)發(fā)。另外，可任選采用體外測定來幫助鑒定最佳劑量范圍。配藥中采用的確切劑量還會取決于施用路徑和疾病或病癥的嚴(yán)重程度，而且應(yīng)當(dāng)依照從業(yè)人員的判斷和每名患者的實(shí)際情況來決定?？梢愿鶕?jù)從體外或動物模型測試系統(tǒng)得到的劑量-應(yīng)答曲線來外推有效劑量。對于抗體，給患者施用的劑量典型地是O.lmg/kg至150mg/kg患者體重。優(yōu)選的是，給患者施用的劑量介于O.lmg/kg和20mg/kg患者體重之間，更優(yōu)選lmg/kg至10mg/kg患者體重。一般而言，由于對外來多肽的免疫應(yīng)答，人抗體在人體中的半衰期長于來自其它物種的抗體。因此，人抗體常?？赡苁褂幂^低的劑量和較低的施用頻率。此外，可通過修飾(諸如例如脂化(lipidation))而增強(qiáng)抗體的攝取和組織穿透(例如進(jìn)入腦)，以降低本發(fā)明抗體的施用劑量和頻率。對于數(shù)天或更長時間里的重復(fù)施用而言，根據(jù)狀況，持續(xù)實(shí)施治療直至出現(xiàn)期望的疾病癥狀遏制。然而，其它劑量方案也是有用的。這樣的治療進(jìn)程很容易通過常規(guī)技術(shù)和測定法來加以監(jiān)測?？贵w變體組合物將以符合良好醫(yī)學(xué)實(shí)踐的方式來配制、定劑量(dose)和施用。在此語境中的考慮因素包括所治療的具體病癥、所治療的具體哺乳動物、患者個體的臨床狀況、病癥的原因、藥劑的投遞部位、施用的方法、施用的進(jìn)度安排、和醫(yī)學(xué)從業(yè)人員知道的其它因素。待施用的抗體變體的"治療有效量"會受這樣的考慮因素的控制，而且是預(yù)防、改善、或治療疾病或病癥的最小量?？贵w變體不必但可任選與一種或多種當(dāng)前用于預(yù)防或治療相關(guān)病癥的藥劑一,起配制。這樣的其它藥劑的有效量取、決于配制劑中存在的抗體的量、病癥或治療的類型、和上文所討論的其它因素。這些一般使用與以前所4吏用的相同的劑量和施用路徑，或者是以前所采用的劑量的約1-99%。在一個優(yōu)選的方面，抗體是基本上純化的(即基本上不含限制其效果或產(chǎn)生不想要的副作用的物質(zhì))。已知有多種投遞系統(tǒng)，它們可用來施用本發(fā)明的抗體，包括注射例如封裝在脂質(zhì)體中、微粒、微膠嚢、能夠表達(dá)化合物的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的胞吞(參見例如Wu等，JBiolChem262:4429(1987))、作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體一部分的核酸的構(gòu)建等?？梢砸匀魏慰山邮艿姆绞浇o哺乳動物施用抗Notch3抗體。導(dǎo)入方法包括但不限于胃腸外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)、硬膜外、吸入和口服路徑、及(如果有利于免疫遏制治療的話)病變內(nèi)施用。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、或腹膜內(nèi)施用?？赏ㄟ^任何方便的路徑來施用抗體或組合物，例如通過輸注或推注、通過穿過上皮或粘膜皮膚襯里(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)的吸收，而且可以與其它生物學(xué)活性劑一起施用。施用可以是全身性的或局部的。另外，可能希望通過任何合適路徑將本發(fā)明的治療性抗體或組合物導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，包括室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；室內(nèi)導(dǎo)管(例如連接于儲藥庫(reservoir)諸如Ommaya儲藥庫的導(dǎo)管)可有助于室內(nèi)注射。另外，通過脈沖輸注(特別是用遞減劑量的抗體)合適地施用抗體。優(yōu)選的是，通過注射(最優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下注射，取決于施用是短期的還是長期的)來給予劑量給藥。也可以采用肺部施用，例如通過使用吸入器或噴霧器及含有霧化劑的配制劑。也可以以干粉組合物的形式將抗體施用入患者的肺中(參見例如美國專利No.6,514,496)。在一個特定的實(shí)施方案中，可能希望將本發(fā)明的治療性抗體或組合物局部地施用于需要治療的部位；這可以通過例如但不限于局部輸注、表面涂施、通過注射、借助導(dǎo)管、借助栓劑、或借助植入物來實(shí)現(xiàn)，所述植入物是多孔的、非多孔的、或凝膠狀的材料，包括膜，諸如硅橡膠(sialastic)膜，或纖維。優(yōu)選的是，在施用本發(fā)明的抗體時，必須注意使用蛋白質(zhì)不吸附(absorb)的材料。在另一個實(shí)施方案中，可以將抗體置于媒介中，特別是脂質(zhì)體中加以投遞(參見Langer,Science249:1527(1990);Treat等，于LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer,Lopez-Berestein等編，pp.353-365(1989》Lopez-Berestein，同上，pp.317-27;參見一般同上)。在又一個實(shí)施方案中，可以將抗體置于受控釋放系統(tǒng)中加以投遞。在一個實(shí)施方案中，可以使用泵(參見Langer，Science249:1527(1990);Sefton，CRCCritRefBiomedEng14:201(1987);Buchwald等，Surgery88:507(1980);Saudek等，NEnglJMed321:574(1989))。在另一個實(shí)施方案中，可以使用聚合材料(參見MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer等編，CRCPress(1974》ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen等編，Wiley(1984);Ranger等,JMacromolSciRevMacromolChem23:61(1983);還可參見Levy等，Science228:190(1985);During等，AnnNeurol25:351(1989);Howard等，JNeurosurg71:105(1989))。在又一個實(shí)施方案中，可以將受控釋放系統(tǒng)置于治療靶附近。本發(fā)明還提供了藥物組合物。這樣的藥物組合物包含治療有效量的抗體和生理學(xué)可接受載體。在一個特定的實(shí)施方案中，術(shù)語"生理學(xué)可接受的"指得到聯(lián)邦或州政府管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)或列于美國藥典或其它一般認(rèn)可的藥典中用于動物，更特別的是人類。術(shù)語"載體"指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑、或媒介。這樣的生理學(xué)載體可以是無菌液體，諸如水，和油，包括源自石油、動物、植物、或合成來源的那些，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)靜脈內(nèi)施用藥物組合物時，水是優(yōu)選的載體。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液態(tài)載體，特別是對于可注射溶液。合適的藥學(xué)賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊(chalk)、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、丙二醇(propylene,glycol)、水、乙醇等。如果需要，組合物還可含有極小量的潤濕劑或乳化劑、或pH緩沖劑。這些組合物可采取溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠嚢劑、粉劑、持續(xù)釋放配制劑等形式。組合物可以用常規(guī)粘合劑和載體(諸如甘油三酸酯)配制成栓劑。口服配39制劑可包括標(biāo)準(zhǔn)載體，諸如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適載體的例子記載于E.W.Martin的《Remington'sPharmaceuticalSc.iences》"這才羊的組合物將含有有,效量的抗體(優(yōu)選純化的形式)以及合適量的載體，從而提供適合施用于患者的形式。配制劑應(yīng)當(dāng)與施用才莫式相適應(yīng)。在一個實(shí)施方案中，依照常規(guī)規(guī)程將組合物配制為適合于對人體靜脈內(nèi)施用的藥物組合物。典型地，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是無菌等張水性緩沖液中的溶液。必要時，組合物還可包括增溶劑和局部麻醉劑諸如利諾卡因(lignocaine)以減輕注射部位的疼痛。一般而言，各成分或是分開地提供，或是一起混合成單位劑型來提供，例如作為標(biāo)明了活性劑的量的密封容器(諸如安瓿或藥嚢(sachette))中的凍干干粉或無水濃縮物)。若要通過輸注來施用組合物，可以用裝有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶來分裝組合物。若通過注射來施用組合物，可提供裝有無菌注射用水或鹽水的安瓿，以便在施用前混合各個成分。本發(fā)明還提供了藥包或試劑盒，其包括一個或多個容器，容器中裝有本發(fā)明藥物組合物的一種或多種成分。任選地，這樣的容器可伴有管理藥品或生物制品的制造、使用或銷售的政府部門所規(guī)定的形式的告知書(notice),該告知書反映了政府部門對用于人體施用的制造、使用或銷售的批準(zhǔn)。制品在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中提供了制品，其包含對于上文所述病癥的治療有用的材料。制品包括容器和標(biāo)簽。合適的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器和試管。容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器裝有對預(yù)防或治療疾患有效的組合物，且可具有無菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或管形瓶)。組合物中的活性劑是抗體。位于容器上的或與容器相伴隨的標(biāo)簽說明所述組合物系用于治療所選擇的疾患。制品可進(jìn)一步包括第二容器，其中裝有藥學(xué)可接受的緩沖劑，諸如磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液、和右旋糖溶液。它還可進(jìn)一步包括其它從商業(yè)和用戶立場上看可取的材料，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和印有使用說明書的包裝插頁?；诳贵w的基因治療在本發(fā)明的另一個方面，通過基因治療的方式，施用包含編碼抗體或其J力能,W彩干4的庫石il的醋.用以v'6^、水卩擊l去子S阮jfeNntA3"A營類；大齊口,,fT"^'，.-,'，'^,，*'，，，■,V'，J，,.、_,、，'、','A，*^^*A■*■■Y/,■，，*"K—、■-，/或活性有關(guān)的疾病或病癥?；蛑委熤竿ㄟ^對受試者施用被表達(dá)的或能表達(dá)的(expressedorexpressible)核酸來實(shí)施的治療。在本發(fā)明的這個實(shí)施方案中，核酸生成它們所編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)介導(dǎo)治療效應(yīng)。任何可用的基因治療方法均可依照本發(fā)明加以使用。下文描述了例示性的方法。關(guān)于基因治療方法的一般性綜述參見Goldspiel等，ClinicalPharmacy12:488(1993);Wu等，Biotherapy3:87(1991);Tolstoshev，AnnRevPharmacolToxicol32:573(1993);Mulligan,Science260:926(1993);Morgan等，AnnRevBiochem62:191(1993);May,TIBTECH11:155(1993)。在一個方面，化合物包含編碼抗體的核酸序列，所述核酸序列表達(dá)載體的一部分，所述表達(dá)載體在合適宿主中表達(dá)抗體或它們的片段或嵌合蛋白或重鏈或輕鏈。具體而言，這樣的核S吏序列具有與抗體編碼區(qū)可操作連接的啟動子，所述啟動子是誘導(dǎo)型的或組成型的，而且任選是組織特異性的。在另一個具體的實(shí)施方案中，使用這樣的核酸分子，其中抗體編碼序列和任何其它期望序列的側(cè)翼存在著促進(jìn)在基因組中期望位點(diǎn)處發(fā)生同源重組的區(qū)域，如此為抗體編碼核酸的染色體內(nèi)表達(dá)提供條件(Koller等，ProcNatlAcadSciUSA86:8932(1989);Zijlstra等，Nature342:435(1989))。在特定的實(shí)施方案中，所表達(dá)的抗體分子是單鏈抗體；或者，核酸序列包括編碼抗體重鏈和輕鏈二者或其片段的序列。將核酸投遞入患者中可以是直接的，在這種情況中，使患者直接暴露于核酸或攜帶核酸的載體；或者是間接的，在這種情況中，首先在體外用核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植入患者中。這兩種方法分別稱為體內(nèi)或回體(exvivo)基因治療。在一個特定的實(shí)施方案中，在體內(nèi)直接施用核酸序列，核酸序列在體內(nèi)表達(dá)以生成所編碼的產(chǎn)物。這可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法中的任一種方法來實(shí)現(xiàn)，例如通過將它們構(gòu)建為適宜的核酸表達(dá)載體的一部分并施用它，使得它們成為細(xì)胞內(nèi)的，例如通過使用缺陷型或減毒型逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒載體進(jìn)行感染(參見美國專利No.4,980,286)、或通過棵DNA的直接注射、或通過使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic,Dupont)、或用脂質(zhì)細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被、封裝在脂質(zhì)體、微?；蛭⒛z嚢中、或?qū)⑺鼈兣c已知的能進(jìn)入核的肽連接后加以施用，將它們與受到受體介導(dǎo)胞吞作用的配體連接后力口以施用(參J^例^f^u等，JBiolChem262:4429(1987))(:^可以用來草巴向4爭異性表達(dá)受體的細(xì)胞類型)等。在另一個實(shí)施方案中，可以形成這樣的核酸-配體復(fù)合物，其中配體包含促溶(flisogenic)病毒肽以破壞內(nèi)體，使得核酸能夠避免溶酶體降解。在又一個實(shí)施方案中，可以使核酸靶向的特定受體來實(shí)現(xiàn)體內(nèi)靶向細(xì)胞特異性攝取和表達(dá)(參見例如PCT申請公布WO92/06180;WO92/22635;WO92/20316;W093/14188,WO93/20221)?；蛘撸梢詫⒑怂釋?dǎo)入胞內(nèi)并通過同源重組摻入宿主細(xì)胞DNA中以進(jìn)行表達(dá)(Koller等，ProcNatlAcadSciUSA86:8932(1989);Zijlstra等，Nature342:435(1989》。在一個特定的實(shí)施方案中，使用包含編碼本發(fā)明抗體的核酸序列的病毒載體。例如，可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見Miller等，MethEnzymol217:581(1993))。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒包4、病毒基因組的正確包裝和整合入宿主細(xì)胞DNA中所必需的構(gòu)件。將編碼基因療法中使用的抗體的核酸序列克隆入一種或多種載體中，所述載體幫助將所述基因投遞入患者中。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的更多詳情可見于Boesen等，Biotherapy6:291(l"4),其描述了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將mdrl基因投遞至造血干細(xì)胞以使得干細(xì)胞對化療更有抗性。闡述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因療法中使用的其它參考文獻(xiàn)有Clowes等，JClinInvest93:644(1994);Kiem等,Blood83:1467(1994);Salmons等，HumanGeneTherapy4:129(1993);和Grossman等，CurrOpinGen和Dev3:110(1993)。也可以在本發(fā)明中使用腺病毒。腺病毒是本發(fā)明中用于投遞抗體至呼吸上皮的一種特別有吸引力的媒介。腺病毒天然地感染呼吸上皮。基于腺病毒的投遞系統(tǒng)的其它靶標(biāo)有肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒的優(yōu)點(diǎn)在于能夠感染不處于分裂中的細(xì)胞。Kozarsky等，CurrOpinGenDev3:499(1993)對基于腺病毒的基因療法進(jìn)行了綜述。Bout等，HumanGeneTherapy5:3(1994)演示了應(yīng)用腺病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至恒河猴的呼吸上皮的用途。腺病毒在基因療法中的用途的其它例子可見于Rosenfeld等，Science252:431(1991);Rosenfeld等,Cell68:143(1992);Mastrangeli等,JClinInvest91:225(1993);PCT申請公布W094/12649;Wang等，GeneTherapy2:775(1995)。腺伴隨病毒(AAV)也已被建議用于基因治療(Walsh等，ProcSocExpBiolMed204:289(1993);美國專利No.5,436,146;6,632,670;禾口6,642，051)。基因療法的另一種方法涉及將基因轉(zhuǎn)移至組織培養(yǎng)中的細(xì)胞，這通過諸如電穿孑L、月旨質(zhì)轉(zhuǎn)染，磷酸4丐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、或病秦感染來實(shí)現(xiàn)。通常，轉(zhuǎn)移方法包括將選擇標(biāo)志轉(zhuǎn)移至細(xì)胞。然后將細(xì)胞置于選擇之下以分離那些已攝取并正在表達(dá)所轉(zhuǎn)移基因的細(xì)胞。然后將那些細(xì)胞投遞至患者。在這個實(shí)施方案中，將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，之后將所得重組細(xì)胞施用到體內(nèi)。這樣的導(dǎo)入可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來進(jìn)行，包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯樣吏注射、使用包含核酸序列的病毒或噬菌體載體進(jìn)行的感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球融合等。本領(lǐng)域知道將外來基因?qū)爰?xì)胞中的許多技術(shù)(參見例如Loeffler等，MethEnzymol217:599(1993);Cohen等，MethEnzymol217:618(1993);Cline,PharmacTher29:69(1985))，而且可依照本發(fā)明4吏用這些技術(shù)，只要受體細(xì)胞的必需的發(fā)育和生理功能不受其破壞即可。所述技術(shù)應(yīng)當(dāng)有助于核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞，使得核酸可被細(xì)胞所表達(dá)，且優(yōu)選能被該細(xì)胞的后代細(xì)胞遺傳和表達(dá)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的各種方法將所得重組細(xì)胞投遞至患者。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用重組血細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞)。細(xì)胞的預(yù)計用量取決于期望的效果、患者的狀態(tài)等，而且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。為了基因療法可在其中導(dǎo)入核酸的細(xì)胞涵蓋任何期望的、可得的細(xì)胞類型，包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)月包、肝細(xì)胞、血細(xì)胞諸如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；各種干細(xì)胞或祖細(xì)胞(特別是造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞)，例如自骨髓、臍帶血、外周血、胎肝等獲得的。在一個實(shí)施方案中，用于基因療法的細(xì)胞對于患者是自體的。將編碼本發(fā)明抗體的核酸序列導(dǎo)入細(xì)胞中，使得它們可由細(xì)胞或其后代表達(dá)，然后體內(nèi)施用這些重組細(xì)胞以獲得治療效應(yīng)。在一個特定的實(shí)施方案中，使用干細(xì)胞或祖細(xì)胞。任何可以在體外分離和維持的干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞均可能依照本發(fā)明的這個實(shí)施方案來使用(參見例如PCT申請公布WO94/08598;Stemple等:Cell71:973(1992);Rheinwald,MethCellBio21A:229(1980);Pittelkow等，MayoClinicProc61:771(1986》。實(shí)施例實(shí)施例l:免疫原的生成NOTCH3胞外結(jié)構(gòu)域-FC融合蛋白使用重組Notch3-Fc融合蛋白(其包含羧基末端與y1Fc區(qū)融合的Notch3LD)作為免疫原，生成了特異性結(jié)合人Notch3之LIN12/二聚化結(jié)構(gòu)域(下文稱為"LD")的抗Notch3單克隆抗體。具體而言，所述免疫原包含Notch3LD的氨基酸殘基1378-1640(見圖l)和人ylFc融合蛋白(Notch3LD/Fc)。使用Notch3EGF重復(fù)區(qū)氨基酸殘基43-1377作為免疫原生成了對照抗體。使用基于因特網(wǎng)的研究軟件和服務(wù)(MotifSearch,http:〃motif.genome.jp/)分析了Notch3蛋白序列。使用標(biāo)準(zhǔn)商品化cDNA合成試劑盒，使用人肝臟和胰腺RNA(Ambion,Inc.Austin,TX)作為模板來合成cDNA第一條鏈。在甜菜堿(l-2M)和DMSO(5。/。)存在下PCR擴(kuò)增編碼Notch3LD和EGF重復(fù)區(qū)的cDNA。將PCR合成的Notch3-LDDNA片#殳(~0.8kb)和Notch3-EGF重復(fù)DNA片段(~4kb)克隆入表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體在商品化載體pSec中或在商品化載體pCD3.1中包含His-ylFc,每種商品化載體都攜帶一種不同的抗生素標(biāo)志物。此克隆過程產(chǎn)生兩種表達(dá)質(zhì)粒，一種表達(dá)Notch3-LD/Fc融合蛋白，另一種表達(dá)Notch3-EGF/Fc融合蛋白。為便于質(zhì)粒構(gòu)建和增強(qiáng)各種Notch3重組蛋白的表達(dá)，生成了包含Notch3核酸編碼序列的前135個^5咸基對的、與前導(dǎo)肽序列對應(yīng)的寡核苷酸。這些寡核苷酸在搖擺(wobble)編碼位置上包含有一些變化以降低GC含量。所有核苷酸序列變化都是沉默的，即沒有氨基酸序列變化(圖8A和8B)。將這些寡核苷酸退火到一起后，通過PCR-SOE(Ho等，Gene77:51(1989);Horton等,接(見圖9)。Notch3-LD/Fc表達(dá)構(gòu)建物和Notch3表達(dá)構(gòu)建物中使用了此前導(dǎo)肽編碼序列。因此，這兩種Fc融合蛋白都包含與N端連接的信號肽和與C端融合的人YlFc序列。Notch3-LD(包括前導(dǎo)肽)的氨基酸序列顯示于圖8B和SEQIDNO:6。使用100plNotch3-EGF/Fc或Notch3-LD/Fc(0.1pg/ml)(在含有l(wèi)x酚紅和3-4滴/升pHix(Pierce,Rockford,IL)的PBS中)包被96孔平底ImmulonII微量測試板(Dynatech,Laboratories,Chantilly，VA)，并于室溫溫育過夜。輕擊板以除去包被溶液，然后向每個孔添力。200nl封閉緩沖液(含有2%BSA、0.1%硫柳汞的PBST)，經(jīng)l小時以封閉非特異性結(jié)合。然后用PBST清洗各孔。自每個融合孔收集50)il培養(yǎng)上清液，并與50nl封閉緩沖液混合，然后添加至微量滴定板的各個孔中。溫育l小時后，用PBST清洗各孔。然后通過與偶聯(lián)有辣根過氧化物酶(HRP)的Fc特異性山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PA)的反應(yīng)來檢測所結(jié)合的小鼠抗體。向各孔添加HRP底物溶液(含有0.1%3,3，5，5-四曱基聯(lián)苯胺和0.0003%過氧化氫)，并顯色30分鐘。通過每孔添加50ml2M112804來終止反應(yīng)。用ELISA讀板儀(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)讀取450nm的OD。在185個分離和分析的雜交瘤中，一個來自用Notch3-LD/Fc免疫的小鼠的雜交瘤克隆產(chǎn)生了Notch3激動性抗體256A-13,對此抗體進(jìn)行了進(jìn)一步定性。使用來自該生成單抗256A-13的雜交瘤克隆的上清液實(shí)施了ELISA。結(jié)果顯示出對純化的Notch3LD/FC融合蛋白(該單抗就是用此融合蛋白生成的)的強(qiáng)結(jié)合活性，且不結(jié)合人Notchl-LD/Fc(LIN/二聚化結(jié)構(gòu)域在羧基末端與Fc區(qū)融合而成)或?qū)φ杖薋c蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)(表l)。表l:256A-13的ELISAOD讀數(shù)(使用雜交瘤上清液)靶蛋白Notch3-LD/Fc雜交瘤上清液對照IgGl單抗256A-13均值0.0192.828S.D.0.0020.047對從該第一ELISA篩選獲得的陽性雜交瘤克隆通過挑取單克隆進(jìn)行進(jìn)一步分離，并如上所述進(jìn)行第二ELISA測定以檢驗(yàn)對所選擇的免疫原的特異性結(jié)合。在更大規(guī)模的培養(yǎng)物中擴(kuò)增經(jīng)過檢驗(yàn)的雜交瘤克隆。使用蛋白A親和柱從這些大規(guī)模培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中純化單克隆抗體(單抗)。然后使用基于細(xì)胞的結(jié)合測定法、顯微鏡檢術(shù)、Western印跡、和FACS分析來表征抗Notch3激動劑單抗。實(shí)施例3:抗NOTCH3單抗的基于細(xì)胞的結(jié)合測定用于表征抗Notch3單抗的基于細(xì)胞的結(jié)合測定要求將全長人Notch3可讀框克隆入載體中，在這里所述載體是pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen,Carlsbad，CA)。使用人肝腫瘤RNA(Ambion，Inc.,Austin,TX)作為模板通過RT-PCR合成Notch3編碼區(qū)。最終的質(zhì)粒構(gòu)建物Notch3/Hygro表達(dá)全長Notch3蛋白，如圖1所示。使用Lipofectamine2000試劑盒，遵循與實(shí)施例1所述相同的規(guī)程，將Notch3/Hygro質(zhì)粒構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞(ATCCNo.CRL-11268)中而生成了表達(dá)Notch3的穩(wěn)定細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞在DMEM生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后再接種到含有200^ig/ml潮霉素的生長培養(yǎng)基中并培養(yǎng)12-14天。挑取完全分離的單集落，并在分開的孔中培養(yǎng)，直至擴(kuò)增得到足夠的克隆細(xì)胞。通過Western印跡分析和4吏用多克隆抗Notch3抗體(R&DSystems,Minneapolis,MN)的焚光電子顯微鏡檢術(shù)鑒定了對潮霉素選擇有抗性且表達(dá)高水平Notch3蛋白的穩(wěn)定293T克隆。還通過PCR構(gòu)建了只包含NotchLIN12/二聚化(LD)結(jié)構(gòu)域和跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域的部分(partial)Notch3表達(dá)質(zhì)粒，并亞克隆入pcDNA3.1中。還通過Western印跡驗(yàn)證了天然表達(dá)Notch3的人Sup-Tl細(xì)胞系(ATCCNo.CRL-1942)。在含有10%胎牛血清，2mM谷氨酰胺和lX必需氨基酸溶液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Sup-Tl細(xì)胞。使用FMATtm(焚光宏觀共聚焦高通量篩選)8100HTS系統(tǒng)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)遵循制造商提供的方案評估基于細(xì)胞的抗體結(jié)合。在96孔板中接種天然表達(dá)Notch3或經(jīng)Notch3表達(dá)構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系?；蛘?，在96孔板中接種瞬時轉(zhuǎn)染的293T或CHO細(xì)胞。細(xì)胞接種密度為30,000-50,000個細(xì)胞每孔。20-24小時后，向各孔添加抗Notch3單抗和lxPBS反應(yīng)緩沖液，并于37。C溫育1小時。除去一抗后，在各孔中添加偶聯(lián)有Cy-5的抗小鼠IgG抗體。還使用內(nèi)部自制的293T/Notch3穩(wěn)定細(xì)胞系以及兩種癌細(xì)胞系即人Sup-T1和A2780細(xì)胞系(KECACCNo.Cat.No.93112519)(二者都天然表達(dá)未顯示)。首先將細(xì)胞與lxPBS中的抗Notch3單抗一起溫育。清洗3次后，將細(xì)胞與偶聯(lián)有熒光分子的二抗一起溫育。將細(xì)胞重懸，在含有0.1%低聚曱醛的lxPBS中固定，并通過FACS(BDSciences,PaloAlto，CA)分析。結(jié)果表明了256A-13可結(jié)合培養(yǎng)細(xì)胞中自重組質(zhì)粒構(gòu)建物表達(dá)的Notch3受體或作為天然蛋白的Noteh3受體(表2)。對經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染的包含Notch3/Hygro質(zhì)粒的293T細(xì)胞也如上所述用免疫焚光染色并通過焚光顯微鏡檢術(shù)加以觀察。表2:256A-13在基于細(xì)胞的FACS分析中的結(jié)合活性(以平均焚光強(qiáng)度表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>基于細(xì)胞的FMAT和FACS分析證實(shí)了單抗256A-13確實(shí)結(jié)合培養(yǎng)細(xì)胞中自重組質(zhì)粒構(gòu)建物表達(dá)的Notch3受體或作為天然蛋白的Notch3受體(表2和表3)。表3:抗Notch3單抗在基于細(xì)胞的FMAT中的結(jié)合活性的匯總表<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>基于顯著高于IgGl對照和其它陰性雜交瘤克隆的FMAT信號讀出(p>0.01)確定陽性結(jié)合信號。IgGl對照結(jié)合讀出視為背景。用Notch3/Hygro質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞也如上所述用免疫焚光染色并通過熒光顯微鏡檢術(shù)觀察。通過Biacore系統(tǒng)(BiacoreInc.，Piscataway，NJ)分片斤了單抗256A-13的結(jié)合活性。將抗體經(jīng)由胺偶聯(lián)直接在芯片上固定化(固定化水平200RU)，并以5種不同濃度(范圍為37.5-120nM,結(jié)合時間為5-8分鐘，解離時間為l-2小時)注射Notch3-LD/Fc蛋白(抗原)。運(yùn)行緩沖液和樣品緩沖液為含有5mMCa"的PBS。芯片表面用10mM甘氨酸pH2再生。抗體以一式二份進(jìn)行定性。表4公開了計算得到的統(tǒng)計學(xué)均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差和動力學(xué)解離常數(shù)(KD)?？贵w具有KD為280pM的高親和力和較慢的關(guān)閉速率(off-rate)。標(biāo)準(zhǔn)誤差和卡方都很低，擬合也很好(動力學(xué)曲線未顯示)。表4:通過Biacore進(jìn)行的單抗256A-13結(jié)合親和力的表征<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>KD:256A-13和Notch3-LD/Fc解離常數(shù)。Ka:256A-13與Notch3-LD/Fc結(jié)合的速率(或稱"開啟速率"(On-rate))。Kd:256A-13與Notch3-LD/Fc解離的速率(或稱"關(guān)閉速率"(Off-rate))。SE:標(biāo)準(zhǔn)誤差。實(shí)施例4:256A-13結(jié)合活性的WESTERN印跡分析實(shí)施了Western印跡來評估在變性條件下256A-13對Notch3受體的結(jié)合活性，以及Notch3和其它Notch相關(guān)蛋白在人細(xì)胞系中的表達(dá)水平。將純化的Notch3-LD/Fc融合蛋白與蛋白質(zhì)加載緩沖液混合。還從實(shí)施例l所述瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制備蛋白質(zhì)樣品，即自培養(yǎng)皿收獲細(xì)胞，用PBS清洗一次，在總細(xì)胞蛋白提取緩沖液(Pierce,Rockford,IL)中重懸，并在添加等體積的2x蛋白質(zhì)樣品加載緩沖液后于100。C溫育10分鐘。通過在4-15。/。梯度SDS-PAGE中電泳將所有樣品分開。將蛋白質(zhì)自凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并將256A-13作為第一檢測抗體施加于Western印跡膜。如上所述使用偶聯(lián)有HRP的第二抗體來進(jìn)行檢測，并使用化學(xué)發(fā)光底物生成信號。針對人Fc、V5標(biāo)簽、Notch3和Notch1的陽性對照4元體購自Invitrogen、R&DSystems、SantaCruzBiotechnologies、和Orbigen。Westem印跡分析顯示，單抗256A-13不但如ELISA和FACS分析中觀察到的那樣在天然分子構(gòu)象下結(jié)合Notch3-LD/Fc，還在變性條件下結(jié)合Notch3-LD/Fc。實(shí)施例5:通過螢光素酶報道物測定法評估256A-13的功能性A.質(zhì)粒構(gòu)建物通過測序驗(yàn)證了上文實(shí)施例3所述全長Notch3表達(dá)構(gòu)建物，其與圖l所示的公布序列相同。如實(shí)施例4所述通過瞬時轉(zhuǎn)染和Western印跡檢驗(yàn)了Notch3表達(dá)。為了生成用于進(jìn)行Notch信號傳導(dǎo)的縈光素酶報道物質(zhì)粒，合成了兩種包含CBF1結(jié)合基序串聯(lián)重復(fù)的互補(bǔ)寡核普酸引物，其具有如下序列5，<MCTCGTGG(SEQIDNO:12)將這兩種寡聚物引物在100mMNaCl中于65。C退火，每種寡聚物的濃度各為4mM。彼此退火后，通過PCR延伸引物。將PCR產(chǎn)物克隆入商品化載體中。通過測序檢驗(yàn)插入序列，其包含CBF1結(jié)合基序的四個串聯(lián)重復(fù)和兩個側(cè)翼XhoI位點(diǎn)。使用XhoI切出插入序列，并連接在螢火蟲螢光素酶報道物編碼序列的下游。在螢光素酶報道物測定法和測序分析后，選擇具有CBF1結(jié)合基序的八個重復(fù)的質(zhì)?？寺?，命名為CBF1-Luc。B.穩(wěn)定細(xì)胞系的生成使用人胚腎細(xì)胞系(HEK293)生成了兩種穩(wěn)定細(xì)胞系，供功能測定使用。一種細(xì)胞系包含已整合到核基因組中的CBFl-Luc報道物質(zhì)粒和Notch3表達(dá)質(zhì)粒。此細(xì)胞系是使用LipoFectamine2000依照制造商的方案將Notch3/潮霉素和CBFl-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中而生成的。在DMEM生長培養(yǎng)基中針對200pg/ml潮霉素選^奪穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆，并通過螢光素酶^^道測定和Western印跡進(jìn)行篩選。選擇一個具有相對高水平Notch3受體表達(dá)(根據(jù)Westem印跡)和螢光素酶活性的細(xì)胞系供功能測定使用，并命名為NC85。C.僅使用過表達(dá)Notch3的細(xì)胞進(jìn)行的螢光素酶報道物測定將NC85細(xì)胞在單抗256-A13存在下培養(yǎng)24-48小時。然后吸去培養(yǎng)基，在lxPassive溶胞緩沖液(E1501,Promega，Madison,WI)中裂解細(xì)胞，并使用螢光素酶測定系統(tǒng)遵循制造商的方案(El501，Promega，Madison,WI)在TD-20/20照度計(TumerDesignsInstrument,Sunnyvale,CA)中測定螢光素酶活性。如圖5所示，對于在單抗256-A13存在下培養(yǎng)的NC85細(xì)胞，螢光素酶活性與對照抗體G3相比升高了幾乎4倍。螢光素酶報道物測定證明了單抗256-A13在沒有配體結(jié)合的情況下誘導(dǎo)了螢光素酶活性的顯著升高，而拮抗性抗Notch3抗體單抗256A-4和256A-8不然(圖5)。實(shí)施例8:256A-13的結(jié)合表位的定位A.使用Notch3單一結(jié)構(gòu)域和Fc融合蛋白構(gòu)建物進(jìn)行的表位定位策略和原理Notch3LIN12/異二聚化結(jié)構(gòu)域(也稱為Notch3LIN12-二聚化結(jié)構(gòu)域(Notch3-LD))由三個LIN12結(jié)構(gòu)域組成，即第一LIN12(Ll)、第二LIN12(L2)和第三LIN12(L3)(見圖IO)。生成了五種Notch3單一結(jié)構(gòu)域/Fc融合蛋白表達(dá)構(gòu)建物(圖7)，并實(shí)施了Western印跡來評估哪個結(jié)構(gòu)域足以進(jìn)行單抗256A-13結(jié)合。瞬時轉(zhuǎn)染后，通過SDS-PAGE分析了含有被分泌的Notch3單一結(jié)構(gòu)域/Fc融合蛋白的的上清液。結(jié)果顯示了單抗256A-13只結(jié)合Notch3-Ll，而不結(jié)合任何其它結(jié)構(gòu)域。ELISA實(shí)驗(yàn)也顯示了單抗256A-13對Notch3-Ll具有很強(qiáng)的結(jié)合，對Notch3-L3的結(jié)合弱，而不結(jié)合其它結(jié)構(gòu)域(表5)。表5:使用針對Notch3-結(jié)構(gòu)域/Fc融合蛋白構(gòu)建物的單抗256A-13的Westem印跡結(jié)果和ELISA讀數(shù)的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>A.通過亞結(jié)構(gòu)域交換進(jìn)行的結(jié)合表位鑒定首先，激動性Notch3單抗256A-13可結(jié)合Notch3LIN12/二聚化結(jié)構(gòu)域(LD)，但不結(jié)合與之同源的人NotchlLIN12/二聚化結(jié)構(gòu)域(表5)。其次，抗Notch3單抗在Westem印跡中可結(jié)合變性的Notch3蛋白，如實(shí)施例4和8所討論的，說明256A-13可結(jié)合單一表位或彼此獨(dú)立的離散表位。第三，Notch3和Notchl在LIN12/二聚化結(jié)構(gòu)域中共享大約55。/。的氨基酸序列同源性，因此得出結(jié)論此區(qū)域中Notch3和Notchl之間的亞結(jié)構(gòu)域交換不會破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法PCR擴(kuò)增了Notchl-LDcDNA。cDNA模板第一條鏈?zhǔn)亲訮A-1細(xì)胞總RNA(ATCCNo.CRL-1572)合成的。PCR擴(kuò)增了人IgGK鏈前導(dǎo)肽編碼序列，用其作為前導(dǎo)肽通過PCR-SOE連接至Notchl-LD的5，端并亞克隆入His-ylFc/pSec中。表6:單抗256A-13和對照IgGl結(jié)合Notch3-LD/Fc或Notch1-LD/Fc的ELISAOD讀數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>B.亞結(jié)構(gòu)域交換融合蛋白構(gòu)建物的生成基于上文A部分呈示的ELISA分析結(jié)果，將第一LIN12結(jié)構(gòu)域或L1的靶結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步分成3個亞結(jié)構(gòu)域，并個別地與Notch1-L1的相應(yīng)亞結(jié)構(gòu)域交換。使用PCR-SOE(Ho等，Gene77:51(1989);Horton等，BioTechniques8:528(1990))生成了亞結(jié)構(gòu)域交換構(gòu)建物，如圖9和10所示。PCR和PCR-SOE反應(yīng)是使用PCR實(shí)施的，其中向反應(yīng)中添加了1M甜菜堿和5。/。DMSO。將最終的PCR-SOE產(chǎn)物亞克隆，并通過測序檢驗(yàn)。用NheI和XhoI切割具有正確插入序列的質(zhì)粒克隆以切出插入序列，將其凝膠純化和亞克隆。圖7顯示了五種Notch3/Notchl亞結(jié)構(gòu)域交換構(gòu)建物。為了便于表位定位，使用人IgGK鏈信號肽作為結(jié)構(gòu)域交換構(gòu)建物中的前導(dǎo)肽。圖10顯示了亞結(jié)構(gòu)域構(gòu)建物的氨基酸序列。C.Notch3/Notchl亞結(jié)構(gòu)域交換融合蛋白的表達(dá)使用LipoFectamine2000將Notch3/Notchl-LD結(jié)構(gòu)域交換質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞中。在6孔板中在含有10%FCS的DMEM生長培養(yǎng)基中以0.8-1x1(/個細(xì)胞每孔接種CHO細(xì)胞，在C02溫箱中維持過夜后轉(zhuǎn)染。在生長培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染約3小時后回收細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)換成含有2。/。FCS的DMEM，并培養(yǎng)3天。收獲條件培養(yǎng)基，并以3500rpm離心10分鐘。收集自CHO分泌的含有Notch3-LD結(jié)構(gòu)域交換蛋白的上清液，并為Western印跡和ELISA結(jié)合分析做好準(zhǔn)備。ELISA顯示了所有結(jié)構(gòu)域交換融合蛋白均在條件培養(yǎng)基中被表達(dá)并分泌(表4)，這得到了Western印跡分析的進(jìn)一步證實(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)。ELISA讀數(shù)使用抗人Fc抗體作為檢測抗體，顯示了所有蛋白質(zhì)均在條件化培養(yǎng)基中得到了表達(dá)。人lgG/Fc用作對照。各個孔中包被的人IgG/Fc的起始點(diǎn)是100ng。D.使用ELISA進(jìn)行的表位結(jié)合分析試才反(Dynatech，Laboratories,Chantilly,VA),方法是添加100nl^t體(0.1iig/ml)(在含有l(wèi)x酚紅和3-4滴/升pHix(Pierce，Rockford，IL)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中)，并于室溫溫育過夜。通過輕擊^1以除去包祐::容液后，向每個孔添加200pl封閉緩沖液(在含有2%BSA和0.1。/。硫柳汞的PBST中)，溫育l小時以封閉非特異性結(jié)合。然后用PBST清洗各孔。自每個Notch3/Notchl結(jié)構(gòu)域交換構(gòu)建物轉(zhuǎn)染收集50pl上述條件培養(yǎng)基，與50jil封閉緩沖液混合，并添加至微量滴定板的各個孔中。溫育1小時后，Notch3/Notchl-LD結(jié)構(gòu)域交換蛋白被所包被的抗Fc抗體捕獲，并用PBST清洗各孔。將抗Notch3單抗和同種型匹配的對照單抗在上述封閉緩沖液中連續(xù)稀釋，并向每個孔中添加50pl稀有辣根過氧化物酶(HRP)的Fc特異性山羊抗小鼠IgG來進(jìn)行檢測。向各孔添加HRP底物溶液(含有0.1%3，3,5,5-四曱基聯(lián)苯胺和0.0003%過氧化氫)，顯色30分鐘。通過每孔添加50ml2M壓804來終止反應(yīng)。用ELISA讀板儀讀取450nm的OD。通過上述ELISA分析類似地檢驗(yàn)了亞結(jié)構(gòu)域交換構(gòu)建物和突變襄(clustersofmutations)。使用針對亞結(jié)構(gòu)域交換蛋白的單抗256A-13進(jìn)行的ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示，Notch3-Ll結(jié)構(gòu)域中第一亞結(jié)構(gòu)域(Ll)的交換不影響結(jié)合，表明256A-13不結(jié)合此區(qū)。另一方面，Notch3-Ll中第二和第三亞結(jié)構(gòu)域的交換顯著降低了結(jié)合。因此可見，這兩個亞結(jié)構(gòu)域包含單抗256A-13的結(jié)合表位(圖IO)。相反，同種型匹配的陰性對照抗體G3在ELISA測定中不結(jié)合任何結(jié)構(gòu)域交換融合蛋白(圖IO)。自上述實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，即第一LIN12結(jié)構(gòu)域是單抗256A-13結(jié)合所要求的，具體是在第二和第三亞結(jié)構(gòu)域區(qū)內(nèi)。為了進(jìn)一步對單抗256A-13所結(jié)合的具體表位定位，將Notch3-Ll結(jié)構(gòu)域的第二和第三亞結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步分成五個氨基酸簇，并與Notchl中的相應(yīng)氨基酸殘基交換(圖IO)。ELISA結(jié)合測定法顯示了DRE(Notch3序列)變成SQL(Notchl序列)的交換完全消除了ELISA結(jié)合活性，表明只有此表位是Notch3-Ll結(jié)構(gòu)域內(nèi)單抗256A-13結(jié)合所要求的。使用雙丙氨酸肽掃描進(jìn)行了單抗256A-13結(jié)合所要求的氨基酸殘基的精確分析。這些丙氨酸肽覆蓋了通過氨基酸交換分析定位得出的DRE表位。將這些肽合成為交聯(lián)到尼龍支持膜上的點(diǎn)。通過點(diǎn)印跡評估了抗體印跡結(jié)合。單抗G3用作對照IgGl。圖ll顯示了這些肽序列。實(shí)施例9:抗NOTCH3單抗的測序因?yàn)榭贵w結(jié)合特性完全依賴于重鏈和輕鏈二者的可變區(qū)，所以確定了256A-13的可變序列的亞型并加以測序?？贵wIgG亞型是使用Isostrip小鼠單克隆抗體試劑盒(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)確定的。結(jié)果顯示了256A-13具有IgGi重鏈和K輕鏈。通過RT-PCR和cDNA克隆將重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列解碼(decode)。使用RNeasy微型試劑盒遵循制造商的方案(QiagenSciences,Valencia,CA)自雜交瘤克隆256A-13分離總RNA。使用RNA模板和SuperscriptaseIII試劑盒合成cDNA第一鏈。使用覆蓋小鼠K鏈編碼區(qū)的5，端的簡并正向引物和在與可變區(qū)3'端的連才妄處(juncturetothe3，endofthevariableregion)與恒定區(qū)匹酉己的反向引物，或者使用覆蓋小鼠重鏈編碼區(qū)的5，端的簡并正向引物和小鼠重鏈中的恒定區(qū)反向引物，從該cDNA第一鏈PCR擴(kuò)增輕鏈和重鏈cDNA的可變區(qū)。將PCR產(chǎn)物克隆入商品化載體中，并由LoneStarLab(Houston,TX)測序。利用計算機(jī)軟件程序DNAStar(DNASTAR,Inc.,Madison，WI)分析核苷酸序列。根據(jù)源自同一雜交瘤克隆的多個PCR克隆的序列確定了每種抗Notch3單抗序列。單抗256A-13的可變重鏈區(qū)包含121個氨基酸殘基，而輕鏈可變區(qū)包含102個氨基酸殘基(圖4A和4B)。實(shí)施例10:NOTCH3激動性抗體對NOTCH3的金屬蛋白酶切割的影響Notch受體活化參與配體誘導(dǎo)的、近膜位點(diǎn)(S2)處的金屬蛋白酶切割，生成胞外亞基。此切割是進(jìn)行S3切割以釋放活化的Notch胞內(nèi)區(qū)的必要先決條件。為了測試激動性抗體是否能誘導(dǎo)不依賴配體的順序Notch活化事件，包括兩次蛋白水解切割，用G3或256-A13處理穩(wěn)定表達(dá)重組Notch3受體的293T細(xì)胞(NC85細(xì)胞)。使用結(jié)合至固相表面的識別Notch3切割產(chǎn)物的抗體進(jìn)行ELISA測定來檢測培養(yǎng)基中由于蛋白水解切割而生成的可溶性胞外亞基。如圖6所示，Notch3激動性單抗顯著提高了條件培養(yǎng)基中可溶性Notch3胞外亞基的生成，而對照抗體G3不然。實(shí)施例12:NOTCH3相關(guān)疾病的測定法為了鑒定其它Notch3相關(guān)疾病，可以對來自患者樣品的Notch3基因測序，或者使用患者組織實(shí)施免疫組織化學(xué)來檢查Notch3受體表達(dá)的不足。另外，可以分離和培養(yǎng)來自懷疑具有Notch3相關(guān)疾病的患者的細(xì)胞，并研究本發(fā)明的激動性抗體對Notch3信號傳導(dǎo)的影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到或僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能夠確定本文所述本發(fā)明具體實(shí)施方案的許多等效實(shí)施方案。所附權(quán)利要求意圖涵蓋這樣的等效實(shí)施方案。權(quán)利要求1.一種可變重(″VH″)鏈序列，其包含與SEQIDNO2所列氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。2.權(quán)利要求1的VH鏈區(qū)，其進(jìn)一步包含恒定區(qū)。3.權(quán)利要求2的VH鏈區(qū)，其包含恒定區(qū)的CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。4.權(quán)利要求2的VH鏈區(qū)，其中所述恒定區(qū)來自IgG抗體。5.權(quán)利要求4的VH鏈區(qū)，其中所述IgG抗體是IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體。6.—種可變輕("VL")鏈序列，其包含與SEQIDNO:3所列氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。7.權(quán)利要求6的VL鏈區(qū)，其進(jìn)一步包含恒定區(qū)。8.—種VH鏈序列，其包含SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。9.一種VL鏈序列，其包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9。10.—種核酸，其編碼權(quán)利要求l或權(quán)利要求6的可變重鏈序列和/或可變輕鏈序列。11.一種核酸，其編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9中的一個或多個。12.—種載體，其包含權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的一種或多種核酸。13.—種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求12的載體。14.一種抗體或抗體片段，其包含權(quán)利要求1的VH鏈區(qū)，其中所述抗體特異'性結(jié)合Notch3。15.—種抗體或抗體片段，其包含權(quán)利要求6的VL鏈區(qū)，其中所述抗體特異性結(jié)合Notch3。16.權(quán)利要求13的抗體，其進(jìn)一步包含權(quán)利要求6的VL鏈區(qū)。17.權(quán)利要求15的抗體，其中所述VL鏈區(qū)包含SEQIDNO:3且所述VH鏈區(qū)包含SEQIDNO:2。18.—種抗體或抗體片段，其包含權(quán)利要求6的VL鏈區(qū)，其中所述抗體特異性結(jié)合Notch3。19.權(quán)利要求17的抗體，其進(jìn)一步包含權(quán)利要求1的VH。20.—種抗體，其包含SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。21.權(quán)利要求20的抗體，其進(jìn)一步包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9。22.權(quán)利要求14-21任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是單鏈Fv。23.權(quán)利要求14-22任一項(xiàng)的抗體，其進(jìn)一步包含標(biāo)記物。24.—種用于產(chǎn)生抗體的方法，包括在適于抗體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求13的細(xì)胞，并分離所產(chǎn)生的抗體。25.權(quán)利要求14-22任一項(xiàng)或權(quán)利要求24的抗體在制備藥物中的用途。26.權(quán)利要求14-22任一項(xiàng)或權(quán)利要求24的抗體用于治療Notch3相關(guān)疾病或病癥的用途。27.依照權(quán)利要求26的用途，其中所迷疾病是神經(jīng)變性性疾病。28.依照權(quán)利要求26的用途，其中所述疾病是CADASIL、家族性偏癱性偏頭痛(FHM)、家族性陣發(fā)性共濟(jì)失調(diào)或Alagille綜合征。29.依照權(quán)利要求23的抗體用于檢測Notch3相關(guān)疾病的用途。30.—種Notch3結(jié)合表位，其包含SEQIDNO:10。31.—種Notch3結(jié)合表位，其包含SEQIDNO:ll。32.—種抗體，其結(jié)合權(quán)利要求30或權(quán)利要求31的表位。33.權(quán)利要求32的抗體，其中所述抗體是激動劑。34.權(quán)利要求33的抗體，其中所述抗體包含SEQIDNO:2和SEQIDNO:3。35.權(quán)利要求33的抗體，其中所述抗體包含SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9。36.—種組合物，其包含權(quán)利要求14-22或32-35任一項(xiàng)的抗體。37.權(quán)利要求36的組合物用于治療Notch3相關(guān)疾病或病癥的用途。全文摘要本發(fā)明涉及特異性結(jié)合Notch3且激活信號傳導(dǎo)的激動性抗體。本發(fā)明包括結(jié)合包含第一個Lin12結(jié)構(gòu)域的表位的抗體。本發(fā)明還包括這些抗體用于治療或預(yù)防Notch3相關(guān)疾病或病癥的用途。文檔編號A61K39/395GK101563366SQ200780047141公開日2009年10月21日申請日期2007年10月18日優(yōu)先權(quán)日2006年10月19日發(fā)明者吳文娟,塞克·C·馮,康李,桑杰亞·辛,濱冰·S·周申請人:健泰科生物技術(shù)公司