專利名稱：制備活化的具有α氮基團的聚合物的方法
制備活化的具有a氮基團的聚合物的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及制備活化的聚合物，如聚環(huán)氧烷的方法。尤其是，本發(fā)明涉 及以高純度制備直鏈的含a氮基團的聚合物的方法。發(fā)明背景水溶性聚環(huán)氧烷(polyalkylene oxide)與治療部分，如蛋白質(zhì)和多肽的軛 合物(conjugation)是已知的。參見，例如，美國專利4,179,337，其公開內(nèi)容 在此引入作為參考。'337專利公開了被PEG修飾的生理學(xué)活性的多肽在體 內(nèi)循環(huán)延長的時期，且具有降低的免疫原性和抗原性。為了軛合聚環(huán)氧烷，聚合物的羥基末端必須首先轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性的官能 團。該方法通常稱為"活化"，且產(chǎn)物稱為"活化的聚環(huán)氧烷"。其它聚合物 被相似地活化。共同轉(zhuǎn)讓的(commonly assigned)美國專利5,730,990描述了一種用于解 決一些聚合物軛合反應(yīng)伴隨的一些問題的方案。具體而言，確定聚合物軛合 物具有與未修飾的蛋白質(zhì)、酶等不同的pl。例如，PEG化，即聚合物與賴氨 酸《氨基的連接導(dǎo)致等電點的降低和最適pH(即在觀察到最大生物活性的 pH)的改變。如'990專利中的報導(dǎo)，恢復(fù)原始的pl或甚至改變聚合物軛合的 pl值以使在生理pH下的生物活性最佳化是有利的。經(jīng)過幾年，確定在'990專利中描述的用于制備活化的聚合物的合成方 法需要改進的，尤其是當(dāng)需要高純度時。'990專利的實施例10表明在75° 下，使PEG-C1與肌氨S臾反應(yīng)4天僅得到80 %純的N-甲基甘氨酸PEG中間 體。也發(fā)現(xiàn)部分PEG-C1轉(zhuǎn)化為PEG-OH，因此難于得到高純度的活化的連 接基或用其制得的PEG軛合物。綜上所述，需要提供活化的具有a氮基團聚合物的改進的制備方法。本 發(fā)明解決了該需要。發(fā)明簡述備在其上具有含孤電子對部分的 聚合物的方法。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了活化的在其上具有(x氮基團的聚合物和聚合物軛合物。該方法包括在石威的水溶液中，在溫度約10至約80"C下， 反應(yīng)，反應(yīng)時間小于約24小時，<formula>formula see original document page 0</formula> (I)式(I)中R,為基本上非抗原性的聚合物； R2為封端基團，LG或LG-(L,)n-; Lj為雙功能連接基；LG為離去基團，如曱苯石黃酸基團或下述的其它基團；且 n二O或正整數(shù)。在本發(fā)明的更優(yōu)選的方面中，R，為分子量為約2,000至約100,000的PEG。在本發(fā)明的一些優(yōu)選的方面中，式(I)的聚合物與在其上具有含^ 瓜電子對基團的式(m)化合物反應(yīng)<formula>formula see original document page 0</formula>(III)式(m)中Z為O、 S或NR7; X為O、 S或NR8; m為正整數(shù)，優(yōu)選1;且R4、 R5、 R6、 R7和Rs獨立地選自H、 C,—6烷基、C3.12支鏈烷基、C3.8環(huán) 烷基、Cw取代的烷基、(33.8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、 C,—6雜烷基、取代的Cw雜烷基、C"烷氧基、苯氧基和C，.6雜烷氧基；條 件是，當(dāng)Z為NR7時，R4和R7不都是H。在式(in)中，z優(yōu)選為NR7，且x優(yōu)選為o。 一個尤其優(yōu)選的式(m)化合物為N-曱基-甘氨酸或肌氨酸。反應(yīng)導(dǎo)致形成相應(yīng)于式IV(a)和IV(b)的化 合物(<formula>formula see original document page 10</formula>一旦在其上具有含"l瓜電子對部分的聚合物以高純度形成，它可以與任何量的在其上具有活化基團的化合物反應(yīng)形成活化的在其上具有含a氮或孤電 子對部分的聚合物。 一個尤其優(yōu)選的在其上具有活化基團的化合物為N-羥 基琥珀酰亞胺(NHS)，且所得的活化的聚合物為<formula>formula see original document page 10</formula>將被理解的是任何一個本領(lǐng)域認(rèn)可的活化基團可以與高純度的中間體 相連，使得活化的聚合物可以用于與多種生物學(xué)活性的親核物質(zhì)相連，并形 成PEG-輒合物。 一些尤其優(yōu)選的生物學(xué)活性的親核物質(zhì)包括天門冬酰胺酶、 腺苷脫氨酶和精氨酸脫亞氨酶。伴隨本發(fā)明優(yōu)選方面的一個主要優(yōu)點為以高純度制備所得含a氮-的聚 合物，如其聚環(huán)氧烷衍生物。因此，產(chǎn)物污染物(contaminants)，即起始物料 和mPEG-OH,不以可識別的量存在。事實上，在本發(fā)明的大多數(shù)方面中， 發(fā)現(xiàn)污染物的量少于約5%,優(yōu)選少于約2%。當(dāng)優(yōu)選的含a氮的PEG衍生 物以高純度更經(jīng)濟的形成時，技術(shù)人員能夠更有效并以較低成本制備終產(chǎn) 物，該中產(chǎn)物中引入了 PEG衍生物。該效果結(jié)果，部分由于含所需a氮中 間體(如肌氨酸)的分離，是不需要的，且基本上消除了 PEG-OTs向PEG-OH 的轉(zhuǎn)化。而且，不需要冗長的離子交換或RP HPLC技術(shù)來提供所需的聚合 物。因此，本發(fā)明提供了高純度的含a氮的PEG-胺，而不需要昂貴的柱色另一個優(yōu)點是下述事實，從本文描述的方法制備的含a氮的聚合物將完 全不改變PEG的骨架。因此，將與現(xiàn)在和將來對于活化的PEG'S的應(yīng)用是 兼容的。發(fā)明詳述本發(fā)明的方法大體上涉及形成在其上含有至少一個a氮基團的聚合物。 在本發(fā)明的大多數(shù)方面中，使用本文描述的方法》務(wù)飾的聚合物為基本上非抗 原性的聚合物。在該類的聚合物中，優(yōu)選聚環(huán)氧烷，且更優(yōu)選聚乙二醇(PEG)。 為了便于描述的目的而不是為了限制，該方法有時描述為使用PEG作為原 始類型的(prototypical)聚合物。然而應(yīng)該理解，該方法可用于許多聚合物， 所述聚合物可以是直鏈、基本上直鏈、支鏈等。然而一個要求是在本文所述 的條件下，該聚合物含有用于共價連接在其上具有含孤電子對基團的部分的 方式。個優(yōu)選方面包括在堿的水溶液(aqueous base)中，溫度約10至約80°C下，使 小時，<formula>formula see original document page 11</formula>(I)式(I)中R,為基本上非抗原性的聚合物； R2為封端基團，LG或LG-(L,V LG為離去基團； L,為雙功能連接基；且n二O或正整數(shù)，優(yōu)選約I至約IO，且更優(yōu)選l。在一些優(yōu)選方面中，溫度范圍為約30至約60°C,而在其它方面中，溫 度范圍為約45至約50。C。優(yōu)選的反應(yīng)時間小于約18小時，且更優(yōu)選約12 小時或更少。所需的最少時間為足以基本上完成反應(yīng)的時間。在大多數(shù)方面 中，優(yōu)選的反應(yīng)過程為至少約4小時。一些優(yōu)選的式I聚合物包括<formula>formula see original document page 12</formula>其中R2為甲氧基；且 R,為聚環(huán)氧烷。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)離去基團限定為本發(fā)明具體描述的基團，且反應(yīng)溫 度和反應(yīng)時間條件如本文所述控制時，可以形成高純度的含a氮的聚合物。比^ 其太P U殺ffl抑右枯^ 4: M那此#"占封端基團如上所述，R2可以為封端基團、另外的(another)離去基團(LG)、或另 外的離去基團和雙功能連接基。對于本發(fā)明的目的，封端基團應(yīng)該理解為指 聚合物末端出現(xiàn)的基團。在大多數(shù)方面中，優(yōu)選曱氧基。也可以使用其它本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的末端基團。其中R3優(yōu)選為曱基，且所述LG為曱苯磺酸基(tosylate)。或者，113可以為 鹵素、硝基、氟曱基、二氟曱基、三氟曱基、被取代的羧基、或多卣素取代12和(lib)R2--O離去基團在本發(fā)明的一些優(yōu)選的方面中，所述離去基團(本文中為LG)為的苯磺?；＿m合的可替換的離去基團的非限制性例示包括曱磺酸基(mesylate)、對溴苯磺酸基(brosylate)、三氟乙磺酸基(tresylate)和對硝基苯磺 酸基(nosylate)。 PEG-甲笨磺酸酯(PEG-tosylate)和其它相應(yīng)于式(IIa)和(IIb)的 化合物可以從市售源得到作為基本上純的起始物料或可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制 得而不用過度的實驗。雙功能連接基本發(fā)明的聚合物還可以包括雙功能連接基團(L,),所述雙功能連接基團 用于本領(lǐng)域認(rèn)可的目的，包括在PEG部分和LG中間插入間隔基或其它任選 基團。因此，L，部分可以選自雙功能連接基團，如下述非限制化合物中的一 種-NH(CH2CH20)y(CH2)q-， -NH(CH2CH20)yCH2CH2-，-C(0)(CR化Rn)qNHC(0)(CR^2)q陽，-C(0)0(CH2)q-，-C(O)(CR10R")q--C(0)NH(CH2CH20)y(CH2)q-，-C(0)0-(CH2CH20)yCH2CH2-， -C(O)NH(CR10R")q-， -C(O)O(CR10R")q-, -C(0)NH(CH2CH20)yCH2CH2-，-NH(CR,oR")q——^ ^~~(CR13R12)tOC(0)CH2CH2-,和-NH(CFtioRn)<CR13R12)tNR9C(0)CH2CH2-，其中119.13獨立地選自d-6烷基等，且優(yōu)選各自為H或CH3;R,4選自與119.13定義相同的基團，以及N02、 Cw鹵代-烷基和鹵素;q、 t和y各自獨立地選自正整數(shù)，1至約12。13L,部分如對于式(I)所示R2————(h)n——LG可以理解，當(dāng)需要雙活化的(bis-activated)聚合物時，旋轉(zhuǎn)L,基團以便在 Ro和LG之間保持合適的方向。1^和基本上非抗原性的聚合物R,還優(yōu)選為在室溫下可溶于水的聚合物，如聚環(huán)氧烷(PAO)，且更優(yōu) 選為聚乙二醇，如mPEG或雙-活化的PEG。因此這些聚合物的非限制性的 實例包括聚環(huán)氧烷均聚物，如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧乙烯化的多 元醇，其共聚物和其嵌段共聚物，條件是保持嵌段共聚物在水中的溶解度。為了說明而不是限制，R,的聚乙二醇(PEG)殘基部分可以為 -CH2CH2—0-(CH2CH20)x-CH2CH2畫其中x為聚合度，即約10至約2,300。聚合物的聚合度表示在聚合物鏈中重復(fù)單元的數(shù)量，且依賴于聚合物的 分子量。雖然基本上非抗原性的聚合物，PAO和PEG的重均分子量可以有 很大變化，但在本發(fā)明的大多數(shù)方面中優(yōu)選的R，的重均分子量為約200至 約100,000道爾頓。更優(yōu)選地，基本上非抗原性的聚合物的重均分子量為 2,000至約48,000道爾頓。&還可以為"星狀-PEG，，或多臂PEG,如NOF Corp. Drug Delivery System catalog, 2005中所述，其公開內(nèi)容在此引入作為參考。尤其是，R,可 以為下式<formula>formula see original document page 14</formula>其中:j為約10至約340的整數(shù)，使得優(yōu)選提供具有約12,000至約40,000總 分子量的聚合物；該殘基的最多3個末端部分被曱基或其它低級烷基封端。 也參見Nektar Catalog 2005-2006, 26頁M-armPEG",其內(nèi)容在此引入作為參 考。在與式III化合物或肌氨酸反應(yīng)前，這些化合物優(yōu)選包括H3C—(OCH2CH2)KQH3C—(OCH2CH2)j、00z(CH2CH20)j^^CH2cH2、LGH3C—(OCH2CH2)KO.H3C—(OCH2CH2)j、a0z(CH2CH20)j~^ch2ch2、lgH3C—(OCH2CH2)K.O、LG-'CHzCHz (OCH2CH2)j、Q',0z(CH2CH20)j~"CH2CH2、lg,(CH2CH20)CH2CH2——(OCH2CH2)KOLG--CH2CH2—(0ch2CH2)j、o■0z(CH2CH20)j---CH2CH:O',(CH2CH20)j.H3C—(OCH2CH2)j—0.H3C—(OCH2CH2)j-0—(CH2CH2C^—CH2CH2—LG、(CH2CH20)j——CH3H3C—(OCH2CH2)「0 H3C—(OCH2CH2)f-QO—(CH2CH20)j—CH3(CH2CH20)「CH2CH2—LGH3C—(OCH2CH2)j—OH3C—(OCH2CH2)j0_(CH2CH20、一CH2CH2—LG、(CH2CH20)j——CH2CH2—LGLG-CH2CH2—(OCH2CH2)j—0 H3C—(OCH2CH2)jZQ0_(CH2CH20h—CH2CH2—LG-(CH2CH20)j——CH3H3C_(OCH2CH2)j—O LG-CH2CH2—(OCH2CH2)jZ00—(CH2CH20)-CH2CH2—LG、(CH2CH20)j——CH3H3C—(OCH2CH2)j—O LG-CH2CH2—(OCH2CH2)jZ00—(CH2CH20、一CH2CH2—LG、(CH2CH20))—CH2CH2—LGLG-CH2CH2—(OCH2CH2)j—0 H3C-(OCH2CH2)jZ0O—(CH2CH20)-CH2CH2—LG、(CH2CH20)j——CH2CH2—LGLG-CH2CH2—(OCH2CH2)j_0.LG—CH2CH2—(OCH2CH2)j-和0—(CH2CH20)-CH2CH2—LG、(CH2CH20)「CH2CH2—LG其中LG優(yōu)選為oII—o——s-0或本文描述的其它基團。同樣在本發(fā)明考慮范圍內(nèi)的是形成其它在其上具有含孤電子對部分的PEG-基的化合物，包括共同轉(zhuǎn)讓的美國專利5,605,976, 5,643,575, 5,919,455 和6,113,906所述的支鏈聚合物殘基，這些公開內(nèi)容在此引入作為參考。這 些對應(yīng)于式I的具體聚合物的代表性的示例包括 (2a)<formula>formula see original document page 0</formula>其中LG、 x和L,與上述相同，且L2和L3獨立地選自與定義相同的基團， 或L2可以為支鏈連接基團，如二氨基烷基或賴氨酸殘基。參見，例如 上述美國專利6,113，卯6;且 z為1至約120的整數(shù)。在另一實施方案中，作為PAO-基的聚合物，R，任選選自一個或多個有 效的非抗原性物料，如葡聚糖、聚乙烯醇、糖-基的聚合物、羥基丙基曱基 丙烯酰胺(HPMA)、聚環(huán)氧烷、和/或其共聚物。也參見共同轉(zhuǎn)讓的美國專 利6,153,655，其內(nèi)容在此引入作為參考。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解本文所 述的相同類型的活化用于PAO's,如PEG。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將知道上述列在本發(fā)明的另一方面中，當(dāng)需要雙-活化的聚合物時，R2可以為且反應(yīng)物用于制備含雙-a氮的聚合化合物。這些雙-活化的聚合物可以為式(Ia): <formula>formula see original document page 18</formula>(la)其中X與上述相同孤電子對或含a-氮的聚合物的生成在本發(fā)明的一些方面中，在石咸的水溶液中，式(I)的聚合物與在其上含有 孤電子對基團的化合物反應(yīng)。 一些在其上含有孤電子對基團的優(yōu)選的化合物 對應(yīng)于下式<formula>formula see original document page 18</formula>其中Z為O、 S或NR7; X為O、 S或NR8; m為正整數(shù)，優(yōu)選l;且R4、 R5、 R6、 R7和Rs獨立地選自H、 Cw烷基、C3.12支鏈烷基、(:3.8環(huán) 烷基、Cw取代的烷基、Cw取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、 C,.6雜烷基、取代的d.6雜烷基、C,—6烷氧基、苯氧基和d.6雜烷氧基；條件是當(dāng)Z為NR7時，R4和R7不都是H。在本發(fā)明該方面中更優(yōu)選式(m)化合物，其中X為O， m為l， R4為曱 基，且Rs和Re每個為H。更優(yōu)選的式(III)化合物為N-曱基-甘氨酸(肌氨酸)。 形成在其上含有孤電子對部分的聚合物中的反應(yīng)結(jié)果，如式(IVa)化合<formula>formula see original document page 0</formula>其它化合物包括<formula>formula see original document page 0</formula> 在實施例(下述)中化合物3為優(yōu)選的對應(yīng)于式(IV)的mPEG-肌氨酸化合物的實例。本發(fā)明的方法優(yōu)選在堿的水溶液中進行，所述堿的水溶液如包含NaOH<formula>formula see original document page 0</formula>(優(yōu)選)、KOH、 LiOH、 Mg(OH)2、 Ca(OH)2等或其混合物的水溶液。視需要， H20和四氫呋喃(THF)、 二曱基曱酰胺(DMF)和二哺烷的混合溶劑可以連同 輔助溶劑一起使用。在任何本領(lǐng)域承認(rèn)的方法中可以卩吏用高純度的含a-氮的PEG-衍生物。 例如，沒有限制，其可以用任何本領(lǐng)域承認(rèn)的方法(包括下述討論的那些)活 化，然后用于直接與酶、蛋白質(zhì)、肽等綴合(conjugation)?；蛘撸珻02H衍生 物可用于可釋放地連接生物學(xué)活性化合物(紫杉醇、喜樹堿等)上的OH殘基。含a-氮聚合物的活化如本發(fā)明的優(yōu)選方面，實例表示用NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)和DIPC (二 異丙基碳二亞胺)活化mPEG-肌氨酸。也將被理解的是，使用根據(jù)具有所需 能夠與特定親核物質(zhì)反應(yīng)的官能團選擇的化合物，進行任何本領(lǐng)域承認(rèn)的末 端C02H的轉(zhuǎn)化是可能的。在大多數(shù)情況中，對于聚合物軛合物(conjugation) 的靶點上的親核基團將具有胺、羧酸基團、反應(yīng)性羰基、羥基、巰基等。不 是為了具體限制，適合的能與胺反應(yīng)的官能團選自a) 碳酸酯(carbonates),包含對硝基苯基或琥珀酰亞胺基；b) 羰基咪唑；c) 二氬p惡唑酮(azlactones);d) 環(huán)狀亞胺石克酮；e) 異氛酉臾酉旨(isocyanates)或異石克氛酉吏酉旨(isothiocyanates);禾口f) 其它活性酯，包含N-羥基琥珀酰亞胺基。 根據(jù)本發(fā)明的這個方面， 一些活化的聚合物包括相似的，能夠與羧酸基團和反應(yīng)性羰基基團反應(yīng)的適合的官能團可以選 自肼和酰肼官能團，包括?；ｋ?acylhydrazide)、肼基曱酸酯(carbazates)、肼基半曱酸酯(semicarbazates)和肼基硫代曱酸酯(thiocarbazates),如<formula>formula see original document page 21</formula> 其可以通過mPEG-肌氨酸與肼反應(yīng)制備。用于軛合的生物學(xué)活性部分一旦活化，高純度的含a氮的聚合物可以與任何或多種生物學(xué)活性的親 核物質(zhì)反應(yīng)。本發(fā)明所關(guān)注的生物學(xué)活性的親核物質(zhì)包括，但不限于，蛋白 質(zhì)、肽、多肽、酶、天然的有機分子和合成的有機分子，如藥物化學(xué)物質(zhì)等。關(guān)注的酶包括糖-特異性的酶、蛋白水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水 解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和連接酶。沒有限制為具體的酶，所關(guān)注的酶的實例 包括天門冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫亞氨酶、腺苷脫氨酶、超氧化物歧 化酶、內(nèi)毒素酶(endotoxinases)、過氧化氫酶、糜蛋白酶、脂酶、尿酸酶、 腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶和膽紅素氧化酶。所關(guān)注的糖-特異性的酶包括葡 萄糖氧化酶、糖香酶、半乳糖苦酶、葡糖糖腦苷脂酶(glucocerebrosidases)、 葡萄糖醛酸酶等。所關(guān)注的蛋白質(zhì)、多肽和肽包括，但不限于，血紅蛋白、血清蛋白，如 血液因子，包括因子VII、 VIII和IX;免疫球蛋白、細(xì)胞因子如白介素、a-、 P-和Y-干擾素、集落刺激因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子、血小板衍生的生長 因子和磷脂酶-活化蛋白(PLAP)。其它通常的生物學(xué)或治療感興趣的蛋白質(zhì) 包括胰島素、植物蛋白如凝集素和蓖麻毒素、腫瘤壞死因子、生長因子、組 織生長因子、TGFa's或TGFp's和表皮生長因子、激素、生長介素、促紅細(xì) 月包生成素、色素激素(pigmentaryhormones)、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、 催乳素、絨毛膜促性腺激素、促卵泡成熟激素、促曱狀腺激素、組織纖維蛋 白溶酶原激活劑等。所關(guān)注的免疫球蛋白包括IgG、 IgE、 IgM、 IgA、 IgD 及其片段。一些蛋白質(zhì)，如白介素、干擾素和集落刺激因子，也以非糖基化形式存 在，通常是由于使用重組技術(shù)。非糖基化物質(zhì)也包括在本發(fā)明的生物學(xué)活性 的親核物質(zhì)中。任何部分。其包括氨基酸序列、反義部分等，抗體片段、單鏈抗原結(jié)合蛋白(參見，例如美國專利4,946,778，其公開內(nèi)容在此引入作為參考)、結(jié)合分子 包括抗體或片段的融合、多克隆抗體、單克隆抗體、催化抗體、核苷酸和寡 核苷酸?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)，如組織培養(yǎng)、從動物源 中提取、或通過重組DNA方法，制備或分離蛋白質(zhì)或其部分(portions)。轉(zhuǎn) 基因源的蛋白質(zhì)、多肽、氨基S吏序列等也在本發(fā)明的考慮范圍內(nèi)。這些物質(zhì) 從轉(zhuǎn)基因的動物即小鼠、豬、牛等得到，其中所述蛋白質(zhì)在奶、血液和組織 中表達。轉(zhuǎn)基因的昆蟲和桿狀病毒表達體系也作為來源考慮。而且，突變的 (mutant)蛋白質(zhì)，如突變的TNFs和突變的干擾素也在本發(fā)明的范圍中。其它關(guān)注的蛋白質(zhì)為變應(yīng)原性蛋白質(zhì)，如豕草、抗原E、蜜蜂毒液、螨 變應(yīng)原等。有用的生物學(xué)活性的親核物質(zhì)不限于蛋白質(zhì)和肽?；旧先魏紊飳W(xué)活 性的化合物包括在本發(fā)明的范圍中。包括化療分子，如藥物化學(xué)物質(zhì)，即抗 腫瘤藥、心血管藥、抗瘤形成藥、抗感染藥、抗焦慮藥、胃腸藥、活化中樞 神經(jīng)系統(tǒng)藥、鎮(zhèn)痛藥、生育或避孕藥、消炎藥、甾體藥、anti-urecemic agents、 心血管藥、血管擴張劑、血管收縮劑等。在本發(fā)明優(yōu)選的方面中，在進行聚 合物和化療部分之間的酯連接的條件下，進行羧酸衍生物的反應(yīng)。 一個尤其 優(yōu)選的生物學(xué)活性的親核基團為天門冬酰胺酶，其來自天然的大腸桿菌(E co/z')發(fā)酵，即左旋門冬酰胺酶(Elspar),或其它細(xì)菌、真菌、酵母等，或重組 表達源，如ECAR-LANS，其來自胡蘿卜軟腐歐文氏菌(五nWm'a caratowra) 的重組L-天門冬酰胺酶或其它人重組L-天門冬酰胺酶。質(zhì)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。輒合反應(yīng)(conjugation reaction),有時稱作PEG化反應(yīng)，通常在溶液中， 用相對于要被軛合的蛋白質(zhì)從大約等摩爾至約過量幾倍摩爾量的活化聚合 物進行。優(yōu)選地，對于蛋白質(zhì)過量的活化的聚合物的摩爾量為約10-倍或更 大。 一種保持蛋白質(zhì)生物活性的方法是基本上避免連接到與與蛋白質(zhì)活性位 點相關(guān)的氨基酸殘基上。例如，對于精氨酸脫亞氨酶蛋白，，在聚合物偶連 過程中需要避免連接到那些與活性位點相關(guān)的精氨酸脫亞氨酶賴氨酸g氨基上。由于偶連反應(yīng)的通常的非特異性，該理論的步驟通常難以實際實現(xiàn)。 在一些任選的實施方案中，將軛合的蛋白質(zhì)被設(shè)計為在遠(yuǎn)離任何活性位點的 位置包括特定殘基，如，通過在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特異性位點插入設(shè)計的半胱氨 酸或寡賴氨酸殘基，然后使用含有(X氮(優(yōu)選在那些設(shè)計的殘基軛合)的本發(fā) 明的活化的聚合物。在相對溫和的條件下進行輒合反應(yīng)以避免使蛋白質(zhì)失活。溫和的條件包括維持反應(yīng)溶液的pH為6-8，且反應(yīng)溫度為約10°-20° C。適合的緩沖劑包 括能夠維持pH范圍6-8，而不干擾軛合反應(yīng)的緩沖溶液。適合的緩沖劑的 非限制性列表包括，如磷酸鹽緩沖劑、檸檬鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑。雖然本文所述的反應(yīng)條件可以產(chǎn)生一些未修飾的蛋白質(zhì)，但該未修飾的影響軛合的反應(yīng)條件還包括對于蛋白質(zhì)或其它靶標(biāo)使約等摩爾至約過 量的大摩爾量的活化的聚合物進行連接反應(yīng)。例如，該方法可以以過量約 l-600-倍摩爾量的聚合物進行；優(yōu)選以過量約l-100-倍摩爾量的聚合物，且 最優(yōu)選以過量約1.75-5-倍摩爾量的聚合物。將被理解，依賴于技術(shù)人員的選 擇，活化的聚合物可以作為固體或以溶液形式加入到目標(biāo)蛋白中。在溫度范 圍約10至約20° C下進行軛合反應(yīng)。反應(yīng)時間還將根據(jù)技術(shù)人員的選擇改 變，且范圍可以從小于1小時至24小時或甚至更長，這依賴于所選擇的活 化的聚合物。任選進行反應(yīng)淬滅。實施例下述實施例進一步提供了對本發(fā)明的理解，但不是為了將本發(fā)明的有效 范圍限制在任何方式中。<formula>formula see original document page 0</formula>(1) 室溫，過夜 () 50。C,過夜 ("<formula>formula see original document page 0</formula>實施例1制備5kmPEG-Ts:將5k mPEG-OH (化合物1, 50 g, 10 mmol)和DMAP (5.89 g， 48 mmol)溶 解于300 ml的CH2C12中。將對曱苯磺酰氯(9.35 g， 50 mmol)單獨溶于200 ml的CH2Cl2中。然后用加料漏斗經(jīng)2至3小時將制備的對甲苯磺酰氯溶液 加入到5k mPEG-OH溶液中。在室溫下，攪拌反應(yīng)混合物過夜。將250 ml 的CH2Cb加入到反應(yīng)混合物中，然后用0.1 N的HC1洗滌反應(yīng)混合物2次。 分離CH2Cl2層并用MgS04干燥。盡可能除去溶劑。將殘余物溶于75 ml的 CNCH3中，且通過加入1500 ml的IPA沉淀產(chǎn)物。過濾固體，然后用IPA洗 滌兩次，并用乙醚洗滌兩次。在40。C下真空干燥終產(chǎn)物(化合物2)(48.4g,產(chǎn) 率96.8%)。通過NMR檢測，純度> 990/0。13C麗R (CDC13) S 21.3 (-CH3), 58.6 (-OCH3), 68.2-71.4 (OCH2CH20在 PEG中)，127.4， 129.3， 132.5, 144.1 (芳香C).實施例2制備5kmPEG-肌氨酸(3):將NaOH (3.49 g， 87.31 mmol)和肌氨酸(7.77 g, 87.31 mmol)溶于180 ml 的H20中。加入5k mPEG-Ts (化合物2， 45 g， 8.73 mmol)。將反應(yīng)混合物加 熱至45-50。C，并在此溫度下保持12小時，然后冷卻至室溫。用CH2Cl2萃 取反應(yīng)混合物2次。用1120反洗滌合并的CEbCl2層。用MgS04干燥有機層。 除去溶劑，且殘余物溶于110ml的0.25NHC1中。用0"12<:12萃取產(chǎn)物2次。 合并的CH2Cb層用MgS04干燥。除去溶劑，且殘余物溶于130 ml的CH2C12， 然后產(chǎn)物用900 ml乙醚沉淀。過濾終產(chǎn)物(化合物3),用乙醚洗滌，然后在 40。C下真空干燥(38.8g，產(chǎn)率86.2%)。通過NMR檢測，純度> 95%。13C麗R (CDC13) 3 42.0 (-NCH3), 54.2 (-CH2NCH2-)， 58.6 (-OCH3)， 65.5-71.4 (OCH2CH20在PEG中)，166.0 (-C=0).實施例3制備5k mPEG-肌氨酸NHS:將5k mPEG-肌氨酸(化合物3， 15 g, 2.958 mmol)溶于100 ml的CH2C12。加入N-羥基琥珀酰亞胺(510 mg, 4.437 mmol)、 二異丙基石友二亞胺(559 mg， 4.437 mmol)和4-二曱基氨基-吡啶(361 mg， 2.958 mmol)。在室溫下4覺拌混合 物過夜。過濾反應(yīng)混合物。盡可能移除溶劑。將殘余固體溶于30 ml的CH2C12， 然后用350 ml乙醚沉淀。過濾固體并用乙醚洗滌。濕的固體從750 ml的IPA 中重結(jié)晶。過濾固體，用IPA洗滌2次，乙醚洗滌2次。在40。C下真空干燥 產(chǎn)物(化合物4)(產(chǎn)量=13.5g)。產(chǎn)率90% 。純度>95%。13C麗R (CDC13) 5 25.1 (-CH2CH2-)， 42,0 (-NCH3)， 54.8-54.9 (-CH2NCH2-)， 58.5 (-OCH3), 68.8-71.4 (OCH2CH20在PEG中)，165.3 (-C=0)， 168.5 (-0=CNO0-).實施例4PEG-肌氨酸-ASN-酶伴隨快速攪拌，將PEG與蛋白質(zhì)的反應(yīng)摩爾比為100:1的PEG粉末加 入到在0.1 M磷酸鈉中的5 ml的5 mg/ml天門冬酰胺酶(Elspar-Merck)中, pH7.6。反應(yīng)在N2下，在30。C下進行60分鐘，通過降低pH至6.0停止反 應(yīng)，或立即在空間排阻柱色譜(size exclusion column)上純化。反應(yīng)混合物用20 mM磷酸鈉，pH 6.0稀釋至50 ml,通過0.45 過 濾器過濾，并在HiLoad Superdex 200柱(Amersham, NJ)上分離。該柱在140 mM的NaCl， 20 mM的NaP, pH 6.0中平衡，且軛合物以10 ml/級分/分鐘 洗脫出來。在SDS-PAGE上收集被鑒定的峰的級分，并使用Ultrafree 30K (Millipore Corp., Bedford, MA)濃縮得到PEG-肌氨酸-ASN酶。實施例5PEG-肌氨酸-寡核苷酸(Genasense)向Genasense (25 mg， 3.9 (amol) (Genta， Berekeley Heights, New Jersey) 在PBS緩沖劑(5 mL, pH 7.8)中的溶液中加入mPEG-肌氨酸NHS 4 (150 mg: 39)Limo1)，并在室溫攪拌5小時。反應(yīng)溶液用DCM(3xl0mL)和鹽水(10mL) 萃取，然后干燥合并的有機層(MgS04)，過濾，然后減壓下蒸發(fā)溶劑。將殘 余物溶于2倍的蒸餾水(5mL)中，并負(fù)載到DEAE快速流動的，弱離子交換柱 (27 mm x 250 mm,柱床體積~ 50 mL)上，該柱用20 mM的Tris-HCl緩沖液， pH7.4預(yù)平衡。未反應(yīng)的PEG連接基用水(3至4倍柱體積)洗脫，然后產(chǎn)物被梯度洗脫，洗脫條件為經(jīng)10分鐘，0-100%的1 M NaCl在20 mM Tris-HCl緩沖 液中的溶液，pH7.4;然后100%的1 MNaCl在20mMTris-HCl緩沖液中的 溶液，pH7.4,以3mL/分鐘的流速維持10分鐘。收集含有純產(chǎn)物的餾分，并 用Amicon攪拌的細(xì)胞濃縮器(stirred cell concentrator), 4吏用分子量截止為 5000的Ultmce11膜脫鹽，然后凍干所得溶液以得到純PEG-^t^酸-Genasense (15.7 mg, 2.42 |amol, 60 %)。 ESI-MS測得釋放的寡核苦酸的質(zhì)量為5879.1 ， 計算質(zhì)量為5879.8。比較例6-7為了證明本發(fā)明提供了提高的純度，檢索到美國專利5,730,990的實施 例10-11中所述的合成方法。如下所示 實施例6合成mPEG-肌氨酸將5k mPEG-Cl (25 g， 4.98 mmol)加入到N-曱基甘氨酸(肌氨酸)在NaOH 溶液(150ml，0.33M)中的溶液中，然后將混合物置于密封的聚丙烯瓶中，并 在75。C下加熱4天。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并用稀HCl將pH調(diào)節(jié)至 6.0/6.5。該水溶液用CH2Cl2萃取，并在減壓下除去溶劑。所得固體從2-丙醇 中重結(jié)晶以得到標(biāo)題化合物，產(chǎn)率77%。 13C畫R: (CDC13) S; 41.31 (NCH3); 54.57 (CH2N); 57.85 (CH2C); 58.04 (OCH3); 167.98 (CO)。通過"C-麗R檢 測，純度為 80%。實施例7制備5kmPEG-肌氨酸NHS:將5k mPEG-肌氨酸(18 g， 3.55 mmol)溶于無水二氯曱烷(90 ml)中，然 后加入N-羥基-琥珀酰亞胺(612 mg, 5.32 mmol)和二異丙基碳二亞胺(671 mg， 5.32 mmol)。該混合物在室溫下攪拌過夜。過濾所得固體，并在真空中 除去溶劑。粗產(chǎn)物從2-丙醇中重結(jié)晶以得到標(biāo)題化合物，產(chǎn)率94%。 13C NMR: (CDC13) 5; 24.73 (CH2琥珀酰亞胺)；41.60 (N-CH3); 54.57 (NCH2); 54.44 (CH2C); 58.11 (OCH3); 165.13 (CO) 168.48 (C琥珀酰亞胺)。檢測純度為約 80%。比較結(jié)果方法PEG-N-COOH的純度％-PEG-C1作為LG,以延長的反應(yīng)時間和高溫 80%PEG-OTs作為LG (新)，以較短的反應(yīng)時間和較 低的反應(yīng)溫度〉95%從上述內(nèi)容可見，通過使用本文描述的方法明顯提高了純度，且可以有效制備C-GMP級活化的聚合物。
權(quán)利要求
1.制備在其上含有孤電子對部分的聚合物的方法，該方法包括在堿的水溶液中，溫度約10至約80℃下，使式(I)的聚合物與在其上具有含孤電子對基團的化合物反應(yīng)，反應(yīng)時間少于約24小時，R2-R1-(L1)n-LG(I)式(I)中R1為基本上非抗原性的聚合物；R2為封端基團，LG或LG-(L1)n-；L1為雙功能連接基；LG為離去基團；和n＝0或正整數(shù)。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述溫度為約30至約60°C。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)時間少于約18小時。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中LG選自其中R3為曱基、鹵素、硝基、氟曱基、二氟曱基、三氟曱基、被取代 的羧基、或多卣素取代的苯磺?；粫趸撬峄?、對溴苯磺酸基、三氟乙磺酸基和對硝基苯磺酸基。
5.權(quán)利要求6的方法，其中LG為
6. 權(quán)利要求1的方法，其中R2為甲氧基。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述在其上含有孤電子對基團的化合物為<formula>formula see original document page 3</formula>(III)其中Z為O、 S或NR7; X為O、 S或NR8; m為正整數(shù)；且R4、 R5、 R6、 R7和Rs獨立地選自H、 d—6烷基、C3-12支鏈烷基、C3-8 環(huán)烷基、Cl6取代的坑基，(:3.8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、 d-6雜烷基、取代的d.6雜烷基、C,-6烷氧基、苯氧基和d-6雜烷氧基； 條件是當(dāng)Z為NR7時，R4和R7不都為H。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中X為O， m為l， R4為曱基，且R5和R6每 個為H。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中所述式(III)化合物為N-曱基-甘氨酸(肌氨酸)。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中112為<formula>formula see original document page 3</formula>
11. 權(quán)利要求l的方法，其中R,為聚環(huán)氧烷。
12. 權(quán)利要求l的方法，其中所述式(I)的聚合物選自<formula>formula see original document page 3</formula><formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula>j為約10至約340的整數(shù)； x為約10至約2,300的整數(shù)； L!、 L2和L3為雙功能連接基；且 z為1至約120的整數(shù)。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述聚環(huán)氧烷為下式的聚乙二醇-CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CH2 -其中x為約10至約2,300的整數(shù)。
14. 權(quán)利要求1的方法，其中所述基本上非抗原性的聚合物具有約200 至約100,000道爾頓的重均分子量。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述基本上非抗原性的聚合物具有約 2，000至約48,000道爾頓的重均分子量。
16. 權(quán)利要求l的方法，其中所述式(I)的聚合物為<formula>formula see original document page 6</formula>其中R2為曱氧基；且 R,為聚環(huán)氧烷。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中R,為聚乙二醇。
18. 權(quán)利要求1的方法，其中所述堿的水溶液選自NaOH、 KOH、 LiOH、 Mg(OH)2、 Ca(OH)2及其混合物。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述堿的水溶液包括NaOH。
20. 權(quán)利要求7的方法，其中所述在其上含有孤電子對部分的聚合物選自<formula>formula see original document page 6</formula>和<formula>formula see original document page 6</formula>
21. 權(quán)利要求1的方法，該方法還包括使在其上含有孤電子對部分的 聚合物與在其上具有活化基團的化合物反應(yīng)形成活化的在其上含有孤電子 對部分的聚合物。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述活化的在其上含有孤電子對部分的 聚合物為
23. 權(quán)利要求21的方法，其中所述在其上具有活化基團的化合物具有能與親核基團反應(yīng)的官能團。
24. 權(quán)利要求1的方法，其中通過所述方法形成的在其上含有孤電子 對部分的聚合物的純度大于95%。
25. 權(quán)利要求1的方法，其中通過所述方法形成的在其上含有孤電子 對部分的聚合物的純度大于98%。
26. 權(quán)利要求22的方法，該方法還包括在足以形成軛合物的條件下使與天門冬酰胺酶反應(yīng)。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述天門冬酰胺酶來自重組的來源。
全文摘要
本發(fā)明公開了以高純度制備基本上非抗原性的聚合物的方法，該聚合物具有含孤電子對的部分。所述聚合物用作合成胺-基的聚合物和對于與親核物質(zhì)軛合形成活化聚合物的中間體。本發(fā)明公開了軛合物和制備方法以及用這些軛合物的治療。得到的聚合物-胺足夠純使得避免了藥物級別聚合物所需的昂貴的和費時的純化步驟。
文檔編號A61K38/16GK101405018SQ200780009499
公開日2009年4月8日 申請日期2007年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月17日
發(fā)明者烏德春, 洪 趙 申請人:安佐制藥股份有限公司