專利名稱：用于治療脊髓增生病的jak抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脊髓增生病(NfPDs)和脊髓發(fā)育異常綜合征的治療。具 體地說，本發(fā)明涉及使用作為JAK2抑制劑的化合物，特別是使用稠合 吡咯并咔唑化合物來治療MPDs和脊髓發(fā)育異常綜合征。
背景技術(shù)：
脊髓增生病(MPDs)是一種特征在于一種或多種造血譜系超量產(chǎn)生 的無性系惡性病，該造血譜系具有導(dǎo)致細(xì)胞過多骨髓(BM)的相對正常 的分化。認(rèn)為MPDs出現(xiàn)在單一的多能祖細(xì)胞或干細(xì)胞中，其支配BM 和血液。經(jīng)過培養(yǎng)的得自MPDs患者的造血祖細(xì)胞顯示生長性改變和 生長因子非依賴性。對于某些MPDs的分子基礎(chǔ)還不清楚的，直到一 系列新近的報(bào)告識別了在JAK2的假激酶(pseudokinase)結(jié)構(gòu)域中的單 個(gè)氨基酸替換V617F，在真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、特發(fā)性血小板增多(ET) 和慢性特發(fā)性骨髓纖維化(CIMF)中作為盛行的分子損害。這一突變在 75%-97%的PV患者和約40%-50%的ET和CIMF患者中被發(fā)現(xiàn)(James 等人，2005, Trends in Molecular Medicine 11, 546-554)。重要地是，在 85種其它激酶的自抑制性(autoinhibitory)結(jié)構(gòu)域或激酶結(jié)構(gòu)域中沒有 發(fā)現(xiàn)其它的突變(Levine等人，2005, Cancer Cell 7, 387-397)。另外，還 在脊髓發(fā)育異常綜合征(MDS)中識別了 V617F突變。基于預(yù)測的JAK2 結(jié)構(gòu)，V617F置換破壞了 JH2與蛋白質(zhì)的激酶(JH1)結(jié)構(gòu)域之間的自抑 制性相互作用。因此，V617F突變體具有組成活性并且當(dāng)在BaF3/EPOR 細(xì)胞中表達(dá)時(shí)被賦予生長因子非依賴性和組成STAT5活化(Levine等 人，Cancer Cell 2005, 7, 387-397; Kralovics等人，2005， N. Engl J. Med. 352， 1779-1790))。運(yùn)載V617F突變的紅系祖細(xì)胞當(dāng)缺乏外源性紅細(xì)胞 生成素(EPO)時(shí)生長并形成內(nèi)源性紅系集落(EEC)(MPDs的一個(gè)標(biāo)志)， 并且siRNA介導(dǎo)的JAK2失活減少EEC形成。最后，用表達(dá)V617F突變體而非野生型JAK2的鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行移植的小鼠發(fā)展成的病理特 征密切地相似于人中的PV，包括血紅蛋白/血細(xì)胞比容的高度增加，白
細(xì)胞增多，巨核細(xì)胞增生，骨髓外造血，導(dǎo)致脾大(spleenomegaly) 和骨髓的骨髓纖維化(James等人，2005, Nature 434, 1144-1148; Wernig 等人，2006, Blood. 2006 Feb 14,[先于印刷的電子公開])。臨床上，CIMF 患者中突變體的存在與更具攻擊性的疾病和顯著更差的存活率有關(guān) (Campbell等人，2006， Blood, 2098-2100)。
本領(lǐng)域需要抵制與突變的或活化的JAK2有關(guān)的表現(xiàn)型和用于治 療與JAK2活化有關(guān)的骨髓增生性疾病和脊髓發(fā)育異常綜合征。

發(fā)明內(nèi)容
受體結(jié)合型酪氨酸激酶(trk)是跨膜蛋白，其包含胞外配體結(jié)合結(jié) 構(gòu)域、跨膜序列和胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。酪氨酸激酶在細(xì)胞信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)中發(fā)揮作用。細(xì)胞增殖、分化、移行、代謝和程序死亡死亡是酪氨 酸激酶介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的實(shí)例。JAK2是非受體酪氨酸激酶。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)JAK2抑制劑可被用來治療脊髓增生病和其它的其中 JAK2的組成型表達(dá)對病理狀態(tài)有貢獻(xiàn)的疾病。
因此本發(fā)明提供了使用包含稠合吡咯并咔唑衍生物的組合物來治 療脊髓增生病和相關(guān)病癥的方法。
可用本發(fā)明的方法治療的與活化JAK2有關(guān)的脊髓增生病和相關(guān) 病癥包括但不限于骨髓增生性疾病，諸如，例如真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、 特發(fā)性血小板增多(ET)、伴骨髓外化生的骨髓纖維化(MMM)(也被稱 作慢性特發(fā)性骨髓纖維化(CIMF))、未分類的脊髓增生病(uMPDs)、嗜 酸性白細(xì)胞增多綜合征(HES)和系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥(SM)。
在本發(fā)明的方法中，將治療有效量的JAK2抑制劑給用至受試者。
15對于平均體重為70千克的成人，給藥方案可以是例如約20毫克約120 毫克，每天兩次。在一些實(shí)施方案中，對于通常成人的劑量為約40毫 克到約100亳克，每天兩次。在其它實(shí)施方案中，對于通常成人的劑 量為約60毫克到約80毫克，每天兩次。
在本發(fā)明的方法中，在存在稠合吡咯并咔唑衍生物時(shí)，某些蛋白 質(zhì)的活性與不存在稠合吡咯并咔唑時(shí)相比被降低。這些蛋白質(zhì)包括但 是不限于JAK2、 STAT5、 STAT3、 SHP2、 GAB2、 AKT和ERK。


圖1表示CEP-701對JAK2激酶活性的抑制。
圖2表示等位基因特異PCR(畫面A)和限制酶切分析(畫面B)的結(jié) 果，所述試驗(yàn)的進(jìn)行是為了證實(shí)在HEL 92細(xì)胞中存在V617F突變。 K562細(xì)胞(其不隱匿這一突變)用作野生型對照。畫面A:對于等位 基因特異PCR，突變體特異性引物產(chǎn)生診斷突變的203 bp產(chǎn)物(箭頭)； 364 bp產(chǎn)物用作PCR的內(nèi)對照。M，分子量標(biāo)記；泳道1和2，是顯 示364bp突變體和野生型等位基因以及203bp突變體特異等位基因的 HEL 92細(xì)胞。泳道3，是僅顯示364bp野生型等位基因的對照K562 細(xì)胞。畫面B:對于限制酶切分析，包括V617F突變的PCR產(chǎn)物從 HEL92和K562 DNA產(chǎn)生并且被BsaXI限制酶酶切消化。未消化的(用 "-"表示)和被BsaXI消化的(用"+ "表示)PCR產(chǎn)物用M (分子量的 標(biāo)記)表示。生成K562 DNA的預(yù)測的限制圖譜。試驗(yàn)了每個(gè)細(xì)胞系 的兩個(gè)獨(dú)立的DNA制備物。圖3表示CEP-701對HEL 92細(xì)胞中 JAK2/STAT信號發(fā)放的作用。HEL 92細(xì)胞與O.l(iM、 0.3|iM、 I.OjiM 和3.0pM的CEP-701培養(yǎng)24小時(shí)，如圖所示。對JAK2/STAT信號發(fā) 放的作用的評價(jià)通過如圖所示的使用磷酸特異性STAT3和STAT5抗 體的蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行，或者通過JAK2的免疫沉淀/蛋白質(zhì)印跡規(guī)程 IP/WB)進(jìn)行總的JAK2抗體用于IP并且通過使用磷酸酪氨酸抗體的 WB評價(jià)磷酸化作用。Bcbd的表達(dá)通過蛋白質(zhì)印跡測定。
圖4表示CEP-701對HEL 92細(xì)胞生長的作用。如圖所示，HEL 92細(xì)胞與濃度漸增的CEP-701培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)。對細(xì)胞生長的作 用通過MTS試驗(yàn)評價(jià)。在10% FCS(畫面A和B)或沒有血清(畫面C 和D)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。畫面A系顯示了在10。/。胎牛血清(FBS)存在的條件 下培養(yǎng)24小時(shí)的結(jié)果。畫面B表示在10%FBS存在的條件下培養(yǎng)48 小時(shí)的結(jié)果。畫面C表示在不存在FBS的條件下培養(yǎng)24小時(shí)的結(jié)果。 畫面D表示在不存在FBS的條件下培養(yǎng)48小時(shí)的結(jié)果。對于畫面A-D， 將漸增量的CEP-701加入到單獨(dú)的培養(yǎng)基中(如陰影條形圖所示)； 未經(jīng)處理的細(xì)胞在第一條形圖中示出。
圖5表示在每24小時(shí)補(bǔ)充化合物的條件下CEP-701對HEL 92細(xì) 胞生長的作用。HEL 92細(xì)胞在2% FCS中與濃度漸增的CEP-701 (如 圖所示)培養(yǎng)72小時(shí)。每24小時(shí)補(bǔ)充CEP-701 。對細(xì)胞生長的作用通 過MTS試驗(yàn)進(jìn)行評價(jià)。未經(jīng)處理的細(xì)胞在第一條形圖中示出。
圖6表示CEP-701在HEL 92細(xì)胞中對細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)的作用。 HEL 92細(xì)胞與濃度漸增的CEP-701 (如圖所示)培養(yǎng)24小時(shí)、48小 時(shí)和72小時(shí)。細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)通過組蛋白/DNA釋放試驗(yàn)進(jìn)行分 析。畫面A表示24小時(shí)試驗(yàn)，畫面B表示48小時(shí)試驗(yàn)，和畫面C表 示72小時(shí)試驗(yàn)。
圖7表示CEP-701在HEL 92細(xì)胞中對STAT5活化的抑制。HEL 92細(xì)胞與濃度漸增的CEP-701培養(yǎng)1小時(shí)、1.5小時(shí)和2.5小時(shí)(如圖 所示)。制備了全細(xì)胞提取物并通過使用特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡評 價(jià)了對STAT5磷酸化作用的影響。對譜帶進(jìn)行定量并將磷酸化程度相 對于樣品中STATS的總量進(jìn)行歸一化。結(jié)果表示為剩余的STAT5磷 酸化與用媒介物處理樣品相比的百分?jǐn)?shù)。
5個(gè)實(shí)驗(yàn)的通常值在底部顯示?；?個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，在HEL92細(xì) 胞中對STAT5抑制的ICso經(jīng)測定為約10nM。
圖8表示CEP-701在HEL 92細(xì)胞中對STAT3活化的抑制。HEL 92細(xì)胞與濃度漸增的CEP-701培養(yǎng)1小時(shí)、1.5小時(shí)和2.5小時(shí)(如圖 所示)。制備了全細(xì)胞提取物并通過使用特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡評 價(jià)了對STAT3磷酸化作用的影響。對譜帶進(jìn)行定量并將磷酸化程度相 對于樣品中STAT3的總量進(jìn)行歸一化。結(jié)果表示為剩余的STAT3磷酸化與用媒介物處理樣品相比的百分?jǐn)?shù)。5個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值在底部顯
示。在HEL92細(xì)胞中對STAT3抑制的IC5o如圖所示為約10nM。
圖9表示人ocl-AGP在HEL 92細(xì)胞中對CEP-701介導(dǎo)的STAT5 活性抑制的作用。HEL 92細(xì)胞與1.0毫克/的otl-AGP和濃度漸增的 CEP-701 (如圖所示)培養(yǎng)1小時(shí)，制備了全細(xì)胞提取物并通過使用特 異性抗體蛋白質(zhì)印跡評價(jià)了對STAT5磷酸化作用的影響。對譜帶進(jìn)行 定量并將磷酸化程度相對于樣品中STAT5的總量進(jìn)行歸一化。結(jié)果表 示為剩余的STAT5磷酸化與用媒介物處理樣品相比的百分?jǐn)?shù)。與1.0 毫克/毫升AGP的共同培養(yǎng)使對STAT5抑制的IC^改變?yōu)?pM。
圖10表示每天兩次皮下給予CEP-701(30毫克/千克)對HEL 92腫 瘤異種移植物的生長的作用。畫面A:未經(jīng)處理的腫瘤的生長用正方 形表示，而經(jīng)過處理的腫瘤用三角形表示。畫面B:表示切除的未經(jīng)處 理的和經(jīng)過處理的腫瘤。圖11表示CEP-701在HEL 92腫瘤異種移植 物中對JAK2/STAT信號發(fā)放的作用。對攜帶HEL 92腫瘤異種移植物 的動(dòng)物皮下給予一劑CEP-701(30毫克/千克)并在通過蛋白質(zhì)印跡在 CEP-701給予后的0、 1、 2、 4、 8和12小時(shí)評價(jià)對STAT5和STAT3 活化的作用。還測定了 CEP-701的腫瘤內(nèi)的濃度。圖12表示用于通過 等位基因特異PCR測定V617F突變的存在的臨床樣品的基因型。通過 等位基因特異PCR試驗(yàn)了慢性特發(fā)性骨髓纖維化(CIMF)患者弁648和 #650的V617F突變。野生型和突變體等位基因作為364bp片段擴(kuò)增， 而203bp (突變體特異PCR產(chǎn)物)顯示了存在V617F突變。還顯示了 HEL 92(其包含突變體等位基因)和野生型K562細(xì)胞的結(jié)果。
圖13表示使用限制酶BstXl的臨床樣品的基因型。包括V617F 突變的PCR產(chǎn)物由BstXl進(jìn)行酶切消化，如圖所示。SLC是包含BstXl 位點(diǎn)的JAK2非相關(guān)PCR產(chǎn)物，其用作消化完成的對照。
圖14表示CEP-701對得自患者#648的CD34+原代培養(yǎng)物的生長 的作用(XTT試驗(yàn))。畫面A: 24小時(shí)。畫面B: 48小時(shí)。
圖15表示CEP-701對得自患者#648的CD34+原代培養(yǎng)物的生長 和存活的作用。CD34+造血祖細(xì)胞從患者糾48中純化得到并且與濃度 漸增的CEP-701進(jìn)行培養(yǎng)，如圖所示。畫面A:細(xì)胞用CEP-701處理
1824小時(shí)并且通過FACS分析評價(jià)對細(xì)胞生長(活細(xì)胞)和細(xì)胞程序死亡 (錨定蛋白(Annexin V))的作用。畫面B:用CEP-701處理24小時(shí)的細(xì) 胞被稀釋到新鮮的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)72小時(shí)。細(xì)胞計(jì)數(shù)使用錐蟲藍(lán)來測 定。T-O表示在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)。
圖16表示CEP-701在得自患者#648的CD34+原代培養(yǎng)物中對 JAK2/STAT信號發(fā)放的作用。CD34+造血祖細(xì)胞從患者弁648中純化得 到并且與濃度漸增的CEP-701進(jìn)行培養(yǎng)1小時(shí)，如圖所示。制備了全 細(xì)胞提取物并通過使用特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡分析了 STAT5、 STAT3的表達(dá)和磷酸化。為了評價(jià)JAK2活性，將JAK2免疫沉淀，然 后使用抗磷酸酪氨酸特異性抗體(4G10)的蛋白質(zhì)印跡分析。將斑點(diǎn)剝離 并用JAK2抗體再次進(jìn)行探針探測。親環(huán)蛋白和(5肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)對照。
圖17表示CEP-701在得自患者#648的CD34+原代培養(yǎng)物中對 SHP2和Gab2活化以及對AKT和MAPK信號發(fā)放的作用。CD34+造血 祖細(xì)胞從患者#648中純化得到并且與濃度漸增的CEP-701培養(yǎng)1小時(shí)， 如圖所示。制備了全細(xì)胞提取物并通過使用特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡 分析了多種信號分子的表達(dá)和磷酸化。畫面A:通過磷酸特異性抗體 (pSHP2和pGAB2)評價(jià)了 CEP-701對SHP2和GAB2活化的作用。分 析了總表達(dá)水平(SHP2和GAB2)。畫面B:使用對抗AKT(pAKT)和 ERK(pERK)的磷酸特異性抗體評價(jià)了 CEP-701對MAPK和AKT信號 發(fā)放的作用。使用特異性抗體(AKT和ERK)分析了總表達(dá)水平。p肌 動(dòng)蛋白用作內(nèi)對照。
圖18表示與CEP-701培養(yǎng)24小時(shí)在得自患者#648的CD34+原代 培養(yǎng)物中對STAT5信號發(fā)放的作用。CD34+造血祖細(xì)胞從患者弁648中 純化得到并且與濃度漸增的CEP-701培養(yǎng)24小時(shí)，如圖所示。制備了 全細(xì)胞提取物并通過使用特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡分析了 STAT5的表 達(dá)和磷酸化以及Bclxl的表達(dá)。p肌動(dòng)蛋白和親環(huán)蛋白的表達(dá)用作內(nèi)對 照。
示例性實(shí)施方案的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及使用生物學(xué)活性的稠合 吡咯并咔唑衍生物治療多種與JAK2活化有關(guān)的病癥或綜合征的方法。在某些實(shí)施方案中，病癥和/或綜合征包括例如脊髓增生病(MPDs)和脊
髓發(fā)育異常綜合征?？捎糜谥委熕霾“Y和/或綜合征的稠合吡咯并咔 唑衍生物之一是B引哚并咔唑和茚并咔唑衍生物。更具體地說，本發(fā)明 涉及使用吲哚并咔唑治療MPDs和脊髓發(fā)育異常綜合征和其它的與 JAK2活化有關(guān)的相關(guān)病癥。可用于這種病癥的稠合吡咯并咔唑衍生物
是本領(lǐng)域已知的并且可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法制備，所
述方法包括例如Murakata等人的美國專利4,923,986; Hudkins等人的 美國專利5,705,511; Hudkins等人的美國專利5，808，060; Singh等人的 美國專利6,127,401; Hudkins等人的美國專利6,841,567; Gingrich等 人的美國專利6,630,500; Lewis等人的美國專利5,756,494; Glicksman 等人的美國專利5,468,872; Dionne等人的美國專利5,516,771; Hudkins 等人的美國專利6,306,849;和Hudkins等人的美國專利6,093,713;這 些公開被全文并入本文作為參考。在某些實(shí)施方案中，在吲哚并咔唑 制備中的起始材料例如K-252a和KT-5556是光學(xué)活性的。在制備可用 于本文所述治療方法中的化合物中，使用起始原料K252a或KT5556 可導(dǎo)致部分地或完全地傳遞光學(xué)活性到所需的稠合吡咯并咔唑衍生 物。
如上被采用并貫穿本公開的，除非另有陳述，以下術(shù)語應(yīng)當(dāng)被理 解具有以下的含義。
本文中使用的"約"是指給定值的±10%的數(shù)值范圍。例如，"約 20"包括20±10%，或?yàn)?8到22，包括端點(diǎn)在內(nèi)。
本文中使用的"烷基"是指任選被取代的、飽和的、直鏈或支鏈 的烴(以及在該范圍內(nèi)的范圍和特定碳原子數(shù)的所有組合和再組合)，包 含約1到約8個(gè)碳原子，優(yōu)選含約1到約4個(gè)碳原子(本文中稱作"低 級烷基")。烷基包括但是不限于甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁 基，異丁基，叔丁基，正戊基，異戊基，新戊基，正己基，異己基， 3-甲基庚基，2,2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。
20本文中使用的"烯基"是指任選被取代的烷基，具有約2到約10 個(gè)碳原子、更優(yōu)選具有約2到約8個(gè)碳原子和一個(gè)或多個(gè)雙鍵(以及在 該范圍內(nèi)的范圍和特定碳原子數(shù)的所有組合和再組合)，其中烷基的定 義如上所述。
本文中使用的"炔基"是指任選被取代的垸基，具有約2到約10
個(gè)碳原子、更優(yōu)選具有約2到約8個(gè)碳原子和一個(gè)或多個(gè)三鍵(以及在
該范圍內(nèi)的范圍和特定碳原子數(shù)的所有組合和再組合)，其中烷基的定 義如上所述。
本文中使用的"芳基"是指任選被取代的單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)芳香
環(huán)體系，具有約6到約14個(gè)碳原子(以及在該范圍內(nèi)的范圍和特定碳原 子數(shù)的所有組合和再組合)，更優(yōu)選具有約6到約IO個(gè)碳原子。非限制 性例子包括例如苯基，萘基，蒽基和菲基。
本文中使用的"芳基烷基"是指任選被取代的部分，其由帶有芳 基取代基的烷基組成，其中芳烷基部分具有約7到約22個(gè)碳原子(以及 在該范圍內(nèi)的范圍和特定碳原子數(shù)的所有組合和再組合)，優(yōu)選具有約 7到約10個(gè)碳原子。非限制性例子包括例如芐基，二苯甲基，三苯甲 基，苯乙基和二苯乙基。本文中使用的"雜芳基"是指任選被取代的 芳香環(huán)系統(tǒng)，具有5到14個(gè)碳原子環(huán)成員，其中一個(gè)或多個(gè)碳原子環(huán) 成員獨(dú)立地被一個(gè)或多個(gè)雜原子替換。在某些實(shí)施方案中，雜原子選 自S、 O或N。優(yōu)選具有總共約5到約14個(gè)、更優(yōu)選約5到約6個(gè)碳 原子環(huán)成員以及雜原子環(huán)成員(以及在該范圍內(nèi)的范圍和特定碳原子數(shù) 的所有組合和再組合)的雜芳基。示例性的雜芳基包括但不限于吡咯 基，呋喃基，吡啶基，吡啶-N-氧化物，1，2,4-噻二唑基，嘧啶基，噻吩 基，異噻唑基，咪唑基，四唑基，吡嗪基，嘧啶基，喹啉基，異喹啉 基，噻吩基，苯并噻吩基，異苯并呋喃基，吡唑基，剛哚基，嘌呤基， 咔唑基，苯并咪唑基和異巡<|唑基。雜芳基可通過碳原子或雜原子與分子的其余部分連接。
本文中使用的"雜芳基烷基"是指任選被取代的環(huán)狀體系，其由 被雜芳基取代的垸基組成，其中雜芳基和垸基的定義如前所述。非限
制性例子包括例如2-(lH-吡咯-3-基)乙基，3-吡啶基甲基，5-(2H-四唑 基)甲基，和3-(嘧啶-2-基)-2-甲基環(huán)戊垸基。
本文中使用的術(shù)語"Pro" 、 "Ser" 、 "Gly" 、 "Lys"分別是指 氨基酸脯氨酸、絲氨酸、甘氨酸和賴氨酸。
本文中使用的術(shù)語"氨基酸"表示包含氨基和羧基兩者的分子。 氨基酸的例子包括a-氨基酸；即，由通式HOOC-CH(NH2)-(側(cè)鏈)表示 的羧酸。氨基酸的側(cè)鏈包括天然和非天然的部分。非天然氨基酸側(cè)鏈 是在例如氨基酸類似物中可用于置換天然氨基酸側(cè)鏈的部分。例如參 見，Lehninger， Biochemistry,第二版，Worth Publishers, Inc， 1975,第 73-75頁，作為參考并入本文。優(yōu)選的a-氨基酸包括甘氨酸，丙氨酸， 脯氨酸，谷氨酸和賴氨酸，具有D構(gòu)型，L構(gòu)型，或?yàn)橥庀镄问健?br> 本文中使用的術(shù)語"GIc"是指葡萄糖。
本文中使用的術(shù)語"實(shí)質(zhì)上富集的"，當(dāng)是指立體異構(gòu)體或立體 異構(gòu)中心時(shí)，表示在混合物中一種立體異構(gòu)體或一種立體異構(gòu)中心以 至少約60%、優(yōu)選約70%、更優(yōu)選約80%、更優(yōu)選約90%占優(yōu)勢存在， 更優(yōu)選一種立體異構(gòu)體或一種立體異構(gòu)化中心為至少約95%。在一些 優(yōu)選實(shí)施方案中，化合物是"實(shí)質(zhì)上對映純的"，那就是說， 一種立 體異構(gòu)形式以至少約97.5%、更優(yōu)選約99%、更優(yōu)選約99.5%占優(yōu)勢。
文中使用的術(shù)語"有效量"是指本文所述的化合物的一定量，其 可治療有效地用來抑制或治療特定疾病、病癥或病況的癥狀。這種疾 病、病癥和病況包括但是不限于那些與JAK2活性有關(guān)的病理學(xué)狀況，其中治療包括例如通過用本發(fā)明的化合物接觸細(xì)胞、組織或受體而抑 制JAK2的活性。因此，例如，術(shù)語"有效量"當(dāng)與本發(fā)明的化合物結(jié) 合用于治療脊髓增生病時(shí)，是指治療通常與脊髓增生病相關(guān)的癥狀、 疾病、病癥和病況。
本文使用的"可藥用"是指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適合接觸 人和動(dòng)物的組織而沒有過度的毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng)或其它問題或并 發(fā)癥，并與合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱的那些化合物、材料、組合物、和/ 或劑型。
本文中使用的"可藥用鹽"是指本文公開的化合物的衍生物，其 中母體化合物通過被制成其酸鹽或堿鹽進(jìn)行改性?？伤幱名}的例子包 括但是不限于堿性殘基諸如胺的無機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽；酸性殘基如羧 酸的堿鹽或有機(jī)鹽；等等?？伤幱名}包括從例如無毒的無機(jī)酸或有機(jī) 酸形成的母體化合物的常規(guī)的無毒鹽或季銨鹽。例如，這種常規(guī)的無 毒鹽包括得自無機(jī)酸的那些鹽，所述無機(jī)酸為諸如鹽酸、氫溴酸、硫 酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸；和從有機(jī)酸制備的鹽，所述有機(jī)酸為諸 如乙酸、丙酸、丁二酸、羥基乙酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、 檸檬酸、抗壞血酸、雙羥萘酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨 酸、苯甲酸、水楊酸、對氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富馬酸、甲 苯磺酸、甲磺酸、乙垸二磺酸、草酸、羥基乙磺酸；等等。這些生理 學(xué)可接受的鹽通過本領(lǐng)域已知的方法制備，例如，在含水醇中將游離 胺堿溶解在過量的酸中，或者用堿金屬堿諸如氫氧化物或胺中和游離 羧酸。貫穿本文所述的化合物可以替換形式被使用或制備。例如，許 多含氨基的化合物可作為酸加成鹽的形式被使用或制備。通常，這些 鹽改善了化合物的分離性和操作性。例如，根據(jù)試劑、反應(yīng)條件等的 不同而異，本文所述的化合物可例如作為其鹽酸鹽或甲苯磺酸鹽的形 式被使用或制備。同晶型、所有的手性和外消旋形式、N-氧化物、水 合物、溶劑合物和酸鹽水合物，也被涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文中 使用的"水合物"是指在分子形式中與水結(jié)合的本發(fā)明的化合物，艮P，
23其中H-OH鍵沒有斷裂，并且可由式R，H20表示，其中R是本發(fā)明的 化合物。給出的化合物可形成超過一種水合物，包括例如一水化物 (R，H20)或多水合物(R，nH20，其中n是〉1的整數(shù))，包括例如二水合物 (R 2H20)、三水合物(R"H20)等等，或半水化合物，諸如例如R*n/2H20、 R*n/3H20、 R、/4H20等，其中n是整數(shù)。
本文中使用的"溶劑合物"是指在分子形式中與溶劑結(jié)合的本發(fā) 明的化合物；目卩；其中溶劑進(jìn)行配位結(jié)合，并且可由式R，(溶劑)表示；
其中R是本發(fā)明的化合物。給出的化合物可形成超過一種溶劑合物， 包括例如單溶劑合物(R，(溶劑))或多溶劑合物(R，n(溶劑)，其中n是>1 的整數(shù))，包括例如二溶劑合物(R"(溶劑))、三溶劑合物(R"(溶劑))等
等，或半溶劑合物，諸如例如R 2(溶劑)、R、/3(溶劑)、R、/4(溶劑)等
等，其中n是整數(shù)。本文的溶劑包括混合溶劑，例如甲醇/水，并因此， 溶劑合物可在溶劑合物內(nèi)并入一種或多種溶劑。
本文中使用的"酸鹽水合物"是指可通過具有一個(gè)或多個(gè)堿性部 分的化合物與至少一種具有一個(gè)或多個(gè)酸部分的化合物結(jié)合形成的復(fù) 合物、或通過具有一個(gè)或多個(gè)酸部分的化合物與至少一種具有一個(gè)或 多個(gè)堿部分的化合物結(jié)合形成的復(fù)合物，所述復(fù)合物進(jìn)一步與水分子 結(jié)合以形成水合物，其中所述水合物的定義如前所述并且R表示本文 上面描述的復(fù)合物。
貫穿本文所述的化合物可以替換形式被使用或制備。例如，許多 包含氨基的化合物可作為酸加成鹽的形式被使用或制備。通常，這些 鹽改善了化合物的分離性和操作性。例如，根據(jù)試劑、反應(yīng)條件等的 不同而異，本文所述的化合物可例如作為其鹽酸鹽或甲苯磺酸鹽的形 式被使用或制備。同晶型、所有的手性和外消旋形式、N-氧化物、水 合物、溶劑合物和酸鹽水合物，也被涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本文中使用的"患者"是指動(dòng)物，胞哺乳動(dòng)物，優(yōu)選指人。
24本文中使用的"前藥"是指經(jīng)過特別設(shè)計(jì)用于使到達(dá)所需部位的 活性物質(zhì)的量最大化的化合物，它們自身通常無活性或具有最小的所 需活性，但是通過生物轉(zhuǎn)化被轉(zhuǎn)化為生物活性的代謝物。
本文中使用的術(shù)語"立體異構(gòu)體"是指具有相同的化學(xué)組成，但 是原子或基團(tuán)的空間排列不同的化合物。
本文中使用的"N-氧化物"是指其中雜芳基環(huán)或者叔胺的堿性氮 原子被氧化得到帶有正形式電荷的四價(jià)氮和帶有負(fù)形式電荷的與氮連 接的氧原子的化合物。
本文中使用的術(shù)語"治療"包括預(yù)防性治療、治病性治療和/或姑 息性治療。
當(dāng)任何變量在任何構(gòu)成或在任何形式中出現(xiàn)超過一次時(shí)，其在每 次出現(xiàn)中的定義與其在所有其他出現(xiàn)中的定義是無關(guān)的。
取代基和/或變量的組合可被允許，只要這種組合獲得穩(wěn)定的化合 物即可。
相信本文使用的化學(xué)式和化學(xué)名正確地和精確地反映了基礎(chǔ)化合 物。然而，本發(fā)明的性質(zhì)和值不完全或部分地依賴于這些式子的理論 修正。因此，可以理解，本文使用的化學(xué)式以及歸屬于所對應(yīng)的所述 化合物的化學(xué)名，不以任何方式意在限制本發(fā)明，包括將其限定到任 何的特定互變異構(gòu)形式或限定到任何特定的光學(xué)或幾何異構(gòu)體，除非 明顯定義了這種立體化學(xué)。
因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療脊髓增生病的方法， 包括對有需要的患者給用治療有效量的JAK2抑制劑。在一些實(shí)施方案中，JAK2抑制劑是稠合的吡咯并咔唑。在某些實(shí)施方案中，稠合的吡 咯并咔唑是U引哚并咔唑，在其它實(shí)施方案中，其是茚并咔唑。在具體 實(shí)施方案中，稠合的吡咯并咔唑具有下式I所示結(jié)構(gòu)、或其立體異構(gòu)體 或可藥用鹽的形式
其中
環(huán)B和F獨(dú)立地為苯基或雜芳基；
W獨(dú)立地為H;烷基；芳基；芳基烷基；雜芳基；雜芳基烷基；
-COR9; -OR10; -CONR7R8; -NR7R8; -(CH2)pNR7R8; -(CH2)pOR10; -0(CH2)pOR10;或-0(CH2)pNR7R8;
R2獨(dú)立地為H; -S02R9; -C02R9; -COR9;含1-8個(gè)碳的垸基；含
2-8個(gè)碳的烯基；含2-8個(gè)碳的炔基；或含5-7個(gè)碳的單糖，
其中單糖的每個(gè)羥基獨(dú)立地任選地被以下基團(tuán)替代含L4個(gè)碳
的烷基、含2-5個(gè)碳的垸基羰基氧基或含l-4個(gè)碳的烷氧基；和
其中烷基、烯基或炔基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代；
其中當(dāng)X為CHR"或NR"時(shí)，則112和R"可任選地通過其2位 和5位結(jié)合在一起形成連接呋喃并且其中連接呋喃的2位和5位任選 地分別被R"和R"取代；和連接呋喃的3位被R"和R"二取代；
R3， R4， R5和R6獨(dú)立地為H;芳基；雜芳基；F; CI; Br; I; -CN;
-CF3; -N02; -OR10; (CH2)pOR10; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; -CH2OR14; -NR7R8; -NR10COR9; -NR10CO2R9; -NR10CONR7R8; -S(O)yR"; -C02R9 ; -COR9 ; -CONR7R8 ; -CHO ; -CI^NOR11 ; -CH=NR9 ; -CH=NNR12R13 ;-(CH2)pS(0)yR9 ;-CH2SR15 ;-CH2S(0)yR14 ; -(CH2)PNR7R8; -(CH2)PNHR14;含1-8個(gè)碳的烷基；含2-8個(gè)碳的烯基；或含2-8個(gè)碳的炔基；
其中垸基、烯基或炔基各自任選獨(dú)立地被l-3個(gè)R"取代； X是
含l-3個(gè)碳并任選被至少一個(gè)以下基團(tuán)取代的亞垸基OH、 =0、 :NOR11、 OR11、 -OCOR9、 -OCONR7R8、 -0(CH2)pNR7R8、 -O(CH2)pOR10、 芳基、芳基垸基、雜芳基、-S02R9; -C02R9、 -COR9、含l-8個(gè)碳的院 基、含2-8個(gè)碳的烯基、含2-8個(gè)碳的炔基、或含5-7個(gè)碳的單糖，
其中單糖的每個(gè)羥基獨(dú)立地任選地被以下基團(tuán)替代含1-4個(gè)
碳的烷基、含2-5個(gè)碳的烷基羰基氧基或含1-4個(gè)碳的烷氧基；和 其中烷基、烯基或炔基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代； -O陽；-S(0)y-; N(R16); CHR16; -CH2Z-; -Z-CHr;或-CH2ZCHr;
其中z為c(oru)(r11)、 o、 s、 c(=0)、 c^noru)或nru;
其中當(dāng)X為CHR16或NR16時(shí)，則R2和R16可任選地通過其2位 和5位結(jié)合在一起形成連接呋喃并且其中連接呋喃的2位和5位任選 地分別被R"和R"取代；和連接呋喃的3位被R"和R"二取代；A1 和A2獨(dú)立地為H、 -OR11、 -SRU或-N(R")2;或者結(jié)合在一起形成=0、 =S或NRH的部分；
Bi和B^蟲立地為H、 -OR11、 41111或-風(fēng)1111)2;或者結(jié)合在一起形 成=0、 二S或二NR"的部分；
前提條件是A1和A2、或B1和B2的至少一對結(jié)合在一起形成=0;
W和RS獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的烷基；或者，與其所連接的氮 一起形成5-7元雜環(huán)烷基；
W獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的烷基、芳基或雜芳基；
r1g獨(dú)立地為h或含1-4個(gè)碳的烷基；
RH獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基； 1112和1113獨(dú)立地為H、垸基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基；或者， 與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基；R"獨(dú)立地為氨基酸的在除 去羧基的羥基之后的殘基；R"獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的烷基；
r"獨(dú)立地為h、含1-4個(gè)碳的垸基、含2-8個(gè)碳的烯基、含2-8 個(gè)碳的炔基、芳基或雜芳基；其中烷基、烯基、炔基、芳基或雜芳基各自任選獨(dú)立地被l-3個(gè)R"取代或者
當(dāng)X為CHR"或NR"時(shí)，則r2和R"可任選地通過其2位和5 位結(jié)合在一起形成連接呋喃并且其中連接呋喃的2位和5位任選地分 別被R"和R"取代；和連接呋喃的3位被1117和R"二取代；
R"獨(dú)立地為OH、含1-6個(gè)碳的O-正-烷基或含2-6個(gè)碳的O-酰
基；
R"獨(dú)立地為H;含l-4個(gè)碳的烷基；CONHC6H5; CH2Y，
其中Y為OR19、 SOR2()、 NR"r22或SR23; N3; C02R15; S-GIc; CONR24R25 ;CH=NNHCONH2 ;CONHOR10 ;CH=NOR10 ;
^7、
CH=NNHC(=NH)NH2; H ; CH=NN(R26)2;或CH2NHCONH
或者R17和R18可以任選地結(jié)合在一起形成-ch2nhc02-、
-CH2OC(CH3)20-、 =0或陽CH2N(CH3)C02-;
R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的垸基或含2-5個(gè)碳的?；?； R^獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、芳基或含氮原子的雜環(huán)垸基； R"和R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、Pro、 Ser、 Gly、 Lys
或含2-5個(gè)碳的?；?，前提條件是R"和R^中只有一個(gè)為Pro、 Ser、
Gly、 Lys或?；?；
R"獨(dú)立地為芳基、含l-4個(gè)碳的烷基或含氮原子的雜環(huán)烷基；
R"和R"獨(dú)立地為H;含1-6個(gè)碳的垸基；苯基；或含1-6個(gè)碳 的羥基垸基；或者，與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)垸基； R^獨(dú)立地為芳基；
R27獨(dú)立地為芳基；雜芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;
-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氫吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13; .P(K))(OR")2;或-OR14;
尺28獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、含l-4個(gè)碳的垸氧基、含7-10個(gè)
碳的芳基垸基、-(ch2)por1()、 -((^2)1)0(:(=0^117118或-((:112)1^117118;r"獨(dú)立地為h、含1-4個(gè)碳的烷基、含1-4個(gè)碳的烷氧基、含7-10
個(gè)碳的芳基烷基、-(ch2)por10、 -((^2){)0(:(=0^117118或-((:112)1^117118;
P為l-4的整數(shù)；和
y為0、 1或2。
在一些實(shí)施方案中，稠合的吡咯并咔唑具有下式II所示結(jié)構(gòu)、或 其立體異構(gòu)體或可藥用鹽的形式
W獨(dú)立地為h;烷基；苯基；含7-10個(gè)碳的芳基垸基；5-6元雜
芳基；雜芳基垸基；-COR9; -OR1Q; -CONR7R8; -NR7R8; -(CH2)pNR7R8; -(CH2)pOR10; -0(CH2)pOR10; 10(CH2)PNR7R8;
R3， R4， R5和R6獨(dú)立地為H;苯基；5-6元雜芳基；F; CI; Br; I; -CN; CF3; -N02; -OR10; (CH2)pOR10; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9;
-OCONHR9 ; -CH2OR14 ; -NR7R8 ; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8; -S(0)yRu; -C02R9; -COR9; -CONR7R8; -CHO; -CH-NOR11; -CH=NR9; -CH=NNR12R13; -(CH2)pS(0)yR9; -CH2SR15; -CH2S(0)yR14; -(CH2)PNR7R8; -(CH2)PNHR14;含1-8個(gè)碳的垸基；含 2-8個(gè)碳的烯基；或含2-8個(gè)碳的炔基；
其中垸基、烯基或炔基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代；
X為-CH-或N;
A^BA2獨(dú)立地為H、 -OR11、 -SR11或-N(RH)2;或者，結(jié)合在一
其中-B^BB2獨(dú)立地為H、 -OR11、 -SR"或-N(RU)2;或者，結(jié)合在一起 形成=0、 ^S或^NR"部分；
前提條件是A1和A2、或B1和B2的至少一對結(jié)合在一起形成-O;
W和RS獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的烷基；或者，與其所連接的氮 一起形成5-7元雜環(huán)烷基；
W獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、芳基或雜芳基；
R^獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的垸基；
RU獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的垸基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基； 1112和R"獨(dú)立地為H、烷基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基；或者， 與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基；
R"獨(dú)立地為氨基酸的在除去羧基的之后的殘基； R"獨(dú)立地為含1-4個(gè)碳的烷基； R"獨(dú)立地為H、含l-4個(gè)碳的烷基、芳基或雜芳基； R"獨(dú)立地為OH、含1-6個(gè)碳的O-正-烷基或含2-6個(gè)碳的O-酰
基；
R"獨(dú)立地為H;含l-4個(gè)碳的烷基；CONHC6H5; CH2Y，
其中Y為OR19、 SOR20、 NR"R"或SR23; N3; C02R15; S-Glc; CONR24R25 ;CH-NNHCONH2 ;CONHOR10 ;CH:NOR10 ;
CH2NHCONHR、
或者R17和R18任選地結(jié)合在 一 起形成-CH2NHCOr 、
-CH2OC(CH3)20-、 = 或-CH2N(CH3)C。2-;
R"獨(dú)立地為H、含l-4個(gè)碳的垸基或含2-5個(gè)碳的?；?R^獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的烷基、芳基或含氮原子的雜環(huán)烷基； R"和1122獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、Pro、 Ser、 Gly、 Lys
或含2-5個(gè)碳的?；?，前提條件是R"和R22中只有一個(gè)為Pro、 Ser、
Gly、 Lys或酰基；
R^獨(dú)立地為芳基、含1-4個(gè)碳的烷基或含氮原子的雜環(huán)垸基；
CH=NNHC(=NH)NH:
30RM和R"獨(dú)立地為H;含1-6個(gè)碳的烷基；苯基；或含1-6個(gè)碳 的羥基烷基；或者，與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基； 1126獨(dú)立地為芳基；
R27獨(dú)立地為芳基；雜芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;
-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氫吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -S(0)yRu; -C02R9; -CONR7R8;隱CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH^NOR11; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02nr12r13; -pocor11^;或-or14;
R"獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、含l-4個(gè)碳的垸氧基、含7-10個(gè) 碳的芳基垸基、-(CH2)pOR1G-、 (CH2)pOC(^0)NR7r8或-(CH2)pNR7r8;
R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、含1-4個(gè)碳的垸氧基、含7-10
個(gè)碳的芳基垸基、-(ch2)por1q、 -(012){)0(:(=0^117118或-((:112)1^117118;
p為l-4的整數(shù)；和 y為0、 1或2。
在某些其它實(shí)施方案中，稠合的吡咯并咔唑具有下式III所示結(jié) 構(gòu)、或其立體異構(gòu)體或可藥用鹽
R3、 R4、 R5、 R6、 R17、 R18、 R28、 R"禾口 X的定義如關(guān)于式II化 合物的定義所述的。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，R3， R4， RS和W各自為 H。
其中:
31在本發(fā)明方法的其它實(shí)施方案中，稠合的吡咯并咔唑是具有式III 所示結(jié)構(gòu)的化合物，其中
R3， R4， R5和R6獨(dú)立地為H;苯基；F; CI; -OR10; (CH2)pOR10; -NR7R8; -CHO; -(CH2)PNR7R8;或含l-8個(gè)碳的烷基； 其中烷基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代；
X為-CH-或N;
W和RS獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的垸基；或者，與其所連接的氮
一起形成5-7元雜環(huán)烷基；
R"蟲立地為含l-4個(gè)碳的垸基、芳基或雜芳基；
R^獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的烷基；
R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的垸基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基； R^和R。獨(dú)立地為H、烷基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基；或者， 與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)垸基；
R"獨(dú)立地為氨基酸的在除去羧基的羥基后的殘基；
R"獨(dú)立地為OH、含1-6個(gè)碳的O-正-烷基或含2-6個(gè)碳的O-酰
基；
R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、CONHC6H5; CH2OH; CH2OCH3; CH2OC(CH3)3; CH2NH2; C02CH3;或CONR24R25;
R"和R"獨(dú)立地為H;含l-6個(gè)碳的垸基；苯基；或含1-6個(gè)碳 的羥基烷基；或者，與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基；
R"獨(dú)立地為芳基；雜芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;
-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氫吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH-NNR12R13; -CI^NOR11; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13; -PO(ORu)2;或-OR14;
R"獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、含l-4個(gè)碳的烷氧基、含7-10個(gè)
碳的芳基烷基、-(ch2)por1()、 -((^2)1)0(:(=0^117118或-((:112)1^117118;
R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、含1-4個(gè)碳的烷氧基、含7-10個(gè)碳的芳基烷基、-(CH2)pOR1Q、 -((3112)150(:(=0)忖117118或-(012)1^117118;
p為1-4的整數(shù)；和
y為0、 1或2。
在某些其它實(shí)施方案中，稠合的吡咯并咔唑具有式III所示結(jié)構(gòu)， 其中R3， R4, 115和R6各自獨(dú)立地為H、苯基、F、 Cl、國OR10、 -NR7R8、 -((3112)1)117尺8或含l-8個(gè)碳的烷基，其中垸基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取 代；或其立體異構(gòu)體或可藥用鹽的形式。
在式III化合物的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，式III的吲哚并咔唑是實(shí) 質(zhì)上對映純的。在其中式III的吲哚并咔唑是實(shí)質(zhì)上對映純的優(yōu)選實(shí)施
方案中，其具有一些結(jié)構(gòu)
或其立體異構(gòu)體或可藥用鹽，其中R3， R4， R5、 R6、 R17、 R18、 R28、 R"和X的定義如以上關(guān)于本文所述的式II的化合物和式III的實(shí) 施方案的定義所述的。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，式III的B引哚并咔唑的 R3， R4， RS和W各自為H。在其它實(shí)施方案中
R3， R4， 115和R6獨(dú)立地為H、 Cl、含1-4個(gè)碳的垸基、-OR10、 CH2OR10、 NR7R8、 CH2NR7r8或CONR7R8;
117和RS獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的垸基；
F^獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的烷基；
R17獨(dú)立地為OH或含1-4個(gè)碳的O-正-烷基；
R"獨(dú)立地為H、 CH2OH、 C02CH3、 C02CH2CH3、 C02CH2CH2CH3、 或C02CH(CH3)2;或者
R28獨(dú)立地為CH3;和 R29獨(dú)立地為H或CH3。
33在式I化合物的另外的實(shí)施方案中，稠合的吡咯并咔唑具有下式 I-A所示的結(jié)構(gòu)、或其立體異構(gòu)體或可藥用鹽的形式
式I-A
其中
W獨(dú)立地為H;烷基；苯基；含7-10個(gè)碳的芳基烷基；5-6元雜
芳基；雜芳基垸基；-COR9; -OR10; -CONR7R8; -NR7R8; -(CH2)pNR7R8; -(CH2)pOR10; -0(CH2)pOR10;或-0(CH2)pNR7R8;
R2獨(dú)立地為H; -S02R9; -C02R9; -COR9;含l-8個(gè)碳的烷基；含 2-8個(gè)碳的烯基；含2-8個(gè)碳的炔基；或含5-7個(gè)碳的單糖，
其中單糖的每個(gè)羥基獨(dú)立地任選地被以下基團(tuán)替代含1-4個(gè)
碳的烷基，含2-5個(gè)碳的烷基羰基氧基或含l-4個(gè)碳的垸氧基；和 其中垸基、烯基或炔基任選地被1-3個(gè)1127基團(tuán)取代； 其中當(dāng)X為CHR"或NR"時(shí)，則112和R"可任選地通過其2位 和5位結(jié)合在一起形成連接呋喃并且其中連接呋喃的2位和5位任選 地分別被R"和R"取代；和連接呋喃的3位被R卩和R"二取代；
R3， R4， R5和R6獨(dú)立地為H;苯基；5-6元雜芳基；F; Cl; Br; I; -CN; CF3; -N02; -OR10; (CH2)pOR10; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9;
-OCONHR9 ; -CH2OR14 ; -NR7R8 ; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8; -S(O)yR"; -C02R9; -COR9; -CONR7R8; -CHO; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH=NNR12R13; -(CH2)pS(0)yR9; -CH2SR15; -CH2S(0)yR14; -(CH2)PNR7R8; -(CH2)PNHR14;含1-8個(gè)碳的烷基；含 2-8個(gè)碳的烯基；或含2-8個(gè)碳的炔基；
其中烷基、烯基或炔基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代；
X為CHR"或含1-2個(gè)碳并任選被至少一個(gè)以下基團(tuán)取代的亞烷
34基OH、 =0、 =NOR"、 OR11、 -OCOR9、 -OCONR7R8、 -0(CH2)pNR7R8、 -0(CH2)pOR1G、芳基、芳基垸基、雜芳基、-S02R9; -C02R9、 -COR9、 含l-8個(gè)碳的烷基、含2-8個(gè)碳的烯基、含2-8個(gè)碳的炔基、或含5-7 個(gè)碳的單糖，
其中單糖的每個(gè)羥基獨(dú)立地任選地被以下基團(tuán)替代含1-4個(gè) 碳的垸基、含2-5個(gè)碳的烷基羰基氧基或含1-4個(gè)碳的烷氧基；和 其中烷基、烯基或炔基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代； A!和A2獨(dú)立地為H、 -OR11、 -SR"或-N(RU)2;或者，結(jié)合在一 起形成=0、 二S或NR"部分；
B^nB2獨(dú)立地為H、 -OR11、 -81111或-1^1111)2;或者，結(jié)合在一起 形成=0、 ^S或NR"部分；
前提條件是A1和A2、或B1和B2的至少一對結(jié)合在一起形成=0; W和RS獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的垸基；或者，與其所連接的氮 一起形成5-7元雜環(huán)烷基；
R"蟲立地為含l-4個(gè)碳的垸基、芳基或雜芳基； R"獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的垸基；
R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基； 1112和尺13獨(dú)立地為H、垸基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基；或者， 與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基；
R"獨(dú)立地為氨基酸的在除去羧基的羥基后的殘基； R"獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的烷基；
R"獨(dú)立地為H、含l-4個(gè)碳的垸基、芳基或雜芳基；或者當(dāng)X為 CHR"時(shí)，則f和R"可任選地通過其2位和5位結(jié)合在一起形成連 接呋喃并且其中連接呋喃的2位和5位任選地分別被R"和1129取代；
和連接呋喃的3位被1117和R"二取代；
R"獨(dú)立地為OH、含1-6個(gè)碳的O-正-垸基或含2-6個(gè)碳的O-酰
基；
R"獨(dú)立地為H;含l-4個(gè)碳的烷基；CONHC6H5; CH2Y，
其中Y為OR19、 SOR20、 NR"R22或SR23; N3; C02R15; S陽GIc; CONR24R25 ;CH=NNHCONH2 ;CONHOR10 ;CH=NOR10 ; CH=NNHC(=NH)NH2 ;H N
C二N H
;CH=NN(R26)2;或CH2NHCONHR16;
或者R17和R18任選地結(jié)合在 一 起形成-CH2NHCOr 、
-CH2OC(CH3)20-、 =0或曙CH2N(CH3)C02-;
R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的垸基或含2-5個(gè)碳的?；?； R^獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的烷基、芳基或含氮原子的雜環(huán)烷基； R"和R22獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、Pro、 Ser、 Gly、 Lys
或含2-5個(gè)碳的酰基，前提條件是R"和R"中只有一個(gè)為Pro、 Ser、
Gly、 Lys或?；?；
R"獨(dú)立地為芳基、含1-4個(gè)碳的垸基或含氮原子的雜環(huán)垸基；
R"和R"獨(dú)立地為H;含1-6個(gè)碳的烷基；苯基；或含1-6個(gè)碳 的羥基垸基；或者，與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基； RM獨(dú)立地為芳基；
R27獨(dú)立地為芳基；雜芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;
-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氫吡喃基；-NR7R8; -NR1()COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR1QCONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -S(0)yR"; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH-NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13; -PO(ORu)2;或-OR14;
R"獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、含l-4個(gè)碳的烷氧基、含7-10個(gè) 碳的芳基烷基、-(CH2)pOR1()、 -(012)130(:(=0^117118或-((:112)1^117118;
R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的垸基、含1-4個(gè)碳的烷氧基、含7-10
個(gè)碳的芳基烷基、-(ch2)por10、 -(0!2)150(:(=0^117118或-((:112)3117118;
p為1-4的整數(shù)；和 y為0、 1或2。
在式I-A的化合物的某些實(shí)施方案中，化合物具有以下結(jié)構(gòu)其中-
RM蟲立地為-C02R^ -COR9;含1-4個(gè)碳的垸基；其中垸基任選
地被1-3個(gè)尺27基團(tuán)取代；
R3， R4， R5和R6獨(dú)立地為H;苯基；CI; -OR10; (CH2)pOR10; -NR7R8; -(CH2)PNR7R8;或含l-6個(gè)碳的烷基；
其中烷基任選地被l-3個(gè)R^基團(tuán)取代；
W和RS獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的烷基；或者，與其所連接的氮 一起形成5-7元雜環(huán)垸基；
W獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、芳基或雜芳基；
R^獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的烷基；
RH獨(dú)立地為H、含l-4個(gè)碳的垸基、含6-10個(gè)碳的芳基；
1112和R。獨(dú)立地為H、烷基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基；或者， 與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)垸基；
R"獨(dú)立地為氨基酸的在除去羧基的羥基后的殘基；
R"獨(dú)立地為H、含l-4個(gè)碳的烷基；
R"獨(dú)立地為芳基；雜芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;
-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氫吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH^NOR11; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13;隱PO(OR")2;或-OR14;
P為l-4的整數(shù)；和
y為0、 1或2。
在式I-A的化合物的其它實(shí)施方案中，化合物具有以下結(jié)構(gòu)其中
W獨(dú)立地為-C02R^ -COR9;含1-4個(gè)碳的垸基；其中垸基任選 地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代；
W和RS獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的烷基；或者，以其所連接的氮 一起形成任選地包含另外的環(huán)氮原子的5-6元雜環(huán)垸基；
W獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的烷基或苯基；
R^獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的烷基； R"獨(dú)立地為H、含l-4個(gè)碳的垸基； R"獨(dú)立地為氨基酸的在除去羧基的羥基后的殘基； R"獨(dú)立地為苯基；5-6元雜芳基；-OR1G; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9;
-OCONHR9; O-四氫吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9; -NR1QC02R9;
-NR10CONR7R8; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -COR9;
-CH2OR7;或-OR14;
P為1-4的整數(shù)；和
y為0、 1或2。
本發(fā)明范圍內(nèi)的稠合的吡咯并咔唑還可由式IV表示。優(yōu)選的式IV 衍生物在下文中被稱為化合物IV-1到IV-4。由式IV表示的功能衍生 物式式IV
或其立體異構(gòu)體或可藥用鹽的形式，其中
(a) W和R"各自獨(dú)立地選自H、含l-6個(gè)碳的垸基、含1-3個(gè)碳 的羥基垸基和含3-6個(gè)碳的烯基，前提條件是W和R"不都為H;
(b) Ai和AS都是氫和R3、 R4、 RS和W各自獨(dú)立地為H或者它們 最多兩個(gè)為F; CI; Br; I; N02; CN或OH; NHCONHR7，其中R7 為C6Hs或含1-3個(gè)碳的烷基，前提條件是R1、 R2、 W和W中只有一 個(gè)為NHCONHR7; CH2OR7;含1-3個(gè)碳的烷基；CH2OCONHC2H5;
或NHC02CH3;禾口
(c) 當(dāng)A^口八2二者結(jié)合在一起表示O時(shí)；貝U R3、 R4、 115和R6
各自為氫。
在本發(fā)明的多種方法中使用的優(yōu)選的式IV化合物是表1中的那些 化合物IV-1到IV-4，其中取代基如下所示。
表1_
化合物(1)_^_ R16
IV-1 CH2CH=CH2 IV-2(2) CH2CH=CH2 IV-3(2) H IV-^_CH2CH2CH2OH
(1) R3、 R4、 115和116為氫。Ai和A2都為氫。
(2) 組分IV-2和IV-3的1.5-1.0的混合物。
本發(fā)明的特征還在于由下式V表示的化合物
CH2CH=CH2 H
CH2CH=CH2 CH2CH2CH2OH
39其中R5表示卣素、CH20CONHR"或NHC02R"(其中r"表示低 級垸基)；RS表示氫或鹵素；和X表示C02CH3、 CH2OH或CONHR"(其 中R"表示氫、被羥基取代的低級垸基、或芳基)，前提條件是排除115= 鹵素、R、氫和X=C02CH3或CH2OH的組合，以及R5=R3=鹵素和 X=C02CH3的組合，以及R5=R3=Br和X=CONHC6H5的組合。式V化 合物的立體異構(gòu)形式和可藥用鹽適用于本發(fā)明的方法中。在某些實(shí)施 方案中，稠合的吡咯并昨唑具有下式所示結(jié)構(gòu)
式VI
其中X表示CH2S(0)R"(其中R"表示芳基或包含氮原子的雜環(huán) 基)、CH2SR16、 CH二NN(R")2(其中R"表示芳基)、CH2NHCONHR"(其 中R"表示低級烷基或芳基)或CH2C02CH3。式VI化合物的立體異構(gòu) 形式和可藥用鹽適用于本發(fā)明的方法中。
本發(fā)明的特征還在于由下式VII表示的化合物、或其可藥用鹽:
40<formula>formula see original document page 41</formula>
式VII
其中112和R"之一為氫且另一個(gè)為烯丙基，或者它們都是烯丙基。 稠合的吡咯并咔唑還可是具有下式VIII所示結(jié)構(gòu)的化合物、或其
可藥用鹽
式VIII
其中R5表示CH(SC6H5)2、 CH(-S-CH2CH2S-)、 CH2SR24(其中r24 表示苯并咪唑-2-基、糠基、2-二甲基氨基乙基或1H-l，2,4-三唑-3-基) 或CH:NR"(其中R"表示吡咯垸-l-基、吡啶-2-基氨基、胍基、嗎啉基、 二甲基氨基或4-甲基哌嗪-l-基)。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，稠合的吡咯并咔唑是CH2OH
更優(yōu)選地，上述的稠合的吡咯并咔唑是實(shí)質(zhì)上對映純的。在另外 的實(shí)施方案中，稠合的吡咯并咔唑是
H
CH2OH CEP-70I
CEP-701。
本文中使用的具有這一結(jié)構(gòu)的化合物稱為"CEP-701"。
用于本發(fā)明方法中的稠合的吡咯并咔唑可通過與可藥用的無毒的 賦形劑和載體混合而被分別或組合配制成藥物組合物。這種組合物可 被制備用于非腸道給藥，特別是液體溶液或懸浮液形式；用于口服給 藥，特別是液體劑、片劑或膠囊形式；或鼻內(nèi)給藥，特別是粉劑、滴 鼻劑或氣霧劑形式。
該組合物可以方便地在單位劑型中給藥并且可根據(jù)本領(lǐng)域已知的 的任何方法制備。這些方法例如在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., Easton， Pa., 1980)中描述。
用于口服給藥的液體劑型包括可藥用的乳劑、微乳劑、溶液、懸
42
o
H浮液、糖漿劑和酏劑。除了活性化合物之外，液體劑型可以包含本領(lǐng) 域常用的惰性稀釋劑，諸如，例如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑諸 如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二 醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油類(特別是棉籽油、花生油、玉米油、 胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氫糠醇，聚乙二醇和山 梨糖醇酐的脂肪酸酯，及其混合物。除了惰性稀釋劑之外，口服組合 物還可以包括助劑，諸如，潤濕劑，乳化劑和助懸劑，甜味劑，調(diào)味 劑和增香劑。
用于口服給藥的固體劑型包括膠囊、片劑、丸劑、粉劑和粒劑。 在這種固體劑型中，活性化合物與至少一種惰性的可藥用賦形劑或載
體諸如枸櫞酸鈉或磷酸二鈣和/或以下物質(zhì)混合(a)填料或增量劑諸如 淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合劑諸如例如羧甲 基纖維素藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯垸酮、蔗糖和阿拉伯膠；(C)濕潤 劑諸如甘油，(d)崩解劑諸如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、 藻酸、某些硅酸鹽、和碳酸鈉，(e)溶液阻滯劑諸如石蠟；(f)吸收促進(jìn) 劑如季銨化合物；(g)潤濕劑諸如例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸 附劑如白陶土和膨潤土；和(i)潤滑劑諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、 固體聚乙二醇、十二垸基硫酸鈉十二垸基硫酸鈉，及其混合物。在膠 囊、片劑和丸劑中，劑型還可包括緩沖劑。
還可使用相似類型的固體組合物作為在填充的軟和硬明膠膠囊中 的填料，使用諸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等等的賦形劑。
還可使用相似類型的固體組合物作為在填充的軟和硬明膠膠囊中 的填料，使用諸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等等的賦形劑?；钚曰?合物還可與上述的一種或多種賦形劑處在微囊密封的形式中。在固體 劑型中，活性化合物可與至少一種惰性稀釋劑諸如蔗糖、乳糖或淀粉 混合。這種劑型如通常實(shí)踐的那樣還可包括不同于惰性稀釋劑的另外 的物質(zhì)，如制片用潤滑劑和其它的制片助劑如硬脂酸鎂和微晶纖維素。在膠囊、片劑和丸劑中，劑型還可包括緩沖劑。它們可任選地包含遮 光劑并且還可是適當(dāng)單獨(dú)的活性成分或優(yōu)先在腸道的某一部分中任選 地以延遲方式釋放活性成分的組合物?？墒褂玫陌窠M合物的例子包 括聚合物和蠟。
本發(fā)明的化合物的最佳劑量可根據(jù)諸如以下因素的不同而異脊 髓增生病的類型和進(jìn)展程度、患者的總體健康狀態(tài)、患者的年齡和體 重、化合物的功效和給藥途徑。化合物劑量的最佳化處在本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員的范圍內(nèi)，并且在本文所提供范圍內(nèi)的值包括落在該范圍內(nèi) 的任何值。用于本發(fā)明方法中的制劑的活性成分當(dāng)在血漿中的濃度為 約l到約20pM時(shí)是有效的，包括處在該范圍內(nèi)的任何值，包括但不限
于2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18 和19pM。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，給用化合物以達(dá)到在血漿中的濃度 為約5到約15pM。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，給用化合物以達(dá)到在血漿 中的濃度為約7.5到約15pM。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，化合物的劑量為每天200微克/千克 到約l克/千克。更優(yōu)選地，化合物的劑量為每天250微克/千克體重到 約3毫克/千克體重。更優(yōu)選地，化合物的劑量為每天約0.5毫克/千克 體重到約2.3毫克/千克體重。更優(yōu)選地，化合物的劑量為每天約0.8毫 克/千克體重到約1.3毫克/千克體重。
在某些實(shí)施方案中，對于普通成人(約70千克)的日劑量為約20 亳克到約300，或約40毫克到約250毫克，或約40毫克到約100毫克。 更優(yōu)選地，日劑量為約80毫克到約160毫克。日劑量通?？山o用一天 一次、 一天兩次、 一天三次或一天四次。在一些實(shí)施方案中，劑量給 藥方案為約20到約120毫克， 一天兩次。在其它實(shí)施方案中，劑量給 藥方案為約20毫克到約100毫克， 一天兩次。在另外的實(shí)施方案中， 劑量為約60毫克到約80毫克， 一天兩次。
44在本發(fā)明的方法中，當(dāng)給用治療量的JAK2抑制劑時(shí)，在JAK2 抑制劑存在的條件下許多其它蛋白質(zhì)的活性比不存在JAK2抑制劑時(shí) 的其它蛋白質(zhì)的活性低。這些其它蛋白質(zhì)是例如許多以下蛋白質(zhì) JAK2、 STAT5、 STAT3、 SHP2、 GAB2、 AKT和ERK。
本發(fā)明進(jìn)一步通過以下實(shí)施例說明。提供實(shí)施例僅用于說明目的， 并且不被認(rèn)為以任何方式限制本發(fā)明的范圍或內(nèi)容。
實(shí)施例
患者細(xì)胞和細(xì)胞系
HEL 92.1.7。 HEL 92.1.7人紅系白血病細(xì)胞系購自TCC(TIB-180)， 并將細(xì)胞在含2 mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長，該培養(yǎng) 基經(jīng)過調(diào)節(jié)含有1.5 g/L碳酸氫鈉、4.5 g/L葡萄糖、10 mM HEPES和 l.OmM丙酮酸鈉和10%的胎牛血清，如推薦的那樣。CEP-701或媒介 物根據(jù)指示加入到完全培養(yǎng)基中并進(jìn)行培養(yǎng)。
CD34+。在賓夕法尼亞大學(xué)癌癥中心(the University of Pennsylvania Cancer Center),在被應(yīng)允后從被診斷為MPDs的患者中收集周圍血液。 通過Ficoll梯度離心(Pharmacia)分離血細(xì)胞。除去單核細(xì)胞層并洗滌。 將單核細(xì)胞與抗CD34免疫雌珠進(jìn)行培養(yǎng)并使用磁單元分揀器 AutoMacs(Miltenyi Biotech,所有使用小珠和設(shè)備的規(guī)程根據(jù)制造商的 推薦進(jìn)行)將CD34+細(xì)胞純化。將CD34+細(xì)胞洗滌并計(jì)數(shù)。細(xì)胞在新鮮 時(shí)被使用或細(xì)胞作為在10% DMSO中的活細(xì)胞被冷凍。將CD34+細(xì)胞 在包含20。/。血清代用品(BIT 9500， Stem Cell Technologies, Vancouver) 的IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞與干細(xì)胞生長因子、白細(xì)胞介素6和 白細(xì)胞介素3培養(yǎng)3-5天用于初始擴(kuò)增。在初始培養(yǎng)后，向培養(yǎng)基中加 入紅細(xì)胞生成素。將細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增2-5天直到獲得足夠的細(xì)胞用于實(shí) 驗(yàn)。所有細(xì)胞因子得自R&DSystems。
使用上述的PCR和限制酶切消化方法分析慢性特發(fā)性骨髓纖維化
45(CIMF)患者的基因型。發(fā)現(xiàn)患者#648和#650攜帶V617F突變(由等位 基因特異PCR顯示，圖12)和BsaXl消化(圖13)。在圖14中，SCL PCR產(chǎn)物用作對照。當(dāng)使用BsaXl消化時(shí)，496 bpSCL產(chǎn)物被切割成 356 bp、 110bp和30bp片段。
實(shí)施例1
CEP-701對JAK2激酶活性的抑制
采用時(shí)間分辨熒光(TRF)檢測，在微量滴定板試驗(yàn)中，試驗(yàn)了 CEP-701抑制桿狀病毒表達(dá)的JAK2的激酶活性的能力。首先將96孔 Costar高粘合板(Corning Costar #3922, Corning, NY)以每孔100微升涂 覆處在37。C下的含10 ng/mL的Neutravidin(Pierce #31000， Rockford， IL) 的Tris-緩沖鹽水(TBS)達(dá)2小時(shí)。然后以每孔100微升涂覆處在37°C 下的含1 pg/mL的15-mer肽底物(生物素基-氨基-己?；?陽EQEDEPEGDYFEWLE-酰胺，Infinity Biotech Research and Resource, Aston， PA)達(dá)另外1小時(shí)。然后向試驗(yàn)板中加入JAK2試驗(yàn)混合物(總體 積,0)iL/孔)，其由20 mM HEPES(pH 7.2)、 0.2 ATP、 1 mM MnCl2、 0.1。/。牛血清白蛋白(BSA)和不同濃度的CEP-701(在DMSO中稀釋；在 試驗(yàn)中最終為2.5%的DMSO)組成。加入酶(15 ng/ml JAK2批號 JAK2[318], JA2-2.1)并在室溫下允許反應(yīng)進(jìn)行20分鐘。磷酸化產(chǎn)物的 檢測如下進(jìn)行以每孔100微升加入在包含0.05。/。土溫20和0.25。/。BSA 的TBS中以1 :5000稀釋的Eu-Nl標(biāo)記的PY100抗體(PerkinElmer Life Sciences #AD0041, Boston, MA)。在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)，然后加入lOOfiL 的增強(qiáng)溶液(PerkinElmer Life Sciences #1244-105, Boston, MA)。將板溫 和攪拌并在30分鐘后，使用PerkinElmer EnVision 2100(or 2102)多標(biāo)記 讀板器測量所得溶液的熒光。在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生抑制曲線并繪制成抑 制。/。-log10化合物濃度的曲線。如下通過將S形劑量-應(yīng)答(可變斜率) 等式配合到GraphPad Prism中進(jìn)行非線性回歸進(jìn)行數(shù)據(jù)分析
y=bottom +(top-bottom)/(l + lO(log IC50.x)*HiUslope)其中y是在給定濃度化合物下的抑制，X是化合物濃度的對數(shù)，
bottom是在最低供試化合物濃度下的抑制％，和t叩是在最高供試化合 物濃度下的抑制％。 bottom和top的值分別固定在0和100。將得自單 個(gè)曲線的ICso平均化并用ICso平均值報(bào)導(dǎo)。繪制CEP-701濃度-JAK2 活性的曲線(圖1)。顯示CEP-701的ICso為0.9士0.2nM。
實(shí)施例2
A.Val617Phe突變的等位基因特異PCR
細(xì)胞系和患者樣品的基因型如E丄等，(2005) "Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders" Lancet 365:1054-106中所述進(jìn)行。使用兩種方法，包括等位基因特異PCR和 限制酶切分析，來確定V617F突變的狀態(tài)。除非另作說明，否則根據(jù) 制造商的說明書，使用Wizard基因組DNA純化試劑盒(Promega)，從 粒細(xì)胞或單核細(xì)胞制備患者的DNA。除非另作說明，否則根據(jù)制造商 的說明書，使用得自Promega的PCR Core試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。
簡而言之，在PCR反應(yīng)(退火溫度58'C， 38-44次循環(huán))中，使 用常見的反向引物(5'-ctgaatagtcctacagtgttttcagtttca-3')(SEQ ID NO:l)和 兩個(gè)正向引物對80-200 ng的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。第一個(gè)是突變體特異引 物(5'-agcatttggttttaaattatggagtatatt-3')(SEQ ID NO:2)，其從3 '末端起第三 個(gè)核苷酸處包含故意錯(cuò)配以改善特異性并且其產(chǎn)生顯示存在V617F突 變的 203 bp 產(chǎn)物。第 二 個(gè)正向引物 (5'-atctatagtcatgctgaaagtaggagaaag-3')(SEQ ID NO:3)從突變的和野生型 等位基因擴(kuò)增為364 bp片段并用作內(nèi)對照。結(jié)果如圖2 (畫面A)所 述。兩個(gè)HEL 92樣品都顯示了內(nèi)對照的擴(kuò)增以及得自突變體等位基因 的203 bp產(chǎn)物。K562用作野生型對照。
B. JAK2基因型的限制酶基試驗(yàn)導(dǎo)致V617F置換的G~VT突變消 除了存在于野生型JAK2中的用于限制酶BsaXl的限制性位點(diǎn)。因此， 阻礙BsaXl識別V617F突變。為了評價(jià)細(xì)胞系和患者樣品中的突變的存在，使用正向引物
(5'國gggtttcctcagaacgttga-3')(SEQ ID NO:4) 和 反 向 引 物 (5'-tcattgctttcctttttcacaa-3')(SEQ ID NO:5)，通過PCR(57。C ， 40-44次循 環(huán))對200 ng的包括JAK2的617位的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。得到的 460 bp片段用BsaXl消化3-4小時(shí)并在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。野 生型等位基因產(chǎn)生241bp、 189bp和31bp的片段，而突變體等位基因 完整無損。得自HEL92細(xì)胞的擴(kuò)增的DNA片段耐受BsaXl的消化， 而得自K562細(xì)胞的擴(kuò)增片段完全被BsaXl消化。為了控制消化的完成， 將得自包含BsaX位點(diǎn)的人SLC gene的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增并用BsaXl 消化。正向引物(5'-tcctggggtcttctgtcttg-3')(SEQ ID NO:6)和反向引物 (5'隱cctgagaggcaatgggagta-3')(SEQ ID NO:7)擴(kuò)增496 bp SLC產(chǎn)品，其被 消化形成356 bp、 110bp和30bp的片段。結(jié)果如圖2 (畫面B)所示。
實(shí)施例3
CEP-701對細(xì)胞增殖的作用
將純化和擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)并鋪板在96孔板中用于XTT試 驗(yàn)。將細(xì)胞用JAK2抑制劑或者媒介物處理24-72小時(shí)，并根據(jù)制造商 的建議使用XTT試齊U(Molecular Probes)分析相對細(xì)胞存活率。
將鋪板在96孔板內(nèi)的HEL 92丄7細(xì)胞(2X 104個(gè)/孔)用CEP-701 或媒介物處理24-72小時(shí)，并根據(jù)推薦通過MTS試劑(Promega)測定細(xì)
胞存活性。
測定用CEP-701處理的HEL 92丄7細(xì)胞的細(xì)胞存活率(圖3，畫面 A-D)。在畫面A中，在胎牛血清(FBS)存在的條件下并用CEP-701處理 進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)后與未用藥物處理所得存活率相比來評價(jià)細(xì)胞。 CEP-701使細(xì)胞存活率降低到約50%(使用3.0|liM的CEP-701)。在畫面 B中，在胎牛血清(FBS)存在的條件下并用CEP-701處理進(jìn)行48小時(shí) 培養(yǎng)后與未用藥物處理所得存活率相比來評價(jià)細(xì)胞。CEP-701使細(xì)胞存活率降低到約25%(使用3.0^M的CEP-701)。在畫面C中，在不存在 FBS的條件下與CEP-701進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)后來評價(jià)細(xì)胞。CEP-701使 細(xì)胞減少率降低到約50%(使用3.0pM的CEP-701)，其類似于畫面A 中的圖形。在畫面D中，在不存在FBS的條件下與CEP-701進(jìn)行48 小時(shí)培養(yǎng)后來評價(jià)細(xì)胞。CEP-701使細(xì)胞減少率降低到約25%(使用 3.0|aM的CEP-701),其類似于畫面B中的圖形。
圖5表示CEP-701對在存在胎牛血清(FCS)和每24小時(shí)補(bǔ)充藥物 的條件下生長的HEL細(xì)胞的存活率的作用。在該實(shí)驗(yàn)中，將HEL 92丄7 細(xì)胞暴露在藥物下達(dá)72小時(shí)并在MTS試驗(yàn)中評價(jià)存活率。CEP-701 使細(xì)胞存活率降低到低于5%(使用l.O^M的CEP-701)。
MTS試驗(yàn)表明CEP-701抑制攜帶V617F突變的HEL 92細(xì)胞的生長。
圖6表示在HEL 92細(xì)胞中，通過組蛋白/DNA釋放試驗(yàn)測量的 CEP-701對誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的作用。該試驗(yàn)表明CEP-701誘導(dǎo)細(xì)胞 程序死亡。
實(shí)施例4
CEP-701對信號路徑的作用的分析
使用特異性抗體和從細(xì)胞系和培養(yǎng)的患者樣品中制備的全細(xì)胞提 取物評價(jià)了 CEP-701對信號路徑的作用。在以下的細(xì)胞裂解緩沖液中 制備全細(xì)胞提取物(20 mM Tris-HCl(pH 7.5)， 150 mM NaCl， 1 mM Na2EDTA， lmMEGTA， 1% Triton, 2.5 mM焦磷酸鈉，1 mM卩-甘油 磷酸鹽，1 mMNa3V04， 1 fig/ml亮肽素)，補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑(Complete Mini, Roche Diagnostic)。測定了蛋白質(zhì)濃度并將等量(10-30pg/泳道)在 SDS-PAGE凝膠上分開。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾器中并根據(jù)制 造商的推薦使用特異性抗體評價(jià)表達(dá)和/或磷酸化的水平。根據(jù)制造商 的說明書使用Supersignal West Pico System(Pierce)將斑點(diǎn)顯色。通過免
49疫沉淀/蛋白質(zhì)印跡規(guī)程測定JAK2的活化。
簡而言之，根據(jù)推薦使用免疫沉淀Starter Pack(Amersham Biosciences),從250|ug的JAK2抗體的提取物中使JAK2發(fā)生免疫沉淀。 在蛋白質(zhì)印跡后，使用磷酸酪氨酸特異性抗體4G10(Upstate)進(jìn)行探針 探測評價(jià)JAK2的酪氨酸磷酸化。
圖3畫面A表示濃度漸增的CEP-701(從0.1到3.0fiM的CEP-701) 對STAT5磷酸化的劑量依賴性抑制。畫面B表示濃度漸增的 CEP-701(從0.03到l.OjiM)對JAK2和STAT3的磷酸化的抑制。畫面B 還表示BCIXl(JAK2/STAT5信號發(fā)放的下游效應(yīng)器)的表達(dá)的劑量依賴 性抑制。
圖7表示在暴露于濃度漸增的CEP-701下L0、1.5、和2.5小時(shí)后， STAT5的磷酸化的抑制。5個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均抑制在底部顯示。在HEL 92丄7細(xì)胞中對STAT5抑制的ICso為約10 nM，其將被解釋為具有臨 床意義上的對JAK2/STAT信號發(fā)放的抑制。圖8表示在暴露于濃度漸 增的CEP-701下1.0、 1.5和2.5小時(shí)后，STAT3的磷酸化的抑制。5 個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均抑制在底部顯示。在HEL 92丄7細(xì)胞中對于STAT3抑制 的IC5。為約10nM，其將被解釋為具有臨床意義上的JAK2/STAT信號 發(fā)放的抑制。
圖9表示在HEL 92細(xì)胞中，al-AGP對CEP-701介導(dǎo)的STAT5 活性的抑制的作用。如圖9所述，1.0毫克/毫升的al-AGP使對STAT5 抑制的ICso改變?yōu)?)LiM。這些濃度在例如在80毫克劑量給藥方案中在 體內(nèi)可容易地實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例5
CEP-701對HEL 92腫瘤異種移植物的生長的作用。 在攜帶HEL92異種移植物的小鼠中評價(jià)CEP-701 (與媒介物對照
50相比)對瘤生長的作用。簡而言之，每天兩次皮下給用30毫克/千克的 CEP-701，并在圖10所示的所選天數(shù)下評價(jià)腫瘤體積。瘤生長被
CEP-701抑制，并且在用CEP-701處理的小鼠中的腫瘤體積顯著減小。
還在HEL 92異種移植物中評價(jià)了 CEP-701對JAK2/STAT信號發(fā) 放的作用。在該研究中，攜帶HEL.92腫瘤的動(dòng)物接受了一劑 CEP-701(30毫克/千克，s.c.)，并通過蛋白質(zhì)印跡在不同的時(shí)間點(diǎn)評價(jià)了 STAT5和STAT3抑制的動(dòng)力學(xué)。如圖11所示，CEP-701強(qiáng)烈地抑制 STAT5和STAT3磷酸化，在給藥后第2-4小時(shí)觀察到最大抑制。抑制 動(dòng)力學(xué)與腫瘤內(nèi)CEP-701濃度很好地相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了 CEP-701在 體內(nèi)抑制JAK2/STAT信號發(fā)放的能力。
實(shí)施例6 患者樣品
在XTT試驗(yàn)(圖14)中顯示了 CEP-701抑制從患者#648分離出的 CD34+細(xì)胞的生長。濃度漸增的CEP-701 (0.03(iM、 O.l(iM禾P 0.3|_iM) 在24小時(shí)(畫面A)和48小時(shí)(畫面B)使細(xì)胞生長減小。
圖15表示對用CEP-701處理的得自患者#648的CD34+原代培養(yǎng) 物的激發(fā)熒光細(xì)胞分離器(FACS)分析。在畫面A中，白色條形圖顯示 活細(xì)胞的數(shù)目。畫面A中的黑色條形圖顯示細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)，通 過測量錨定蛋白顯示。在圖15的畫面B中，黑色條形圖顯示活的CD34+ 細(xì)胞的數(shù)目，其用濃度漸增的CEP-701處理24小時(shí)并然后被稀釋到新 鮮的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)另外72小時(shí)。使用錐蟲藍(lán)測定細(xì)胞計(jì)數(shù)。
圖16表示CEP-701在得自患者#648的CD34+原代培養(yǎng)物中對 JAK2/STAT信號發(fā)放的作用。CD34+造血祖細(xì)胞從患者弁648中純化并 且與濃度漸增(30nM、 100nM、 300nM和1000nM)的CEP-701如圖所示 培養(yǎng)1小時(shí)。使用特異性抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析、STAT3的表達(dá)和 磷酸化。為了評價(jià)JAK2活性，將JAK2免疫沉淀，然后使用抗磷酸酪氨酸特異性抗體(4G10)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。在培養(yǎng)的攜帶V617F突變并得自MPD患者的CD34+前體細(xì)胞中，CEP-701顯示抑制JAK2/STAT信號發(fā)放。
在培養(yǎng)的得自患者#648的CD34+細(xì)胞中評價(jià)了 CEP-701對SHP2、GAB2、 AKT和ERK的活化的作用。使用蛋白質(zhì)印跡檢測SHP2、GAB2(圖17畫面A)和AKT和ERK(圖17畫面B)的磷酸化和表達(dá)。將濃度漸增的CEP-701加入到得自患者#648的CD34+細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中。使用的濃度是O(即，只有媒介物)、30、 100、 300和1000 nM的CEP-701 。 CEP-701顯示抑制牽涉CD34+前體細(xì)胞的增殖和存活的多信號發(fā)放路徑，暗示了在攜帶V617F突變的細(xì)胞中在受體水平下的廣泛抑制。在畫面B中，看家基因p-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)用作對照。
還在檢測作為JAK2/STAT信號發(fā)放的下游靶標(biāo)的STAT5的表達(dá)和磷酸化以及BCL-Xt的表達(dá)的試驗(yàn)中評價(jià)了得自患者弁648的細(xì)胞(圖18)。將濃度漸增的CEP-701加入到得自患者#648的CD34+細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中。使用的濃度是O(即，只有媒介物)、30、 100、 300和1000 nM的CEP-701。看家基因(3-肌動(dòng)蛋白和親環(huán)蛋白的表達(dá)用作對照。在這些細(xì)胞中，CEP-701顯示抑制JAK2/STAT信號發(fā)放和Bclxl表達(dá)。延長暴露在CEP-701下(例如多次劑量給藥)可導(dǎo)致STAT5表達(dá)的下調(diào)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是，有可能根據(jù)上述教導(dǎo)對本發(fā)明進(jìn)行多種改進(jìn)和改變。因此，可理解的是，在由權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以與本文所具體說明的不同方式被實(shí)踐，并且本發(fā)明的范圍意在涵蓋所有的這些變體。
權(quán)利要求
1. 治療脊髓增生病的方法，該方法包括對患者給用治療有效量的作為JAK2抑制劑的化合物。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中JAK2抑制劑是稠合的吡咯并咔唑。
3. 治療脊髓增生病的方法，該方法包括對患者給用治療有效量的下式所示的化合物、或其立體異構(gòu)體或可藥用鹽的形式，其中環(huán)B和F獨(dú)立地為苯基或雜芳基；W獨(dú)立地為H;垸基；芳基；芳基烷基；雜芳基；雜芳基烷基；-COR9; -OR10; -CONR7R8; -NR7R8; -(CH2)PNR7R8; -(CH2)pOR10;-0(CH2)pOR!。；或-0(CH2)pNR7R8;R2獨(dú)立地為H; -S02R9; -C02R9; -COR9;含l-8個(gè)碳的烷基；含2-8個(gè)碳的烯基；含2-8個(gè)碳的炔基；或含5-7個(gè)碳的單糖，其中單糖的每個(gè)羥基獨(dú)立地任選地被以下基團(tuán)替代含1_4個(gè)碳的垸基、含2-5個(gè)碳的烷基羰基氧基或含l-4個(gè)碳的烷氧基；和其中烷基、烯基或炔基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代；其中當(dāng)X為CHR16或NR16時(shí)，則R2和R16可任選地通過其2位和5位結(jié)合在一起形成連接呋喃并且其中連接呋喃的2位和5位任選地分別被R"和！129取代；和連接呋喃的3位被R"和R"二取代；R3， R4， R5和R6獨(dú)立地為H;芳基；雜芳基；F; CI; Br; I; -CN;-CF3; -N02; -0R1U; (CH2)pORlu; -0(CH2)pNR'R8; -OCORy;畫OCONHR、-CH2OR14; -NR7R8; -NR1()COR9; -NR1()C02R9; -NR1()CONR7R8; -SCCOyR11;-C02R9 ; -COR9 ; -CONR7R8 ; -CHO ; -CH:NOR11 ; -CH=NR9 ;-CH=NNR12R13 ;-(CH2)pS(0)yR9 ;-CH2SR15 ;-CH2S(0)yR14 ;-(CH2)PNR7R8; -(CH2)PNHR14;含1-8個(gè)碳的垸基；含2-8個(gè)碳的烯基；或含2-8個(gè)碳的炔基；其中垸基、烯基或炔基各自任選獨(dú)立地被l-3個(gè)R"取代；X是含1-3個(gè)碳并任選被至少一個(gè)以下基團(tuán)取代的亞烷基OH、 =0、二NOR11、 OR11、 -OCOR9、 -OCONR7R8、 -0(CH2)pNR7R8、 -O(CH2)pOR10、芳基、芳基烷基、雜芳基、-S02R9; -C02R9、 -COR9、含l-8個(gè)碳的烷基、含2-8個(gè)碳的烯基、含2-8個(gè)碳的炔基、或含5-7個(gè)碳的單糖，其中單糖的每個(gè)羥基獨(dú)立地任選地被以下基團(tuán)替代含1-4個(gè)碳的垸基、含2-5個(gè)碳的烷基羰基氧基或含1-4個(gè)碳的垸氧基；和其中垸基、烯基或炔基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代；-O-; -S(0)y-; N(R16); CHR16; -CH2Z-; -Z-CH2-;或-CH2ZCH2-；其中z為c(or11)(1111)、 o、 s、 c(=o)、 c(二noru)或nru;其中當(dāng)X為CHR"或NR"時(shí)，則112和R"可任選地通過其2位和5位結(jié)合在一起形成連接呋喃并且其中連接呋喃的2位和5位任選地分別被R28和R29取代；和連接呋喃的3位被R17和R18 二取代；a'和八2獨(dú)立地為h、 -or11、 -sr11或-n(rh)2;或者結(jié)合在一起形成=0、 二s或nrh的部分；B^PB2獨(dú)立地為H、 -OR11、 -81111或^(1111)2;或者結(jié)合在一起形成=0、 二S或二NR"的部分；前提條件是A1和A2、或B1和B2的至少一對結(jié)合在一起形成=0;W和r8獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的烷基；或者，與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)垸基；W獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、芳基或雜芳基；R"獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的垸基；R11獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的垸基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基；仗12和R"獨(dú)立地為H、烷基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基；或者，與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基；R"獨(dú)立地為氨基酸的在除去羧基的羥基之后的殘基；R"獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基；R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的院基、含2-8個(gè)碳的烯基、含2-8個(gè)碳的炔基、芳基或雜芳基；其中垸基、烯基、炔基、芳基或雜芳基各自任選獨(dú)立地被1-3個(gè)R27取代或者當(dāng)X為CHR16或NR16時(shí)，則R2和R16可任選地通過其2位和5位結(jié)合在一起形成連接呋喃并且其中連接呋喃的2位和5位任選地分別被R^和R"取代；和連接呋喃的3位被R"和R"二取代；R"獨(dú)立地為OH、含1-6個(gè)碳的O-正-烷基或含2-6個(gè)碳的O-?；?；R"獨(dú)立地為H;含l-4個(gè)碳的烷基；CONHC6H5; CH2Y，其中Y為OR19、 SOR20、 NR"R"或SR23; N3; C02R15; S-GIc;CONR24R25 ;CH=NNHCONH2 ;CONHOR10 ;CH=NOR10 ;CH2NHCONHR'b;或者R17和R18可以任選地結(jié)合在一起形成-CH2NHC02-、-CH2OC(CH3)20-、 =0或-CH2N(CH3)C02-;R"獨(dú)立地為H、含l-4個(gè)碳的垸基或含2-5個(gè)碳的?；?；R"獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、芳基或含氮原子的雜環(huán)烷基；R"和1122獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、Pro、 Ser、 Gly、 Lys或含2-5個(gè)碳的酰基，前提條件是R"和R"中只有一個(gè)為Pro、 Ser、Gly、 Lys或酰基；R"獨(dú)立地為芳基、含l-4個(gè)碳的烷基或含氮原子的雜環(huán)烷基；R"和R"獨(dú)立地為H;含1-6個(gè)碳的垸基；苯基；或含1-6個(gè)碳的羥基垸基；或者，與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基；1126獨(dú)立地為芳基；R27獨(dú)立地為芳基；雜芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氫吡喃基；-NR7R8; -NR1()COR9 ; -NR1()C02R9 ; -NR1()CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13; -P^OXOR11)"或陽OR";R"獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的烷基、含l-4個(gè)碳的院氧基、含7-10個(gè) 碳的芳基烷基、-(CH2)pOR10、 -(CH2)pOC(=0)NR7R^-(CH2)pNR7R8;R^獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的垸基、含1-4個(gè)碳的垸氧基、含7-10 個(gè)碳的芳基垸基、-(CH2)pOR1()、 -(012)130(:(=0^117118或-(012)1^尺7118;p為1-4的整數(shù)；禾口y為0、 1或2。
4.權(quán)利要求3的方法，其中化合物具有下式所示的結(jié)構(gòu)、或其立 體異構(gòu)體或可藥用鹽的形式其中W獨(dú)立地為H;垸基；苯基；含7-10個(gè)碳的芳基烷基；5-6元雜芳基；雜芳基烷基；-COR9; -OR1G; -CONR7R8; -NR7R8; -(CH2)pNR7R8; -(CH2)pOR1(); -0(CH2)pOR1();或-0(CH2)pNR7R8;R3， R4， R5和R6獨(dú)立地為H;苯基；5-6元雜芳基；F; CI; Br; I; -CN; CF3; -N02; -OR10; (CH2)pOR10; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9;誦OCONHR9 ; -CH2OR14 ; -NR7R8 ; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8; -SCOyi11; -C02R9; -COR9; -CONR7R8; -CHO;-CH-NOR11; -CH=NRy; -CH=NNR12R"; -(CH2)pS(0)yRy; -CH2SR"; -CH2S(0)yR14; -(CH2)PNR7R8; -(CH2)PNHR14;含1-8個(gè)碳的垸基；含 2-8個(gè)碳的烯基；或含2-8個(gè)碳的炔基；其中烷基、烯基或炔基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代；X為-CH-或N;A^口A2獨(dú)立地為H、 -OR11、 -SR11或-N(R")2;或者，結(jié)合在一 起形成=0、 S或-NRH部分；B^卩B2獨(dú)立地為H、 -OR11、 -81111或^(1111)2;或者，結(jié)合在一起 形成=0、 -S或二NR"部分；前提條件是A1和A2、或B1和B2的至少一對結(jié)合在一起形成K);W和RS獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的烷基；或者，與其所連接的氮 一起形成5-7元雜環(huán)垸基；R"蟲立地為含l-4個(gè)碳的垸基、芳基或雜芳基；R^獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的垸基；R11獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的垸基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基； 1112和R"獨(dú)立地為H、垸基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基；或者， 與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)垸基；R"獨(dú)立地為氨基酸的在除去羧基的之后的殘基； R"獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的烷基；R"獨(dú)立地為H、含l-4個(gè)碳的垸基、芳基或雜芳基； R"獨(dú)立地為OH、含1-6個(gè)碳的O-正-烷基或含2-6個(gè)碳的O-?；籖"獨(dú)立地為H;含l-4個(gè)碳的烷基；CONHC6H5; CH2Y，其中Y為OR19、 SOR20、 NR"R"或SR23; N3; C02R15; S-Glc; CONR24R25 ;CH=NNHCONH2 ;CONHOR10 ;CH=NOR10 ;CH2NHCONHR10;或者R17和R18任選地結(jié)合在 一 起形成-CH2NHCO -CH2OC(CH3)20-、 =0或-CH2N(CH3)CCV;CH=NNHC(=NH)NH:CH=NN(R26)2 ; 或R^獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基或含2-5個(gè)碳的?；?； R^獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的烷基、芳基或含氮原子的雜環(huán)垸基； R"和1122獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、Pro、 Ser、 Gly、 Lys或含2-5個(gè)碳的酰基，前提條件是R"和R22中只有一個(gè)為Pro、 Ser、Gly、 Lys或?；?；R"獨(dú)立地為芳基、含l-4個(gè)碳的烷基或含氮原子的雜環(huán)烷基；RM禾P R"獨(dú)立地為H;含1-6個(gè)碳的垸基；苯基；或含1-6個(gè)碳 的羥基垸基；或者，與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基； R^獨(dú)立地為芳基；R27獨(dú)立地為芳基；雜芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氫吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; ■NR10SO2R9;陽S(0)yR"; -C02R9; —GONR7R8; -CHO; -COR9; —GH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13;國PO(OR")2;或國OR";R"獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、含l-4個(gè)碳的垸氧基、含7-10個(gè) 碳的芳基垸基、-(CH2)pOR1Q-、 (CH2)pOC(二0)NR7r8或-(CH2)pNR7r8;R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、含1-4個(gè)碳的垸氧基、含7-10 個(gè)碳的芳基垸基、-(CH2)pOR1()、 -(0!2)]30(:(=0^117118或-((:112)1^117118;p為l-4的整數(shù)；和y為0、 1或2。
5.權(quán)利要求4的方法，其中化合物具有下式所示結(jié)構(gòu)、或其立體 異構(gòu)體或可藥用鹽的形式其中R3， R4， R5禾卩R6 蟲立;t也為H;苯基；F; CI; -OR10; (CH2)pOR10;-NR7R8; -CHO; -(CH2)PNR7R8;或含l-8個(gè)碳的烷基； 其中垸基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代； X為-CH-或N;W和RS獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的烷基；或者，與其所連接的氮 一起形成5-7元雜環(huán)垸基；W獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的烷基、芳基或雜芳基； RW獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的烷基；RH獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基； 仗12和R"獨(dú)立地為H、烷基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基；或者， 與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)垸基；R"獨(dú)立地為氨基酸的在除去羧基的羥基后的殘基；R"獨(dú) 立地為OH、含1-6個(gè)碳的O-正-垸基或含2-6個(gè)碳的O-酰基；R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的烷基、CONHC6H5; CH2OH; CH2OCH3; CH2OC(CH3)3; CH2NH2; C02CH3;或CONR24R25;1124和R"獨(dú)立地為H;含1-6個(gè)碳的垸基；苯基；或含1-6個(gè)碳 的羥基垸基；或者，與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基；R27獨(dú)立地為芳基；雜芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氫吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -S(0)yRu; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7;-CH=NNR12Rlj; -CH^NOR11; -CH=NRy; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13; -PO(ORu)2;或-OR14;R"獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、含l-4個(gè)碳的烷氧基、含7-10個(gè)碳的芳基烷基、-(ch2)por1()、 -(0!2){)0(:(=0^117118或-((:1"12)"1 7118;R"獨(dú)立地為H、含1-4個(gè)碳的垸基、含1-4個(gè)碳的垸氧基、含7-10個(gè)碳的芳基垸基、-(ch2)por10、-(<:仏){)0(:(=0^117118或-((:^){^117118;p為1-4的整數(shù)；禾口y為0、 1或2。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中R3， R4， 115和w各自獨(dú)立地為H、 苯基、F、 Cl、 -OR1Q、 -NR7R8、 -CHO、 -(CH2)PR7R8或含1-8個(gè)碳的烷 基，其中烷基任選地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代。
7. 權(quán)利要求4的方法，其中化合物具有下式所示結(jié)構(gòu)、或其立體 異構(gòu)體或可藥用鹽的形式其中R3， R4， 115和R6獨(dú)立地為H、 Cl、含1-4個(gè)碳的烷基、-OR1G、 CH2OR10、 NR7r8、 CH2NR7rm CONR7R8;尺7和RS獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的烷基；111(>獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的烷基；R卩獨(dú)立地為OH或含1-4個(gè)碳的O-正-垸基；R"獨(dú)立地為H、 CH2OH、 C02CH3、 C02CH2CH3、 C02CH2CH2CH3 或C02CH(CH3)2;或者1128獨(dú)立地為CH3;和R29獨(dú)立地為H或CH3。
8.權(quán)利要求7的方法，其中化合物具有下式所示結(jié)構(gòu):<formula>formula see original document page 10</formula> 。
9.權(quán)利要求7的方法，其中化合物具有下式所示結(jié)構(gòu)、或其立體異構(gòu)體或可藥用鹽的形式其中(a) ie和R"各自獨(dú)立地選自H、含l-6個(gè)碳的垸基、含l-3個(gè)碳 的羥基垸基和含3-6個(gè)碳的烯基，前提條件是W和R"不都為H;(b) A^卩A^P是氫和R3、 R4、尺5和116各自獨(dú)立地為11或者它們 最多兩個(gè)為F; CI; Br; I; N02; CN或OH; NHCONHR7，其中R7 為含1-4個(gè)碳的烷基，前提條件是R3、 R4、 W和R6中只有一個(gè)為 NHCONHR7; CH2OR1Q;含1-4個(gè)碳的烷基；CH2OCONHC2H5;或NHC02CH3;禾口(c)當(dāng)A'和A2二者結(jié)合在一起表示O時(shí)；貝U R3、 R4、 115和R6各自為氫。
10.權(quán)利要求3的方法，其中化合物具有下式結(jié)構(gòu)、或其立體異構(gòu)體或可藥用鹽的形式其中R"獨(dú)立地為-C02R、 -COR9;含1-4個(gè)碳的烷基；其中垸基任選 地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代；R3， R4， 115和R6獨(dú)立地為H;苯基；CI; -OR10; (CH2)pOR1(); -NR7R8; -(CH2)PNR7R8;或含l-6個(gè)碳的烷基；其中垸基任選地被1-3個(gè)R"基團(tuán)取代；W和RS獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的垸基；或者，與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基；W獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的垸基、芳基或雜芳基；R^獨(dú)立地為H或含l-4個(gè)碳的烷基； RH獨(dú)立地為H、含l-4個(gè)碳的烷基、含6-10個(gè)碳的芳基； 1112和R"獨(dú)立地為H、烷基、含6-10個(gè)碳的芳基或雜芳基；或者， 與其所連接的氮一起形成5-7元雜環(huán)烷基；R"獨(dú)立地為氨基酸的在除去羧基的羥基后的殘基； R"獨(dú)立地為H、含l-4個(gè)碳的垸基；R27獨(dú)立地為芳基；雜芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;-0(CH2)PNR7R8; -OCOR9;國OCONHR9; O-四氫吡喃基；-NR7R8; -NR1QCOR9 ; -NR^COzR9 ; -NR1QCONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ;-NRluS02Ry; -S(O)yR"; -C02Ry; -CONR'R8;扁CHO; -CORy; -CH2OR'; -CH=NNR12R13; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13;隱PO(ORU)2;或陽OR"; p為l-4的整數(shù)；和y為0、 1或2。
11.權(quán)利要求IO的方法，其中化合物具有下式結(jié)構(gòu)、或其立體異構(gòu)體或可藥用鹽的形式其中W獨(dú)立地為-C02R^ -COR9;含1-4個(gè)碳的垸基；其中垸基任選 地被l-3個(gè)R"基團(tuán)取代；R7和RS獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的垸基；或者，以其所連接的氮一起形成任選地包含另外的環(huán)氮原子的5-6元雜環(huán)垸基；W獨(dú)立地為含l-4個(gè)碳的烷基或苯基； R"獨(dú)立地為H或含1-4個(gè)碳的烷基； R"獨(dú)立地為H、含l-4個(gè)碳的垸基；R"獨(dú)立地為氨基酸的在除去羧基的羥基后的殘基；R27獨(dú)立地為苯基；5-6元雜芳基；-OR1G; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氫吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9; -NR10CO2R9; -NR10CONR7R8; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -COR9; -CH2OR7;或-OR14;p為l-4的整數(shù)；禾口y為0、 1或2。
12. 權(quán)利要求3的方法，其中所述脊髓增生病選自真性紅細(xì)胞 增多癥(PV)、特發(fā)性血小板增多(ET)、伴骨髓外化生的骨髓纖維化(MMM)、特發(fā)性骨髓纖維化(CIMF)、未分類的脊髓增生病(uMPDs)、 嗜酸性白細(xì)胞增多綜合征(HES)和系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥(SM)。
13. 權(quán)利要求8的方法，其中所述脊髓增生病選自真性紅細(xì)胞 增多癥(PV)、特發(fā)性血小板增多(ET)、伴骨髓外化生的骨髓纖維化 (MMM)、特發(fā)性骨髓纖維化(CIMF)、未分類的脊髓增生病(uMPDs)、 嗜酸性白細(xì)胞增多綜合征(HES)和系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥(SM)。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中化合物以每天約0.8毫克/千克體重 到約1.3毫克/千克體重的量給用。
15. 權(quán)利要求13的方法，其中化合物以約60毫克到約80毫克的 量每天兩次給用。
全文摘要
本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物中治療脊髓增生病、脊髓發(fā)育異常綜合征和其它其中JAK2的活化對病理學(xué)有貢獻(xiàn)的疾病的方法，該方法包括對哺乳動(dòng)物給用有效量的稠合的吡咯并咔唑衍生物，其中稠合的吡咯并咔唑衍生物抑制JAK2的活化。
文檔編號A61K31/553GK101489562SQ200780027662
公開日2009年7月22日 申請日期2007年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者布魯斯·A·魯杰里, 帕維爾·多布然斯基 申請人:賽福倫公司