專利名稱：用于制備人造組織的聚合物骨架的制作方法
用于制備人造組織的聚合物骨架
本發(fā)明涉及適于制備人造組織的聚合物骨架，尤其是多糖骨架，制備 它們的方法，它們?cè)谥苽淙嗽旖M織中的用途，以及基于所述聚合物骨架制 備的人造組織。
盡管某些低級(jí)脊推動(dòng)物(如蠑螈)能夠修復(fù)廣泛的身體和器官損傷，但 是在大多數(shù)哺乳動(dòng)物包括人類在內(nèi)，再生能力較低。在人類以及其它哺乳 動(dòng)物的大多數(shù)組織和器官中以各種方式(如由傷害、病原體或自身免疫反應(yīng)) 引起的損害不能在消除傷害因素后通過形成新的功能組織而被修復(fù)，而僅 僅是通過填充特定的結(jié)締組織而修補(bǔ)(形成傷疤)，由此可能影響特定器官 的其它功能。甚至在那些顯示出較好再生能力的組織(尤其是皮膚、結(jié)締組 織和它們的衍生物，如骨骼)中，原有功能的恢復(fù)對(duì)患者而言既耗時(shí)又不舒 服，尤其是在廣泛損害情形下(如大面積燒傷)。治療因此集中于維持或最 小損傷的治療模式，關(guān)于此應(yīng)當(dāng)提及的是最小化的侵入式外科法(腹腔鏡檢 查)。然而，甚至用最優(yōu)化的醫(yī)學(xué)和外科治療方法，也不可能完全排除因醫(yī) 生的治療或者因上述因素引起的大規(guī)模的組織損害。因此，需要尋找恢復(fù) 損傷的或經(jīng)摘除的器官的功能的可能方式。
對(duì)此的傳統(tǒng)方式是移植和機(jī)械彌補(bǔ)術(shù)，后者現(xiàn)在限于對(duì)基本上生化惰 性和和電生理學(xué)惰性的身體部分(如關(guān)節(jié)、眼睛的晶狀體、心瓣膜)。對(duì)于 具有生化活性的組織和器官(如心臟、肺、肝臟、腎臟)僅有的可能恢復(fù)性 治療目前而言是移植。盡管在許多情形下它導(dǎo)致完全的功能替代，但是已
知的不足是嚴(yán)重的；關(guān)于此應(yīng)當(dāng)提到的主要是捐獻(xiàn)器官的短缺，需要終生 免疫抑制以避免排斥反應(yīng)和病原體(尤其是病毒)傳播的風(fēng)險(xiǎn)。因此，能夠 恢復(fù)功能組織，可能恢復(fù)甚至整個(gè)器官的想法具有極大的治療興趣。
目前受到大量關(guān)注的方法是采用多能性的干細(xì)胞，為了再生目的，這 些干細(xì)胞能夠分化以產(chǎn)生各種組織。起初的假定是干細(xì)胞自身插入到損 害處(如梗塞的心肌組織)，它們自行構(gòu)造或再生功能組織，如它們?cè)谔烊粋€(gè)體發(fā)生過程中所做的那樣。然而已經(jīng)清楚的是，它不如假定的有價(jià)值， 且大面積損害不能直接以此方式處理。尤其是，具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)(更不用說整 個(gè)器官)的組織的恢復(fù)明顯不可能以此方式進(jìn)行。
正如目前已知的那樣，組織信號(hào)的存在對(duì)于組織或器官的生長(zhǎng)是基本 要素。在天然個(gè)體發(fā)生過程中，這些信號(hào)通過復(fù)雜且僅部分了解的可傳播
因子的網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用(已知為Spemann，s誘發(fā)物)介導(dǎo)。關(guān)于此， 在完整(complete)生物體中通過細(xì)胞在預(yù)成型結(jié)構(gòu)體中的排列(尤其是排列 到"細(xì)胞外基質(zhì)"的基本框架中)在再生方法中起著基本作用。"細(xì)胞外基質(zhì)，， 是指與細(xì)胞分開的但仍經(jīng)常與之接觸的所有結(jié)構(gòu)體的總和。作為組織細(xì)胞 的附著點(diǎn)且由于其自身的固有性質(zhì)(例如滲透性和機(jī)械穩(wěn)定性)，細(xì)胞外基 質(zhì)對(duì)于許多組織的穩(wěn)定性和功能性而言是重要的，而且由于它對(duì)于特定細(xì) 胞類型的特異性，它對(duì)于保持組織的器官化(形態(tài)發(fā)生(Morphostase))和動(dòng) 態(tài)平衡也是重要的。組織的器官化關(guān)于此是指細(xì)胞的正確空間排列，以及 動(dòng)態(tài)平衡是指它們隨時(shí)間(甚至在變化的應(yīng)力的情形下)的保持性能。
從活的有機(jī)體(包括患者)中切除、擴(kuò)張和刺激各種組織類型的活細(xì)胞 通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。然而，
提供這樣的合成的預(yù)成型結(jié)構(gòu)體(基質(zhì))仍然涉及一個(gè)實(shí)質(zhì)問題對(duì)于 該預(yù)成型結(jié)構(gòu)體，細(xì)胞可自身插入到該結(jié)構(gòu)體內(nèi)和細(xì)胞可自身附著于該結(jié) 構(gòu)體上，由此使得可形成能夠行使機(jī)能且適于再植入的組織(理想的是整個(gè) 器官)。
通過活細(xì)胞克隆預(yù)成型的合成結(jié)構(gòu)體原則上可在活體內(nèi)發(fā)生，但后移 植方法也是可能的，如人造骨組織用天然骨熔接。
作為醫(yī)學(xué)/藥學(xué)研究(特別是在藥物尋靶領(lǐng)域)的模型，人造組織或器官 的應(yīng)用除了在可再生治療中的用途以外還是對(duì)目前經(jīng)常使用的動(dòng)物器官的 有吸引力的替代，因?yàn)樗粌H可直接與人類組織一起工作，而且具有更好 的標(biāo)準(zhǔn)化和再現(xiàn)性的可能性。
在活體內(nèi)制備組織和器官經(jīng)常是指組織工程(例如參見P. L. Pabst， "Tissue engineering: a historical review as seen through the US Patent Office", Expert Opin. Ther. Patents 13 (2003): 347-352; L. G. Griffith和G.Vaughton， "Tissue Engineering — Current Challenges and Expanding Opportunities", Science 295 (2002): 1009-1012; E. Pennisi， "Tending Tender Tendons", Science 295 (2002): 1011)。
制備人造組織的最初嘗試采用軟骨，后者是富含在細(xì)胞外基質(zhì)中的幾 乎沒有代謝和生化活性并因此難以再生的組織。US 5,041,138和 US 5,736,372描述了人造組織片甚至在合成的預(yù)成型結(jié)構(gòu)體降解之后的空 間形狀的保持力，以及所述人造組織片甚至能夠以正確程度生長(zhǎng)的可能性， 這例如在兒科應(yīng)用中是重要的。因此，在該情形下可以談及完全恢復(fù)而不 僅僅是彌補(bǔ)。然而US 5,041,138和US 5，736，372僅僅涉及制備這樣的軟骨 結(jié)構(gòu)體(如耳朵、鼻子、食道)，該軟骨結(jié)構(gòu)體盡管在宏觀上具有復(fù)雜的形 狀，但僅顯示出輕微不同的微細(xì)結(jié)構(gòu)和低代謝活性。
此，基本方面是該物質(zhì)必須不能誘發(fā)任何炎癥或排斥反應(yīng)，這樣就排除了 開篇所述的許多通用的蛋白樣材料。此外，所述物質(zhì)應(yīng)當(dāng)是可生物降解的， 理想的是，其生物降解速率對(duì)應(yīng)于在特定器官中由源于生物的結(jié)構(gòu)體代替 之后的速率。這應(yīng)當(dāng)使得合成基質(zhì)可以被天然組織/結(jié)構(gòu)體察覺不到地替 代，而保持沒有機(jī)械穩(wěn)定性降低的臨界相時(shí)的形狀。所述降解的進(jìn)行優(yōu)選 應(yīng)當(dāng)沒有溶脹/分裂，而是通過腐蝕進(jìn)行，以使得人造結(jié)構(gòu)體的機(jī)械穩(wěn)定性 保持得盡可能長(zhǎng)。此外，在該降解中應(yīng)當(dāng)形成無(wú)毒性的單體或低聚物。
這對(duì)于預(yù)成型合成基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)以及構(gòu)成它的材料提出了某些要求。
聚合物生物材料的綜述由例如L.G. Griffith, "Polymeric Biomaterials"， Acta Mater. 48 (2000)，第263-277頁(yè)給出。既可提到天然材 料，如膠原質(zhì)和纖維蛋白，又可提到合成聚合物，如聚乙醇酸交酯和聚交 酯。對(duì)于成型，例如將聚乙醇酸交酯浸入聚交酯的CHCl3溶液中，并將經(jīng) 潤(rùn)濕的材料在才莫具中成型。然而，這種制備三維骨架的方式既不是非常精 確的，也不能應(yīng)用于制備如希望一般小或具有復(fù)雜形狀的骨架。此外，該 方法局限于具有較低軟化點(diǎn)或熔點(diǎn)的材料。
US 5,328,603描述一種制備在亞毫米范圍內(nèi)的纖維素珠粒的方法，其意圖應(yīng)用在色傳方法中。在該情形下，首先將纖維素通過離液序列高的鹽 增溶，然后將該原子化的液體放置于不溶解纖維素的介質(zhì)中。
WO 03/029329描述了通過在離子液體中增溶纖維素并隨后將該溶液 擠出含水介質(zhì)中而制備纖維素?cái)D出物。它沒有描述制備二維或三維纖維素 結(jié)構(gòu)體。
最初應(yīng)用于生物高分子的三維成型且全部基本上通過使該聚合物發(fā)泡 而起作用的隨機(jī)方法導(dǎo)致不足的結(jié)果，這是因?yàn)槌鲇谖锢碓?，獲得具 有被聚合材料彼此分開的許多不連續(xù)空腔的小泡結(jié)構(gòu)，而不是獲得希望的 基本上連續(xù)的、優(yōu)選支化的通道結(jié)構(gòu)。與此對(duì)比，基于鑄模的方法出于實(shí) 際原因得到專門的通道結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)僅以有限的程度為細(xì)胞提供附著和積 聚的可能性。此外，施用不熔融的材料(像大多數(shù)多糖)的施用是困難的。 天然的源于生物的聚合物的使用可導(dǎo)致形成海綿樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中存在通 道和空腔形狀但是該結(jié)構(gòu)大多數(shù)具有有限的機(jī)械穩(wěn)定性。在提到的三種情 形中的任一種中，不可能分化結(jié)構(gòu)性構(gòu)造或摻雜生長(zhǎng)因子或信號(hào)因子。這 對(duì)于尤其細(xì)菌纖維素也適用(A. Svensson等人，Biomaterials 26 (2005)， 419-431),該纖維素盡管其它方面的性質(zhì)令人滿意，但其僅適于空間簡(jiǎn)單 且基本結(jié)構(gòu)也簡(jiǎn)單的組織片，如人造關(guān)節(jié)軟骨。
在精密工程領(lǐng)域，對(duì)成型方法的合適程度的控制允許CAD/CAM(計(jì)算 機(jī)輔助設(shè)計(jì)/計(jì)算機(jī)輔助制造)領(lǐng)域的工藝小型化，現(xiàn)在經(jīng)常指桌面制造或 快速定型(prototyping)。 在這些工藝中，在計(jì)算機(jī)中制造待制造目標(biāo)的三 維模型，然后通過計(jì)算機(jī)控制的自動(dòng)化工具無(wú)需進(jìn)一步的中間階段進(jìn)行制 造。在這些情形中，計(jì)算機(jī)通常執(zhí)行將三維模型自動(dòng)分解成大量適于執(zhí)行 的有限元素的運(yùn)算法則并然后成功地將它們完成。
構(gòu)造方法就此而論是指那些方法，在該方法中，沒有由初始粘著的材
料塊中切開(cut out)空隙，而是所述材料在成型工藝過程中逐步地加載。
在該情形下，意圖的空腔也可以仍舊是空的，即填充工作介質(zhì)(空氣或所述 材料不溶于其中的液體介質(zhì))，或該空腔填充有可在成型工藝完成后例如通
過溶劑或加熱除去的占據(jù)空間的物質(zhì)。對(duì)于構(gòu)造方法，存在各種可能的變 形，包括化學(xué)和/或光化學(xué)反應(yīng)。構(gòu)造方法的實(shí)施原則上可分為印刷(不連續(xù))和標(biāo)繪(plotting)(連續(xù))這 兩類。在印刷中，將所述材料以網(wǎng)屏或光柵方式加載在上面，優(yōu)選從噴嘴 陣列加載，而在標(biāo)繪中將基本未間斷的材料線擠出。標(biāo)繪需要更大的工時(shí) 消耗，但加載技術(shù)和控制運(yùn)算法則產(chǎn)生更加均勻和可預(yù)測(cè)的結(jié)果。標(biāo)繪和 印刷以及它們?cè)诮M織工程領(lǐng)域中的用途描述在現(xiàn)有技術(shù)中(如V. L.Tsang 和S. N. Bhatia，"三維組織制造"，Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004): 1635-1647; A. Pfister等人，"用于組織工程應(yīng)用的生物學(xué)功能快速 定型；3D生物標(biāo)繪對(duì)3D印刷"，Journal of Polymer Science [A部分聚合 物化學(xué)j，第42巻(2004)，第624-638頁(yè))；E. Sachlos和J. T. Czernuszka，" 組織工程骨架制造工作"，Europ. Cells and Materials 5 (2003): 29-40; D. W. Hutmacher，"用于工程組織的骨架設(shè)計(jì)與制造技術(shù)"，J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 12 (2001): 107-124)。然而，，所述文獻(xiàn)中應(yīng)用的聚合物僅僅是 具有較低的軟化點(diǎn)或熔點(diǎn)并因而實(shí)際上可擠出的那些。
本發(fā)明的目的是提供一種方法，該方法使得可以精確地制造可以在形 成可再植入的或適于作為研究模型(例如作為組織工程領(lǐng)域中的骨架)的組 織中用作骨架的二維和/或尤其三維結(jié)構(gòu)體。該方法尤其意圖還允許使用這 樣的骨架材料該骨架材料盡管從生物學(xué)/醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)看是有利的，但由于它 們的物理化學(xué)性質(zhì)如熔點(diǎn)、模塑性或溶解性，利用形成骨架的常規(guī)方法不 能容易地加工。
上述目的通過一種制備可生物降解且生物相容的聚合物的二維或三維 骨架的方法得以實(shí)現(xiàn)，該方法包括下述步驟
(i) 在離液序列高的液體中增溶可生物降解且生物相容的聚合物；和 (ii-a)將在第 一步中獲得的溶液借助于針基本上連續(xù)地?cái)D出到與所述離液 序列高的液體混溶但是所述聚合物基本上不溶于其中的液體介質(zhì) 中，其中所述針和所得的骨架在擠出步驟過程中在二維或優(yōu)選三維 上相對(duì)于彼此移動(dòng)；或者 (ii-b)將在第 一 步中獲得的溶液借助于針擠出到與所述離液序列高的液體 混溶但是所述聚合物基本上不溶于其中的液體介質(zhì)中，以形成各個(gè) 直的、巻曲的或彎曲的聚合物線，其中所述針和所得的聚合物線在擠出步驟過程中相對(duì)于彼此移動(dòng)，如果合適的話，從液體介質(zhì)中分 離聚合物線并將該聚合物線連接以形成二維或三維骨架。 任意的可生物降解且生物相容的聚合物原則上都適于用作所述材料。
聚合物在本發(fā)明上下文中描述為"可生物降解的"，這是指它在有機(jī) 體內(nèi)的主流條件下，在合適的時(shí)間內(nèi)，如1年內(nèi)，優(yōu)選在幾周或幾個(gè)月的 過程中，可被化學(xué)或酶催降解成可溶解在體液中的單體或低聚物。
聚合物在本發(fā)明上下文中描述為"生物相容的"，這是指該聚合物或 其單體或低聚降解產(chǎn)物對(duì)有機(jī)體均不顯示出有害作用，如有毒和/或促炎作 用，尤其是指所述降解產(chǎn)物可以以原樣或者在有機(jī)體中經(jīng)常規(guī)轉(zhuǎn)變后被 排泄(裂解、偶合等)和/或在代謝中被利用，而不會(huì)發(fā)生毒性的、免疫的(如 促炎)、誘變、致癌、輔助致癌或形態(tài)發(fā)生(如產(chǎn)生畸形)的作用。
合適的聚合物的綜述例如由Toshio Hayashi在"生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的可生 物降解聚合物"，Prog. Polym. Sci.，第19巻，第663-702頁(yè)，(1994)中給出。
術(shù)語(yǔ)"骨架"在本發(fā)明上下文中是指包括至少兩個(gè)直的、巻曲的和/或 彎曲的棒或線并且其中至少一根線或棒經(jīng)常重疊或接觸的空間結(jié)構(gòu)體。"重 疊"關(guān)于此是指各線之間的角度不等于0，而接觸還包括0角度(例如當(dāng) 各線彼此平行時(shí))。在骨架內(nèi)還可以包括非棒狀元件，如平的、螺旋形的或 圓形元件。
"棒"或"線"是指這樣的結(jié)構(gòu)體，該結(jié)構(gòu)體在延展?fàn)顟B(tài)時(shí)("直的棒/線") 基本上是線性的，即，沿一維延展的空間。"線"是可通過擠出獲得的棒。 彎曲或巻曲的棒/線作為整個(gè)結(jié)構(gòu)考慮具有二維的范圍。
在本發(fā)明上下文中，如果結(jié)構(gòu)體在特定維數(shù)上的范圍大于1、優(yōu)選大 于2個(gè)線或棒直徑，則該結(jié)構(gòu)體要填補(bǔ)該特定維數(shù)。因而，根據(jù)US 5,328,603 的"珠粒"是零維，而延伸的單線是一維的。"三維骨架"是具有三個(gè)維數(shù)的 骨架。"二維骨架"具有兩個(gè)維數(shù)的范圍。盡管各個(gè)巻曲線或彎曲線根據(jù)上 述定義也是二維的，但是在本發(fā)明上下文中，二維骨架意圖指包括至少兩 個(gè)在至少一個(gè)點(diǎn)上重疊或接觸的棒/線且它們的接合程度僅限于二維的那 些。除了本發(fā)明的骨架以外，多維骨架還包括沒有線重疊的形狀，例如線 圏或巻材。盡管這些與本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語(yǔ)"骨架"不相對(duì)應(yīng)，但它們可構(gòu)成本發(fā)明骨架的一部分。
術(shù)語(yǔ)"增溶，，在本發(fā)明上下文中是指在無(wú)實(shí)質(zhì)加熱的情況下可將骨架材 料(聚合物)轉(zhuǎn)化成可流動(dòng)態(tài)、可傾倒態(tài)或可擠出態(tài)的轉(zhuǎn)化。這能夠使聚合 物轉(zhuǎn)化成溶劑化狀態(tài)，然而在其中各個(gè)聚合物分子不需要通過溶劑化護(hù)套 完全包封。有必要通過增溶將聚合物轉(zhuǎn)化成液態(tài)或轉(zhuǎn)化成至少軟化態(tài)。術(shù)
語(yǔ)"無(wú)實(shí)質(zhì)加熱"是指對(duì)于增溶采用的溫度不超過200°C,優(yōu)選不超過 150°C,特別優(yōu)選不超過120。C，尤其不超過100。C。
如果物質(zhì)能夠通過擾亂或影響分子間相互作用而同時(shí)又不影響分子內(nèi) 的共價(jià)鍵而破壞大分子的超分子締合，則該物質(zhì)指的是"離液序列高的"。
術(shù)語(yǔ)"擠出，，在本發(fā)明上下文中不限于特定的制造技術(shù)，而非常一般 性地是指使可流動(dòng)材料基本上連續(xù)地強(qiáng)制通過較窄的孔(即，最廣義的概念 為噴嘴)如通過針。"基本上連續(xù)地"關(guān)于此是指，擠出操作也可以反復(fù)地中 斷，例如以為了制備各個(gè)聚合物線(例如如步驟(ii-b)),或在步驟(ii-a)中變 換不同的空間平面。然而，它不發(fā)生周期性的中斷以使得僅制得零維結(jié)構(gòu) 體，例如珠粒。
"基本上連續(xù)的"聚合物棒是在延伸狀態(tài)時(shí)是一維的聚合物結(jié)構(gòu)體，即， 不是通過將零維結(jié)構(gòu)體連接在一起和/或以特定排列熔合零維結(jié)構(gòu)體而制 備的結(jié)構(gòu)體。關(guān)于此優(yōu)選的是，所述棒具有基本上均勻的厚度，尤其是它 沒有顯示出更厚和更薄片段的有節(jié)奏的交替，以及分子結(jié)構(gòu)在維度方向上 基本上是均勻的，尤其是分子結(jié)構(gòu)在維度方向上沒有顯示出有節(jié)奏的交替。 進(jìn)一步優(yōu)選的是，棒中的聚合物鏈基本上彼此平行排列并且在棒的縱向上 平行排列，尤其是聚合物鏈在縱向維度上平行重疊以致于產(chǎn)生分子間的接 觸面積。關(guān)于此特別優(yōu)選的是，所述重疊的程度在棒的整個(gè)長(zhǎng)度上是基本 上均勻的。在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物鏈的重疊導(dǎo)致形成部分結(jié) 晶的區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過共價(jià)交聯(lián)在重疊區(qū)域可以進(jìn)行隨后 的穩(wěn)定化。表述"基本上"是指例如通過擠出步驟引起的常見偏差是可容忍 的。
術(shù)語(yǔ)"針"是指在第一步中制備的溶液可連續(xù)強(qiáng)制通過的任意類型的噴嘴。"針和骨架或針和聚合物線相對(duì)于彼此移動(dòng)"是指在擠出步驟(ii)期 間，針與骨架或與聚合物線或與包含聚合物擠出到其中的液體介質(zhì)的容器 移動(dòng)的每一對(duì)中，針可以單獨(dú)移動(dòng)或者每對(duì)中的兩者均可移動(dòng)。從步驟(ii-a) 的整體考慮，該移動(dòng)在兩個(gè)空間方向上發(fā)生(二維移動(dòng))或優(yōu)選在所有的三 個(gè)空間方向上發(fā)生(三維移動(dòng))，或從步驟(ii-b)的整體考慮，該移動(dòng)在一個(gè) 或兩個(gè)空間方向上進(jìn)行。在一個(gè)空間方向上的移動(dòng)產(chǎn)生直的聚合物線，而 二維相對(duì)移動(dòng)產(chǎn)生巻曲或彎曲的線。在步驟(ii-b)中還可以存在針和聚合物 線的三維相對(duì)移動(dòng)，以例如形成螺旋或圓形元素，這些元素也可以是骨架 的 一部分但優(yōu)選以較d 、程度摻入。
"三維移動(dòng)"或"在三個(gè)空間方向上移動(dòng)，，是指針孔的位置在所有三個(gè) 空間維度上相對(duì)于已經(jīng)形成的骨架被改變。在步驟(ii-a)的特別實(shí)施方案中， 擠出機(jī)構(gòu)可在所有三個(gè)空間維度上位移。在步驟(ii-a)的可供選擇的實(shí)施方 案中，擠出機(jī)構(gòu)可在至少兩個(gè)空間維度上位移，而已經(jīng)形成的骨架可在至 少一個(gè)空間維度上移動(dòng)，以使得擠出機(jī)構(gòu)中缺少的空間維數(shù)(自由度)可通 過位移已經(jīng)形成的骨架來(lái)彌補(bǔ)。在步驟(ii-a)的進(jìn)一步可供選擇的實(shí)施方案 中，擠出機(jī)構(gòu)可在至少一個(gè)維度上位移，而已經(jīng)形成的骨架在至少二個(gè)維 度上位移，以使得擠出機(jī)構(gòu)中缺少的自由度可通過已經(jīng)形成的骨架的移動(dòng) 性來(lái)彌補(bǔ)。在步驟(ii-a)的進(jìn)一步可供選擇的實(shí)施方案中，擠出機(jī)構(gòu)基本上 不動(dòng)，而已形成的骨架可在所有三個(gè)空間維度上位移。
類似的說明對(duì)于步驟(ii-a)或(ii-b)中的"一維或二維移動(dòng)"是適用的，即 擠出機(jī)構(gòu)或所得的聚合物線(或更準(zhǔn)確地是后者擠出到其中的容器)是可移 動(dòng)的。在二維相對(duì)移動(dòng)的情形下，還可能的是擠出機(jī)構(gòu)在一個(gè)空間維度 上移動(dòng)，而聚合物線在不同于它的空間方向上移動(dòng)。
"基本上不溶"是指聚合物在液體介質(zhì)中的溶解度小于5g/L，優(yōu)選小 于0.5g/L，特別優(yōu)選小于0.05g/L。
"液體介質(zhì)"是指其物理化學(xué)性質(zhì)主要由液體溶劑的物理化學(xué)性質(zhì)決定 的介質(zhì)。作為在可溶性或可溶脹的大分子存在下的結(jié)果，液體介質(zhì)也可以 具有凝膠樣稠度。
"烷基"代表直鏈或支鏈的烷基。烷基優(yōu)選d-C6烷基。d-C6烷基代表直鏈或支鏈的具有1 6個(gè)碳原子的烷基。其實(shí)例是甲基、乙基、丙基、異 丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、正己基及這些的構(gòu)造 異構(gòu)體。d-C4烷基代表直鏈或支鏈的具有1~4個(gè)碳原子的烷基。其實(shí)例 是甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基和叔丁基。
d-C6烷氧基代表經(jīng)由氧原子連接的d-C6烷基。其實(shí)例是曱氧基、乙
氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基、
戊氧基、己氧基及這些的構(gòu)造異構(gòu)體。d-C4烷氧基代表經(jīng)由氧原子連接 的d-C4烷基。其實(shí)例是曱氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、
仲丁氧基、異丁氧基和叔丁氧基。
d-C6烷氧基-C,-C6烷基代表其中的 一個(gè)或多個(gè)氫原子被crc6烷氧基
替代的d-C6烷基。其實(shí)例是甲氧基曱基、乙氧基曱基、丙氧基曱基、1-和2-甲氧基乙基、l-和2-乙氧基乙基、l-和2-丙氧基乙基等。d-C4烷氧基
-C廣C4烷基代表其中的一個(gè)或多個(gè)氫原子被C廣C4烷氧基替代的C廣C4烷
基。其實(shí)例是上述基團(tuán)。
芳基代表優(yōu)選具有6~14個(gè)碳原子的碳芳基。其實(shí)例是任選取代的苯 基、任選取代的萘基、任選取代的蒽基和任選取代的菲基。合適的取代基 實(shí)例是鹵素、CVC6烷基、N02、 OH和CN。芳基優(yōu)選苯基或取代的苯基， 如曱苯基、二甲苯基、硝基苯基或氯苯基。
芳基-CrC6烷基代表經(jīng)由CrC6烷基、優(yōu)選d-C2烷基連接的芳基， 如千基或2-苯基乙基。
芳氧基代表經(jīng)由氧連接的芳基，如苯氧基。
芳基-d-C6烷氧基代表其中的一個(gè)氫原子被芳基替代的d-C6烷氧基、
優(yōu)選d-C2烷氧基，如節(jié)氧基。
芳氧基-CVC6烷基代表其中的一個(gè)氫原子被芳氧基替代的d-C6烷基、
優(yōu)選d-C2烷基。
閨素代表氟、氯、溴或不典，尤其是氟或氯。
CVC6單羧酸的酸陰離子是脂肪族d-C6單羧酸的酸陰離子。其實(shí)例是 乙酸根、丙酸根、丁酸根、異丁酸根、戊酸根、己酸根等。
C2-C6 二羧酸的一價(jià)陰離子和二價(jià)陰離子是脂肪族C2-C6 二羧酸的單價(jià)陰離子或二價(jià)陰離子，如如下酸的一價(jià)陰離子或二價(jià)陰離子草酸、丙 二酸、琥珀酸、己二酸等。
下文關(guān)于本發(fā)明主題的優(yōu)選實(shí)施方案所作的說明適用于它們自身以及 相互的組合。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物骨架材料是有機(jī)聚合物。有 機(jī)聚合物關(guān)于此是指其單體基本上是有機(jī)分子的聚合物，所述有機(jī)分子例 如是醇類，尤其是二醇和多元醇；羧酸，尤其是羥基二羧酸和氨基酸；胺，
尤其是二胺和多胺；氨基酸；糖類，尤其是葡萄糖和果糖單元。"基本上是
有機(jī)分子"是指這些分子還可包含無(wú)機(jī)組分，如金屬陽(yáng)離子或卣素離子，但 分子的整個(gè)性質(zhì)是有機(jī)的。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物是生物大分子。生物大分子關(guān)于此 是指其單體是天然存在的(如糖類和氨基酸)的聚合物，尤其是其整個(gè)結(jié)構(gòu)
都天然存在的聚合物。生物大分子的實(shí)例是蛋白，如絲蛋白；以及多糖， 如纖維素、纖維素衍生物、甲殼質(zhì)、殼聚糖、葡聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟 骨素、木聚糖和淀粉。
聚合物更優(yōu)選選自多糖和改性多糖，尤其是選自多糖。這些不僅滿足 在組織工程領(lǐng)域中對(duì)于合適材料的化學(xué)和機(jī)械的要求；與許多蛋白相比， 它們額外地是免疫學(xué)上可接受的。合適多糖的實(shí)例是纖維素、纖維素衍生 物、甲殼質(zhì)、殼聚糖、葡聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、木聚糖和淀粉。
在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將纖維素或纖維素衍生物應(yīng)用于本發(fā)明 方法中。合適的纖維素衍生物的實(shí)例是甲基纖維素、乙基纖維素、丙基纖 維素、羥乙基纖維素和羥丙基纖維素。尤其使用纖維素。任何已知形式的 纖維素可用作纖維素，如紙漿、棉花、由紙張獲得的纖維素或細(xì)菌纖維素。
聚合物可在增溶前如通過研磨和/或切碎適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行機(jī)械尺寸降低。
聚合物可以單獨(dú)或與其它組分一起用于步驟(i)中。優(yōu)選的其它組分是 有利地影響骨架構(gòu)造和/或影響骨架的隨后使用的那些。合適組分的實(shí)例是 無(wú)機(jī)顆粒，如羥基磷灰石顆粒和非骨架性的生物大分子，即不同于骨架聚 合物的生物大分子，如蛋白、蛋白片段、肽或某些碳水化合物。在優(yōu)選的 實(shí)施方案中，非骨架性的生物大分子用作有利于細(xì)胞的粘附和/或有利于器官化的超細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成的額外組分。合適的非骨架性的生物大分子的實(shí) 例是基質(zhì)蛋白，如纖連蛋白、玻連蛋白、膠原質(zhì)、層粘連蛋白、外源凝聚
素、組織提取物、生長(zhǎng)因子，如VEGF或融合蛋白，或所述蛋白的其它衍 生物。其它合適的生物大分子是包含氨基酸圖形R-G-D的蛋白或肽，還 有利于粘附的碳水化合物，如sialyl-LewisX或其片段，或以其它方式具有 生物活性的碳水化合物，如肝磷脂或其片段。相應(yīng)的分子在每種情形下可 與聚合物分子共價(jià)或非共價(jià)連接。
當(dāng)應(yīng)用于步驟(i)的聚合物包含一種或多種所述生物大分子時(shí)，后者的 存在量基于骨架聚合物的總重量?jī)?yōu)選為0.1 5%重量，尤其是1~2%重量。
當(dāng)骨架聚合物包含無(wú)機(jī)顆粒如羥基磷灰石時(shí)，這些無(wú)機(jī)顆粒的存在量 基于骨架聚合物的總重量?jī)?yōu)選為1 20%重量，尤其為5 10%重量。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，離液序列高的液體基本上是無(wú)水的。"基 本上無(wú)水"是指離液序列高的液體基于該離液序列高的液體的總重量，包含 小于5%重量的水，優(yōu)選小于2%重量的水，特別優(yōu)選小于1%重量的水。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，離液序列高的液體基本上不含含氮堿。 "基本上不含含氮堿"是指，離液序列高的液體基于該離液序列高的液體的 總重量，包含小于5%重量、優(yōu)選小于2%重量、特別優(yōu)選小于1%重量的 含氮堿。含氮堿例如是氨、胺以及具有至少一個(gè)堿性氮原子作為環(huán)成員的 芳族或非芳族雜環(huán)。
離液序列高的液體優(yōu)選是在不超過150°C，如在-100。C +150。C或在 0 +150。C或50~+150。C的溫度范圍，特別優(yōu)選不超過120。C ， 如-50。O+120。C或0~+120°C或50~+120。C的溫度范圍，尤其不超過 100。C，如-10。O+100。C或0~+100。C或50~+100°C的溫度范圍的溫度下 是液體。這是指，該離液序列高的液體的熔點(diǎn)優(yōu)選不超過150°C，特別優(yōu) 選不超過120。C,尤其不超過100。C。
增溶步驟也可借助于超聲進(jìn)行。
在本發(fā)明的特別實(shí)施方案中，加熱通過微波輻照進(jìn)行。 增溶優(yōu)選在不超過200°C，如0 200°C或優(yōu)選20。~200°C或特別優(yōu)選 50 200。C或尤其100 200。C，特別優(yōu)選不超過150°C，如0°O+150°C或優(yōu)選20~150°C或特別優(yōu)選50~150°C或尤其100~150°C，更優(yōu)選不超過 120。C，如0。C 120。C或優(yōu)選20 120°C或特別優(yōu)選50~120°C或更優(yōu)選 80 120。C或尤其100 120。C,以及尤其不超過100。C,如0。C~+100。C或 優(yōu)選20 100°C或特別優(yōu)選50~100°C或尤其80~100°C的溫度下進(jìn)行。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，離液序列高的液體選自液體鹽。液體鹽 也稱作離子液體。離子液體通常是指在其中離子僅微弱配位以使得這些鹽 在較低溫度下(如低于150。C或低于100。C或甚至在室溫)是液體的鹽。在 該情形下，至少一種離子的電荷是離域的，且至少一種離子的性質(zhì)是有機(jī) 的，由此防止了穩(wěn)定晶格的形成。
液體鹽優(yōu)選具有式Het+Ax-1/X。
關(guān)于此，Het+是帶正電荷的N-烷基化、N-芳基化、N-芳基烷基化、N-烷氧基化、N-芳氧基化、N-芳基烷氧基化、N-烷氧基烷基化和/或N-芳氧 基烷基化的含氮雜環(huán)。換言之，Het+是這樣的帶正電荷的含氮雜環(huán)，其中 通常環(huán)氮原子經(jīng)由其游離電子對(duì)帶有鍵合的烷基、芳基、芳基烷基、烷氧 基、芳氧基、芳基烷氧基、烷氧基烷基和/或芳氧基烷基，以使得在雜環(huán)上 產(chǎn)生正電荷，即，雜環(huán)的正電荷歸功于環(huán)氮原子的游離電子對(duì)上的取代。
在所述基團(tuán)中的烷基優(yōu)選為d-C6烷基。所述基團(tuán)中的烷氧基優(yōu)選為 d-C6烷氧基。所述基團(tuán)中的芳基優(yōu)選為苯基。所述基團(tuán)中的芳基烷基優(yōu) 選為芳基-CVC6烷基，如節(jié)基或苯乙基。所述基團(tuán)中的芳氧基優(yōu)選為經(jīng)由 氧連接的苯基，如苯氧基。所述基團(tuán)中的芳基烷氧基優(yōu)選為芳基-d-C6烷 氧基，如芐氧基。所述基團(tuán)中的烷氧基烷基優(yōu)選為CrC6烷氧基-d-C6烷 基。所述基團(tuán)中的芳氧基烷基優(yōu)選為芳氧基-d-C6烷基，尤其是苯氧基
-C廣C6坑基》
取決于Het+是否是其中環(huán)氮原子不是雙鍵的一部分的芳族雜環(huán)或脂環(huán) 族雜環(huán)，形式上產(chǎn)生正電荷的氮原子被上述基團(tuán)取代一次或兩次。 A、,x是陰離子，其中x為l、 2或3。 Het+優(yōu)選選自
-帶正電荷的5-或6-元芳族雜環(huán)，其包含作為環(huán)成員的基團(tuán)NRa并任選包 含一個(gè)或兩個(gè)選自N、 O、 S、 NRb、 SO和S02的雜原子或含雜原子基團(tuán)，
-帶正電荷的5-或6-元芳族雜環(huán)，其包含作為環(huán)成員的基團(tuán)NRa并任選包
含一個(gè)或兩個(gè)選自N、 O、 S、 NRb、 SO和S02的雜原子或含雜原子基
團(tuán)，并且該芳族雜環(huán)與苯環(huán)稠合，和 -帶正電荷的5-或6-元飽和脂環(huán)族雜環(huán)，其包含作為環(huán)成員的基團(tuán)NRaRa'
并且任選包含一個(gè)或兩個(gè)選自O(shè)、 S、 NRb、 SO和S02的雜原子或含雜
原子基團(tuán)， 其中
Ra和Ra'各自獨(dú)立地為CrC6烷基、芳基、d-C6烷氧基、芳氧基、CrC6 烷氧基-CVC6烷基或芳氧基-d-C6烷基，優(yōu)選d-C6烷基或d-C6烷 氧基-d-C6烷基；和 -
Rb為氫、d-C6烷基、芳基、d-C6烷氧基、芳氧基、C廣C6烷氧基-C廣C6 烷基或芳氧基-CrC6烷基,優(yōu)選d-C6烷基或d-C6烷氧基-d-C6烷基;
其中所述的脂環(huán)族或芳族雜環(huán)或者后者可與之稠合的苯環(huán)可具有1 5個(gè) 選自CrC6烷基、CrC6烷氧基和CrC6烷氧基-d-C6烷基的取代基。 Het+特別優(yōu)選選自式Hetl HeU5的化合物
<formula>formula see original document page 18</formula><formula>formula see original document page 19</formula>
其中
R1和R2各自獨(dú)立地為d-C6烷基或CrC6烷氧基-C，-C6烷基；和
R3 R9各自獨(dú)立地為氫、C廣C6烷基、C廣C6烷氧基-C廣C6烷基或d-C6
烷氧基，特別優(yōu)選氫。
優(yōu)選W和W均為d-C4烷基或d-C4烷氧基-d-C4烷基，其中這些
基團(tuán)之一特別優(yōu)選是甲基。特別優(yōu)選W和I^均為d-C4烷基。尤其RJ或 W之一為曱基，而另一個(gè)為C廣Q烷基，如乙基。 R3 R9優(yōu)選為H。
Het+優(yōu)選為單環(huán)。因此，Het+優(yōu)選選自式Het.l HeU3的化合物。Het+ 特別優(yōu)選5-元單環(huán)。因此，Het+特別優(yōu)選選自式Het.5 HeUl和Hetl3的
化合物。
Het+更優(yōu)選為式Het.5的咪唑銪離子、式Het6的吡唑錯(cuò)離子、式Het.7的噁唑镥離子、式Het.8或Het.9的1，2，3-三唑镥離子、式Het.10的1，2，4-三唑錯(cuò)離子或式Het.ll的噻唑錯(cuò)離子，其中R匕RS如上定義。此處也相應(yīng) 地適用上文關(guān)于優(yōu)選的基團(tuán)R^RS的說明，即，W和I^優(yōu)選均為Q-C4 烷基或d-C4烷氧基-d-C4烷基，特別優(yōu)選d-C4烷基，其中特別優(yōu)選這
些基團(tuán)之一為曱基。尤其是，基團(tuán)W或ie之一為甲基，而另一個(gè)為CrC4
烷基，如乙基。F^ R5優(yōu)選為H。
Het+更優(yōu)選為式Het.5的咪唑錄離子，其中1^ R5如上定義。此處也 相應(yīng)地適用上文關(guān)于優(yōu)選的基團(tuán)R1 115的說明，即，R1和W優(yōu)選均為Q-C4 烷基或d-C4烷氧基-d-C4烷基，特別優(yōu)選d-C4烷基，其中特別優(yōu)選這 些基團(tuán)之一為曱基。RS RS優(yōu)選為H。因此，Het+尤其是式Het5的咪唑鏞 離子，其在一個(gè)環(huán)氮原子上帶有曱基，而在另一個(gè)環(huán)氮原子上帶有CrC4 烷基或d-C4烷氧基-d-C4烷基。在該情形下，R3、 R"和RS特別是H。尤 其是，基團(tuán)R'或R"之一為甲基，而另一個(gè)為C廣C4烷基，如乙基。
AX-仏優(yōu)選選自配位陰離子，即原則上能夠配位的那些，例如與金屬中 心配位的那些。
AX-仏優(yōu)選選自鹵離子、擬鹵離子、高氯酸根、d-C6單羧酸的酸陰離 子以及C2-C6二羧酸的一價(jià)陰離子和二價(jià)陰離子，其中單羧酸和二羧酸可
以被卣素和/或鞋基取代一次、兩次或三次。優(yōu)選的酸陰離子是乙酸根。
AX-仏特別優(yōu)選選自鹵離子、擬鹵離子和乙酸根。
擬鹵離子的實(shí)例是氰離子(CN-)、氰酸根離子(OCN—)、異氰酸根離子 (CNCT)、硫代氰酸根離子(SCN-)、硫代異氰酸根離子(NCS-)和疊氮離子 (N3_)。
A x尤其是氯離子、溴離子、氰酸根離子、硫代氰酸根離子或乙酸根。 Ax—1/X特別為氯離子或乙酸#>。
特別是，Het+Ax-1/X是氯化咪唑錯(cuò)鹽Het.5-Cr或乙酸咪唑鏘鹽 Het.5-(CH3COO-)，其中咪唑錄離子優(yōu)選如上被取代。
在可供選擇的優(yōu)選實(shí)施方案中，離液序列高的液體選自離液序列高的 鹽在極性非質(zhì)子溶劑中的溶液。
無(wú)機(jī)鹽優(yōu)選選自堿金屬面化物、堿土金屬卣化物、卣化銨、堿金屬擬卣化物、堿土金屬擬氯化物、擬卣化銨、堿金屬高氯酸鹽、堿土金屬高氯 酸鹽、高氯酸銨以及前述鹽的混合物。
無(wú)機(jī)鹽特別優(yōu)選選自氯化鋰、硫代氰酸釣、多典化鈉、高氯酸鈉以及前 述鹽的混合物。
優(yōu)選的極性非質(zhì)子溶劑是二曱基曱酰胺、二曱基乙酰胺、二曱亞砜和 二乙胺以及前述化合物的混合物。
離液序列高的液體特別優(yōu)選選自如上所述的離子液體。關(guān)于此參考上 文關(guān)于離子液體的優(yōu)選實(shí)施方案所作的說明。
本發(fā)明方法的步驟(i)進(jìn)行的方式通常應(yīng)使得將如果合適的話，先前 進(jìn)行過碾磨的聚合物，與離液序列高的液體機(jī)械混合并攪拌直至完全溶解。 在本發(fā)明的特別實(shí)施方案中，在所述混合的過程中或之后加熱混合物，以 加快溶解和均化步驟，例如如通過微波輻照加熱，但優(yōu)選加熱到溫度不超 過150。C，更優(yōu)選不超過120。C，尤其不超過100。C。
在優(yōu)選實(shí)施方案中。增溶的聚合物在離液序列高的液體中的濃度為 5~35%重量，優(yōu)選5 25%重量，尤其是10~25%重量。
當(dāng)將增溶的聚合物《I入到液體介質(zhì)中時(shí)(步驟(ii))，它在非常短的時(shí)間 內(nèi)如小于l秒內(nèi)沉淀。該引入通過擠出進(jìn)行，即，將增溶物擠出通過針。 在將離液序列高的溶液引入到離液序列高的組分可溶于其中但是聚合物材 料基本上不溶于其中的液體介質(zhì)中時(shí)，聚合物沉淀。
將聚合物橋出到液體介質(zhì)中通過可移動(dòng)的針來(lái)進(jìn)行，所述針優(yōu)選是自 動(dòng)化裝置的組件。使針或使液體介質(zhì)存在于其中的容器或者使這兩者在此 期間移動(dòng)，其移動(dòng)方式應(yīng)使得在變型(ii-a)中的擠出物呈現(xiàn)三維骨架、網(wǎng) 絡(luò)或網(wǎng)格的形狀，而在變型(ii-b)中的擠出物呈現(xiàn)直的、巻曲的或彎曲的聚 合物線的形狀。
應(yīng)用于步驟(ii)的液體介質(zhì)一方面與步驟(i)的離液序列高的液體混溶， 而另一方面，所用的聚合物基本上不溶于其中。優(yōu)選的液體介質(zhì)是質(zhì)子溶 劑，如水和鏈烷醇；環(huán)醚，如四氬呋喃和二^惡烷；酮，如丙酮和甲乙酮； 腈類，如乙腈；以及前述溶劑的混合物。優(yōu)選的液體介質(zhì)是質(zhì)子溶劑，如 水和鏈烷醇，及它們的混合物。合適的鏈烷醇是d-C4鏈烷醇，例如曱醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇和+又丁醇。液體介質(zhì)優(yōu)選含水，即
它包含至少10%重量的水。液體介質(zhì)特別優(yōu)選包含至少50%重量的水，尤 其是至少80%重量的水。含水介質(zhì)的其它組分優(yōu)選選自Q-C3鏈烷醇，如 曱醇、乙醇、正丙醇和異丙醇。尤其是使用水。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，在骨架、網(wǎng)格或網(wǎng)絡(luò)的各元素之間的接 觸點(diǎn)或重疊點(diǎn)通過聚電解質(zhì)來(lái)穩(wěn)定。
稱作"聚電解質(zhì)"的聚合物是其重復(fù)單元具有能夠接收或釋放質(zhì)子的基 團(tuán)，因而能夠在質(zhì)子介質(zhì)、尤其是含水介質(zhì)中接收電荷并再將它們釋放的 那些，它們?cè)诜肿觾?nèi)可以帶正電荷和/或帶負(fù)電荷。在含水介質(zhì)中帶負(fù)電荷 的基團(tuán)的實(shí)例是羧基，在含水介質(zhì)中帶正電荷的基團(tuán)的實(shí)例是氨基。原則 上所有常用的聚電解質(zhì)均是合適的。合適的聚電解質(zhì)的實(shí)例是用作添加劑 以增加在造紙中紙張的濕強(qiáng)度的化合物，如聚羧酸，如聚丙烯酸；聚胺， 如聚乙烯胺；聚亞胺，在酰胺結(jié)構(gòu)部分中不飽和的羧酰胺與不飽和羧酸的 共聚物，如N-乙烯基甲酰胺/丙烯酸共聚物；可聚合的堿性雜環(huán)，如N-乙 烯基吡咯烷酮；聚胺與表氯醇的反應(yīng)產(chǎn)物；環(huán)氧化聚酰胺，脲樹脂、蜜胺 樹脂、聚氨酯等。所述的濕強(qiáng)度劑例如描述在EP 01 118 439中，該文獻(xiàn)引 入本文作為參考。
然而，優(yōu)選的聚電解質(zhì)是聚羧酸，例如聚丙烯酸，單一的脂族聚胺， 例如聚乙烯胺，和可聚合的堿性雜環(huán)，即具有環(huán)外烯屬雙鍵的雜環(huán)，例如 聚乙烯吡咯烷酮。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，聚電解質(zhì)是增溶的聚合物擠出到其中的 液體介質(zhì)的組分。關(guān)于此優(yōu)選的是，液體介質(zhì)包含基于該液體介質(zhì)的總重 量，至多20%重量的聚電解質(zhì)，尤其是5~10%重量的聚電解質(zhì)。
然而，在骨架、網(wǎng)格或網(wǎng)絡(luò)的不同元素之間的接觸點(diǎn)或重疊點(diǎn)也可以 按照下文關(guān)于工藝變型(ii-b)所述進(jìn)行穩(wěn)定。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，骨架的各個(gè)部分或者所有部分提供有作 用于活細(xì)胞的信號(hào)因子或生長(zhǎng)因子。相應(yīng)的因子(如VEGF或NGF)是本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟悉的。取決于它們的各物理或化學(xué)性質(zhì)，這些因子優(yōu)選加入 到如上所迷的步驟(i)中的待擠出材料中("摻雜")，或者在步驟(ii)的擠出工藝過程中涂覆到所得線的表面上或然后使用合適的針涂覆到所得線的表面 上。
所得的聚合物骨架關(guān)于所述因子的分布可以是均勻的，但優(yōu)選導(dǎo)致形 成信號(hào)因子梯度并因而給出形成新組織(如血管和神經(jīng)纖維的向內(nèi)生長(zhǎng))方 向的非均勻分布。特別優(yōu)選的是，信號(hào)因子的不均勻性與骨架、網(wǎng)格或網(wǎng) 絡(luò)的結(jié)構(gòu)不均勻性以合適的方式通過讓大的高度摻雜的凹穴自由(如對(duì)于 血管或神經(jīng))或者產(chǎn)生用于形成更復(fù)雜器官結(jié)構(gòu)的先決條件進(jìn)行組合。
在步驟(ii-a)的優(yōu)選實(shí)施方案中，擠出的進(jìn)行方式應(yīng)使得骨架基本上 以分層方式構(gòu)造使得形成具有層結(jié)構(gòu)的骨架，即，大多數(shù)的棒或線位于彼 此平行的平面中，其中各相鄰層之間的穩(wěn)定化接觸主要通過線的重疊產(chǎn)生， 而不位于平面中的棒或線的貢獻(xiàn)對(duì)于層間的相互作用是不重要的，并因此 對(duì)于骨架的三維穩(wěn)定性也是不重要的。"基本上以分層方式構(gòu)造"是指，骨 架也可包含不屬于這些層的線排列，但所述骨架主要(例如，基于全部構(gòu)造 成骨架的聚合物線的長(zhǎng)度，有至少60%、優(yōu)選至少80%、尤其至少90%) 由聚合物線以分層方式排列。
每一層優(yōu)選主要由彼此平行走向的擠出物線、尤其是往復(fù) (bustrophedon)線(即，擠出物線在一個(gè)方向上和其相反方向上從相鄰線到 相鄰線交替地走向)組成。不平行走向的元素的比例在該情形下不重要。如 果要將網(wǎng)格狀的可透過結(jié)構(gòu)體提供在平面的相關(guān)區(qū)域中，則每一層的線的 穩(wěn)定化主要通過與相鄰層或相鄰各層的線的接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，平面或部 分平面也可以通過在相關(guān)區(qū)域中彼此放置得如此近以致于接觸的平行走向 的線而具有不可滲透的構(gòu)造。
關(guān)于此，對(duì)于骨架的機(jī)械穩(wěn)定，優(yōu)選的是，相鄰平面的線彼此既不平 行也不反平行。特別優(yōu)選的是，相鄰層之間的線的角度為90°、 60?；?5°。
在步驟(ii-a)的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，擠出的進(jìn)行方式應(yīng)使得各層 基本上由呈二維空間填充曲線的形式(FASS曲線；FASS-空間填充，自避 免，簡(jiǎn)單和自相似)的擠出物線構(gòu)造。"基本上"是指，基于構(gòu)造成各層的聚 合物線的總長(zhǎng)度，至少60%、優(yōu)選至少80%、尤其至少卯％的層由呈二 維空間填充的曲線形式的聚合物線構(gòu)成。FASS曲線是這樣的路線，該路線在由許多均勻區(qū)塊組成的區(qū)域上引出，或者該路線穿過由許多"室"組成 的三維或多維空間，以至于每個(gè)區(qū)塊或每個(gè)室接觸，而該路線自身不交叉。 這導(dǎo)致形成的結(jié)構(gòu)體相比于當(dāng)平面由平行線構(gòu)成時(shí)在平面的兩個(gè)維度上更
均勻。優(yōu)選的特定類型的FASS曲線是Peano曲線、Hilbert曲線和 Sierpi6ski曲線。
在該實(shí)施方案中，對(duì)于制備，優(yōu)選將每個(gè)平面劃分成許多區(qū)域，每個(gè) 區(qū)域基本上獨(dú)立于同一平面的其它區(qū)域填滿。關(guān)于此優(yōu)選的是，將相鄰平 面劃分到不同的區(qū)域組中。每個(gè)平面特別優(yōu)選劃分產(chǎn)生最大比例的四方區(qū) 域，這些四方區(qū)域在每種情形下由FASS曲線填滿。關(guān)于此特別優(yōu)選的是， 待劃分的各區(qū)域能夠使擠出盡可能地連續(xù)。
關(guān)于此同樣特別優(yōu)選的是，平面的劃分方式應(yīng)使得它基本上(例如至 少50%、優(yōu)選至少75%、尤其至少90%)由FASS曲線組成。
FASS曲線可通過對(duì)給定區(qū)塊的回歸算法產(chǎn)生。相應(yīng)的方法是本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟悉的且例如描述于下列文獻(xiàn)中V. Batagelj: Z^g( to尸MWc77;pr. 為Eurologo'97準(zhǔn)備的文章，Ljublj ana 1997; A.J. Cole: j w她s/ ace cwrves. Software - Practice and Experience, 13(1983)， 1181-1189; A.J. Cole: J wote 戶eafi0 i^(^ms aw</ Ofly CWes. International Journal of Computer Mathematics, 18(1985)， 3-13; C. Davis, D. E. Knuth: 7Vw附^
/ e/7fesew似,/o附 awf/ Z)mg0/1 Cw/W51， Journal of Recreational
Mathematics, 3(1970)， 66-81; 3(1970)， 133-149; F.M. Dekking， M. Mendes
France, A. van der Poorten: Fo/fife !. The Mathematical Intelligencer, 4(1982)， 130-138; 4(1982)， 173-181; 4(1982)， 190-195; F.M. Dekking: / ec鮮e"f 5Ws. Advances in Mathematics, 44(1982)， 78-104; A.J. Fisher:」 ew fl/goW幼附Z/i76eW c""ves. Software - Practice and Experience, 16(1986)， 5曙12; W.J. Gilbert: Fni""/ Geo附"/j Z)enVed /h 附 CV 附/7fex: 5"亂The Mathematical Intelligencer, 4(1982)， 78-86; J. Giles, Jr.: Cbws,尸w"/ow /^//ctfriwg 5"M/ e/^Mres1. Journal of Combinatorial Theory, Series A， 26(1979)， 328-334; L.M. Goldschlager: fl/gw幼附s 5/7flce-/Z〃/"g c"fves. Software - Practice and Experience, 11(1981)， 99;A. Null: iS/mce-/ //— cwves， o/* /row to謹(jǐn)他,/歸w/幼a / /o股r. Software -Practice and Experience, 1(1971)， 403-410 ; P. Prusinkiewicz， A. Lindenmayer: 77re a/gw'狄附/c 6ea鄉(xiāng)Springer, New York, 1990; N. Wirth.. J/goW幼附s + Z) f" 5^"wms =Prentice國(guó)Hall， 1976; I.H. Witten und B. Wyvill: 幼e gewemftV /1 awd附e o/5/7""-/ //,>1《c"rves. Software - Practice and Experience, 13(1983), 519-525，這些文獻(xiàn)引入本文 作為參考。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物骨架包含螺旋形的、螺旋的或圓 形的元素，這些元素可以為圓的或有角的、連續(xù)的或分步的單螺旋或多螺 旋。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，就線厚度和/或來(lái)自呈網(wǎng)格形式的元素的摻雜而 言，螺旋形的、螺旋的或圓形的元素線可不同。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物骨架的結(jié)構(gòu)基本上是三維均勻的， 即，線或棒在所有空間維度上作出數(shù)量上和質(zhì)量上相當(dāng)?shù)呢暙I(xiàn)。
在步驟(ii-a)的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物骨架基本上由呈三維 FASS曲線、尤其是呈三維Peano曲線形式的擠出物線組成。"基本上" 是指，基于全部構(gòu)造成骨架的聚合物線的總長(zhǎng)度，至少60%、優(yōu)選至少 80%、尤其至少卯％的骨架由呈三維FASS曲線形式的聚合物線構(gòu)造。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物骨架的總體積的至少25%被連續(xù) 通道占據(jù)。"連續(xù)通道"是其長(zhǎng)度至少是整個(gè)聚合物骨架的與之平行的那一 維的長(zhǎng)度的一半且與骨架外表面相通的空穴。
聚合物骨架通過將其從用于步驟(ii)的容器中取出而分離，或者首先通 過移除擠出已經(jīng)進(jìn)行到其中的液體介質(zhì)進(jìn)行分離。尤其當(dāng)使用水或含水混 合物作為步驟(ii)的液體介質(zhì)時(shí)，適合的可供選擇的分離方法是冷凍所述 介質(zhì)，并由冷凍的介質(zhì)中通過合適的方法(即，通過機(jī)械移除冷凍的介質(zhì)或 通過升華移除冷凍的介質(zhì))分離骨架。然后，可對(duì)所述骨架除去液體介質(zhì)的 殘余物，例如通過在空氣中、烘箱中或真空干燥箱中干燥，或者通過凍干。
在變型(ii-b)中，擠出步驟(i)中獲得的增溶物的方式應(yīng)使得產(chǎn)生各個(gè) 直的、巻曲的或彎曲的聚合物線。希望的形狀通過針與容器的相對(duì)移動(dòng)和/ 或通過在擠出后將線成型(如通過拉伸、巻曲和/或彎曲)來(lái)產(chǎn)生。為此目的可以使用所有常用的機(jī)械輔助手段，如夾子、鑷子、棒等，或者要不然是 具有希望形狀并浸在液體介質(zhì)中且隨后再取出的模具。
在加工形成所述骨架之前，將聚合物線優(yōu)選從液體介質(zhì)中分離出來(lái)， 如果合適的話，(后)成型和/或干燥。分離和干燥可如前所述進(jìn)行。所述(后) 成形可在干燥之后，優(yōu)選干燥之前進(jìn)行。(后)成形可包括例如將聚合物線 拉伸、巻曲和/或彎曲，如借助于前述輔助手段。
然后，可將聚合物線(纖維)連接，得到希望的骨架結(jié)構(gòu)體。關(guān)于此， 可以將僅僅相同類型的聚合物纖維連接在一起，也可以將不同的聚合物纖 維連接在一起。當(dāng)使用不同的聚合物纖維時(shí)，它們的不同之處可在于它們 的直徑、它們的性質(zhì)和/或它們的制備方法。因而，可以使用不同的聚合物
制備，和/或在于它們由不同的可生物降解且生物相容的聚合物開始制備， 和/或在于它們通過不同的方法制備，但是其中至少一種類型的聚合物線必 須是通過本發(fā)明方法制備的。不同于本發(fā)明方法的且可采用的方法是本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟悉的且適于用于制備聚合物纖維的特定類型聚合物的所有方 法，如紡紗方法、電紡紗方法等。
連接可借助于將這些類型的聚合物接合/鍵合的已知技術(shù)，如借助于可 生物降解且生物相容的常用于此目的的粘合劑進(jìn)行。然而，該連接優(yōu)選通 過施用步驟(i)獲得的少量增溶物進(jìn)行，或者將少量的由在離液序列高的液 體中的生物相容且可生物降解的聚合物組成的另一種增溶物施用到希望的 連接點(diǎn)，隨后加入聚合物不溶于其中的液體介質(zhì)。當(dāng)所述聚合物沉淀時(shí)， 它同時(shí)將各聚合物線接合在一起。
原則上，也可以在液體介質(zhì)中將聚合物線連接在一起，例如通過將少
量步驟(i)中獲得的增溶物施用到希望的連接點(diǎn)。然后，可將在液體介質(zhì)中 制備的骨架如上所述進(jìn)行分離且如果希望的話，進(jìn)行干燥。然而優(yōu)選第一 種工序，即，首先分離出聚合物線，并且僅隨后進(jìn)行連接得到骨架，因?yàn)?它更容易進(jìn)行。
尤其是當(dāng)使用僅僅少量的液體介質(zhì)時(shí)，經(jīng)常在步驟(ii)中形成可以較容 易分離的凝膠狀產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化成固態(tài)通過干燥來(lái)進(jìn)行。也可能有利的是，為
26了增加它們的儲(chǔ)存性，讓骨架在它們被應(yīng)用前以凝膠狀形式形成，且在緊 臨使用前將它們干燥。
如果所述骨架還沒有(完全)干燥，則如果希望的話，它們可以(后)成型， 這可以如前所述進(jìn)行。
變型(ii-a)對(duì)于步驟(ii)是優(yōu)選的，尤其是對(duì)于制備具有復(fù)雜形狀的骨架 而言是優(yōu)選的。該變型尤其允許可簡(jiǎn)單且可再現(xiàn)地獲得三維骨架，而后者 的制備在其它方面將不會(huì)是瑣碎的。然而，根據(jù)變型(ii-b)的工序也適于制 備簡(jiǎn)單的、尤其是二維的骨架，例如足以構(gòu)造例如平面組織(如皮膚)的網(wǎng)。
然后，可將所得骨架按照上文和下文所述進(jìn)行處理，例如通過使用作 用于活細(xì)胞的信號(hào)和/或生長(zhǎng)因子進(jìn)行涂覆或摻雜，或通過用活細(xì)胞進(jìn)行克 隆。
通過本發(fā)明方法，可以容易地由通常難以加工的可生物降解的且生物 相容的聚合物(如纖維素或纖維素衍生物)制備二維和三維骨架。這些骨 架——它們也可以呈現(xiàn)非常復(fù)雜的形狀——可在構(gòu)造人造組織中用作成型 結(jié)構(gòu)體。
本發(fā)明還涉及可通過本發(fā)明方法獲得的聚合物骨架。關(guān)于聚合物骨架 的優(yōu)選實(shí)施方案，也可以參考上述說明。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在已完成的主要骨架的空隙處，通過澆注可熔 融或膠凝且其在體內(nèi)的降解性不同于第一聚合物的另 一種聚合物并然后降 解第一聚合物而形成"陰骨架"。
在本發(fā)明聚合物骨架的優(yōu)選實(shí)施方案中，將活細(xì)胞限制于其中。這些 優(yōu)選是真核細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人細(xì)胞。作為選擇，活細(xì)胞優(yōu) 選是原核細(xì)胞，尤其是以社會(huì)方式組織的細(xì)菌(socially organized bacteria) 的細(xì)胞，如形成生物膜或在菌絲體中生長(zhǎng)的細(xì)菌。
在聚合物骨架通過活細(xì)胞克隆之前，它可以合適的方法進(jìn)行制備。因 而，用于通過活細(xì)胞克隆的已完成的聚合物骨架的制備可例如通過用含水 介質(zhì)如水，生理鹽水("林格溶液")或磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)洗滌一次 或多次來(lái)進(jìn)行。尤其當(dāng)使用的聚合物和/或使用的聚電解質(zhì)包含大比例的低 分子量物質(zhì)時(shí)，多次洗滌是合適的。而且，所述聚合物骨架可在通過活細(xì)胞克隆之前干燥，例如通過快速 冷凍并然后冷凍干燥。關(guān)于此優(yōu)選的是，干燥參數(shù)的選擇應(yīng)使得經(jīng)干燥的
聚合物骨架是可儲(chǔ)存的。關(guān)于此，儲(chǔ)存性是指在優(yōu)選至少一周內(nèi)，特別 優(yōu)選至少一個(gè)月內(nèi)，聚合物骨架在光或電子顯4敫鏡下不顯示出明顯的結(jié)構(gòu) 損害。
經(jīng)干燥的骨架在通過活細(xì)胞克隆之前優(yōu)選用含水介質(zhì)進(jìn)行平衡，該平 衡步驟它可以設(shè)計(jì)成洗滌步驟，或其后跟隨一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟。此外， 該平衡也可包括最初用與聚合物線的表面特定或非特定結(jié)合的物質(zhì)浸漬聚 合物骨架。所述浸漬也可以在沒有先前的干燥步驟下進(jìn)行。優(yōu)選的用于浸 漬的分子是調(diào)節(jié)或影響活細(xì)胞的克隆和/或功能但與本發(fā)明的擠出方法不 相容(例如由于關(guān)于所用的離液序列高的物質(zhì)缺乏穩(wěn)定性)的那些。關(guān)于此 優(yōu)選的是，將吸收在聚合物線上的物質(zhì)的希望的分布基本上是均勻的，或
致于產(chǎn)生待吸收物質(zhì)的不同分布。
尤其當(dāng)要將與聚合物線的表面結(jié)合的分子活化時(shí)，適于進(jìn)行上述平衡/
浸漬，所述活化如通過消除保護(hù)基、活化酶原的蛋白水解裂解和/或復(fù)活因 用離液序列高的物質(zhì)處理而已經(jīng)變性的多肽鏈來(lái)進(jìn)行，例如通過用在弱還 原條件下具有陪伴活性的蛋白或蛋白混合物處理骨架，例如通過用包含 10%重量的血清白蛋白和lmM的P-巰基乙醇的生理鹽水緩沖液在+37。C 下孵育。
此外，聚合物骨架可在該聚合物骨架通過活細(xì)胞克隆之前進(jìn)行機(jī)械預(yù) 處理，如通過拉伸或預(yù)拉伸進(jìn)行處理。所述工藝是聚合物技術(shù)所熟悉的； 不束縛于理論，可以假定將小機(jī)械力施加到聚合物線上導(dǎo)致超分子排列的 改善，并因而分子間的相互作用增強(qiáng)和線的機(jī)械穩(wěn)定性增加。
如果希望的話，在通過活細(xì)胞克隆之前，可以將聚合物骨架進(jìn)行其它 的機(jī)械、化學(xué)、熱和輻射處理。
制備的聚合物骨架通過活細(xì)胞的克隆原則上在體內(nèi)進(jìn)行，而聚合物骨 架的降解、細(xì)胞外基質(zhì)等的形成，如果合適的化，可在植入后繼續(xù)。主要 用于克隆的細(xì)胞是粘連的或能夠粘連的，并且先前已經(jīng)從它們的天然聚集體中脫離，如通過用蛋白酶、優(yōu)選胰島素和/或螯合劑，例如乙二胺四乙酸
(EDTA)處理。從它們的聚集體中提取細(xì)胞的相應(yīng)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 悉的。
克隆有利地通過在通?？稍试S的條件下用在生長(zhǎng)介質(zhì)中的細(xì)胞孵育所 制備的聚合物骨架而進(jìn)行，該聚合物骨架如果合適的話，已經(jīng)用細(xì)胞生長(zhǎng) 介質(zhì)平衡過。通過人細(xì)胞克隆的典型條件是例如用10%胎牛血清和合適 的抗生素增補(bǔ)的DMEM (Eagle介質(zhì)的Dulbecco修飾)，在+37。C在大氣壓 下，5%C02。所述介質(zhì)和條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。組織的克隆和構(gòu) 造可以各種方式進(jìn)行監(jiān)測(cè)，如就地通過光顯微鏡方法監(jiān)測(cè)。使用前可以進(jìn) 一步洗滌和將介質(zhì)調(diào)節(jié)至更像人體那樣的條件。
適于生化/生理學(xué)活化組織的預(yù)成型結(jié)構(gòu)體必須具有這樣的三維精細(xì) 結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使得在體內(nèi)通過細(xì)胞來(lái)克隆成為可能，允許對(duì)這些細(xì)胞充足 地供應(yīng)氧氣和營(yíng)養(yǎng)成分，并后來(lái)允許來(lái)自有機(jī)體的血管(血管化)和如果合 適的話，神經(jīng)的向內(nèi)生長(zhǎng)。為此目的以及為了構(gòu)造具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的器官或 器官部分(如腎單位)，還希望能夠用合適的生長(zhǎng)因子和信號(hào)因子"摻雜"預(yù) 成型合成結(jié)構(gòu)體的各個(gè)部分，以為了以此方式使細(xì)胞自組織成功能聚集體。 刺激例如血管或神經(jīng)向內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)入到組織區(qū)域中的生長(zhǎng)因子以及對(duì)于建立 并保持有機(jī)體中的結(jié)構(gòu)的信號(hào)物質(zhì)，原則上它們至少對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是 熟悉的。例如 Bukovsky， "Cell-mediated and neural control of morphostasis"， Med. Hypotheses 36 (1991)， 261-268給出了綜述。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及活細(xì)胞按如上所述與之結(jié)合的聚合物骨架在制備用 于在待處理有機(jī)體中恢復(fù)、測(cè)量或修飾生物學(xué)功能的植入物中的用途。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述植入物選自人造骨組織、人造皮膚、人造血管和 中空器官。在作為選擇的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述植入物用作藥物釋放體系 或可植入的緩釋制劑的載體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及由本發(fā)明聚合物骨架構(gòu)成的人造組織。在該情形下， 該聚合物骨架可在植入或其它應(yīng)用的時(shí)候仍然基本上完全保留、部分降解 和/或部分被細(xì)胞外基質(zhì)替代，或基本上完全降解和/或基本上完全被細(xì)胞外 基質(zhì)替代。在優(yōu)選實(shí)施方案中，植入物用作恢復(fù)壞掉的神經(jīng)纖維的神經(jīng)引導(dǎo)物。 關(guān)于此優(yōu)選的是，聚合物骨架在植入的時(shí)候還沒有完全降解。
在可供選擇的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組織選自人造骨組織、人造皮膚、 人造血管和中空器官。如果組織是人造血管或中空器官，則它優(yōu)選包括螺 旋形元素，因?yàn)檫@些元素具有適于制備內(nèi)表面和外表面的幾何條件。
本發(fā)明進(jìn)一 步涉及基于本發(fā)明聚合物骨架的人造組織在體內(nèi)和體外診 斷中的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明聚合物骨架在生物反應(yīng)器中的用途，其中活 細(xì)胞已經(jīng)與所述骨架結(jié)合。在特別的實(shí)施方案中，細(xì)胞在該情形下保持在 穩(wěn)態(tài)條件下，如通過使用逆流交換來(lái)保持。關(guān)于此優(yōu)選的是，細(xì)胞分泌可 溶性產(chǎn)物，特別優(yōu)選形成可溶性蛋白的雜交瘤或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。在該實(shí)施 方案中，三維聚合物骨架對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中已知的中空纖維系統(tǒng)構(gòu)成更耐用
的選擇(例如參見T. L. Evans和R. A. Miller, "Large-scale prouction of
murine monoclonal antibodies using hollow fiber bioreactors"， Biotechniques 1988， Sep. 6 (8): 762-767)。
如果根據(jù)本發(fā)明在生物反應(yīng)器中使用真核細(xì)胞，則優(yōu)選雜交瘤和其它 產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，如雙雜交瘤(Quadrome)。同樣優(yōu)選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如 CHO或NIH3T3細(xì)胞，它們例如具有整合到基因組的轉(zhuǎn)基因，其中特別優(yōu) 選的細(xì)胞是分泌可溶性蛋白的細(xì)胞。
如果根據(jù)本發(fā)明在生物反應(yīng)器中使用原核細(xì)胞，則優(yōu)選低分子量代謝 物的以社會(huì)方式組織的生產(chǎn)者，尤其是抗生素的生產(chǎn)者，如鏈霉菌，如鏈 霉菌(iSVr印to考ce51 c"e/Zco/o/*)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種進(jìn)行本發(fā)明方法的裝置，尤其是用于通過擠出 制備聚合物骨架的裝置。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該裝置包括在相對(duì)于所 得網(wǎng)格的三維方向上可移動(dòng)的擠出針，機(jī)械定位器和適于控制定位器的計(jì) 算機(jī)單元。對(duì)于該計(jì)算機(jī)單元特別優(yōu)選包括自動(dòng)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)體的程序。
在特別的實(shí)施方案中，擠出機(jī)構(gòu)和/或當(dāng)前形成的骨架可圍繞固定軸或 可變軸旋轉(zhuǎn)。
用于針的相對(duì)三維定位的相應(yīng)機(jī)械裝置正如聚合物的擠出原理那樣，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的(例如參見T.H.Ang等人"Fabrication of 3D chitosan-hydroxyapatite scaffolds using a robotic dispensing system", Materials Science and Engineering C 20 (2000): 35-42)。
在特別的實(shí)施方案中，三維移動(dòng)主要平行于所得骨架的三個(gè)軸分步發(fā) 生。關(guān)于此優(yōu)選的是，將針保持為不與所述三個(gè)軸的任一個(gè)平行，尤其是 使針與所有三個(gè)軸形成最大角度(arc tan々2 - 55°;相當(dāng)于笛卡爾坐標(biāo)體系 中的1 1 1點(diǎn))。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，針與骨架的軸之一平行。關(guān)于此優(yōu)選的 是，骨架在一維方向上可移動(dòng)且而擠出機(jī)構(gòu)在兩個(gè)其它方向上移動(dòng)，而針 保持與骨架的移動(dòng)方向("Z軸")平行。
在特別的實(shí)施方案中，針的橫截面是圓的。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案 中，針具有橢圓形、多邊形、鋸齒狀的或不規(guī)則形狀的橫截面。關(guān)于此， 在本發(fā)明中為了同時(shí)或順序地制備骨架，可使用多個(gè)具有相同或不同直徑 和具有相同或不同橫截面幾何形狀的針。
本發(fā)明的裝置原則上包括三類組件
1、 離液序列高的溶液用的儲(chǔ)存容器、管線系統(tǒng)和針，
2、 針的定位系統(tǒng)；
3、 液體介質(zhì)用的容器。
所述第 一組件包括直接與聚合物在離液序列高的溶劑中的溶液接觸的 那些部件。因此，相應(yīng)部件有利地由能耐受所用離液序列高的試劑的材料 制成，所述離液序列高的試劑尤其具有腐蝕效果?？紤]到已完成骨架的隨 使用，優(yōu)選對(duì)于該骨架可以無(wú)菌操作第一組件的各部件，如通過超熱汽流 對(duì)它們進(jìn)行消毒("能經(jīng)受住壓熱器作用的，，)。
儲(chǔ)存容器優(yōu)選由硅酸鹽材料或耐腐蝕金屬(如玻璃、陶瓷或不銹鋼)構(gòu) 成。所述針優(yōu)選由耐腐蝕金屬如不銹鋼構(gòu)成。由儲(chǔ)存容器引出到可移動(dòng)針 的管線通常包括柔韌性部件，在特別的實(shí)施方案中也可以是剛性部件。所 述管線的柔韌性部件適于由耐腐蝕聚合物材料如聚硅氧烷制成。如果剛性 部件用作管線的元素，則這些原則上可由與儲(chǔ)存容器同樣的材料制成或者 與柔韌性部件同樣的材料制成。儲(chǔ)存容器用于接收溶解在本發(fā)明的離液序列高的試劑中的聚合物。在 特別的本發(fā)明實(shí)施方案中，儲(chǔ)存容器裝有攪拌器，以確保聚合物溶液的均 勻性。在進(jìn)一步特別的實(shí)施方案中，儲(chǔ)存容器是溫控的，優(yōu)選它可以將儲(chǔ) 存容器的內(nèi)容物保持在聚合物的離液序列高的溶液是液體的溫度。攪拌器 和溫控單元都可各自獨(dú)立地連接到第二組件的控制系統(tǒng)中，或者獨(dú)立于該 系統(tǒng)。
儲(chǔ)存容器原則上可具有任何合適的形狀。
溶解的聚合物通過與儲(chǔ)存容器連接的管線從儲(chǔ)存容器中取出，或者依 靠重力，如用閥門控制，或者優(yōu)選通過受控泵取出。在該情形下，優(yōu)選的 泵機(jī)構(gòu)要求可移動(dòng)構(gòu)成部分與待泵送溶液不直接接觸，如蠕動(dòng)管式泵。關(guān) 于此優(yōu)選的是，用于控制流速的部件(閥門和/或泵)與第二組件的控制系統(tǒng) 連接。
第二組件包括機(jī)械組件，并優(yōu)選包括用以控制針和擠出物之間的相對(duì) 移動(dòng)的軟件。機(jī)械組件關(guān)于此原則上是已知的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第 二組件組包括許多驅(qū)動(dòng)彼此垂直設(shè)置且用于移動(dòng)針的精細(xì)驅(qū)動(dòng)器的步進(jìn)式 發(fā)動(dòng)機(jī)。關(guān)于此，當(dāng)所述針具有側(cè)向移動(dòng)的自由度時(shí)，所述第二組件優(yōu)選 包括與針一樣多的步進(jìn)式發(fā)動(dòng)機(jī)/精細(xì)驅(qū)動(dòng)器。
在本發(fā)明特別的實(shí)施方案中，所述第二組件組額外地包括改變針角度 的裝置。在進(jìn)一步特別的實(shí)施方案中，所述第二組件組包括用于旋轉(zhuǎn)針的 裝置。在進(jìn)一步特別的實(shí)施方案中，所述第二組件組包括用以在不同直徑 和/或不同幾何形狀的不同針之間的自動(dòng)改變的裝置，如基于旋轉(zhuǎn)裝置原 理。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第二組組件的步進(jìn)式發(fā)動(dòng)機(jī)和任選組件
通過計(jì)算機(jī)經(jīng)由D/A轉(zhuǎn)換器進(jìn)行控制。特別優(yōu)選的是，第一組的閥門和泵 以及尤其還有第一組的攪拌器和溫控單元也因此是受控的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)使用適于三維控制針的市購(gòu)硬件和軟件。 關(guān)于此特別優(yōu)選的是，軟件能夠?qū)㈩A(yù)定的空間形狀自動(dòng)地轉(zhuǎn)化成根據(jù)本發(fā) 明的擠出物線的排列，尤其是擠出物線的包含F(xiàn)ASS曲線、特別是Peano 曲線的排列，并相應(yīng)地引導(dǎo)所述針。在本發(fā)明特別的實(shí)施方案中，控制性計(jì)算機(jī)還控制屬于第 一組件組并控制溶解的聚合物對(duì)針的供應(yīng)的泵，適合 控制針的移動(dòng)。
相應(yīng)的步進(jìn)式發(fā)動(dòng)機(jī)、精細(xì)驅(qū)動(dòng)器系統(tǒng)、D/A轉(zhuǎn)換器和合適的計(jì)算機(jī) 硬件組件原則上是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。
第三組件組包括用于液體介質(zhì)的容器，在該容器中，溶解的聚合物材 料發(fā)生橋出。任何類型的容器原則上都適于該目的。在本發(fā)明特別的實(shí)施 方案中，水箱由玻璃或陶瓷構(gòu)成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，水箱同樣 支撐于由能夠增添針在側(cè)向位移和/或旋轉(zhuǎn)中的缺失自由度的步進(jìn)式發(fā)動(dòng) 機(jī)和精細(xì)驅(qū)動(dòng)器系統(tǒng)上。有利的是，第三組件組的步進(jìn)式發(fā)動(dòng)機(jī)和精細(xì)驅(qū) 動(dòng)器通過與第二組相同的硬件和軟件進(jìn)行控制，以使得可以均勻控制系統(tǒng) 中的所有移動(dòng)，以為了精確成型。
考慮到已完成骨架的隨后使用，優(yōu)選的是，也可以無(wú)菌操作第三組件 的各部件，如通過超熱汽流對(duì)它們進(jìn)行消毒("能經(jīng)受住壓熱器作用的")。
本發(fā)明通過下述非限制性實(shí)施例和附圖
進(jìn)行說明。
所述附圖表明，如實(shí)施例制備的兩個(gè)方向上的纖維素網(wǎng)絡(luò)。所述的1 分硬幣表示網(wǎng)的尺寸。
實(shí)施例
將纖維素引入到l-乙基-3-曱基咪唑鏘乙酸鹽中，并在卯。C下通過攪 拌2小時(shí)使其溶解在其中。溶液中的纖維素含量基于該溶液的總重量為1% 重量的纖維素。
將該溶液通過外科針以70 mL/h的速率注入到水浴中，并拉伸所得的 聚合物纖維。結(jié)果得到凝膠，該凝膠在干燥時(shí)收縮且形成游離纖維(free fiber)。這些干纖維的平均直徑為70pm。將這些凝膠一個(gè)鋪在另一之上， 并通過施加一滴上面制備的纖維素溶液以及然后施加一滴水將纖維之間的 連接點(diǎn)連接，這樣得到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)體(參見附圖)。
權(quán)利要求
1、一種制備可生物降解且生物相容的聚合物的二維或三維骨架的方法，其包括下述步驟(i)在離液序列高的液體中增溶可生物降解且生物相容的聚合物；和(ii-a)將在步驟(i)中獲得的溶液借助于針基本上連續(xù)地?cái)D出到與所述離液序列高的液體混溶但是所述聚合物基本上不溶于其中的液體介質(zhì)中，其中所述針和所得的骨架在擠出步驟過程中相對(duì)于彼此移動(dòng)；或者(ii-b)將在第一步中獲得的溶液借助于針擠出到與所述離液序列高的液體混溶但是所述聚合物基本上不溶于其中的液體介質(zhì)中，以形成各個(gè)直的、卷曲的或彎曲的聚合物線，其中所述針和所得的聚合物線在擠出步驟過程中相對(duì)于彼此移動(dòng)，如果合適的話，從液體介質(zhì)中分離聚合物線并將該聚合物線連接以形成二維或三維骨架。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述聚合物是多糖或改性多糖。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述多糖是纖維素或纖維素衍生物。
4、 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述離液序列高的液體的熔 點(diǎn)小于或等于150。C。
5、 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述離液序列高的液體選自 式Het+A x的鹽，其中Het+是帶正電荷的N-烷基化、N-芳基化、N-芳基烷基化、N-烷氧基化、 N-芳氧基化、N-芳基烷氧基化、N-烷氧基烷基化和/或N-芳氧基烷基化的含 氮雜環(huán)；A、/x是陰離子；以及x為1、 2或3。
6、根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中Het+選自 -帶正電荷的5-或6-元芳族雜環(huán)，其包含作為環(huán)成員的基團(tuán)NRa并任選包含1 3個(gè)選自N、 O、 S、 NRb、 S0和S02的雜原子或含雜原子基團(tuán)， -帶正電荷的5-或6-元芳族雜環(huán)，其包含作為環(huán)成員的基團(tuán)NRa并任選包含一個(gè)或兩個(gè)選自N、 O、 S、 NRb、 SO和S02的雜原子或含雜原子基團(tuán)，并且該芳族雜環(huán)與苯環(huán)稠合，和 -帶正電荷的5-或6-元飽和脂環(huán)族雜環(huán)，其包含作為環(huán)成員的基團(tuán)NRaRa'并且任選包含一個(gè)或兩個(gè)選自O(shè)、 S、 NRb、 SO和S02的雜原子或含雜原子基團(tuán)， 其中Ra和Ra'各自獨(dú)立地為d-C6烷基、芳基、d-C6烷氧基、芳氧基、d-Q烷氧基-CrC6烷基或芳氧基-d-C6烷基；和 Rb為氫、d-C6烷基、芳基、d-C6烷氧基、芳氧基、C廣C6烷氧基-C廣C6烷基或芳氧基-d-C6烷基； 其中所述的脂環(huán)族或芳族雜環(huán)或者后者可與之稠合的苯環(huán)可具有1~5個(gè)選自d-Cfi烷基、d-C6烷氧基和d-Q烷氧基-d-C6烷基的取代基。
7、根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中Het+選自式HeU HeU5的化合物<formula>formula see original document page 3</formula><formula>formula see original document page 4</formula>Het.14 Het.15其中W和R2各自獨(dú)立地為Q-C6烷基或d-C6烷氧基-d-C6烷基；和RS I^各自獨(dú)立地為氫、CVC6烷基、d-C6烷氧基或CrC6烷氧基-C廣C6烷基。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中Het+選自式Het5的咪唑錯(cuò)離子、式 Het6的吡唑錯(cuò)離子、式Het7的喁唑錯(cuò)離子、式Het.8或Het.9的l，2，3-三唑 錯(cuò)離子、式HeU0的l，2,4-三唑錯(cuò)離子或式Het.ll的噻唑鏞離子。
9、 根據(jù)權(quán)利要求5 8任一項(xiàng)的方法，其中A、/x選自卣離子、擬卣離子、高氯酸根、C廣C6單羧酸的酸陰離子以及C2-C6二羧酸的一價(jià)陰離子或二價(jià)陰離子，其中單羧酸和二羧酸可以被g素和/或羥基取代一次、兩次或 三次。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中A^,x選自閨離子和擬囟離子。
11、 根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)的方法，其中所述離液序列高的液體選自 無(wú)機(jī)鹽在極性非質(zhì)子溶劑中的溶液。
12、 根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中所述無(wú)機(jī)鹽選自堿金屬g化物、堿 土金屬卣化物、卣化銨、堿金屬擬卣化物、堿土金屬擬氯化物、擬鹵化銨、 堿金屬高氯酸鹽、堿土金屬高氯酸鹽、高氯酸銨以及前述鹽的混合物。
13、 根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其中所述極性非質(zhì)子溶劑選自二曱基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲亞砜、二乙胺及前述化合物的混合物。
14、 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中應(yīng)用于步驟(ii-a)或(ii-b)中 的液體介質(zhì)是含水的。
15、 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述針是自動(dòng)化裝置的組件。
16、 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中將所述骨架的各個(gè)部分或 所有部分使用作用于活細(xì)胞的信號(hào)因子或生長(zhǎng)因子涂覆或摻雜。
17、 根據(jù)前迷權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中骨架在步驟(ii-a)中具有基 本上分層的骨架。
18、 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述骨架的各層基本上由平行走向 的擠出物線構(gòu)成。
19、 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述骨架的各層基本上由呈FASS 曲線形式的擠出物線構(gòu)成。
20、 方法根據(jù)權(quán)利要求1 16任一項(xiàng)的方法，其中所述骨架在步驟(ii-a) 中基本上由呈三維FASS曲線形式的擠出物線構(gòu)成。
21、 一種可通過前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法獲得的聚合物骨架。
22、 根據(jù)權(quán)利要求21的聚合物骨架，包含與聚合物骨架結(jié)合的活細(xì)胞。
23、 根據(jù)權(quán)利要求21或22的聚合物骨架在制備用于恢復(fù)、修飾或測(cè)量 生物學(xué)功能的植入物中的用途。
24、 根據(jù)權(quán)利要求21或22的聚合物骨架在生物反應(yīng)器中的用途。
25、 一種包含根據(jù)權(quán)利要求21或22的聚合物骨架的人造組織。
26、 根據(jù)權(quán)利要求25的人造組織在體內(nèi)和體外診斷中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及適于制備人造組織的聚合物骨架，尤其是多糖骨架。本發(fā)明還涉及它們?cè)谥苽淙嗽旖M織中的用途，以及由所述聚合物骨架制備的人造組織。
文檔編號(hào)A61L27/20GK101410559SQ200780010569
公開日2009年4月15日 申請(qǐng)日期2007年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月24日
發(fā)明者M·馬斯, S·德克, S·錢普 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司