專利名稱：：α-毒素在治療和預(yù)防葡萄球菌感染上的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)菌感染的治療和預(yù)防。具體而言，本發(fā)明提供治療和預(yù)防金黃色葡萄球菌(&a/^yZococcw做re^，S.aureus)和其它細(xì)菌感染的組合物和方法，所述感染包括與耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌菌株(例如那些產(chǎn)生a-毒素者)相關(guān)的感染
背景技術(shù)：
：金黃色葡萄球菌細(xì)菌通常稱為"staph"、"Staph,aureus"或"S.aureus"，其一般寄生在健康人的鼻子和皮膚中。約20%至30%的人口在任何給定時(shí)間都寄生有金黃色葡萄球菌。這些細(xì)菌經(jīng)常在健康個(gè)體中引發(fā)輕微感染，例如丘疹和癤，但也會(huì)引發(fā)全身性感染。可將其視為條件致病菌。通常，粘膜和表皮屏障(皮膚)可抵抗金黃色葡萄球菌感染。由于損傷-例如燒傷、創(chuàng)傷或外科手術(shù)-所導(dǎo)致的這些天然屏障的中斷可顯著增大感染風(fēng)險(xiǎn)。危害免疫系統(tǒng)的疾病(例如糖尿病、腎病后期、癌癥)也會(huì)增大感染風(fēng)險(xiǎn)。機(jī)會(huì)性金黃色葡萄球菌感染可變得極為嚴(yán)重從而引發(fā)心內(nèi)膜炎、菌血癥和骨髓炎，其通常導(dǎo)致極高的發(fā)病率或死亡率。金黃色葡萄球菌表達(dá)多種毒力因子，包括莢膜多糖和蛋白毒素。一種重要的毒力因子是a_毒素(a-溶血素)，其是由大多數(shù)金黃色葡萄球菌致病菌株產(chǎn)生的成孔和溶血性胞外蛋白。研究已表明，人類白血細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞特別容易受a-毒素溶血效應(yīng)的影響。所述研究確立了a-毒素與人類病理生理狀況的相關(guān)性。已證明抗a-毒素免疫力可抵抗毒素的有害影響，但抗a-毒素疫苗的設(shè)計(jì)仍然是重大挑戰(zhàn)。這是因?yàn)檎T導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的需要必須與避免引發(fā)與毒素的生物活性相關(guān)的疾病的需要相平衡。雖然據(jù)報(bào)導(dǎo)對(duì)a-毒素進(jìn)行化學(xué)和分子修飾可降低其毒性，但沒有一例報(bào)告稱修飾可完全消除a-毒素的毒性。另外，在現(xiàn)實(shí)中經(jīng)修飾a毒素存在可能回復(fù)其毒性較強(qiáng)的較早期狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)。此使得任何經(jīng)單一修飾a-毒素都不適用于人類疫苗中。6因此，業(yè)內(nèi)需要可安全地賦予a-毒素和金黃色葡萄球菌細(xì)菌以免疫性的組合物和方法。本發(fā)明可滿足此需要和其它需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供治療金黃色葡萄球菌感染的疫苗、治療和預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的方法、抗體組合物(包括靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)組合物)和制備抗體組合物的方法。在一實(shí)施例中，提供五價(jià)葡萄球菌(Staphylococcal)抗原組合物，其包括(i)金黃色葡萄球菌5型抗原、(ii)金黃色葡萄球菌8型抗原、(iii)金黃色葡萄球菌336抗原、(iv)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和(v)葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原。在一實(shí)施例中，至少一種葡萄球菌抗原是保護(hù)性抗原。在一實(shí)施例中，金黃色葡萄球菌a-毒素抗原與5型抗原、8型抗原、336抗原、或殺白細(xì)胞素抗原中的至少一者結(jié)合。在一實(shí)施例中，相對(duì)于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素，a-毒素抗原含有至少兩處可降低其毒性的改變。在一實(shí)施例中，葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原選自由帕頓-瓦倫丁(Panton-Valentine)殺白細(xì)胞素(PVL)抗原亞單位和Y-溶血素亞單位抗原組成的群組。在一實(shí)施例中，葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原是選自由下列組成的群組(i)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位、(ii)金黃色葡萄球菌PVL的LukS-PV亞單位、(iii)HlgA金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位、(iv)HlgB金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位；(v)HlgC金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位、(vi)來自金黃色葡萄球菌的LukD、(vii)來自金黃色葡萄球菌的LukE、(viii)來自金黃色葡萄球菌的LukM、(ix)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位、(x)來自中間型葡萄球菌(S.intermedius)的LukF-I亞單位、和(xi)來自中間型葡萄球菌的LukS-I亞單位。在一實(shí)施例中，組合物另外包含一或多種其它細(xì)菌抗原，例如選自由下列組成的群組的葡萄球菌抗原.，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁酸(LTA)和識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組份(MSCRAMM)蛋白、和其組合。在另一實(shí)施例中，提供包含金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和醫(yī)藥上可接受的載劑的組合物，其中相對(duì)于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素，所述a-毒素抗原含有至少兩處可降低其毒性的改變。在一實(shí)施例中，至少一處改變是化學(xué)改變。在另一實(shí)施例中，至少一處改變是分子改變。在再一實(shí)施例中，至少一處改變是化學(xué)改變并且至少一處是分子改變。在一實(shí)施例中，分子改變是在野生型金黃色葡萄球菌a-毒素氨基酸序列中的取代、插入或缺失。在一實(shí)施例中，分子改變是在野生型金黃色葡萄球菌a-毒素氨基酸序列中的取代。在一實(shí)施例中，取代發(fā)生在野生型金黃色葡萄球菌oc-毒素中對(duì)應(yīng)于His-35的位置。在一實(shí)施例中，取代是用Arg、Lys、Ala、Leu或Glu取代His。在一實(shí)施例中，分子改變是在野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的氨基閥結(jié)構(gòu)域(latchdomain)中的取代、插入或缺失。在一實(shí)施例中，分子改變是在野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的氨基閥結(jié)構(gòu)域中的缺失。在一實(shí)施例中，分子改變是在野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的干結(jié)構(gòu)域(stemdomain)中的缺失。在另一實(shí)施例中提供組合物，其包含(i)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和(ii)一或多種不同于所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的其它細(xì)菌抗原。在一實(shí)施例中，一或多種其它細(xì)菌抗原中的至少一者是選自由下列組成的群組的其它葡萄球菌抗原金黃色葡萄球菌5型、金黃色葡萄球菌8型、金黃色葡萄球菌336、葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁酸(LTA)和識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組份(MSCRAMM)蛋白、和其組合。在一實(shí)施例中，其它葡萄球菌抗原是保護(hù)性抗原。在一實(shí)施例中，金黃色葡萄球菌a-毒素抗原與一或多種其它細(xì)菌抗原中的至少一者結(jié)合。在一實(shí)施例中，相對(duì)于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素，a-毒素抗原含有至少兩處可降低其毒性的改變。在另一實(shí)施例中，提供治療或預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的方法，其包含對(duì)有需要的個(gè)體投與任一種上述抗原組合物。在一實(shí)施例中，方法另外包含投與選自由下列組成的群組的藥劑抗感染劑、抗生素和抗微生物劑，例如萬古霉素(vancomycin)、溶葡萄球菌素(lysostaphin)或氯林肯霉素(clindamycin)。在一實(shí)施例中，金黃色葡萄球菌感染與耐氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌相關(guān)。在一實(shí)施例中，耐氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生d-毒素。在另一實(shí)施例中，提供制備超免疫特異性靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)制劑的方法，其包含(i)對(duì)個(gè)體投與任一上述組合物，(ii)自所述個(gè)體采集血漿，和(iii)純化來自所述個(gè)體的免疫球蛋白。在另一實(shí)施例中，提供五價(jià)葡萄球菌抗體組合物，其包含(i)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌5型抗原的第一抗體、(ii)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌8型抗原的第二抗體、(iii)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌336抗原的第三抗體、(iv)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌ci-毒素抗原的第四抗體、和(v)特異性結(jié)合葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原的第五抗體。在一實(shí)施例中，第一至第五抗體中的至少一者是單克隆抗體。在一實(shí)施例中，第一至第五抗體中的至少一者是中和抗體。在一實(shí)施例中，第五抗體特異性結(jié)合選自由帕頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞素(PVL)抗原亞單位和Y-溶血素亞單位抗原組成的群組的葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原。在一實(shí)施例中，第五抗體特異性結(jié)合選自由下列組成的群組的葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原(i)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位、(ii)金黃色葡萄球菌PVL的LukS-PV亞單位、(iii)HlgA金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位、(iv)HlgB金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位、(v)HlgC金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位、(vi)來自金黃色葡萄球菌的LukD、(vii)來自金黃色葡萄球菌的LukE、(viii)來自金黃色葡萄球菌的LukM、(ix)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位、(x)來自中間型葡萄球菌的LukF-I亞單位；禾Q(xi)來自中間型葡萄球菌的LukS-I亞單位。在另一實(shí)施例中提供保護(hù)性抗體組合物，其包含(i)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌8a-毒素抗原的第一抗體和(ii)至少一種特異性結(jié)合不同于所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的細(xì)菌抗原的第二抗體。在一實(shí)施例中，第一和第二抗體中的至少一者是單克隆抗體。在一實(shí)施例中，第一和第二抗體中的至少一者是中和抗體。在一實(shí)施例中，至少一種第二抗體中的至少一者特異性結(jié)合選自由下列組成的群組的其它葡萄球菌抗原金黃色葡萄球菌5型、金黃色葡萄球菌8型、金黃色葡萄球菌336、葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁斷LTA)和識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組份(MSCRAMM)蛋白。在一實(shí)施例中，至少一種第二抗體中的至少一者特異性結(jié)合選自由帕頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞素(PVL)抗原亞單位和y-溶血素亞單位抗原組成的群組的葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原。在一實(shí)施例中，至少一種第二抗體中的至少一者特異性結(jié)合選自由下列組成的群組的葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原(i)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位、(ii)金黃色葡萄球菌PVL的LukS-PV亞單位、(iii)fflgA金黃色葡萄球菌y-溶血素亞單位、(W)HlgB金黃色葡萄球菌y-溶血素亞單位、(v)fflgC金黃色葡萄球菌y-溶血素亞單位、(vi)來自金黃色葡萄球菌的LukD、(vii)來自金黃色葡萄球菌的LukE、(viii)來自金黃色葡萄球菌的LukM、(ix)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位、(x)來自中間型葡萄球菌的LukF-I亞單位、和(xi)來自中間型葡萄球菌的LukS-I亞單位。在一實(shí)施例中，組合物包含次優(yōu)量的所述第一抗體和次優(yōu)量的所述第二抗體。在一實(shí)施例中，組合物是通過包含下列步驟的方法來制備(a)對(duì)人類個(gè)體投與(i)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和(ii)一或多種不同于所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的其它細(xì)菌抗原，(b)自所述個(gè)體采集血漿，和(c)純化來自所述個(gè)體的免疫球蛋白。在一實(shí)施例中，方法使用與所述一或多種其它細(xì)菌抗原中的至少一者結(jié)合的金黃色葡萄球菌a-毒素抗原。在一實(shí)施例中，方法使用金黃色葡萄球菌a-毒素抗原，相對(duì)于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素，所述抗原含有至少兩處可降低其毒性的改變。在一實(shí)施例中，組合物使通過包含下列步驟的方法來制備(a)篩選尚未投與金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和不同于所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的其它細(xì)菌抗原的人類個(gè)體，(b)自所述個(gè)體采集血漿，和(c)純化來自所述個(gè)體的免疫球蛋白。在另一實(shí)施例中，提供治療或預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的方法，其包含對(duì)有需要的個(gè)體投與任一上述抗體組合物。在一實(shí)施例中，方法另外包含投與選自由下列組成的群組的藥劑抗感染劑、抗生素和抗微生物劑，例如萬古霉素、溶葡萄球菌素或氯林肯霉素。在一實(shí)施例中，金黃色葡萄球菌感染與耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌相關(guān)。在一實(shí)施例中，金黃色葡萄球菌感染產(chǎn)生a-毒素。在另一實(shí)施例中提供中和金黃色葡萄球菌PVL感染的方法，其包含對(duì)有需要的患者投與包含以下的組合物(i)葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原或(ii)特異性結(jié)合葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原的抗體。在另一實(shí)施例中提供中和葡萄球菌殺白細(xì)胞素感染的方法，其包含對(duì)有需要的患者投與包含以下的組合物(i)金黃色葡萄球菌PVL抗原亞單位或(ii)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌PVL抗原亞單位的抗體。圖l:用兔多克隆抗ALD/H35K免疫擴(kuò)散a-毒素蛋白。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供治療金黃色葡萄球菌感染的疫苗、治療和預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的方法、抗體組合物(包括IVIG組合物)、和制備抗體組合物的方法。在本發(fā)明這些方面的論述中，除非另外說明，否則使用"一"和"所述"來意指"一或多"。通常認(rèn)為，細(xì)菌多糖(PS)是T細(xì)胞非依賴性抗原，因此當(dāng)單獨(dú)投與時(shí)在初次試驗(yàn)人群組和幼兒中不引發(fā)顯著量的抗體，即不觸發(fā)回憶性免疫應(yīng)答。與絕大多數(shù)細(xì)菌多糖類似，表皮葡萄球菌PS1(未與蛋白質(zhì)結(jié)合)不能單獨(dú)引發(fā)特異性抗體免疫應(yīng)答。然而，通過以化學(xué)方式使多糖與蛋白質(zhì)(PR)結(jié)合，多糖可獲得T細(xì)胞依賴性抗原的性質(zhì)，例如免疫記憶和長(zhǎng)效IgG應(yīng)答。蛋白質(zhì)在PS-PR結(jié)合疫苗中用作蛋白載體的適宜性通常是通過測(cè)量PS特異性抗體應(yīng)答來評(píng)估。在本文所述PSl-rALD/H35K結(jié)合物的情況下，蛋白載體rALD/H35K在臨床上是重要的抗原并且rALD/H35K特異性抗體可中和天然a-毒素。因此，由PSl-rALD/H35K誘導(dǎo)的抗a-毒素抗體應(yīng)答的量值在臨床上很重要。疫苗組合物本發(fā)明提供包含金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的疫苗。本文所用"金黃色葡萄球菌a-毒素抗原"或"a-毒素抗原"是指任何包含金黃色葡萄球菌a-毒素抗原性部分的分子，包括全長(zhǎng)金黃色葡萄球菌a-毒素和其片段。適用于本發(fā)明的金黃色葡萄球菌a-毒素的片段具有類似于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的抗原性質(zhì)。例如，所述抗原可誘導(dǎo)與野生型金黃色葡萄球菌a-毒素特異性結(jié)合的抗體。金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的長(zhǎng)度可為約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300個(gè)氨基酸。金黃色葡萄球菌a-毒素抗原可包含野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、或290個(gè)相鄰氨基酸。在其整個(gè)長(zhǎng)度上，金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的氨基酸序列可約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%地等同于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的氨基酸序列(SEQIDNO:l)或金黃色葡萄球菌a-毒素的對(duì)應(yīng)部分。金黃色葡萄球菌ct-毒素抗原可為重組抗原，意指抗原是通過重組DNA方法來制備。所述重組DNA方法在業(yè)內(nèi)眾所周知。重組金黃色葡萄球菌a-毒素抗原通常不含10在天然狀態(tài)下與野生型金黃色葡萄球菌a-毒素相關(guān)的其它蛋白質(zhì)和細(xì)胞組份(即存于金黃色葡萄球菌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和細(xì)胞組份)。用于制備金黃色葡萄球菌ci-毒素抗原的例示性重組宿主是大腸桿菌(E.COli)?？墒紫仍诖竽c桿菌細(xì)胞中表達(dá)抗原，隨后使用(例如)親和柱色譜自大腸桿菌純化。相對(duì)于野生型金黃色葡萄球菌o-毒素，可用于本發(fā)明中的金黃色葡萄球菌a-毒素抗原可包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸插入、取代或缺失。例如，金黃色葡萄球菌a-毒素序列內(nèi)的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基可被另一用作功能等效物的具有類似極性的氨基酸取代，產(chǎn)生沉默改變?？乖瓋?nèi)的取代可選自所述氨基酸所屬類別中的其它成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氮基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸?；蛘?，可實(shí)施非保守性氨基酸改變，包括以下在對(duì)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原實(shí)施去毒的上下文中更詳細(xì)論述的改變。因此，在某些實(shí)施例中，對(duì)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原實(shí)施非保守性氨基酸改變以將其去毒。根據(jù)本發(fā)明，相對(duì)于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素抗原來改變金黃色葡萄球菌a-毒素抗原以降低其毒性。在一實(shí)施例中，相對(duì)于野生型抗原，所述抗原含有至少兩處改變。此實(shí)施例將毒性降至最低并且同樣降低了抗原回復(fù)較強(qiáng)毒性狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)。例如，抗原可含有2、3、4、5-10、10-15、15-20或更多處改變。所述改變可為"化學(xué)改變"，可為"分子改變"，或可為化學(xué)改變與分子改變的組合。出于計(jì)數(shù)改變數(shù)量的目的，將單一氨基酸或氨基酸連續(xù)序列的化學(xué)或分子改變視為單一改變。因此，本文所用兩個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸的缺失、取代或插入是"單一改變"。"化學(xué)改變"是指通過對(duì)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原進(jìn)行化學(xué)處理或?qū)⒔瘘S色葡萄球菌a-毒素抗原結(jié)合到另一部分來達(dá)成的修飾。例如，已知用焦碳酸二乙酯對(duì)金黃色葡萄球菌a-毒素中的組氨酸實(shí)施化學(xué)修飾可降低a-毒素的溶血活性。使金黃色葡萄球菌a-毒素與其它分子結(jié)合也可降低a-毒素的溶血活性。在一實(shí)施例中，另一分子是另一細(xì)菌抗原，例如細(xì)菌多糖或細(xì)菌糖蛋白。細(xì)菌抗原可為金黃色葡萄球菌抗原或可得自其它細(xì)菌種類。例示性細(xì)菌抗原包括金黃色葡萄球菌5型、金黃色葡萄球菌8型、金黃色葡萄球菌336、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、殺白細(xì)胞素(例如PVL(包括各個(gè)PVL亞單位，LukS-PV和LukF-PV)和Y-溶血素亞單位(HlgA、HlgB禾卩HlgC)、來自金黃色葡萄球菌的LukD、來自金黃色葡萄球菌的LukE、來自金黃色葡萄球菌的LukM、來自金黃色葡萄球菌的LukF-PV、來自中間型葡萄球菌的LukF-I亞單位、或來自中間型葡萄球菌的LukS-I亞單位)、脂磷壁酸(LTA)和識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組份(MSCRAMM)蛋白。因此，本發(fā)明的疫苗可包含a-毒素抗原5型結(jié)合物、a-毒素抗原8型結(jié)合物、a-毒素抗原336型結(jié)合物、a-毒素-PVL結(jié)合物、a-毒素抗原-PS1結(jié)合物、a-毒素抗原-GP1結(jié)合物、a-毒素-LTA結(jié)合物、或a-毒素-MSCRAMM結(jié)合物。類似地，本發(fā)明疫苗可包含通過結(jié)合另一分子而經(jīng)改變和去毒的a-毒素抗原，所述另一分子例如另一細(xì)菌多糖、另一革蘭氏(Gram)陽性細(xì)菌抗原或革蘭氏陰性細(xì)菌抗原。"分子改變"是指金黃色葡萄球菌a-毒素的氨基酸序列中的修飾。修飾可為插入、缺失或取代一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸。分子改變可在金黃色葡萄球菌ct-毒素的任一部分中發(fā)生。在一實(shí)施例中，氨基闊結(jié)構(gòu)域發(fā)生分子修飾。例如，氨基閥結(jié)構(gòu)域的部分或整個(gè)氨基閥結(jié)構(gòu)域(Ala'-Va嚴(yán))可缺失，由此使a-毒素抗原去毒。在另一實(shí)施例中，干結(jié)構(gòu)敏Lys，-Ty,8)發(fā)生分子修飾。例如，干結(jié)構(gòu)域的部分或整個(gè)干結(jié)構(gòu)域可缺失。在另一實(shí)施例中，形成三角區(qū)域的氨基酸殘基(Pro,-Thr朋和Val149-Asp152)發(fā)生分子修飾。在再一實(shí)施例中，帽結(jié)構(gòu)域發(fā)生分子修飾。在另一實(shí)施例中，邊緣結(jié)構(gòu)域發(fā)生分子修飾。在又一實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上組氨酸殘基經(jīng)修飾，例如His35、His48、HinHis259。對(duì)His"的修飾是例示性的。例如，修飾可為His35Lys、His35Arg、His"Ala、His"Leu或His"Glu取代。His"Lys取代是一個(gè)具體實(shí)施例。其它可經(jīng)修飾的例示性殘基包括Asp24、Lys37、Lys58、Aspl(K)、He107、Glum、Met113、Asp127、Asp128、Gly130、Gly134、Lys147、Gln150、Asp152、Phe'153、Lys154、Val169、Asn173、Arg200、Asn214和Leu219。分子改變可通過業(yè)內(nèi)熟知的方法來達(dá)成，包括基于質(zhì)粒模板通過原始孔克爾(Kunkel)方法(孔克爾，TA,科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Acad.Sci.)，美國(guó)，82:488-492(1985))使用單鏈模板或雙鏈DNA模板(帕普沃斯(Papworth)等人，戰(zhàn)略O(shè)S加"g!'")，9(3):34(1996))實(shí)施引物延伸，和PCR克隆(布拉曼(Braman),J.(編輯)，體外誘變方案(INVITROMUTAGENESISPROTOCOLS),第2版，希爾曼那出版社(HumanaPress),脫托瓦(Totowa)，新澤西(2002);伊什(Ishii)等人，酶學(xué)方法(Me仇&iz;ymo/)，293，，53-71(1998);卡曼(Kammann)等人，核酸研究(7V"ddcAcWs尺".)，17:5404(1989);赫姆斯禾U(Hemsley)等人，核酸研究，17:6545-6551(1989);杰貝爾(Giebel)等人，核酸研究，18:4947(1990);蘭德特(Landt)等人，基因(Gme)，96:125-128(1990);斯徳默(Stemmer)等人，生物技術(shù)(所oredim々MM)，13:214-220(1992);馬里尼(Marini)等人，核酸研究，21:2277-2278(1993);和韋纟內(nèi)(Weiner)等人，基因，151:119-123(1994))。業(yè)內(nèi)熟知確定改變是否可降低金黃色葡萄球菌a-毒素抗原毒性的方法。a-毒素能透化細(xì)胞膜，造成細(xì)胞組份迅速外流。因此，通過習(xí)用染料排斥試驗(yàn)、通過測(cè)量螢光染料(例如碘化丙啶或溴化乙啶)的吸收、或通過測(cè)量ATP滲漏可方便地記錄有核細(xì)胞的孔形成和死亡?？捎糜跍y(cè)量a-毒素毒性的技術(shù)包括光或螢光顯微術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)和螢光測(cè)定術(shù)。伯恩海默(Bernheimer)闡述使用紅細(xì)胞來測(cè)量毒性的溶血分析。(伯恩海默，A.W.，酶學(xué)方法，165:213-217(1988))。測(cè)定溶血效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)程序是將紅細(xì)胞懸浮液添加至經(jīng)連續(xù)稀釋的毒素中。在1小時(shí)內(nèi)于室溫下引發(fā)50%溶胞的稀釋度的倒數(shù)給出溶血單位(HU)數(shù)，其可以每毫克蛋白質(zhì)來表示。在通過添加1體積的2.5%紅細(xì)胞懸浮液(2.5X108細(xì)胞/ml)來評(píng)價(jià)時(shí)，經(jīng)純化a-毒素的比活性在40,000HU/mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)溶血效價(jià)升高并在室溫下保持4小時(shí)后達(dá)到50,000至100,000HU/mg。金黃色葡萄球菌a-毒素抗原與其它分子的結(jié)合不僅降低a-毒素抗原的溶血活性，也使得可誘導(dǎo)對(duì)其它分子的免疫應(yīng)答。實(shí)際上，分子與金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的結(jié)合可改良分子的抗原特征，或提高對(duì)所述分子的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。對(duì)諸如肽和寡糖等低分子量分子來說尤其如此，其自身不能誘導(dǎo)長(zhǎng)期有效的免疫應(yīng)答。因此，金黃色葡萄球菌ci-毒素抗原可用作有效載體蛋白。其是尤其有用的細(xì)菌抗原載體。因此，在本發(fā)明某些實(shí)施例中，使金黃色葡萄球菌a-毒素抗原與另一分子結(jié)合。在一實(shí)施例中，另一分子是另一細(xì)菌抗原，例如細(xì)菌多糖或細(xì)菌糖蛋白。細(xì)菌抗原可為金黃色葡萄球菌抗原或可得自另一種細(xì)菌種類。例示性細(xì)菌抗原包括金黃色葡萄球菌5型、金黃色葡萄球菌8型、金黃色葡萄球菌336、殺白細(xì)胞素(例如，諸如LukS-PV和LukF-PV等帕頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞素(PVL)抗原、諸如HlgA、HlgB和HigC等Y-溶血素亞單位抗原，和其它殺白細(xì)胞素，例如來自金黃色葡萄球菌的LukM和LukF-PV、來自金黃色葡萄球菌的LukE和LukD、來自中間型葡萄球菌的LukS-I和LukF-I)、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、LTA和MSCRAMM。因此，本發(fā)明疫苗可包含a-毒素抗原5型結(jié)合物、a-毒素抗原8型結(jié)合物、a-毒素抗原336型結(jié)合物、a-毒素抗原-PSl結(jié)合物、a-毒素-殺白細(xì)胞素結(jié)合物(例如a-毒素-PVL結(jié)合物)、a-毒素抗原-GPl結(jié)合物、a-毒素-LTA結(jié)合物、或a-毒素-MSCRAMM結(jié)合物。在一實(shí)施例中，另一抗原是保護(hù)性抗原，例如所述抗原可誘導(dǎo)中和抗體。業(yè)內(nèi)存在使金黃色葡萄球菌a-毒素抗原與諸如細(xì)菌抗原等另一分子結(jié)合的方法。例如，可用l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)活化PSl、5型或8型抗原來形成半胱胺衍生物。用N-琥珀酸亞胺-3-(-2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)修飾a-毒素，然后通過硫醇替換使其與PS1的半胱胺衍生物結(jié)合?？赏ㄟ^尺寸排除色譜法將所得結(jié)合物與未結(jié)合抗原分離。在另一實(shí)施例中，通過(例如)以下方法使金黃色葡萄球菌a-毒素抗原與336抗原結(jié)合使用溴化氰或四氟硼酸l-氰基-4-二甲基氨基吡啶鐺活化336抗原上的羥基，并且通過含親核基團(tuán)的連接子或不使用連接子與a-毒素抗原結(jié)合。然后可使所產(chǎn)生結(jié)合物與未結(jié)合抗原分離。在另一實(shí)施例中，通過(例如)以下方法使金黃色葡萄球菌a-毒素抗原與PS1抗原結(jié)合用己二酸二酰肼(ADH)通過EDC易化反應(yīng)修飾PS1以制備PS1的乙二酸二酰肼衍生物(PS"h)。然后使金黃色葡萄球菌a-毒素抗原琥珀?；⑹筧-毒素抗原的琥珀酸衍生物結(jié)合PSUh，此步驟是由EDC介導(dǎo)。其它可用的結(jié)合方法也為所屬領(lǐng)域中所知，例如在高碘酸鹽氧化后實(shí)施還原性胺化、碳化二亞胺處理、和所述方法的組合。所述方法可提供分子與a-毒素載體的直接13或間接(通過連接子》共價(jià)結(jié)合。不論使用何種方法來使分子與(X-毒素載體結(jié)合，分子與載體的共價(jià)結(jié)合都可將分子從T細(xì)胞非依賴性抗原轉(zhuǎn)換為T細(xì)胞依賴性抗原。因此，結(jié)合物將在經(jīng)免疫動(dòng)物中引發(fā)分子特異性抗體應(yīng)答，與單獨(dú)投與所述分子時(shí)無此應(yīng)答形成對(duì)比。本發(fā)明疫苗也可包含醫(yī)藥上可接受的載劑。醫(yī)藥上可接受的載劑是可用作抗原媒劑的材料，因?yàn)樵谝呙缤杜c的情況下所述材料是惰性的或是醫(yī)學(xué)上可接受的，并且與活性劑相容。除適宜賦形劑外，醫(yī)藥上可接受的載劑也可含有習(xí)用疫苗添加劑，例如稀釋劑、佐劑和其它免疫刺激劑、抗氧化劑、防腐劑和增溶劑。例如，可添加聚山梨醇酯80以使聚集最小化并可將其用作穩(wěn)定劑，并且可添加緩沖液來控制pH值。制備疫苗的方法通常為所屬領(lǐng)域中所知。例如，參見迪托馬索(DiTommaso)等人，疫苗(Vaccine),15:1218-24(1997)和費(fèi)托姆(Fattom)等人，感染和免疫(Infect,andImmun.),58:2367-2374(1990)和64:1659-1665(1996)。本文所述的疫苗允許相對(duì)容易地添加佐劑，而不損害組合物的性質(zhì)。另外，本發(fā)明疫苗也可經(jīng)調(diào)配以包括"貯存"組份，從而延長(zhǎng)抗原材料在投與位點(diǎn)的保持。例如，除佐劑(如果使用)夕卜，也可添加明礬(氫氧化鋁或磷酸鋁)、QS-21、硫酸葡聚糖或礦物油來提供此貯存效應(yīng)。如上所述，本發(fā)明疫苗可包含一或多種不同于金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的細(xì)菌抗原。其它細(xì)菌抗原可與金黃色葡萄球菌a-毒素抗原結(jié)合，可作為同一組合物的分開組份與金黃色葡萄球菌a-毒素抗原共同投與，或可作為完全分開的組合物的一部分在投與a-毒素抗原之前、期間或之后投與。在任一情況下，其它細(xì)菌抗原都可為先前所述的抗原之一，例如細(xì)菌多糖或細(xì)菌糖蛋白，包括金黃色葡萄球菌抗原和自其它細(xì)菌種類獲得的抗原。在一實(shí)施例中，其它細(xì)菌抗原為誘導(dǎo)中和抗體的保護(hù)性抗原。因此，其它細(xì)菌抗原可為5型和8型抗原如費(fèi)托姆等人，感染和免疫，58:2367-2374(1990)和費(fèi)托姆等人，感染和免疫，64:1659-1665(1996)中所述。其它細(xì)菌抗原也可為美國(guó)專利第5,770,208號(hào)、第6,194,161號(hào)、第6,537,559號(hào)中所述的金黃色葡萄球菌336抗原，或美國(guó)專利第5,770,208號(hào)和第6,194,161號(hào)中所述的葡萄球菌336抗原，或其抗體。其它金黃色葡萄球菌抗原在業(yè)內(nèi)為人習(xí)知并涵蓋于本發(fā)明中。例如，參見亞當(dāng)斯(Adams)等人，臨床微生物學(xué)雜志(/.C"".M^o&W.)，26:1175-1180(1988);瑞奈克(Rieneck)等人，生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(5Zoc/u'm.A'o;^，A"a.)，1350:128-132(1977);和奧賴爾登(O'Riordan)等人，臨床微生物學(xué)研究(CW打./^v.)，17:218-34(2004)。例如，本發(fā)明涵蓋帕頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞素(PVL)抗原，包括其各個(gè)亞單位LukF-PV和LukS-PV。類似地，本發(fā)明涵蓋表皮葡萄球菌抗原。例如，也稱為PS1的表皮葡萄球菌II型抗原揭示于美國(guó)專利第5,961,975號(hào)和第5，866，140號(hào)中。所述抗原是酸性多糖抗原，其可通過包含生長(zhǎng)可凝集ATCC55254抗血清的表皮葡萄球菌分離菌(II型分離菌)的細(xì)胞的方法來獲得。表皮葡萄球菌GP1抗原闡述于公開的美國(guó)專利申請(qǐng)案第2005/0118190號(hào)中。許多凝固酶陰性葡萄球菌菌株都具有GP1，所述菌株包括表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)和人葡萄球菌(Staphylococcushominis)?？乖勺砸訟TCC202176儲(chǔ)存的表皮葡萄球菌菌株獲得。本發(fā)明涵蓋的另一葡萄球菌抗原闡述于WO00/56357中。此抗原構(gòu)型中包含氨基酸和N-乙?；禾前?，不含O-乙?；⑶也缓禾?。其特異性結(jié)合以ATCC202176儲(chǔ)存的葡萄球菌菌株的抗體?？乖陌被岱治鲲@示絲氨酸、丙氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、纈氨酸和蘇氨酸以約39:25:16:10:7的莫耳比存在。氨基酸構(gòu)成抗原分子的約32重量％?？捎糜诒景l(fā)明的其它抗原包括殺白細(xì)胞素。殺白細(xì)胞素(也稱為(例如)雙組份白細(xì)胞毒素)的種類包括(但不限于)S組份，例如LukS-PV、來自金黃色葡萄球菌的LukM、HlgA(Y-溶血素)、HlgC(Y-溶血素)、來自金黃色葡萄球菌的LukE、LukS-I(來自中間型葡萄球菌)；和F組份，例如LukF-PV、LukF-PV、HlgB(y-溶血素)、來自金黃色葡萄球菌的LukD、和LukF-I(來自中間型葡萄球菌)。本發(fā)明涵蓋使用各種殺白細(xì)胞素中的任一種，包括一或多種本文所述S和F組份。因此，本發(fā)明包括組合物，其包含a-毒素抗原、一或多種其它細(xì)菌抗原和醫(yī)藥上可接受的載劑，其中a-毒素抗原和一或多種其它細(xì)菌抗原可分開提供，或其中a-毒素抗原與一或多種其它細(xì)菌抗原結(jié)合。一實(shí)施例涉及可用于(例如)誘導(dǎo)中和抗體的毒素制劑。例示性抗毒素制劑可包含(i)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原；(ii)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和殺白細(xì)胞素，例如帕頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞素(PVL)抗原；(iii)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和一或多種PVL抗原亞單位，例如LukS-PV或LukF-PV;(i)、(ii)、和(iii)的任一組合、和其它包含a-毒素抗原的毒素制劑。在一具體實(shí)施例中，毒素制劑包含a-毒素和至少一種殺白細(xì)胞素抗原，例如至少一種PVL亞單位或至少一種Y-溶血素亞單位，例如HlgA、HlgB或HlgC。另一實(shí)施例涉及調(diào)理制劑，例如可誘導(dǎo)調(diào)理抗體。例示性調(diào)理制劑可包含a-毒素抗原和一或多種調(diào)理抗原，例如金黃色葡萄球菌5型、8型、或366。調(diào)理制劑也可包含殺白細(xì)胞素抗原，例如PVL抗原或一或多種PVL亞單位，例如LukS-PV或LukF-PV。一具體實(shí)施例提供五價(jià)制劑，其包含a-毒素抗原、殺白細(xì)胞素抗原(例如PVL抗原，例如PVL或一或多種PVL亞單位)、5型抗原、8型抗原、和336抗原。在另一實(shí)施例中提供包括rLukS-PV抗原的五價(jià)抗原組合物。另一實(shí)施例提供五價(jià)制劑，其包含a-毒素抗原、殺白細(xì)胞素抗原(例如一或多種Y-溶血素亞單位抗原，例如HlgA、HlgB或HlgC)、5型抗原、8型抗原和336抗原。在一實(shí)施例中，制劑同時(shí)包含表面抗原和毒素抗原，其可用于(例如)預(yù)防金黃色葡萄球菌感染。此一組合物可包含表面抗原(例如5型和/或8型莢膜抗原和/或表面多糖，例如336抗原)，以及毒素抗原(例如a-毒素抗原(例如rALD/H35K))和/或殺白細(xì)胞素抗原(例如PVL抗原或PVL亞單位(例如LukS-PV)或Y-溶血素亞單位抗原)。在一實(shí)施例中，組合物包含(i)5型-rEPA結(jié)合物，(ii)8型-rEPA結(jié)合物，(iii)336-rEPA結(jié)合物；和(iv)a-毒素抗原rALD/H35K。在另一實(shí)施例中，組合物包含(i)5型-rEPA結(jié)合物，(ii)8型-rEPA結(jié)合物，(iii)336-rEPA結(jié)合物;(iv)a-毒素抗原rALD/H35K禾P(v)rLukS-PV。在另一實(shí)施例中，組合物包含(i)5型-rEPA結(jié)合物，(ii)8型-rEPA結(jié)合物，(iii)336-rEPA結(jié)合物;(iv)a-毒素抗原rALD/H35K禾口(v)—或多種Y-溶血素亞單位抗原，例如HIgA、HIgB或HlgC。已發(fā)現(xiàn)某些抗原對(duì)與其它抗原相關(guān)的感染具有交叉反應(yīng)性和交叉中和性。因此，例如，PVL亞單位抗原，例如LukS-PV或LukF-PV可誘導(dǎo)能中和與另一殺白細(xì)胞素(Y-溶血素)相關(guān)感染的抗體。反的，Y-溶血素抗原(例如HlgA、HlgB禾n/或HlgC)可誘導(dǎo)能中和與PVL相關(guān)的感染的抗體。因此，本發(fā)明一方面包括包含一或多種PVL亞單位抗原的組合物，其可用于(例如)抵抗Y-溶血素感染。本發(fā)明另一方面包括包含一或多種Y-溶血素抗原(例如HlgA、HlgB或HlgC)的組合物，其可用于(例如)抵抗PVL感染。因此，本發(fā)明包括包含一種類型抗原的組合物，其可用于抵抗與不同的交叉反應(yīng)性抗原相關(guān)的感染。用疫苗組合物治療和預(yù)防感染本發(fā)明也提供通過對(duì)有需要的個(gè)體投與任一上述疫苗來治療或預(yù)防感染的方法。本文所述治療和預(yù)防方法的目標(biāo)個(gè)體群體包括經(jīng)細(xì)菌病原(例如金黃色葡萄球菌)感染或有感染風(fēng)險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物，例如人類。在某些實(shí)施例中，欲治療或預(yù)防的感染與耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌相關(guān)。在具體實(shí)施例中，耐甲氧苯青霉素的金黃色葡疫苗可與其它抗原聯(lián)合投與，如上文所述。其它例示性抗原包括金黃色葡萄球菌莢膜多糖抗原(例如5型、8型、和336抗原)和其它所屬領(lǐng)域中已知的金黃色葡萄球菌。其它例示性抗原也包括表皮葡萄球菌抗原(例如PS1抗原或GP1抗原)和其它葡萄球菌抗原，例如WO00/56357中所述抗原。其它例示性抗原包括殺白細(xì)胞素，例如帕頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞素(PVL)抗原(例如LukS-PV和LukF-PV)、Y-溶血素亞單位抗原(例如HlgA、HlgB禾BHlgC)，和其它殺白細(xì)胞素，例如來自金黃色葡萄球菌的LukM和LukF-PV、來自金黃色葡萄球菌的LukE和LukD、和來自中間型葡萄球菌的LukS-I和LukF-I。如上所述，一或多種其它抗原可與金黃色葡萄球菌a-毒素抗原疫苗組合物分開投與，或可包括于金黃色葡萄球菌a-毒素抗原疫苗組合物中。鑒于上述某些抗原具有交叉反應(yīng)性和交叉中和活性，本發(fā)明包括通過投與包含一種抗原的疫苗來中和與不同交叉反應(yīng)性抗原相關(guān)的感染的方法。例如，本發(fā)明包括使用包含Y-溶血素抗原(例如HlgA、HlgB禾卩/或HlgC)的疫苗來中和PVL感染的方法，以及使用包含PVL亞單位抗原(例如LukF-PV和LukS-PV)的疫苗來中和Y-溶血素感染的方法。本發(fā)明疫苗的治療或預(yù)防有效量可通過業(yè)內(nèi)常規(guī)方法來確定。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可認(rèn)識(shí)到，所述量可隨疫苗組成、具體個(gè)體的特征、所選投與途徑以及所治療或預(yù)防的16細(xì)菌感染的性質(zhì)而變化。一般性指導(dǎo)可見(例如)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(theInternationalConferenceonHarmonization)的出版物以及雷明頓醫(yī)藥科學(xué)(REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES)(馬克印刷公司(MackPublishingCompany)1990)。典型疫苗劑量可在1昭至400昭抗原之間。疫苗可與或不與佐劑一起投與。若使用佐劑，則佐劑應(yīng)經(jīng)選擇以便避免佐劑誘導(dǎo)毒性。例如，本發(fā)明疫苗可包含如美國(guó)專利第6,355,625號(hào)所述P-葡聚糖，或粒細(xì)胞集落刺激因子。疫苗可以任何期望劑型投與，包括可經(jīng)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下投與人類的劑型。疫苗可以單次劑量或根據(jù)多次給藥方案投與?？梢匀我粩?shù)量的途徑投與，包括皮下、皮內(nèi)和靜脈內(nèi)。在一實(shí)施例中，使用肌內(nèi)投與。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可認(rèn)識(shí)到，投與途徑可根據(jù)待治療或預(yù)防的細(xì)菌感染和疫苗的組成而變化。在組合療法中，疫苗可與抗感染劑、抗生素和/或抗微生物劑一起投與。例示性抗感染劑包括(但不限于)萬古霉素和溶葡萄球菌素。例示性抗生素和抗微生物劑包括(但不限于)耐青霉素酶的青霉素(penicimn)、頭孢菌素(cephalosporin)和碳青霉烯類(carbapenems)，包括萬古霉素、溶葡萄球菌素、青霉素G、氨芐西林(ampicillin)、苯唑西林(oxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、氯唑西林(cloxacilUn)、雙氯西林(dicloxacillin)、頭孢菌素(cephalothin)、頭孢唑林(cefazolin)、頭孢力新(cephalexin)、頭孢霉定(c印hradine)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢西丁(cefoxitin)、亞胺培南(imipenem)、美羅培南(meropenem)、正大霉素(gentamycin)、替考拉寧(teicoplanin)、林可霉素(lincomycin)和氯林肯霉素。這些抗生素的劑量為所屬—領(lǐng)域中所知。例如，參見默克診斷和治療手冊(cè)(MERCKMANUALOFDIAGNOSISANDTHERAPY),§13，第157章，第100版(比爾斯(Beers)和伯科(Berkow)編輯，2004)。抗感染劑、抗生素和/或抗微生物劑可于投與前組合，或可與疫苗組合物同時(shí)或依序投與?？贵w本發(fā)明另外提供包含特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的抗體("a-毒素抗體")和特異性結(jié)合另一細(xì)菌抗原的抗體("細(xì)菌抗原抗體")的組合物。金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和另一細(xì)菌抗原可為任何天然存在的a-毒素或另一細(xì)菌抗原，或可為任一上述抗原?？贵w可為單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段或其任一組合?？贵w可與醫(yī)藥上可接受的載劑一起調(diào)配。本文所用術(shù)語"抗體"是指全長(zhǎng)(即天然存在的或通過標(biāo)準(zhǔn)免疫球蛋白基因片段重組方法形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特異性結(jié)合)部分，包括抗體片段。本文所用"抗體"與"免疫球蛋白"同義。抗體片段是抗體的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、sFv等。無論結(jié)構(gòu)如何，抗體片段都與全長(zhǎng)抗體可識(shí)別的同一抗原結(jié)合，并且在本發(fā)明上下文中特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌a-毒素抗原或另一細(xì)菌抗原。制備和篩選抗體片段的方法在業(yè)內(nèi)為人所熟知。本發(fā)明的a-毒素抗體或細(xì)菌抗原抗體可通過多種不同方法來制備。例如，抗體可自經(jīng)投與金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和/或細(xì)菌抗原的個(gè)體獲得?？贵w也可自經(jīng)針對(duì)a-毒素抗體和/或細(xì)菌抗原抗體篩選的血漿獲得，其在下文中有更詳細(xì)的論述。在某些實(shí)施例中，抗體可通過重組方法來制備。制備重組單克隆抗體的方法在業(yè)內(nèi)為人習(xí)知。重組多克隆抗體可通過與美國(guó)專利申請(qǐng)案第2002/0009453號(hào)(赫若姆(Haurum)等人)中所闡述者類似的方法使用金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和/或細(xì)菌抗原作為免疫原來產(chǎn)生。本發(fā)明的(x-毒素抗體或細(xì)菌抗原抗體可為鼠類、人類或人化抗體。人化抗體是其中抗體CDR來自一個(gè)物種的重組蛋白；例如，將嚙齒動(dòng)物、兔、狗、山羊、馬、或雞抗體(或任何其它適宜動(dòng)物抗體)自嚙齒動(dòng)物抗體的可變重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)移至人類重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中。抗體分子的恒定結(jié)構(gòu)域衍生自人類抗體的恒定結(jié)構(gòu)域。制備人化抗體的方法已為所屬領(lǐng)域中所熟知?？赏ㄟ^習(xí)用方法來獲得上述抗體。例如，可將a-毒素抗原和/或其它細(xì)菌抗原投與個(gè)體并通過標(biāo)準(zhǔn)方法由自所述個(gè)體采集的血槳純化所得IgG。用于獲得抗體的抗原可為任何天然存在的抗原、任何上述抗原、或所屬領(lǐng)域中已知的任何其它抗原。在一實(shí)施例中，根據(jù)上述教示使得用于獲得a-毒素抗體的金黃色葡萄球菌a-毒素抗原為無毒的?？贵w組合物本發(fā)明包括適合投與的抗體組合物，例如包含抗體和醫(yī)藥上可接受的載劑的組合物?？贵w組合物可通過所屬領(lǐng)域中已知的方法經(jīng)調(diào)配用于任何投與途徑，包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和經(jīng)皮。在一實(shí)施例中，抗體組合物提供治療或預(yù)防有效量的抗體，即足以達(dá)成治療或預(yù)防有益作用的量。在另一實(shí)施例中，抗體是保護(hù)性抗體組合物，其中和感染和/或提供抗感染的保護(hù)作用。在一實(shí)施例中，抗體組合物是IVIG組合物。如本文所用，"IVIG"是指適于靜脈內(nèi)投與的免疫球蛋白組合物。除免疫球蛋白外，IVIG組合物也可含有醫(yī)藥上可接受的載劑。IVIG組合物可為"特異性IVIG"，意指IVIG含有特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和/或其它期望細(xì)菌抗原(如上所述)的免疫球蛋白。IVIG組合物也可為"超免疫特異性IVIG"。"超免疫特異性IVIG"是指包含高效價(jià)的a-毒素抗體的抗體制劑。超免疫特異性IVIG制劑可由已受目標(biāo)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和/或其它期望細(xì)菌抗原攻擊的個(gè)體的血漿來制備，或可通過對(duì)尚未投與抗原的個(gè)體的血漿進(jìn)行高抗體效價(jià)篩選來獲得。在每一種情況下，個(gè)體都可為人類或動(dòng)物。在一實(shí)施例中，特異性IVIG組合物既包含特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌a-毒素抗原(和視情況中和a-毒素抗原)的抗體也包含特異性結(jié)合其它細(xì)菌抗原(和視情況中和其它細(xì)菌抗原)的抗體?？贵w和抗原可為先前所述抗體和抗原中的任一種。例如，其它細(xì)菌抗原可為多糖并且可為糖蛋白，包括金黃色葡萄球菌5型、金黃色葡萄球菌8型、金黃色葡萄球菌336、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、殺白細(xì)胞素組18份(例如PVL(包括各個(gè)PVL亞單位LukS-PV和LukF-PV)、Y-溶血素亞單位(HlgA、HlgB和HlgC)、來自金黃色葡萄球菌的LukE或LukD、來自金黃色葡萄球菌的LukM或LukF'-PV、來自中間型葡萄球菌的LukF-I或LukS-I亞單位)、脂磷壁酸(LTA)和識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組份(MSCRAMM)蛋白。一實(shí)施例涉及抗毒素制劑。例示性抗毒素制劑可包含(i)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的抗體；(ii)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的抗體和特異性結(jié)合殺白細(xì)胞素(例如帕頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞素(PVL))抗原的抗體；(iii)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的抗體和特異性結(jié)合殺白細(xì)胞素亞單位抗原(例如PVL抗原亞單位)的抗體，例如特異性結(jié)合LukS-PV或LukF-PV的抗體；(i)、(ii)和(iii)的任一組合，和其它包含特異性結(jié)合ci-毒素抗原的抗體的抗毒素制劑。在一具體實(shí)施例中，抗毒素制劑包含特異性結(jié)合a-毒素的抗體和特異性結(jié)合PVL、LukS-PV或LukF-PV或特異性結(jié)合另一殺白細(xì)胞素(例如Y-溶血素亞單位，例如HlgA、HlgB或HlgC)的抗體。另一實(shí)施例涉及調(diào)理抗體制劑，其包含調(diào)理抗體。例示性調(diào)理抗體制劑可包含特異性結(jié)合a-毒素抗原的抗體和一或多種調(diào)理抗體，例如特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌5型、8型或366的抗體。調(diào)理抗體制劑也可包含特異性結(jié)合殺白細(xì)胞素抗原(例如PVL抗原)的抗體，或特異性結(jié)合一或多種PVL亞單位(例如LukS-PV或LukF-PV)的抗體，或特異性結(jié)合Y-溶血素亞單位(例如HlgA、HlgB或HlgC)的抗體。一具體實(shí)施例提供五價(jià)制劑，其包含特異性結(jié)合a-毒素抗原結(jié)合的抗體，特異性結(jié)合殺白細(xì)胞素抗原(例如PVL抗原(例如PVL或一或多種PVL亞單位)或y-溶血素亞單位(例如HlgA、HlgB或HlgC))的抗體，特異性結(jié)合5型抗原的抗體，特異性結(jié)合8型抗原的抗體，和特異性結(jié)合336抗原的抗體。因此，某些實(shí)施例提供包含具中和性(例如抗a-毒素抗體)和/或調(diào)理性(例如抗莢膜或表面抗原的抗體)的單克隆和/或多克隆抗體的組合物。一種組合物包含特異性結(jié)合5型抗原單克隆和/或多克隆抗體、特異性結(jié)合8型抗原的抗體、特異性結(jié)合336抗原的抗體和特異性結(jié)合a-毒素抗原rALD/H35K的抗體。另一組合物特異性結(jié)合5型抗原的包含單克隆和/或多克隆抗體、特異性結(jié)合8型抗原的抗體、特異性結(jié)合336抗原的抗體、特異性結(jié)合a-毒素抗原的抗體和特異性結(jié)合rLukS-PV的抗體。。另一組合物包含特異性結(jié)合5型抗原的單克隆和/或多克隆抗體、特異性結(jié)合8型抗原的抗體、特異性結(jié)合336抗原的抗體、特異性結(jié)合a-毒素抗原的抗體和特異性結(jié)合丫-溶血素亞單位(例如HlgA、HlgB或HlgC)的抗體。另一實(shí)施例涉及具交叉反應(yīng)性，交叉中和性的抗體組合物。例如，本發(fā)明包括包含對(duì)一種抗原具特異性并且對(duì)另一抗原具有交叉反應(yīng)性和交叉中和性的抗體的組合物。例如，本發(fā)明包括包含對(duì)Y-溶血素抗原(例如HlgA、HlgB禾卩/或HlgC)具有特異性的抗體的組合物，其可用于(例如)抵抗PVL感染，并且包括包含對(duì)PVL亞單位抗原(例如LukF-PV和LukS-PV)具有特異性的抗體的組合物，其可用于抵抗Y-溶血素感染。如上所述，本發(fā)明提供抗體組合物，其提供抗體的治療或預(yù)防有效量，即足以達(dá)成治療或預(yù)防有益效應(yīng)的量。在另一實(shí)施例中，抗體是保護(hù)性抗體組合物，其可中和感染和/或提供抵抗感染的保護(hù)作用。所述保護(hù)性組合物可包括保護(hù)量的a-毒素抗體和保護(hù)量的抵抗另一細(xì)菌抗原的抗體?；蛘?，保護(hù)性抗體組合物可包含次優(yōu)量的抗a-毒素抗體和次優(yōu)量的抵抗另一細(xì)菌抗原的抗體。本文所用"次優(yōu)"(sub-optimal)量意指自身不具有保護(hù)性的量，即自身不能有效中和感染或提供抗感染保護(hù)的量。雖然這些組合物所包含抗體量自身無效，卻可通過各抗體組合的協(xié)同活性來中和感染和/或提供抵抗感染的保護(hù)作用。在一具體實(shí)施例中，組合物包含次優(yōu)量的抗a-毒素抗體和次優(yōu)量的金黃色葡萄球菌5型抗體。在另一具體實(shí)施例中，組合物包含次優(yōu)量的抗a-毒素抗體和次優(yōu)量的金黃色葡萄球菌8型抗體。制備IVIG組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明也提供制備包括特異性IVIG組合物和超免疫IVIG組合物在內(nèi)的IVIG組合物的方法。任一上述抗原組合物都可用于制備IVIG組合物。在一實(shí)施例中，通過以下方法制備IVIG組合物:對(duì)個(gè)體投與金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和其它細(xì)菌抗原，然后自所述個(gè)體采集血漿并自血漿純化免疫球蛋白d金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和其它細(xì)菌抗原可為任一上述抗原，包括野生型抗原，和可誘導(dǎo)中和抗體的保護(hù)性抗原，并且可將其調(diào)配于任一上述疫苗中。因此，其它細(xì)菌抗原可為多糖并且可為糖蛋白，并且在一實(shí)施例中選自下列抗原金黃色葡萄球菌5型、金黃色葡萄球菌8型、金黃色葡萄球菌336、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、殺白細(xì)胞素類(例如殺白細(xì)胞素組份，例如帕頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞素(PVL)抗原(例如LukS-PV和LukF-PV)、Y-溶血素亞單位抗原(例如HlgA、HlgB和HlgC)、和其它殺白細(xì)胞素(例如來自金黃色葡萄球菌的LukM和LukF'-PV、來自金黃色葡萄球菌的LukE或LukD、來自中間型葡萄球菌的LukS-I和LukF-I))、脂磷壁酸(LTA)和識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組份(MSCRAMM)蛋白。細(xì)菌抗原可與金黃色葡萄球菌a-毒素抗原結(jié)合。在一實(shí)施例中，相對(duì)于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素，金黃色葡萄球菌a-毒素抗原含有至少兩處可降低其毒性的改變，如上所述。受到抗原(例如金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和其它細(xì)菌抗原)攻擊或投與的個(gè)體可為人類或可為另一動(dòng)物，例如小鼠、兔、大鼠、雞、馬、狗、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物或任一其它適宜動(dòng)物。特異性結(jié)合抗原的抗體可通過習(xí)用血漿分級(jí)分離方法自動(dòng)物血漿獲得。在另一實(shí)施例中，IVIG組合物是通過以下方法來制備篩選尚未投與抗原的個(gè)體，例如尚未投與金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和另一細(xì)菌抗原的個(gè)體(即未受到刺激的個(gè)體)，然后自所述個(gè)體采集血漿并自血漿采集免疫球蛋白。在此實(shí)施例中，對(duì)來自未經(jīng)刺激個(gè)體的血漿進(jìn)行高效價(jià)抗體篩選，所述抗體特異性結(jié)合抗原，例如金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和其它細(xì)菌抗原。抗原可為任一上述抗原。例如，其它細(xì)菌20抗原可為多糖并且可為糖蛋白，并且可選自金黃色葡萄球菌5型、金黃色葡萄球菌8型、金黃色葡萄球菌336、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、殺白細(xì)胞素(例如PVL(包括各個(gè)PVL亞單位，LukS-PV和LukF-PV)或Y-溶血素亞單位(HlgA、HlgB或HlgC)、來自金黃色葡萄球菌的LukE或LukD、來自金黃色葡萄球菌的LukM或LukF-PV、來自中間型葡萄球菌的LukF-I或LukS-I亞單位)、脂磷壁酸(LTA)和識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組份(MSCRAMM)蛋白。根據(jù)一實(shí)施例，篩選a-毒素抗體和/或其它細(xì)菌抗體效價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)IVIG制劑中常見效價(jià)的2倍或更高、3倍或更高、4倍或更高、或5倍或更高的血槳。同樣，待篩選個(gè)體可為人類或可為另一動(dòng)物，例如小鼠、兔、大鼠或非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物。免疫球蛋白可通過習(xí)用血槳分級(jí)分離方法自動(dòng)物血漿獲得。用抗體組合物治療和預(yù)防感染本發(fā)明也提供治療或預(yù)防感染的方法，其是通過對(duì)有需要的個(gè)體投與上述抗體組合物(例如上述IVIG組合物)來達(dá)成。治療和預(yù)防感染的目標(biāo)患者群體包括感染細(xì)菌病原菌或有感染風(fēng)險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物，例如人類。在一實(shí)施例中，待治療或預(yù)防的感染是金黃色葡萄球菌感染，包括耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌或產(chǎn)生a-毒素的金黃色葡萄球菌的感染或表皮葡萄球菌感染。根據(jù)一實(shí)施例，本發(fā)明提供使用包含金黃色葡萄球菌a-毒素抗體、特異性結(jié)合另一金黃色葡萄球菌抗原的抗體、和醫(yī)藥上可接受的載劑的組合物治療或預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的方法。金黃色葡萄球菌a-毒素抗體和結(jié)合另一金黃色葡萄球菌抗原的抗體可為任一上述抗體。在一實(shí)施例中，抗體組合物是IVIG組合物或超免疫特異性IVIG組合物。在另一實(shí)施例中，抗體是重組或人化抗體。在另一實(shí)施例中，抗體為單克隆抗體。鑒于上述某些抗原具有交叉反應(yīng)性和交叉中和活性，本發(fā)明包括中和與一種抗原相關(guān)的感染的方法，其是通過投與包含對(duì)與第一抗原交叉反應(yīng)和交叉中和的不同抗原具有特異性的抗體的抗體組合物(包括IVIG組合物)來達(dá)成。例如，本發(fā)明包括使用包含Y-溶血素抗原(例如HlgA、HlgB和/或HlgC)特異性抗體的抗體組合物或IVIG來中和PVL感染的方法，以及使用包含PVL亞單位抗原(例如LukF-PV和LukS-PV)特異性抗體的抗體組合物或IVIG來中和Y-溶血素感染的方法?？贵w組合物的治療或預(yù)防有效量可通過業(yè)內(nèi)常規(guī)方法來確定。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可了解，所述量可根據(jù)組合物中具體抗體、組合物中抗體含量、投與頻率、待治療或預(yù)防的感染的嚴(yán)重性、和個(gè)體細(xì)節(jié)(例如年齡、體重和免疫情況)來改變。在某些實(shí)施例中，劑量可為至少50mgIVIG組合物/kg體重(mg/kg)，包括至少100mg/kg、至少150mg/kg、至少200mg/kg、至少250mg/kg、至少500mg/kg、至少750mg/kg和至少1000mg/kg。單克隆抗體組合物的劑量通常較低，例如是IVIG組合物劑量的1/10，例如至少約5mg/kg、至少約10mg/kg、至少約15mg/kg、至少約20mg/kg、或至少約25mg/kg。投與途徑可為適合滅活疫苗的任一途徑。因此，可想到靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)和其它投與途徑。如上所述，抗體的治療或預(yù)防有效量是足以達(dá)成治療或預(yù)防有益效應(yīng)的量。保護(hù)性抗體組合物可中和和/或預(yù)防感染。保護(hù)性抗體組合物可包含自身不具有保護(hù)作用但在組合時(shí)可產(chǎn)生保護(hù)性抗體組合物的量的抗a-毒素抗體和/或抵抗另一細(xì)菌抗原的抗體。在組合療法中，抗體組合物可與抗感染劑、抗生素和/或抗微生物劑一起投與。例示性抗感染劑包括(但不限于)萬古霉素和溶葡萄球菌素。例示性抗生素和抗微生物劑包括(但不限于)耐青霉素酶的青霉素、頭孢菌素和碳青霉烯類，包括萬古霉素、溶葡萄球菌素、青霉素G、氨芐西林、苯唑西林、萘夫西林、氯唑西林、雙氯西林、頭孢菌素、頭孢唑林、頭孢力新、頭孢霉定、頭孢孟多、頭孢西丁、亞胺培南、美羅培南、正大霉素、替考拉寧、林可霉素和氯林肯霉素。這些抗生素的劑量為所屬領(lǐng)域中所知。例如，參見默克診斷和治療手冊(cè)，§13，第157章，第100版(比爾斯和伯科編輯，2004)。抗感染劑、抗生素和/或抗微生物劑可在投與之前組合，或與IVIG組合物同時(shí)或依序投與。在某些實(shí)施例中，投與相對(duì)少劑量的抗體組合物，例如一或兩劑，并且采用習(xí)用抗生素療法，其通常涉及于數(shù)天或數(shù)周內(nèi)投與多份劑量。因此，可在一段時(shí)間內(nèi)(例如在至少5天、IO天或甚至14天或更多天內(nèi))一次、兩次或三次或多次投用抗生素，而抗體組合物通常僅投與一次或兩次。然而，熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可選擇并調(diào)節(jié)抗體組合物和抗生素的不同劑量、投藥時(shí)間和相對(duì)量。以下實(shí)例僅為闡釋性而非限制性，并且提供對(duì)本發(fā)明的更全面理解。實(shí)例1此實(shí)例說明大腸桿菌(Escherichiacoli.)中重組a—毒素突變體ALD/H35K(rALD/H35K)的克隆和表達(dá)。rALD/H35K含有氨基閥缺失(ALD)和在氨基酸35位上的點(diǎn)突變(由組氨酸到賴氨酸)(H35K)。無組氨酸-6-標(biāo)記的重組a-毒素突變蛋白rALD/H35K的表達(dá)構(gòu)建體是根據(jù)下文來制備。用預(yù)先制備的經(jīng)組氨酸標(biāo)記的構(gòu)建體pTrcHis-ALD/H35K對(duì)ALD/H35K基因?qū)嵤㏄CR擴(kuò)增。引物經(jīng)設(shè)計(jì)而去除組氨酸標(biāo)記并分別在氨基和羧基末端納入Ncol和BamHI限制位點(diǎn)。在擴(kuò)增和限制酶切消化后，在Ncol和BamHI限制位點(diǎn)處將ALD/H35K基因連接入英杰(Invitrogen)pTrcHisB載體。通過使用Ncol限制位點(diǎn)的ATG來啟動(dòng)轉(zhuǎn)譯，去除載體編碼的組氨酸標(biāo)記和腸激酶裂解位點(diǎn)。結(jié)果是表達(dá)無額外N末端氨基酸的蛋白質(zhì)。使用NcoI和BamHI對(duì)pTrcffis-B實(shí)施雙限制酶切消化。然后使用PCR反應(yīng)來產(chǎn)生無His6標(biāo)記的雙突變體ALD/H35K。PCR反應(yīng)的引物是ALD-F(5'-GGCAGCATGCCATGGCAAATACTACAGTAAAAAC-3')(SEQIDNO:1)禾口AGO-2(5'-GGAATTCGTGGATCCTTAATTTGTCATTTCTTC-3')(SEQIDNO:2)。在PCR后，實(shí)施瓊脂糖凝膠電泳。在分析并拍攝凝膠后，將凝膠置于UV透射儀上并切除載體和插入片段(PCR產(chǎn)物)。使用基質(zhì)凝膠提取系統(tǒng)自瓊脂糖片層中提取載體和插入片段。對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)施乙酸銨/乙醇沉淀，之后使用NcoI和BamHI對(duì)凝膠提取插入片段實(shí)施雙限制酶切消化。然后對(duì)經(jīng)消化插入片段實(shí)施二氧化硅樹脂純化。根據(jù)基因選擇(Genechoice)TM快速連接試劑盒(RapidLigationKk)上的操作指示連接載體與插入片段。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入GC10感受態(tài)高效細(xì)胞中，所述細(xì)胞在轉(zhuǎn)化板上生長(zhǎng)。然后通過"菌落PCR"實(shí)施篩選。生長(zhǎng)產(chǎn)生適當(dāng)大小擴(kuò)增子(約800bp)的菌落的過夜培養(yǎng)物。制備優(yōu)良無性系的珠粒原液和小量制劑。對(duì)小量制劑實(shí)施限制性酶消化分析并出于測(cè)序目的對(duì)所述小量制劑實(shí)施定量。使用以下四種引物實(shí)施測(cè)序pTrcffis-正向(5'-GAGGTATATATTAATGTATCG-3')(SEQIDNO:3)、正向-1(5'-GGTACCATTGCTGG-3')(SEQIDNO:4)、正向-2(5'-CGATTGGTCATACACTG-3')(SEQIDNO:5)和正向-3(5'-CCAGACTTCGCTAC-3')(SEQIDNO:6)。測(cè)序檢驗(yàn)插入片段的正確DNA序列。也自珠粒原液生長(zhǎng)培養(yǎng)物并且在細(xì)胞溶解后通過SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)。rALD/H35Ka-毒素突變體的可溶性過度表達(dá)得到證實(shí)。實(shí)例2此實(shí)例闡述構(gòu)建缺少來自金黃色葡萄球菌的野生型a-毒素的毒性或溶血活性的a-毒素突變體。構(gòu)建His35取代/缺失、氨基閥缺失(ALD)和干缺失(SDD)突變體以裂解七聚孔。據(jù)信這些區(qū)域在孔形成中具有關(guān)鍵作用。制備突變體作為重組蛋白，并且是通過PCR克隆技術(shù)來構(gòu)建。然后用IPTG誘導(dǎo)突變體來表達(dá)蛋白，并評(píng)價(jià)所述突變體的毒性/溶血活性。使用普洛麥格(Promega)的WizardTM基因組DNA純化試劑盒自金黃色葡萄球菌伍德(Wood)46菌株來純化基因組DNA。使用下表1和2中列出的引物組合來實(shí)施PCR。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>然后對(duì)PCR擴(kuò)增DNA片段和pTrcffisB載體DNA實(shí)施雙限制酶切消化，之后對(duì)經(jīng)消化DNA實(shí)施乙酸銨和乙醇沉淀。連接經(jīng)限制酶切消化和乙醇沉淀的插入片段和載體DNA，并且用經(jīng)連接DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞并使其在瓊脂板上生長(zhǎng)。然后挑取菌落并制備質(zhì)粒制劑。然后用BamHI和NcoI酶消化質(zhì)粒并在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行以篩選重組體。自重組體制備珠粒原液并測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與野生型a-毒素的序列匹配，并證明存在期望突變。也對(duì)突變體實(shí)施IPTG誘導(dǎo)和表達(dá)。突變體以可溶和不溶形式以不同方式表達(dá)。通過SDS-PAGE來確認(rèn)表達(dá)。實(shí)例3此實(shí)例闡述無his標(biāo)記的rALD/H35Ka類毒素的純化和定性。用溶菌酶裂解含有表達(dá)質(zhì)粒并且經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)rALD/H35Ka類毒素的細(xì)胞。然后用脫氧膽酸(DOC)溶解細(xì)胞膜。然后通過超聲波處理降低細(xì)胞裂解物的粘度，之后用Dnase和Rnase酶來消化DNA/RNA。通過離心去除細(xì)胞碎片，并且傾析出含有o類毒素的上清液用于進(jìn)一步處理。使用填充有ToyopeariTM苯基(Phenyl)650M樹脂的柱對(duì)上清液實(shí)施色譜。使用考馬斯(Coomassie)染色方法通過SDS-PAGE分析苯基650柱流份，并且對(duì)根據(jù)a類毒素的純度和量選擇的經(jīng)匯集流份實(shí)施透析過濾。使用填充有安瑪西亞汽巴克隆藍(lán)色速流(AmershamCibacronBlueFastFlow)TM樹脂的柱進(jìn)一步實(shí)施色譜。再次通過SDS-PAGE分析柱流份，并對(duì)根據(jù)a類毒素的純度和量選擇的經(jīng)匯集流份再次實(shí)施透析過濾。再使用填充有陶瓷羥基磷灰石(CHT)的柱實(shí)施色譜。通過SDS-PAGE分析來自CHT柱的流份，并根據(jù)流份中的a類毒素純度和量匯集所選流份。整個(gè)純化過程概述于下文中。用溶菌酶實(shí)施細(xì)胞壁消化用脫氧膽酸實(shí)施細(xì)胞膜溶解通過超聲波處理降低粘度■■.+-用DNase禾BRNase消化DNA/RNA將硫酸銨濃度調(diào)節(jié)至1.5M通過離心實(shí)施澄清4—用苯基650M實(shí)施色譜實(shí)施緩沖液更換并用汽巴克隆藍(lán)色速流(CibacronBlueFastFlow)實(shí)施色譜實(shí)施緩沖液更換并用陶瓷羥基磷灰石實(shí)施色譜通過BCA、SDS-PAGE和尺寸排除色譜法確認(rèn)蛋白含量、純度和分子量。用蛋白質(zhì)印跡法和N末端測(cè)序鑒定rALD/H35Ka類毒素。夾心式ELISA顯示，純化過程獲得12%的rALD/H35Ka類毒素的回收率。對(duì)rALD/H35Ka類毒素實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)溶血分析顯示所述類毒素不具有溶血活性。實(shí)例4此實(shí)例闡述對(duì)用作制備PS蛋白結(jié)合物的載體蛋白的ot-毒素的純化和定性。構(gòu)建H35K/ALD(rALD/H35K)雙突變體并在大腸桿菌中過度表達(dá)。首先使用Ni-NTA(填充鎳)親和柱純化突變體，然后通過使用陶瓷羥基磷灰石柱實(shí)施進(jìn)一步純化。通過免疫擴(kuò)散和溶血活性評(píng)估a-毒素的抗原性和毒性。通過B-PER利用Benzonase和PMSF裂解大腸桿菌細(xì)胞。實(shí)施離心并收集上清液。使用Ni-NTA柱實(shí)施色譜并通過SDS-PAGE分析收集到的流份。匯集a-毒素流份并通過BCA蛋白分析法來分析總蛋白。使用HTP柱通過色譜進(jìn)一步純化經(jīng)Ni-NTA純化的a-毒素并通過SDS-PAGE再次分析所收集流份。然后匯集含a-毒素流份，濃縮并分析。所述純化過程概述于下26文中。重組a-毒素H35K/ALD突變體蛋白純化圖細(xì)胞漿液(20g)細(xì)胞裂解iNi-NTA親和柱(匯集第24-34號(hào)流份)5K-TFF透析過濾夜更換)親和柱)第44-52號(hào)5K或10K攪拌細(xì)胞濃度最終經(jīng)純化重組a-毒素通過免疫擴(kuò)散測(cè)試經(jīng)純化a-毒素突變體的同一性和抗原性。也對(duì)a-毒素突變體實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)溶血分析，并表明所述突變體不具有可檢測(cè)到的溶血活性。實(shí)例5此實(shí)例闡述可通過投與埃爾塔斯蒂夫(AltaStaph)以及所獲得可抵抗重組ALD/H35Ka-類毒素突變體的a-毒素特異性抗體來達(dá)成針對(duì)高a-毒素產(chǎn)量金黃色葡萄球菌分離菌的協(xié)同被動(dòng)保護(hù)作用。埃爾塔斯蒂夫TM(納比生物制藥公司(Na1^Biopharmaceuticals),羅克韋爾(RockviUe)，馬里蘭州(Maryland))含有高含量的抵抗金黃色葡萄球菌莢膜多糖5型和8型抗原的抗體。埃爾塔斯蒂夫TM是通過用包含莢膜多糖金黃色葡萄球菌5型和8型抗原的斯蒂夫VAX(納比⑧生物制藥公司，羅克韋爾，馬里蘭州)免疫健康人類志愿者來產(chǎn)生。目前生產(chǎn)的埃爾塔斯蒂夫TM是pH為6.2且存于0.075氯化鈉、0.15M甘氨酸和0.01%聚山梨醇酯80中的無菌可注射5%人類血漿蛋白溶液。每lmL溶液含有50mg蛋白，其中超過96%的蛋白是IgG免疫球蛋白。IgA和IgM類是以Sl.Og/L部分iiBioRad-HTP1柱純化(緩沖iBioRad-H'(匯集三次運(yùn)27的濃度存在。將80只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)置于干凈籠中并于研究開始前隔離6天。在細(xì)菌攻擊前24小時(shí)，將抗體劑量投與至每組IO只小鼠的腹膜腔內(nèi)?；诟骺贵w治療的組名稱闡述于表3中。表3(基于抗體治療的研究組名稱)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>金黃色葡萄球菌5型328分離菌是高a毒素產(chǎn)量分離菌，在37。C下經(jīng)約20小時(shí)在10mL哥倫比亞(Columbia)Mg/CaCl2培養(yǎng)基中以200rmp恒定振蕩使其生長(zhǎng)過夜。第二天，使細(xì)菌在PBS中懸浮至在540nm下O.D.為0.1。此O.D.表示約2x107CFU/ml的濃度，之后以25mL總體積將其連續(xù)調(diào)節(jié)至約2xl(^CFU/ml。將經(jīng)稀釋細(xì)菌懸浮液置于冰上，準(zhǔn)備與新制備的豬粘蛋白一起實(shí)施細(xì)菌攻擊。在室溫下經(jīng)5至10分鐘恒定攪拌將5克豬粘蛋白溶解于50mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。在混合后，以未包裹循環(huán)將懸浮液高壓蒸汽滅菌IO分鐘，將懸浮液用冰冷卻并轉(zhuǎn)移至存于冰填充容器中的動(dòng)物設(shè)施中。在注射時(shí)，將細(xì)菌懸浮液懸浮于等體積10%豬粘蛋白中，裝入3mL注射器中，并使用安裝有25GS"針頭的注射器將500pL注射至小鼠腹膜腔內(nèi)。所計(jì)算實(shí)際攻擊劑量是5.81x1()4CFU/500nL攻擊。在第16、24、41、48、65、168小時(shí)記錄每一組的攻擊后發(fā)病率和死亡率。在攻擊后第5天結(jié)束研究。每個(gè)單獨(dú)經(jīng)治療組的存活數(shù)據(jù)概述于下表4中。經(jīng)投與補(bǔ)充有4mga-類毒素(rALD/H35雙突變體)衍生總兔IgG的200ugT5CP特異性IgG(埃爾塔斯蒂夫頂IGIV)的小鼠顯示100%保護(hù)。經(jīng)補(bǔ)充有2mg或lmg類毒素IgG的埃爾塔斯蒂夫免疫的小鼠保護(hù)程度降低。攻擊5天后，2mg總IgG劑量的存活率為90%，而1mg劑量為60%。相反，未經(jīng)補(bǔ)充的埃爾塔斯蒂夫具有30%存活率，而對(duì)于類毒素IgGMEPIGIV未觀察到保護(hù)作用。表4埃爾塔斯蒂夫IGIV+a-類毒素(rALD/H35K)IgG抵抗分泌高毒性a-毒素的金黃色葡萄球菌的協(xié)同被動(dòng)保護(hù)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>5'GGAATTCGTGGATCCTTAATTTGTCATTTCTTC3'H35K-F:編碼H35K突變的正向引物5'GAAAATGGCATGAAAAAAAAAGTATTTTATAGH35K-R:編碼H35K突變的反向引物5'CTATAAAATACTTTTTTTTTCATGCCATTTTG3'CTH-R:編碼His6標(biāo)記終止密碼子和BamHI位點(diǎn)的C末端引物5,AG01:編碼NcoI位點(diǎn)、起始密碼子、和之后的hla基因的N末端引物5'GGCAGCATGCCATGGCAGATTCTGATATTAAT3'根據(jù)制造商(英杰)所述程序或使用Ncol和BamHI位點(diǎn)將PCR產(chǎn)物克隆入pTrcHisB中。另外，隨后將含有hla-ALD/H33K基因的NcoI-BamHI插入片段亞克隆入pET28(諾瓦真(Novagen))中。使用制造商的方案(基因選擇)將所得構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌GC10細(xì)胞中。使用ABIPRISM染料終止子循環(huán)測(cè)序儀實(shí)施測(cè)序。將所有具有正確序列的無性系都轉(zhuǎn)化入大腸桿菌GC10或大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中進(jìn)行表達(dá)。實(shí)例7.rALD/H35K的表達(dá)和純化在振蕩燒瓶中，在37i:下于選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)含rALD/H35K質(zhì)粒的大腸桿菌菌株GC10或BL21(DE3)pLysS直至對(duì)數(shù)中期，并使用1mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)2至3小時(shí)。通過離心釆集細(xì)胞。通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析來分析振蕩燒瓶培養(yǎng)物，顯示在誘導(dǎo)前不明顯的表觀分子量為32KDa的區(qū)帶。觀察到的此分子量與存在的突變一致，而野生型重組a-毒素具有34KDa的表觀分子量。將沉淀的細(xì)胞重新懸浮于20mMTris-HCl、50mMNaCl，pH8中并在室溫下用2mg/g溶菌酶糊劑處理20分鐘，隨后用0.25%(w/v)脫氧膽酸裂解細(xì)胞膜并用美索尼克斯(Misonix)超聲儀實(shí)施超聲處理。將經(jīng)裂解細(xì)胞懸浮液與等體積2.25M(NH4)2S04、20mMNa2HP04,pH7.0緩沖液混合。通過離心收集細(xì)胞裂解物的上清液。在Toyopearl苯基-650M上對(duì)可溶性蛋白實(shí)施色譜。使用1.5至0M(NH4)2S04和0至20%甘油存于20mMNa2HP04，pH7.0緩沖液中的線性梯度洗脫結(jié)合的rALD/H35K突變體。匯集含rALD/H35K的流份并以20mMTris，100mMNaCl，5%甘油，pH7.0透析過濾。將所得經(jīng)透析過濾流份施加至藍(lán)色瓊脂糖(BlueSepharose)6FF柱上并用0.1至2.5MNaCl存于20mMTris，5%甘油，pH7.0緩沖液中的線性梯度洗脫。匯集含rALD/H35K流份并以20mMTris,100mMNaCl,5%甘油，pH6.8透析過濾。然后在陶瓷羥基磷灰石1型柱上使用100至750mMNaCl存于20mMNa2HP04，5%甘油pH6.8緩沖液中的線性梯度對(duì)滲余物實(shí)施色譜，其產(chǎn)生純r(jià)ALD/H35K。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡分析，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜并使用a-毒素突變體的一級(jí)單克隆抗體使用所屬領(lǐng)域中己知的標(biāo)準(zhǔn)程序加以處理。印跡證實(shí)存在大致在約32kDa處具有區(qū)帶的rALD/H35K抗原。另外，rALD/H35K的N末端測(cè)序證實(shí)存在hla-ALD/H35K基因產(chǎn)物。使用同一方法純化a-毒素突變體rALD和rH35K。實(shí)例8a-毒素rALD/H35K多克隆抗體的生成以1:1比率分3次將rALD/H35K(50昭)與佐劑(CFA，隨后為IFA)—起注射至新西蘭白兔(NewZealandWhiterabbit)中，中間相隔2周。在針對(duì)抗原的免疫擴(kuò)散分析中rALD/H35K抗血清將rALD/H35K和天然金黃色葡萄球菌a—毒素(里斯特生物實(shí)驗(yàn)室(ListBiologicalLaboratories))識(shí)別為相同的抗原。rALD/H35K抗血清同時(shí)識(shí)別野生型和突變a-毒素二者，如蛋白質(zhì)印跡和ELISA所示。這些結(jié)果表明，rALD/H35K疫苗產(chǎn)生可與天然a-毒素反應(yīng)的抗體。合并陽性血并在蛋白G柱上純化IgG。然后將經(jīng)純化抗ALD/H35KIgG用于動(dòng)物模型中。實(shí)例9a-毒素抗原的免疫化學(xué)分析在1%瓊脂糖凝膠中實(shí)施雙免疫擴(kuò)散來測(cè)定rALD/H35K抗血清的特異性，以及測(cè)定a-毒素抗原的抗原性。簡(jiǎn)單來說，在濕環(huán)境下使10)aL/孔200昭/mL的每種a-毒素抗原(外部孔)和10pL/孔rALD/H35K抗血清(中央孔)透過凝膠擴(kuò)散過夜。然后在PBS中洗滌瓊脂糖凝膠并加壓，干燥并用考馬斯藍(lán)染色。對(duì)凝膠實(shí)施沉淀素帶分析，所述沉淀素帶是在抗原與抗體結(jié)合在一起形成抗體-抗原復(fù)合體時(shí)形成D當(dāng)將兩種具有與抗血清反應(yīng)的共享表位的抗原置于毗鄰孔中并對(duì)相同抗血清擴(kuò)散時(shí)，其沉淀素線將融合在一起形成"一致性線"。當(dāng)在兩種抗原中并不同時(shí)存在所有與來自抗血清的Ab反應(yīng)的表位時(shí)，在兩種抗原間形成部分一致性線(在兩條沉淀素線的交匯點(diǎn)處的突起)。四種蛋白，即自金黃色葡萄球菌純化的天然a-毒素(里斯特生物實(shí)驗(yàn)室)、和重組突變體rALD/H35K、rALD和rH35K，其每一種都與抗rALD/H35K血清反應(yīng)為單沉淀素帶，其形成一致性線，表明針對(duì)rALD/H35K產(chǎn)生的抗血清可將天然金黃色葡萄球菌a-毒素、和突變體rALD和rH35K和rALD/H35K識(shí)別為相同或極為類似的抗原。圖1。實(shí)例IOa-類毒素雜交瘤生成用rALD免疫BALB/c小鼠。在此研究中自小鼠收集經(jīng)免疫脾細(xì)胞，并使用50%聚乙二醇使其與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。將融合細(xì)胞再懸浮于選擇培養(yǎng)基中，接種于96孔組織培養(yǎng)板中并在具有8%C02的37。C培養(yǎng)器中及增濕條件下培養(yǎng)。在涂布有經(jīng)純化rALD抗原的ELISA板上篩選生長(zhǎng)培養(yǎng)物上清液中的單克隆抗體(MAb)分泌者。在連續(xù)2次克隆過程后生成若干雜交瘤并且建立11個(gè)MAb分泌者。自這些無性系建立的大量培養(yǎng)物產(chǎn)生接種原液，并利用這些無性系產(chǎn)生小鼠腹水，自小鼠腹水制備經(jīng)純化MAb并對(duì)其實(shí)施進(jìn)一步定性。實(shí)例lla-毒素單克隆抗體的定性定性分析揭示，在如上所述制備的11種經(jīng)建立a-毒素(Alt)MAb中有9種在蛋白質(zhì)印跡評(píng)估中特異性結(jié)合天然金黃色葡萄球菌a-毒素(里斯特生物實(shí)驗(yàn)室)，而11種中有2種不識(shí)別天然a-毒素。所有具有蛋白質(zhì)印跡陽性的MAb在紅血細(xì)胞(RBC)溶血實(shí)驗(yàn)(參見實(shí)例15)中都可中和野生型a-毒素。同種型評(píng)估揭示所有11種已建立MAb都是IgGlK亞類。由已建立無性系的大量培養(yǎng)物產(chǎn)生接種原液，其也用于產(chǎn)生小鼠腹水，自小鼠腹水制備經(jīng)純化MAb并對(duì)其實(shí)施進(jìn)一步定性。實(shí)例12通過溶血分析在活體外測(cè)定細(xì)胞毒性活性在含有0.85呢氯化鈉(NaCl)，pH7.2的10mMTris-HC1溶液(稀釋/洗滌緩沖液)中制備1.0Mg/mL的經(jīng)純化a-毒素溶液。在96孔板上對(duì)a-毒素抗原實(shí)施連續(xù)2倍稀釋。每一分析板上都包括僅含有緩沖液(無a-毒素)的細(xì)胞對(duì)照孔。將兔RBC(科羅拉多血清(ColoradoSerum)公司，目錄號(hào)CS1081)連續(xù)洗滌2次，每次洗滌是以10體積實(shí)施，然后用洗滌緩沖液重新調(diào)整至初始濃度。將等體積RBC懸浮液添加至含有a-毒素和洗滌緩沖液的各孔中。在37t下將板培養(yǎng)30分鐘以使a-毒素裂解RBC。然后將板離心以沉淀所有RBC和細(xì)胞碎片，繼而在另一聚苯乙烯ELISA板的對(duì)應(yīng)孔中用洗滌緩沖液對(duì)各上清液進(jìn)行稀釋。借助于ELISA板讀數(shù)器在450nm處測(cè)量上清液的光學(xué)密度(OD)，在報(bào)告數(shù)據(jù)前減去作為背景的細(xì)胞對(duì)照(無毒素)0D。然后計(jì)算由a-毒素活性導(dǎo)致裂解的RBC的百分率。使用于0.5pg/mL天然金黃色葡萄球菌a-毒素或0.5pg/mL野生型重組a-毒素時(shí)觀察到完全或接近100%的溶血(表5)。然而，在此分析中使用多于185倍以上的rALD/H35K抗原(92.8昭/mL)時(shí)未檢測(cè)到可測(cè)量溶血活性。這些結(jié)果表明，rALD/H35K在活體外不具有溶血性且因此rALD/H35K可用作疫苗來產(chǎn)生與金黃色葡萄球菌天然a-毒素反應(yīng)的抗體。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實(shí)例13金黃色葡萄球菌a-毒素溶血活性的多克隆抗體中和在96孔分析板上對(duì)兔血清抗體(來自4只不同兔子的抗rALD/H35K)或標(biāo)準(zhǔn)兔血清實(shí)施2倍連續(xù)稀釋。在每個(gè)分析板上都包括僅含有洗滌緩沖液的細(xì)胞對(duì)照孔(無a-毒素并且無抗體)和a-毒素對(duì)照孔(無抗體)。將等體積存于洗滌緩沖液中的4X濃縮a-毒素(2pg/mL)添加至所有具有抗體的孔中和僅具有洗滌緩沖液的孔中(用于毒素陽性對(duì)照)。將等體積洗滌緩沖液添加至所有僅含洗滌緩沖液的細(xì)胞對(duì)照孔中。以與各孔中相等的體積向每一具有經(jīng)稀釋抗體、a-毒素和洗滌緩沖液(用于細(xì)胞對(duì)照)的孔中添加經(jīng)洗滌RBC。結(jié)果，所有抗體和毒素濃度都稀釋成起始濃度的1/4。在增濕37'C培養(yǎng)器中將各板培養(yǎng)30分鐘。然后對(duì)板實(shí)施離心以沉淀所有RBC和細(xì)胞碎片，繼而在另一聚苯乙烯ELISA板的對(duì)應(yīng)孔中用洗滌緩沖液對(duì)各上清液實(shí)施稀釋。借助ELISA板讀數(shù)器在450nm處測(cè)量上清液的光學(xué)密度(OD)，在報(bào)告數(shù)據(jù)前減去作為背景的細(xì)胞對(duì)照(無毒素)OD。以a-毒素陽性對(duì)照為基準(zhǔn)測(cè)定各抗體的中和能力。結(jié)果(列于表6中)表明，所有4只用rALD/H35K免疫的兔都產(chǎn)生針對(duì)金黃色葡萄球菌天然a-毒素的中和抗體?？笰LD/H35K超免疫血清能以約1:2648至1:6125的稀釋度中和大致50%的。-毒素溶血活性，而標(biāo)準(zhǔn)兔血清在1:100稀釋度下以濃縮25倍以上的濃度也不能中和50%的a-毒素溶血活性。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，ALD/H35K特異性抗體在活體外可有效中和天然a-毒素活性。表6用多克隆血清在活體外中和a-毒素溶血活性血清稀釋倍數(shù)中和百分比抗rALD/H35K第76b號(hào)兔抗rALD/H35K第76a號(hào)兔抗rALD/H35K第77a號(hào)兔抗rALD/H35K第77b號(hào)兔標(biāo)準(zhǔn)兔血清100100.8101.0101.1101.30.120099.9100.3100.2100.5約6.8400100.2100.3跳3100.4約5.5800100.0100.2100.0100.3約0.9160099.895.785.799.9約1.7320080.361.447.082.33.0640038.329.929.447.06.01280029.929.528.430.616.22560013.8U.79.510.611.85120012.210.513.611.413.51024006.85.37.54.910.720480014.58.813.3-3.6".2中和50%時(shí)的稀釋倍數(shù)5506435526486125不可測(cè)量簡(jiǎn)實(shí)例14a-毒素抗原的免疫原性和抗rALD/H35K的反應(yīng)性以及對(duì)天然金黃色葡萄球菌a-毒素的中和活性33通過免疫10只小鼠/組制備多克隆超免疫小鼠血清。使用含有或不含有明礬作為佐劑的2.5昭抗原(rALD/H35K、rH35K、rH35R或rALD)對(duì)小鼠實(shí)施3次注射，中間相隔2周。在最后一次注射后l周抽取小鼠的血液，匯集各抗原的小鼠血清，并且實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)定量性ELISA來測(cè)定IgG對(duì)野生型a-毒素和對(duì)同源抗原的效價(jià)。所有小鼠血清匯集物都可識(shí)別同源抗原和金黃色葡萄球菌天然a-毒素。這些結(jié)果表明，與其它單點(diǎn)突變抗原相比，雙突變體rALD/H35K能產(chǎn)生較高含量的a-毒素IgG并且可獲得大于或類似于rALD抗原的效價(jià)。如實(shí)例13中所述，也測(cè)試小鼠血清匯集物在活體外對(duì)金黃色葡萄球菌a-毒素所造成溶血活性的中和作用。結(jié)果(列于表7中)顯示，抗rALD/H35K血清可有效中和溶血活性。表7多克隆小鼠血清的免疫原性、與天然a-毒素的反應(yīng)性以及對(duì)于溶血活性的中和作用小鼠血清抗天然a-毒素IgG(EU/ml)507。中和時(shí)的EU抗rALD/H35K1000.307具有明礬的抗rALD/H35K1890.459具有明礬的抗rH35K690.194具有明礬的抗rAU^2070.3%具有明礬的抗rH35RnNA抗rH35R6NA具有明礬的抗rH35K3NA抗rH35K6NA具有明礬的抗rALX^60NA抗rALD45NA*結(jié)果是來自兩種不同小鼠血清匯集物的報(bào)告。實(shí)例15單克隆抗體對(duì)a-毒素溶血活性的中和鑒定含有抗a-毒素MAb(如實(shí)例10中所述獲得)的組織培養(yǎng)上清液在體外中和a-毒素的能力。作為陰性對(duì)照，分別評(píng)估對(duì)尼古丁和標(biāo)準(zhǔn)兔血清具有特異性的Mab的中和活性。在96孔板上對(duì)抗體實(shí)施連續(xù)2倍稀釋。每個(gè)分析板上都包括僅含有洗滌緩沖液的細(xì)胞對(duì)照孔(無a-毒素并且無抗體)和a-毒素對(duì)照孔(無抗體)。將存于洗滌緩沖液中的等體積a-毒素(2昭/mL)添加至所有具有抗體的孔和僅具有洗滌緩沖液(用于毒素陽性對(duì)照)的孔中。將等體積洗滌緩沖液添加至所有僅含洗滌緩沖液的細(xì)胞對(duì)照孔中。向每一具有經(jīng)稀釋抗體、a-毒素和洗滌緩沖液(用于細(xì)胞對(duì)照)的孔中添加34與各孔同體積的經(jīng)洗滌RBC。結(jié)果，所有抗體和毒素濃度都稀釋成起始濃度的1/4。在增濕37'C培養(yǎng)器中將各板培養(yǎng)30分鐘。然后對(duì)板實(shí)施離心以沉淀所有RBC和細(xì)胞碎片，繼而在另一聚苯乙烯ELISA板的對(duì)應(yīng)孔中用洗滌緩沖液對(duì)各上清液實(shí)施稀釋。借助于ELISA板讀數(shù)器在450nm處測(cè)量上清液的光學(xué)密度(OD)，在報(bào)告數(shù)據(jù)前減去作為背景的細(xì)胞對(duì)照(無毒素)OD。以a-毒素陽性對(duì)照為基準(zhǔn)測(cè)定各抗體的中和能力。如蛋白質(zhì)印跡分析所表明，與天然a-毒素結(jié)合的9種Mab經(jīng)顯示可中和天然a-毒素的活體外溶血活性(數(shù)據(jù)列于表8中)。在蛋白質(zhì)印跡分析中不結(jié)合天然a-毒素的兩種MAb和非特異性單克隆抗體(2Nic311)不具有a-毒素中和活性。表8單<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>NA=未檢測(cè)到可測(cè)量中和活性或未達(dá)成50%中和。實(shí)例16多克隆兔血清對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中a-毒素溶血活性的中和在活體外溶血分析中證明抗rALD/H35K抗體中和金黃色葡萄球菌分泌的a-毒素的能力。將來自分離菌伍德(ATCC10832號(hào)，a-毒素原型分離菌)和Nabi臨床分離菌MRSA的金黃色葡萄球菌過夜培養(yǎng)物調(diào)節(jié)至2.0OD54。nm，離心并過濾所得上清液。然后將四倍稀釋的上清液添加至連續(xù)稀釋的兔抗rALD/H35K兔血清中并培養(yǎng)IO分鐘。于培養(yǎng)后，添加新獲得的兔紅細(xì)胞并于37'C下將板培養(yǎng)30分鐘。在培養(yǎng)后，以2000rpm將微量滴定板離心IO分鐘，并且通過使用ELISA讀數(shù)器于410nm波長(zhǎng)處測(cè)量所釋放血紅素的含量來定量裂解程度。結(jié)果(列示于表9中)證明抗rALD/H35血清具有中和活性。于1:1000稀釋度下，抗ALD/H35K能夠在活體外完全中和100ng/mL經(jīng)純化天然a-毒素和細(xì)菌分泌的a-毒素(來自兩種金黃色葡萄球菌臨床分離菌)。表9抗rALD/H35K兔血清對(duì)來自金黃色葡萄球菌細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的a—毒素溶血活性的中和<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)例17單克隆和多克隆抗體對(duì)金黃色葡萄球菌天然a-毒素攻擊的活體內(nèi)中和如下所述評(píng)價(jià)如實(shí)例10中所述獲得的a-毒素MAb之一(MAb1Alt660)和抗rALD/H35K多克隆抗體的活體內(nèi)中和效力。向BALB/c小鼠腹膜腔內(nèi)(IP)投與100WgMAb1Alt660。作為對(duì)照，給予另一組小鼠針對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁組份產(chǎn)生的MAb(MAb158)。同樣，對(duì)小鼠投與如實(shí)例8中所述自rALD/H35K接種兔獲得的500叱總抗ALD/H35KIgG，并且對(duì)另一組小鼠投與等量的標(biāo)準(zhǔn)兔IgG作為對(duì)照。24小時(shí)后，用10嗎天然a-毒素(里斯特生物實(shí)驗(yàn)室)經(jīng)皮內(nèi)(ID)攻擊小鼠，并在7天內(nèi)觀察皮膚損傷和致死率。被動(dòng)免疫數(shù)據(jù)表明，兩種單克隆抗體lAlt660和抗ALD/H35KIgG都能阻止傷口形成和a-毒素誘導(dǎo)的死亡。結(jié)果概述于表10中。表10單克隆和多克隆抗體對(duì)BALB/c小鼠中天然金黃色葡萄球菌a-毒素攻擊的活體內(nèi)中和<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)例18抗rALD/H35KIgG和斯蒂夫VAXIgG(5型和8型IgG)抵抗金黃色葡萄球菌致死性攻擊的用途為表現(xiàn)在治療中組合中和抗體和調(diào)理抗體來對(duì)抗高毒性金黃色葡萄球菌分離菌的優(yōu)勢(shì)，通過腹膜內(nèi)途徑對(duì)BALB/c小鼠投與抗ALD/H35K兔IgG(中和抗體)以及200叱調(diào)理抗體，即金黃色葡萄球菌5型和8型莢膜多糖人類抗體(埃爾塔斯蒂夫，納比生物制藥公司)。作為對(duì)照，對(duì)小鼠投與等劑量的包含抗rALD/H35KIgG的抗體或僅埃爾塔斯蒂夫或非免疫IgG(標(biāo)準(zhǔn)人類IGTV)。24小時(shí)后，用存于5%豬粘蛋白中的5x104CFU金黃色葡萄球菌NabiMRSA328(其分泌大量a-毒素)IP攻擊小鼠，并于細(xì)菌攻擊后24小時(shí)、40小時(shí)和5至7天監(jiān)控發(fā)病率和死亡率。結(jié)果(列示于表11中)展示金黃色葡萄球菌中和抗體與調(diào)理抗體組合的保護(hù)性效力。因此，用兔抗rALD/H35KIgG(中和)以及埃爾塔斯蒂夫(抗5型和8型莢膜多糖調(diào)理IgG)免疫的小鼠不受高毒性金黃色葡萄球菌攻擊的影響，而僅接受抗-!"八1^/105&1§0或埃爾塔斯蒂夫的小鼠未能在攻擊后存活。表ll抗rALD/H35KIgG和斯蒂夫VAXIgG抵抗金黃色葡萄球菌致死性攻擊的效力<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實(shí)例19使用rALD/H35K作為載體蛋白制備結(jié)合疫苗的方法非毒性a-毒素突變體rALD/H35K在多糖蛋白結(jié)合疫苗中用作蛋白載體。本實(shí)例闡述使表皮葡萄球菌多糖抗原PS1與rALD/H35K結(jié)合的方法。在0.1MMES緩沖液中制備PS1溶液(IOmg/mL)。添加呈干粉形式的己二酸二酰肼(ADH)以產(chǎn)生0.2M的終濃度。為引發(fā)反應(yīng)，添加乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)至0.05M的終濃度并將其另外攪拌30分鐘。然后以1MNaCl透析含衍生PS1(PS1.ah)的反應(yīng)混合物，隨后以蒸餾水透析，然后通過葡聚糖凝膠(Sephadex)G25柱實(shí)施色譜以去除殘留鹽。通過三硝基苯磺酸(TNBS)分析以比色法測(cè)定納入抗原PSUh上的ADH的量。于含0.3MNaCl的0.05M磷酸鈉/0.2M咪唑緩沖液中制備含rALD/H35K(2mg/mL)的溶液。隨后，以2:1的w/w比率向蛋白質(zhì)中添加琥珀酸酐并使用1MNaOH將pH維持在8并保持2小時(shí)，同時(shí)加以攪拌。然后以0.2MNaCl透析衍生載體蛋白rALD/H35K孤，并于葡聚糖凝膠-G25柱上進(jìn)一步純化，匯集并濃縮。通過BCA(Pierce)測(cè)量蛋白質(zhì)含量，并且在反應(yīng)之前和之后通過用TNBS分析測(cè)量氨基來估算蛋白質(zhì)琥珀酰基化的效率。在1mL0.1MMES/0.2MNaCl緩沖液，pH5.7-5.8中制備含有10mgPS1.八h禾口10mgrALD/H35K-sue的溶液。向反應(yīng)混合物中添加EDC以達(dá)50mM的終濃度，并在攪拌的情況下將反應(yīng)維持30分鐘，隨后以0.2MNaCl透析。通過在用0.2MNaCl洗脫的丙烯葡聚糖凝膠(Sephacryl)S-300柱上實(shí)施尺寸排除色譜獲得純結(jié)合物。結(jié)合物中PS1和載體蛋白(rALD/H35K)的量是分別通過磷分析和BCA分析(Pierce)測(cè)定。作為對(duì)照，使用相同方法制備PS1與綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A的非毒性突變體(rEPA)的結(jié)合物(PS1-rEPA)。表12對(duì)表皮葡萄球菌PSl-rALD/H35K與PSl-rEPA結(jié)合物的特性加以比較。在通過氨基數(shù)量降低所監(jiān)測(cè)的琥珀酰基化效率方面，rALD/H35K和rEPA的琥珀酸衍生物具有極類似的特性，其琥珀?；史謩e是80%和75%。所得結(jié)合物PSl-rALD/H35K和PSl-rEPA具有類似的w/wPS/PR比率(0.71和0.61)。表12使用rALD/H35K或rEPA作為載體蛋白制備的表皮葡萄球菌PS1結(jié)合物的定性<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實(shí)例20表皮葡萄球菌PSl-rALD/H35K結(jié)合疫苗的免疫原性為評(píng)估PSl-rALD/H35K的免疫原性，用含有和不含有佐劑(QS-21)的2.5和10昭PSl-rALD/H35K結(jié)合物將每組10只BALB/c小鼠免疫3次，中間間隔2周。于第3次注射后7天，對(duì)小鼠實(shí)施放血并收集血清。分別使用PSl或天然a-毒素(里斯特生物實(shí)驗(yàn)室)作為固定抗原通過ELISA測(cè)量血清樣品中的抗PS1IgG和抗a-毒素IgG應(yīng)答。免疫結(jié)果以表示為ELISA單位/mL(EU/mL)的血清IgG的組幾何平均(GM)值給出。將抗PS1IgG效價(jià)與任意指定為100EU/mL的參考血清加以比較。100EU/mL的效價(jià)代表在ELISA中于1:2000稀釋度下給出2.0的OD45。的特異性IgG的濃度。通過內(nèi)插至任意指定為5,000EU/mL的參考血清來計(jì)算抗a-毒素IgG效價(jià)。5,000EU/mL的效價(jià)代表在ELISA中于1:5,000稀釋度下給出2.0的OD45()的特異性IgG的濃度。評(píng)估所有血清樣品在活體外對(duì)天然a-毒素溶血活性的中和，如實(shí)例13中所述。免疫后，抗PS1IgG以及抗a-毒素IgG應(yīng)答都以劑量依賴性方式增加，并且當(dāng)在免疫期間使用佐劑時(shí)表現(xiàn)出效價(jià)增高。盡管PSl-rALD/H35K結(jié)合物可誘導(dǎo)顯著抗a-毒素效價(jià)，但僅使用極高效價(jià)血清(>300EU/mL)即可在體外中和天然a-毒素的溶血活性。在接受具有佐劑(QS-21)的2.5或10|agPSl-rALD/H35K的動(dòng)物中90%至100%的動(dòng)物誘導(dǎo)抗a-毒素IgG的所述相關(guān)毒素中和程度，而在無佐劑的情況下，用10昭結(jié)合物免疫在2/10的動(dòng)物中誘導(dǎo)50%中和效價(jià)。這些數(shù)據(jù)表明，rALD/H35K可作用多糖結(jié)合物(例如PSl-rALD/H35K)的載體蛋白，其可用于刺激高效價(jià)的PS抗體以及a-毒素抗體，有效地中和天然ci-毒素溶血活性。表13表皮葡萄球菌PSl-rALD/H35K結(jié)合疫苗的免疫原性<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>GNfc幾何平均*若一組10份中有6份血清未達(dá)到可測(cè)量的50%中和效價(jià)，則不計(jì)算GM值。最低50%中和效價(jià)是"4"并且對(duì)應(yīng)于中和分析中純血清(未經(jīng)稀釋血清)的使用。實(shí)例21調(diào)理(抗5型、抗8型和抗336)和中和(抗LukS-PV和抗ALD/H35K)多克隆抗體的生成將抗原注射入新西蘭白兔中5至6次，中間間隔2周。兔子接受(l)5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA結(jié)合物各50嗎，(2)各50昭的1:1的rALD/H35K和rLukS-PV:佐劑(5%Titermax),(3)5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA結(jié)合物各50昭，和各50昭的1:1的rALD/H35K和rLukS-PV:佐劑(5%Tite觀x)，或(4)1:1的PBS:佐劑(5%Titermax)<>通過用5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA結(jié)合物對(duì)兔實(shí)施免疫產(chǎn)生的抗血清在ELISA和免疫擴(kuò)散中識(shí)別5型、8型和336多糖。通過用rALD/H35K和rLukS-PV對(duì)兔實(shí)施免疫產(chǎn)生的抗血清于ELISA和免疫擴(kuò)散中識(shí)別天然金黃色葡萄球菌a-毒素(里斯特生物實(shí)驗(yàn)室)和rLukS-PV。通過用5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA結(jié)合物以及rALD/H35K和rLukS-PV對(duì)兔實(shí)施免疫產(chǎn)生的抗血清于ELISA和免疫擴(kuò)散中識(shí)別5型、8型和336多糖、a-毒素和LukS-PV。合并陽性血并于蛋白G或A柱上純化IgG。然后在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中使用以下經(jīng)純化IgG:(1)抗5型和抗8型莢膜多糖IgG和抗336IgG(調(diào)理抗體)；(2)抗a-毒素ALD/H35K和抗LukS-PVIgG(中和抗體)；(3)抗5型和抗8型莢膜多糖IgG、抗336IgG、抗a-毒素ALD/H35KIgG和抗LukS-PVIgG(調(diào)理和中和抗體)。實(shí)例22通過用5型結(jié)合物、8型結(jié)合物、336結(jié)合物、rALD/H35K和rLukS-PV實(shí)施主動(dòng)免疫來抵抗金黃色葡萄球菌攻擊評(píng)價(jià)包含5型結(jié)合物、8型結(jié)合物、336結(jié)合物、rALD/H35K和rLukS-PV的疫苗抵抗金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)皮膚感染的能力。如實(shí)例21中所述對(duì)5至6月齡新西蘭雌性兔實(shí)施免疫以產(chǎn)生高含量抗體。于第5或第6次注射后7天對(duì)兔實(shí)施放血，并通過ELISA評(píng)價(jià)5型、8型和336多糖以及a-毒素和LukS-PVIgG抗體的效價(jià)。在所有相關(guān)血清中，這些抗原的效價(jià)都經(jīng)1:105-106稀釋以達(dá)成0045()11111=2.0。將兔的背部剃光并皮內(nèi)注射108CFU/100mL金黃色葡萄球菌菌株USA300-01114(產(chǎn)生PVL的CA-MRSA)。觀察動(dòng)物皮膚壞死損傷的形成狀況。用5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA結(jié)合物、rALD/H35K和rLukS-PV接種可分別誘導(dǎo)每種亞單位的高抗體效價(jià)(稀釋1:105-106以達(dá)成0045()11111=2)。據(jù)顯示這些抗體可抵抗由產(chǎn)生PVL的金黃色葡萄球菌分離菌(或CA-MRSAUSA300)所導(dǎo)致的膿腫形成。也就是說，在用五價(jià)組合(5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA結(jié)合物、rALD/H35K和rLukS-PV)免疫的兔中觀察到注射位點(diǎn)僅略微發(fā)紅。相反，在接受安慰劑(PBS加Titemiax)的對(duì)照兔中觀察到膿腫形成。用所有5種抗原(5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA結(jié)合物、rALD/H35K和rLukS-PV)免疫的兔子在第8天還很健康。然而，觀察到用安慰劑免疫的兔具有臨床發(fā)病體征(體重減輕，嗜睡)。因此，用含有5型結(jié)合物、8型結(jié)合物、336結(jié)合物、rALD/H35K和rLukS-PV的五價(jià)金黃色葡萄球菌疫苗免疫可預(yù)防金黃色葡萄球菌感染，包括由高致病性PLV生成菌株誘導(dǎo)的感染。實(shí)例235型/8型/336IgG(調(diào)理IgG)與a-毒素/PVLIgG(中和IgG)抵抗金黃色葡萄球菌攻擊的協(xié)同作用為表現(xiàn)調(diào)理與中和多克隆抗體(pAb)的組合抵抗高毒性金黃色葡萄球菌分離菌的優(yōu)勢(shì)，用下列抗體經(jīng)腹膜內(nèi)被動(dòng)免疫BALB/c小鼠(1)抗5型和抗8型莢膜多糖IgG和抗336IgG調(diào)理pAb;(2)抗a陽毒素ALD/H35K和抗LukS-PV兔IgG中和pAb;或(3)抗5型和抗8型莢膜多糖IgG、抗336IgG、抗ALD/H35KIgG和抗LukS-PVIgG(例如調(diào)理與中和pAb的組合)。作為對(duì)照，對(duì)小鼠投與等劑量的2mg總IgG的標(biāo)準(zhǔn)兔IgG。24小時(shí)后，剃去小鼠背部的毛發(fā)，并通過皮內(nèi)(ID)途徑用lxl()SCFU金黃色葡萄球菌USA300-01114攻擊，其為分泌PVL和a-毒素的CA-MRSA菌株。于16和72小時(shí)觀察小鼠的皮膚壞死損傷情況。結(jié)果(列示于表14中)展示金黃色葡萄球菌中和與調(diào)理pAb的組合的保護(hù)效力。因此，用調(diào)理和中和pAb(抗5型、抗8型、抗336、抗a-毒素rALD/H35K和抗LukS-PV)免疫的小鼠可抵抗高毒性金黃色葡萄球菌攻擊，而僅接受調(diào)理pAb(抗5型、抗8型和抗336)或僅接受中和pAb(抗a-毒素ALD/H35K和抗LukS-PV)的小鼠不能抵抗此攻擊。表14調(diào)理pAb與中和pAb于抵抗金黃色葡萄球菌感染中的協(xié)同作用攻擊后具有皮膚壞死損免疫劑傷的/，、鼠數(shù)16小時(shí)72小時(shí)抗5型、抗8型、抗336兔IgG0/101/10(調(diào)理pAb，1mg總IgG)禾口抗a-毒素rALD/H35K和抗LukS-PV兔IgG(中和pAb，lmg總IgG)抗5型、抗8型、抗336兔IgG(調(diào)理pAb，1mg總IgG)和標(biāo)準(zhǔn)0/105/10兔IgG(lmg總IgG)抗a-毒素rALD/H35K和抗LukS-PV圖IgG(中和pAb，1mg總0/104/10IgG)和標(biāo)準(zhǔn)兔IgG(1mg總IgG)標(biāo)準(zhǔn)兔IgG(2mg總IgG)0/10謂PBS-安慰劑0/1010/10實(shí)例24金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位的克隆、表達(dá)和純化自金黃色葡萄球菌菌株ATCC49775提取基因組DNA，并且引物經(jīng)設(shè)計(jì)以在賦予氨芐西林抗性的pTrcHisA質(zhì)粒載體中克隆Y-溶血素基因hlgA、hlgB禾BhlgC。使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)自所有三種基因去除信號(hào)肽，并構(gòu)建BamHI和Ncol位點(diǎn)以實(shí)41施克隆。用BamHI和NcoI消化PCR產(chǎn)物，并將三種基因各自分別與以類似方式消化的載體連接。然后將經(jīng)連接DNA轉(zhuǎn)化入在含有氨芐西林的LB瓊脂板上生長(zhǎng)的GC-10大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中。使用PCR篩選具有正確基因插入片段的菌落，并使陽性菌落在LB培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，之后提取質(zhì)粒DNA并用BamHI和Ncol消化來加以確認(rèn)。然后對(duì)具有正確基因插入片段的樣品實(shí)施測(cè)序，繼而將具有正確插入片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中以迸行蛋白表達(dá)。使用相同的方法通過以下方式來純化HlgA、HlgB和HlgC:使表達(dá)各亞單位的大腸桿菌分別在37。C下于2L循環(huán)生長(zhǎng)(Circlegrow)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，隨后于3(TC下用IPTG誘導(dǎo)。然后通過離心采集細(xì)菌細(xì)胞，并使細(xì)胞漿液暴露于使用20%蔗糖溶液的滲透沖擊下，隨后再懸浮于低滲緩沖液中。通過離心去除細(xì)胞碎片并過濾上清液，然后將其裝入SP瓊脂糖陽離子交換柱上。使用氯化鈉溶液的線性梯度實(shí)施洗脫，并于SDS-PAGE上分析經(jīng)洗脫樣品。匯集含有正確大小的蛋白質(zhì)的樣品并將其裝于陶瓷羥基磷灰石(CHT)柱上，仍使用氯化鈉的線性梯度實(shí)施洗脫。通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡對(duì)樣品實(shí)施分析。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡分析，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜并使用所屬領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)程序以抗LukS-PV或抗LukF-PV抗體實(shí)施處理。印跡法以大致在約32-34kDa處的區(qū)帶證實(shí)存在rHlgA、rHlgB和rfflgC抗原。實(shí)例25殺白細(xì)胞素多克隆抗體的生成和定性將rLukS-PV、rLukF墨PV、rHlgA、rHIgB或rHlgC(各50yg)與佐劑(西格瑪(Sigma)Titermax或CFA，之后為IFA)—起以1:1之比注射至新西蘭白兔中，注射3至6次，間隔2周。LukS-PV抗血清在對(duì)抗原的免疫擴(kuò)散分析中將rLukS-PV識(shí)別為相同抗原，而rLukF-PV抗血清識(shí)別LukF-PV。rLukS-PV或rLukF-PV不與異源抗血清反應(yīng)。實(shí)例26金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞素亞單位HlgA、HlgB,HlgC與PVL抗體的交叉反應(yīng)性在1%瓊脂糖凝膠中實(shí)施雙免疫擴(kuò)散來測(cè)定PVL抗血清的特異性，以及測(cè)定Hlg亞單位抗原的抗原性。簡(jiǎn)單來說，使10nL/孔的200iag/mL各殺白細(xì)胞素抗原(外部孔)和10)iL/孔的LukS-PV抗血清(中央孔)在潮濕環(huán)境下透過凝膠擴(kuò)散過夜。然后在PBS中洗滌瓊脂糖凝膠并加壓、干燥并用考馬斯藍(lán)染色。對(duì)凝膠實(shí)施沉淀素帶分析，所述沉淀素帶在抗原與抗體結(jié)合在一起形成抗體-抗原復(fù)合體時(shí)形成。當(dāng)將具有可與抗血清反應(yīng)的共享表位的兩種抗原置于毗鄰孔中并對(duì)相同抗血清擴(kuò)散時(shí)，其沉淀素線將融合在一起形成"一致性線"。當(dāng)兩種抗原中并不同時(shí)存在所有與抗血清Ab反應(yīng)的表位時(shí)，在兩種抗原間形成部分一致性線(在兩條沉淀素線交匯點(diǎn)的突起)。三種金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞素S亞單位rHlgA(A)、rHlgC和LukS-PV(S)與抗42LukS-PV血清以單沉淀素帶形式反應(yīng)，形成部分一致性線，并且這些S亞單位不與抗LukF-VP抗血清反應(yīng)。此表明，針對(duì)rLukS-PV產(chǎn)生的抗血清將金黃色葡萄球菌Y-毒素S亞單位、HlgA和HlgC識(shí)別為并不具有全部但具有某些共享表位的類似抗原。同樣，兩種殺白細(xì)胞素F亞單位rHlgB(B)和rLukF-PV(F)與抗LukF-PV血清以單沉淀素帶形式反應(yīng)，形成部分一致性線，并且不與LukS-PV抗血清反應(yīng)。此表明，針對(duì)rLukS-PV產(chǎn)生的抗血清將金黃色葡萄球菌Y-溶血素F亞單位、HlgB識(shí)別為并不具有全部但具有某些共享表位的類似抗原。因此，PVL抗體與金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞素(Y-溶血素)具有交叉反應(yīng)性。用抗LukS-PV和抗LukF-PV兩種抗體實(shí)施定量ELISA，證實(shí)在各殺白細(xì)胞素S亞單位(rHlgA、rHlgC和rLukS-PV)之間、以及在各殺白細(xì)胞素F亞單位(rHlgB和rLukF-PV)之間存在交叉反應(yīng)性。據(jù)證明，殺白細(xì)胞素S與F亞類間不存在交叉反應(yīng)性。實(shí)例27殺白細(xì)胞素抗體的反應(yīng)性使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)評(píng)估兔多克隆抗體(抗LukS-PV、抗LukF-PV、抗HlgA、抗HlgB和抗HlgC)與各種殺白細(xì)胞素抗原(包括rLukS-PV、rLukF-PV、rHlgA、rfflgB禾口rHlgC)的反應(yīng)性。簡(jiǎn)單來說，用lyg/mL特異性殺白細(xì)胞素抗原涂布96孔板，然后洗滌板并用BSA封閉。再次洗滌板，然后將抗殺白細(xì)胞素兔血清或參考對(duì)照兔血清在板上連續(xù)稀釋并加以培養(yǎng)。再次洗滌板并添加與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的第二抗體。洗滌板，然后使用過氧化物酶底物系統(tǒng)顯影，并通過在OD450nm處讀取來確定活性。當(dāng)在450nm處的OD大于0.2時(shí)視為具有交叉反應(yīng)性。ELISA數(shù)據(jù)表明，殺白細(xì)胞素S亞單位(rLukS-PV、rHlgA禾口rHlgC)與抗LukS-PV、抗HlgA和抗HlgC抗體反應(yīng)，而殺白細(xì)胞素F亞單位(rLukF-PV和rHlgB)與抗LukF-PV和抗HlgB抗體反應(yīng)(表15)。殺白細(xì)胞素S亞單位(rLukS-PV、rHlgA禾口rfflgC)不與抗HlgB和抗LukF-PV抗體反應(yīng)，而殺白細(xì)胞素F亞單位(rLukF-PV和rHlgB)不與抗LukS-PV、抗HlgA或抗HlgC抗體反應(yīng)。因此，殺白細(xì)胞素S抗體與異源殺白細(xì)胞素S亞單位交叉反應(yīng)，并且殺白細(xì)胞素F抗體與異源殺白細(xì)胞素F亞單位交叉反應(yīng)。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實(shí)例28殺白細(xì)胞素多克隆抗體對(duì)金黃色葡萄球菌Y-溶血素的中和在DMSO的存在下，使HL-60細(xì)胞在補(bǔ)充有10呢胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7天以誘導(dǎo)分化。然后通過慢速離心采集細(xì)胞，繼而使用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基以5x105細(xì)胞/孔將其接種于96孔板中。于37i:下將不同濃度的Y-溶血素(HlgA/HlgB或HlgC/HlgB)與不同稀釋度的兔多克隆抗LukS-PV抗體、抗LukF-PV抗體或標(biāo)準(zhǔn)兔血清培養(yǎng)一起30分鐘。然后將抗體與毒素的混合物添加至細(xì)胞中，并將其培養(yǎng)24小時(shí)。然后向細(xì)胞中添加XTT(2，3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰苯胺內(nèi)鹽)溶液并測(cè)量450nm處的吸光度以測(cè)定細(xì)胞存活率。作為對(duì)照，在不添加任何兔血清的情況下實(shí)施反應(yīng)。HlgA/HlgB和HlgC/B分別在250ng/mL和32叱/mL的濃度下對(duì)HL-60細(xì)胞具有細(xì)胞毒性?？筁ukS-PV和抗LukF-PV抗血清二者都能中和HlgA/HlgB和HlgC/HlgB的細(xì)胞毒性?？寡宓闹泻托?yīng)具有稀釋度依賴性，而標(biāo)準(zhǔn)兔血清的效應(yīng)卻相反，其顯示較低程度的非特異性中和。抗LukF-PV和抗LukS-PV抗血清在1:20的稀釋度下分別將HlgA/HlgB細(xì)胞毒性活性中禾卩84%和74%?？筁ukF-PV和抗LukS-PV在1:5的稀釋度下分別將HlgC/HlgB細(xì)胞毒性中和91%和72%。此明確表明，抗殺白細(xì)胞素抗體可交叉中和異源殺白細(xì)胞素。表16抗LukS-PV和抗LukF-PV抗體對(duì)Y-溶血素HlgA/HlgB和HlgC/HlgB的交叉中和<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>實(shí)例29殺白細(xì)胞素多克隆抗體對(duì)金黃色葡萄球菌PVL細(xì)胞毒性的中和在DMSO的存在下使HL-60細(xì)胞于補(bǔ)充有10呢胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7天以誘導(dǎo)分化。然后通過慢速離心采集細(xì)胞，繼而使用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基以5x105細(xì)胞/孔將其接種于96孔板中。于37。C下將PVL(32昭/mL的rLukS-PV和rLukF-PV)與不同稀釋度的兔多克隆抗HlgA、抗fflgB和抗HlgC抗體或標(biāo)準(zhǔn)兔血清一起培養(yǎng)30分鐘。然后將抗體與毒素的混合物添加至細(xì)胞中并培養(yǎng)24小時(shí)。然后向細(xì)胞中添加XTT(2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰苯胺內(nèi)鹽)溶液并測(cè)量450nm處的吸光度以測(cè)定細(xì)胞存活率。作為對(duì)照，在不添加任何兔血清的情況下實(shí)施反應(yīng)。PVL在32昭/mL的濃度下對(duì)HL-60細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。兔抗HlgA、抗HlgB和抗HlgC抗血清能中和PVL的細(xì)胞毒性?？寡宓闹泻托?yīng)具有稀釋度依賴性，而標(biāo)準(zhǔn)兔血清的效應(yīng)卻相反，其顯示較低程度的非特異性中和。當(dāng)以1:5稀釋血清時(shí)，抗HlgA、抗HlgB和抗HlgC抗血清分別將PVL細(xì)胞毒性活性中和32%、26%和26%。于1:5稀釋度下標(biāo)準(zhǔn)兔血清顯示極低或不顯示中和活銜1%)。由此證明，殺白細(xì)胞素特異性抗體可中和異源殺白細(xì)胞素。表17抗HlgA、抗HlgB和抗HlgC抗體對(duì)PVL毒素的交叉中和<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>實(shí)例30殺白細(xì)胞素多克隆抗體對(duì)金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞素細(xì)胞毒性的中和本實(shí)例闡述殺白細(xì)胞素細(xì)胞毒性和殺白細(xì)胞素抗體對(duì)殺白細(xì)胞素細(xì)胞毒性的中和。在37。C下將殺白細(xì)胞素(PVL或Y-溶血素HlgC/HlgB，各為400ng/mL)與不同稀釋度的兔多克隆抗HlgA、抗HlgB或抗HlgC抗體或標(biāo)準(zhǔn)兔血清一起培養(yǎng)30分鐘。然后使用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基將抗體/毒素混合物添加至5x105細(xì)胞/孔人類多形核白細(xì)胞(PMN)中并將其培養(yǎng)2小時(shí)。將XTT(2，3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5—甲酰苯胺內(nèi)鹽)溶液添加至細(xì)胞中并且在450nm下測(cè)量吸光度以測(cè)定細(xì)胞存活率。作為對(duì)照，在不添加任何兔血清的情況下實(shí)施反應(yīng)。金黃色葡萄球菌PVL和Y-溶血素(HlgOHlgB)在400ng/mL的濃度下對(duì)PMN具有細(xì)胞毒性。兔抗HlgA、抗HlgB和抗HlgC抗血清能夠中和PVL細(xì)胞毒性，并且抗LukS-PV和抗LukF-PV能夠中和HlgC/HlgB細(xì)胞毒性?？寡宓闹泻托?yīng)具有稀釋度依賴性，而標(biāo)準(zhǔn)兔血清的效應(yīng)卻相反，其顯示較低程度的非特異性中和。這些數(shù)據(jù)表明，殺白細(xì)胞素特異性抗體能夠中和異源殺白細(xì)胞素。表18殺白細(xì)胞素抗體對(duì)金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞素PVL和Y-溶血素的交叉中和<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實(shí)例315型/8型/336單克隆抗體(調(diào)理抗體)與a-毒素/殺白細(xì)胞素單克隆抗體(中和抗體)抵抗金黃色葡萄球菌的協(xié)同作用為表現(xiàn)在針對(duì)高毒性金黃色葡萄球菌分離菌的治療中組合中和與調(diào)理單克隆抗體(mAb)的優(yōu)勢(shì)，用以下抗體經(jīng)腹膜內(nèi)被動(dòng)免疫BALB/c小鼠(1)抗5型和抗8型莢膜多糖mAb和抗336mAb(調(diào)理mAb),(2)抗a-毒素和抗LukS-PVmAb(毒素中和mAb)，或(3)抗5型和抗8型莢膜多糖mAb和抗336mAb、和抗a-毒素和抗LukS-PVmAb(調(diào)理與中和mAb的組合)。作為對(duì)照，對(duì)小鼠投與非特異性單克隆抗體或PBS。24小時(shí)后，剃去小鼠背部的毛發(fā)，并通過皮內(nèi)(ID)途徑用1x108CFU金黃色葡萄球菌USA300-01114進(jìn)行攻擊，其為分泌PVL和a-毒素的CA-MRSA菌株。在第72小時(shí)觀察小鼠的皮膚和軟組織感染情況。結(jié)果(列于表19中)闡述在用金黃色葡萄球菌分離菌USA300進(jìn)行細(xì)菌攻擊后72小時(shí)，與單獨(dú)用中和或調(diào)理抗體免疫的保護(hù)效應(yīng)相比，金黃色葡萄球菌毒素中和與調(diào)理抗體的組合的保護(hù)效力。接受非特異性單克隆抗體或PBS的對(duì)照小鼠不能抵抗細(xì)菌感染，這是因?yàn)樗行∈蠖汲霈F(xiàn)壞死性皮膚損傷并具有更高器官移種率。用毒素中和抗體(抗a-毒素和抗殺白細(xì)胞素單克隆抗體)免疫的小鼠顯示皮膚損傷數(shù)量降低，而用調(diào)理抗體(抗5型、抗8型和抗336單克隆抗體)免疫的小鼠顯示器官移種降低。同時(shí)用調(diào)理與中和抗體(抗5型、抗8型、抗336、抗a-毒素和抗LukS-PV單克隆抗體)免疫的小鼠可抵抗高毒性金黃色葡萄球菌攻擊，這是因?yàn)槠渚哂袛?shù)量減少的皮膚損傷以及更低器官移種率。因此，調(diào)理與毒素中和抗體的組合在預(yù)防皮膚和軟組織感染和器官移種方面展示出保護(hù)效應(yīng)。表19調(diào)理和中和抗體在抵抗金黃色葡萄球菌攻擊中的保護(hù)效應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>*高劑量500Ug每種調(diào)理抗體和lOOUg每種中和抗體**低劑量=100)ag每種調(diào)理抗體和50叱每種中和抗體盡管已足夠詳細(xì)地闡述和例示了本發(fā)明使得熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可制備和使用本發(fā)明，但在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下各種改變、修改和改良是顯而易見的。本文所提供實(shí)例是代表性和例示性的，并且不意欲限制本發(fā)明范圍。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可構(gòu)想出其中的修改和其它應(yīng)用。這些修改涵蓋于本發(fā)明精神內(nèi)并且是由權(quán)利要求范圍所限定。說明書中所提及的所有專利和出版物都指明本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)者的水平。所有專利和出版物都是以引用方式并入本文中，其并入程度如同明確地及個(gè)別地指明每個(gè)單獨(dú)出版物是以引用方式并入一般。權(quán)利要求1、一種五價(jià)葡萄球菌(Staphylococcal)抗原組合物，其包含(i)金黃色葡萄球菌(S.aureus)5型抗原，(ii)金黃色葡萄球菌8型抗原，(iii)金黃色葡萄球菌336抗原，(iv)金黃色葡萄球菌α-毒素抗原，和(v)葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原。2、如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述葡萄球菌抗原中的至少一者是保護(hù)性抗原。3、如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原與所述5型抗原、所述8型抗原、所述336抗原和所述殺白細(xì)胞素抗原中的至少一者結(jié)合。4、如權(quán)利要求l所述的組合物，其中所述a-毒素抗原相對(duì)于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素，其含有至少兩處降低其毒性的改變。5、如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原是選自由帕頓-瓦倫丁(Panton-Valentine)殺白細(xì)胞素(PVL)抗原亞單位和Y-溶血素亞單位抗原組成的群組。6、如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原是選自由下列組成的群組(i)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位，(ii)金黃色葡萄球菌PVL的LukS-PV亞單位，(iii)HlgA金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位，(iv)HlgB金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位，(v)HlgC金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位，(vi)來自金黃色葡萄球菌的LukD，(vii)來自金黃色葡萄球菌的LukE，(viii)來自金黃色葡萄球菌的LukM，(ix)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位，(x)來自中間型葡萄球菌(S.intermedius)的LukF-I亞單位；和(xi)來自中間型葡萄球菌的LukS-I亞單位。7、如權(quán)利要求1所述的組合物，其另外包含一或多種其它細(xì)菌抗原。8、如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述一或多種其它細(xì)菌抗原中的至少一者是選自由下列組成的群組的葡萄球菌抗原表皮葡萄球菌(S.epidermidis)PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁酸(LTA)和識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組份(MSCRAMM)蛋白、和其組合。9、一種組合物，其包含金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和醫(yī)藥上可接受的載劑，其中所述a-毒素抗原相對(duì)于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素，其含有至少兩處降低其毒性的改變。10、如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述改變中的至少一者是化學(xué)改變。11、如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述改變中的至少一者是分子改變。12、如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述改變中的至少一者是化學(xué)改變并且所述改變中的至少一者是分子改變。13、如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述分子改變是野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的氨基酸序列中的取代、插入或缺失。14、如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述分子改變是野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的氨基酸序列中的取代。15、如權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述取代發(fā)生在對(duì)應(yīng)于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的His-35的位置。16、如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述取代是用Arg、Lys、Ala、Leu或Glu取代His。17、如權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述分子改變是野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的氨基閥結(jié)構(gòu)域(latchdomain)中的取代、插入或缺失。18、如權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述分子改變是野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的氨基閥結(jié)構(gòu)域中的缺失。19、如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述分子改變是野生型金黃色葡萄球菌a-毒素的干結(jié)構(gòu)域(stemdomain)中的缺失。20、一種組合物，其包含(i)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和(ii)一或多種不同于所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的其它細(xì)菌抗原。21、如權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述一或多種其它細(xì)菌抗原中的至少一者是選自由下列組成的群組的其它葡萄球菌抗原金黃色葡萄球菌5型、金黃色葡萄球菌8型、金黃色葡萄球菌336、葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁酸(LTA)和識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組份(MSCRAMM)蛋白、和其組合。22、如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述其它葡萄球菌抗原是保護(hù)性抗原。23、如權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原與所述一或多種其它細(xì)菌抗原中的至少一者結(jié)合。24、如權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述a-毒素抗原相對(duì)于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素，其含有至少兩處降低其毒性的改變。25、一種制備超免疫特異性靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)制劑的方法，其包含(i)對(duì)個(gè)體投與如權(quán)利要求l、9或20中任一權(quán)利要求所述的組合物，(ii)自所述個(gè)體采集血漿，和(iii)純化來自所述個(gè)體的免疫球蛋白。26、一種五價(jià)葡萄球菌抗體組合物，其包含(i)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌5型抗原的第一抗體，(ii)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌8型抗原的第二抗體，(iii)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌336抗原的第三抗體，(iv)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的第四抗體，和(v)特異性結(jié)合葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原的第五抗體。27、如權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述第一至第五抗體中的至少一者是單克隆抗體。28、如權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述第一至第五抗體中的至少一者是中和抗體。29、如權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述第五抗體特異性結(jié)合選自由帕頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞素(PVL)抗原亞單位和Y-溶血素亞單位抗原組成的群組的葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原。30、如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述第五抗體特異性結(jié)合選自由下列組成的群組的葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原(i)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位，(ii)金黃色葡萄球菌PVL的LukS-PV亞單位，(iii)HlgA金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位，(iv)HlgB金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位，(v)HlgC金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位，(vi)來自金黃色葡萄球菌的LukD，(vii)來自金黃色葡萄球菌的LukE，(viii)來自金黃色葡萄球菌的LukM，(k)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位，(x)來自中間型葡萄球菌的LukF-I亞單位；禾n(xi)來自中間型葡萄球菌的LukS-I亞單位。31、一種保護(hù)性抗體組合物，其包含(i)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的第一抗體，和(ii)至少一種特異性結(jié)合不同于所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的細(xì)菌抗原的第二抗體。32、如權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述第一和第二抗體中的至少一者是單克隆抗體。33、如權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述第一和第二抗體中的至少一者是中和抗體。34、如權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述至少一種第二抗體中的至少一者特異性結(jié)合選自由下列組成的群組的其它葡萄球菌抗原金黃色葡萄球菌5型、金黃色葡萄球菌8型、金黃色葡萄球菌336、葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁酸(LTA)和識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組份(MSCRAMM)蛋白。35、如權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述至少一種第二抗體中的至少一者特異性結(jié)合選自由帕頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞素(PVL)抗原亞單位和Y-溶血素亞單位抗原組成的群組的葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原。36、如權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述至少一種第二抗體中的至少一者特異性結(jié)合選自由下列組成的群組的葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原(i)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位，(ii)金黃色葡萄球菌PVL的LukS-PV亞單位，(iii)HlgA金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位，(iv)HlgB金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位，(v)HlgC金黃色葡萄球菌Y-溶血素亞單位，(vi)來自金黃色葡萄球菌的LukD，(vii)來自金黃色葡萄球菌的LukE，(viii)來自金黃色葡萄球菌的LukM，(ix)金黃色葡萄球菌PVL的LukF-PV亞單位，(x)來自中間型葡萄球菌的LukF-I亞單位，和(xi)來自中間型葡萄球菌的LukS-I亞單位。37、如權(quán)利要求31所述的組合物，其包含次優(yōu)量的所述第一抗體和次優(yōu)量的所述第二抗體。38、如權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述組合物是通過包含下列步驟的方法來制備(a)對(duì)人類個(gè)體投與(i)金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和(ii)一或多種不同于所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的其它細(xì)菌抗原，(b)自所述個(gè)體采集血漿，和(C)純化來自所述個(gè)體的免疫球蛋白。39、如權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原與所述一或多種其它細(xì)菌抗原中的至少一者結(jié)合。40、如權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原相對(duì)于野生型金黃色葡萄球菌a-毒素，其含有至少兩處降低其毒性的改變。41、如權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述組合物是通過包含下列步驟的方法來制備(a)篩選尚未投與金黃色葡萄球菌a-毒素抗原和不同于所述金黃色葡萄球菌a-毒素抗原的其它細(xì)菌抗原的人類個(gè)體，(b)自所述個(gè)體采集血漿，和(c)純化來自所述個(gè)體的免疫球蛋白。42、一種治療或預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的方法，其包含對(duì)有需要的個(gè)體投與如權(quán)利要求l、9、20、31或36所述的組合物。43、如權(quán)利要求42所述的方法，其另外包含投與選自由抗感染劑、抗生素和抗微生物劑組成的群組的藥劑。44、如權(quán)利要求43所述的方法，所述藥劑是選自由萬古霉素(vancomycin)、溶葡萄球菌素(lysostaphin)和氯林肯霉素(clindamycin)組成的群組。45、如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述金黃色葡萄球菌感染與耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌相關(guān)。46、如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述金黃色葡萄球菌產(chǎn)生a-毒素。47、一種中和金黃色葡萄球菌PVL感染的方法，其包含對(duì)有需要的患者投與包含以下的組合物(i)葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原或(ii)特異性結(jié)合葡萄球菌殺白細(xì)胞素抗原的抗體。48、一種中和葡萄球菌殺白細(xì)胞素感染的方法，其包含對(duì)有需要的患者投與包含以下的組合物(i)金黃色葡萄球菌PVL抗原亞單位或(ii)特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌PVL抗原亞單位的抗體。全文摘要本發(fā)明提供包含金黃色葡萄球菌(S.aureus)α-毒素抗原和醫(yī)藥上可接受的載劑的疫苗，并且所述疫苗可用于治療和預(yù)防感染。所述金黃色葡萄球菌α-毒素抗原可含有至少兩處降低其毒性的改變和/或可與另一細(xì)菌抗原結(jié)合或共同投與。所述疫苗可包含一或多種其它細(xì)菌抗原。本發(fā)明也提供包含抵抗α-毒素和視情況一或多種其它細(xì)菌抗原的抗體的抗體組合物，并且所述組合物可用于治療和預(yù)防感染。文檔編號(hào)A61K39/40GK101466406SQ200780021183公開日2009年6月24日申請(qǐng)日期2007年2月27日優(yōu)先權(quán)日2006年6月12日發(fā)明者金伯利·L·泰勒,阿里·I·法湯姆申請(qǐng)人:Nabi生物制藥公司