專利名稱：：用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的密碼子優(yōu)化的IL-15和IL-15Rα基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提高的細(xì)胞因子表達(dá)，通過優(yōu)化細(xì)胞因子基因表達(dá)的所有步驟。
背景技術(shù)：
：白介素-15(IL-15)是一種多效細(xì)胞因子，對(duì)先天性和獲得性免疫系統(tǒng)非常重要(Diab,等人，Cytotherapy(2005)7:23-35)。IL-15促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨嗟細(xì)胞的活化，是樹突狀細(xì)胞(DC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、NKT細(xì)胞和CD8十T細(xì)胞(Id.)的發(fā)育和功能必不可少的。IL-15在淋巴和非'淋巴隔室作用于細(xì)月包(VanBelle和Grooten，ArchImmunolTherExp(2005)53:115)?；谄涠喾N功能和動(dòng)物模型中的相對(duì)安全性，發(fā)現(xiàn)了IL-15給藥在治療免疫缺陷中的用途，用于T細(xì)胞和NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增，和作為疫苗的佐劑，包括抗HIV疫苗(Diab，等人，上述；Ahmad，等人，CurrHIVRes(2005)3:261;AlpdoganandvandenBrink,TrendsImmunol(2005)26:56)。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外源IL-15給藥顯著增強(qiáng)感染人類免疫缺陷性病毒(HIV)的獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者的免疫細(xì)胞功負(fù)fe(Ahmad,等人，上述；還可參見，Pett和Kelleher,ExpertRevAndInfectTher(2003)1:83;和Ansari，等人，ImmunolRes(2004)29:1)。IL-15給藥對(duì)淋巴組織生成的作用和免疫缺陷病癥的治療也在研究中(AlpdoganandvandenBrink,上述)。來自數(shù)個(gè)研究者的結(jié)果已經(jīng)表明IL-15受體a的天然可溶形式是IL-15的拮抗劑(參見，Mortier，等人，(2004)J.Immunol.173，1681-1688;Ruchatz，等人，(1998)J.Immunol.160，5654-566;和Smith,等人，(2000)J.Immunol.165，3444-3450)。相反，當(dāng)通過柔性氨基酸連接區(qū)融合到IL-15時(shí)，IL-15受體a的sushi結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被認(rèn)為是IL-15功能的體外激動(dòng)劑(JBiolChem.2006Jan20;281(3):1612-9)?？扇苄园捉樗?15受體a(IL-15Ra)-sushi是通過IL-15R的IL-15作用的選擇性和有效的激動(dòng)劑(參見，MortierE,等人，JBiolChem.2006281:1612)。為了提供用于作為編碼核酸或者蛋白給藥的治療性的單獨(dú)的IL-15、或者與完整IL-15受體a或者可溶性IL-15受體a組合的IL-15,非常重要的是發(fā)展用于該細(xì)胞因子的有效表達(dá)載體和有效表達(dá)編碼核酸序列。本發(fā)明涉及這種需要。發(fā)明簡述本發(fā)明提供用于單獨(dú)的白介素-15(IL-15)以及與完整IL-15受體a(IL15Ra)或者IL15Ra的可溶形式(IL15sRa)組合的白介素-15(IL-15)的高水平表達(dá)的核酸序列、表達(dá)載體和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明還提供用于單獨(dú)的白介素-15以及與完整IL-15受體《IL15Ra)或者IL15Ra的可溶形式(IL15sRa)組合的白介素-15在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)的方法。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供用于完整IL-15受體《IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)高水平表達(dá)的核酸序列、表達(dá)載體和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明還提供用于完整IL-15受體《IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)高水平表達(dá)的方法。一方面，本發(fā)明提供核酸序列，所述核酸序列編碼與天然哺乳動(dòng)物IL-15蛋白具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的白介素-15(IL-15)蛋白，其中該核酸序列與編碼天然哺乳動(dòng)物IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的改變的核苷酸位置具有至少50%的差異。在一些實(shí)施方式中，核酸序列與編碼天然哺乳動(dòng)物IL-15的核酸序列在圖4和/或圖6所標(biāo)識(shí)的改變的密碼子位置具有至少50%的差異。在一些實(shí)施方式中，改變的核苷酸和密碼子位于成熟IL-15序列。天然哺乳動(dòng)物IL-15可以是任何哺乳動(dòng)物IL-15,包括人IL-15、靈長類動(dòng)物IL-15、豬IL-15、小鼠IL-15，等等。在一些實(shí)施方式中，編碼IL-15的核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的115個(gè)改變的核苦酸位置(陰影)具有至少大約55%(例如，59個(gè)核苷酸)、60%(例如，64個(gè)核苷酸)、65%(例如，70個(gè)核苷酸)、70%(例如，75個(gè)核苷酸)、75%(例如，81個(gè)核苷酸)、80%(例如，86個(gè)核苷酸)、85%(例如，91個(gè)核苷酸)、90%(例如，97個(gè)核苷酸)、95%(例如，109個(gè)核苷酸)的差異。在一些實(shí)施方式中，編碼IL-15的核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在圖4所標(biāo)識(shí)的121個(gè)改變的密碼子位置(陰影，加框或者下劃線)具有至少大約55%(例如，66個(gè)密碼子)、60%(例如，73個(gè)密碼子)、65%(例如，78個(gè)密碼子)、70%(例如，85個(gè)密碼子)、75%(例如，91個(gè)密碼子)、80%(例如，97個(gè)密碼子)、85%(例如，103個(gè)密碼子)、90%(例如，109個(gè)密碼子)、95%(例如，115個(gè)密碼子)的差異。在一些實(shí)施方式中，改變的核苷酸和密碼子位于成熟IL-15序列。例如，編碼改進(jìn)的IL-15的核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的成熟IL-15的78個(gè)改變的核芬酸位置(陰影)具有至少大約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的差異。在另一個(gè)實(shí)施方式中，編碼改進(jìn)的IL-15的核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在圖4所標(biāo)識(shí)的成熟IL-15的84個(gè)改變的密碼子位置(陰影，加框或者下劃線)具有至少大約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的差異。在一些實(shí)施方式中，核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在下列核苷酸位置不同6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486，其中核香酸位置如圖8所鑒定的。在一些實(shí)施方式中，核酸序列在下列核苷酸位置包括鳥嘌呤(g)或者胞嘧咬(c)核苷酸6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486,其中核苦酸位置如圖8所鑒定的。密碼子可以任何方式不同使得相同或者相似的(即，保守取代的)氨基酸^皮編碼。在一些實(shí)施方式中，改變密碼子以增加GC含量。在一些實(shí)施方式中，改進(jìn)的IL-15核酸序列均包括占序列長度至少大約50%、55%、60%、65%、70%、75%或者更高的GC含量(例如，脫氧鳥苷和脫氧胞苷脫氧核糖核苷殘基或者鳥苷和胞苷核糖核苷殘基)。編碼IL-15的核酸與SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:16的核酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，如圖8(SEQIDNO:3或者SEQIDNO:4)或者圖16(SEQIDNO:16)所標(biāo)識(shí)的，編碼IL-15的核酸序列不同于編碼天然IL-15的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，編碼IL-15信號(hào)肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列被替換為編碼異源蛋白的信號(hào)肽(SIG)或者信號(hào)肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，編碼IL-15信號(hào)肽的核酸序列被替換為編碼異源蛋白信號(hào)肽的核酸序列。異源蛋白可以來自，例如，組織纖溶酶原活化因子(tPA)、生長激素、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或者免疫球蛋白(例如，IgE)。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼IL-15信號(hào)肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列被替換為編碼tPASIG-PRO的核酸序列，所述tPASIG國PRO與SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:25或者SEQIDNO:27具有95%的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，編碼IL-15的核酸^皮可操作的連4妄到編碼RNA，命出元件的核酸，例如CTE或者RTEm26CTE。在一些實(shí)施方式中，編碼IL15Ra信號(hào)肽的核酸序列^皮替換為編碼異源蛋白的信號(hào)肽(SIG)或者信號(hào)肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，編碼IL15Ra信號(hào)肽的核酸序列被替換為編碼異源蛋白信號(hào)肽的核酸序列。異源蛋白可以來自，例如，組織纖溶酶原活化因子(tPA)、生長激素、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或者免疫球蛋白(例如，IgE)。在一些實(shí)施方式中，編碼IL15Ra的核酸被可操作的連接到編碼RNA輸出元件的核酸，例如CTE或者RTEm26CTE。另一方面，本發(fā)明提供編碼來自除了IL-15以外的蛋白的信號(hào)肽-前肽(SIG-PRO)序列的核酸序列，例如tPASIG-PRO序列、生長激素信號(hào)序列(SIG)、免疫球蛋白信號(hào)序列(SIG)，所述核酸序列可操作的連接到編碼與天然哺乳動(dòng)物IL-15蛋白具有至少90%的序列同一性的IL-15蛋白的核酸，其中所述編碼IL-15的核酸序列包括至少50%的GC含量。在一個(gè)實(shí)施方式中，SIG-PRO序列來自選自如下的蛋白tPA、GM-CSF、生長激素和免疫球蛋白家族蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，SIG-PRO序列編碼tPASIG-PRO,所述tPASIG-PRO與SEQIDNO:6或者SEQIDNO:8具有至少95%的氨基酸序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，SIG-PRO序列是tPASIG-PRO，其與SEQIDNO:5或者SEQIDNO:7具有至少95%的核酸序列同一性。其他實(shí)施方式如上所述。另一方面，本發(fā)明包括包含本發(fā)明核酸序列的表達(dá)載體和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括如上所述的實(shí)施方式。在一些實(shí)施方式中，編碼IL-15和/或IL15Ra的核酸序列還包括用作疫苗佐劑的藥物賦形劑。在一些實(shí)施方式中，編碼IL-15和/或IL15Ra的核酸序列還包括用作免疫治療因子的藥物賦形劑，例如，在體外或者體內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的擴(kuò)增中，所述淋巴細(xì)胞包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列用于擴(kuò)增表達(dá)IL-2/IL-15|87受體的淋巴細(xì)胞群。在一些實(shí)施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列用于擴(kuò)增CD4+和/或CD8+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列用于在抗原刺激后擴(kuò)增雙分泌IL-2和IFN-7的多功能細(xì)胞(例如，多功能T細(xì)胞)的數(shù)量。另一方面，本發(fā)明提供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)IL-15的方法，該方法包4舌重組修飾哺乳動(dòng)物細(xì)^^以表達(dá)編碼IL-15蛋白的核酸，所述IL-15蛋白與天然哺乳動(dòng)物IL-15蛋白具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性，其中該核酸序列與編碼天然哺乳動(dòng)物IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苷酸位置具有至少50%的不同。所述方法的實(shí)施方式如上所述用于核酸序列。在相關(guān)方面，本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)包括受體全部胞外結(jié)構(gòu)域的完整IL-15受體a(IL15Ra)或者IL15Ra的可溶形式(IL15sRa)在體外和體內(nèi)是IL-15的有效穩(wěn)定劑。IL-15和IL15sRa復(fù)合物在循環(huán)中具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性，并具有增加的IL-15效力，這是通過包括天然殺傷(NK)細(xì)胞和T細(xì)胞的多個(gè)淋巴細(xì)胞亞群的擴(kuò)增測定的。本發(fā)明提供在體外和體內(nèi)增加IL-15效力的方法、表達(dá)載體和蛋白組合。這些方法可用于在給予個(gè)體(例如，哺乳動(dòng)物、人)時(shí)增強(qiáng)IL-15的生物利用率、穩(wěn)定性和效力，以及用于增強(qiáng)IL-15的生物學(xué)功效。本發(fā)明提供用于IL-15與其受體IL-15受體《IL15Ra)協(xié)同表達(dá)的表達(dá)載體。該載體通常包含一個(gè)拷貝的IL-15編碼序列或/和一個(gè)拷貝的IL-15受體a(IL15Ra)(完整或者可溶的)。兩個(gè)蛋白的表達(dá)比例可以調(diào)整為1:1、1:2或者1:3，例如，通過利用不同的質(zhì)粒DNA比例(w/w)或者通過選擇不同表達(dá)強(qiáng)度的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，IL-15細(xì)胞因子和IL-15受體a(IL15Ra)表達(dá)的摩爾比例為1:3。在一個(gè)實(shí)施方式中，才艮據(jù)此處描述的本方法，至少一個(gè)IL-15細(xì)胞因子和IL-15受體ce(IL15Ra)的核酸序列被改進(jìn)。IL-15細(xì)胞因子和完整或者可溶的IL-15受體a(IL15Ra)的共表達(dá)增加,人細(xì)胞表達(dá)和分泌的IL-15細(xì)胞因子和IL15Ra的量，與IL-15單獨(dú)表達(dá)相比，尤其是與野生型IL-15序列相比，超過10倍、100倍、10,000倍、100,000倍、1，000，000倍或者更高。與單獨(dú)的IL-15相比，使用這種栽體增強(qiáng)IL-15和IL15ra的穩(wěn)定性超過10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或者更高，并且在體內(nèi)增加IL-15蛋白的穩(wěn)態(tài)水平。與單獨(dú)的IL-15相比，與IL15Ra共表達(dá)的IL-15的生物功能(例如，淋巴細(xì)胞擴(kuò)增的活化和誘導(dǎo)，所述淋巴細(xì)胞包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞和NKT細(xì)胞)在體內(nèi)也顯著增強(qiáng)，超過10倍、15倍、20倍或者更高。這些栽體可用于增加生物活性細(xì)胞因子在特定組織中的遞送。發(fā)現(xiàn)IL-15和IL15Ra載體和蛋白在預(yù)防和治療性疫苗接種、癌癥免疫治療或者任何用于增強(qiáng)淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的適應(yīng)癥和任何免疫缺陷狀況中的用途。一方面，本發(fā)明提供用于IL-15與完整IL15Ra或者可溶性IL15Ra協(xié)同表達(dá)的表達(dá)載體。IL-15和完整IL15Ra或者可溶性IL15Ra可以包含在相同的表達(dá)載體或者包含在多個(gè)表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)用于高效表達(dá)的本方法，至少一個(gè)IL-15和完整IL15Ra或者可溶性IL15Ra的編碼核酸序列^^皮改進(jìn)。本發(fā)明的一方面是提供的載體能夠快速產(chǎn)生可溶性胞外IL15sRa的天然形式，當(dāng)遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物時(shí)所述載體表達(dá)IL-15和全長IL15Ra。因此，IL-15和IL15Ra的共遞送和表達(dá)在細(xì)胞表面產(chǎn)生IL-15/IL-15R復(fù)合物以及IL-15/IL15sRa復(fù)合物，它們被釋放到循環(huán)中，可以在遠(yuǎn)處組織中起作用。另一方面，本發(fā)明提供編碼完整IL-15受體a(IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)的改進(jìn)的核酸序列，它們與天然哺乳動(dòng)物IL-15受體q;(IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)的蛋白(參見，例如，NM—002189)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性，其中該核酸序列與編碼天然哺乳動(dòng)物IL-15的核酸序列在圖35-38所標(biāo)識(shí)的改變的核苷酸位置具有至少50%的不同。在一些實(shí)施方式中，IL15Ra(完整或者可溶形式的)的編碼序列與圖35-38中任意一個(gè)所示的核酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、說明書第8/42頁98%或者99%的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，IL15Ra由圖35-38中任意一個(gè)所示的核酸序列編碼。在一個(gè)實(shí)施方式中，改進(jìn)的IL15Ra(完整或者可溶的)編碼核酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或者85%的GC含量。本發(fā)明還提供增加IL-15數(shù)量、穩(wěn)定性和生物活性的方法。該方法可以在體外進(jìn)4亍，通過在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中共表達(dá)IL-15和IL15Ra或者IL15sRa。該方法可以在體內(nèi)進(jìn)4亍，通過給個(gè)體給予IL-15和IL-15受體a(完整或者可溶的)的組合，作為用于注射的蛋白或者作為在體內(nèi)產(chǎn)生的DNA構(gòu)建體(天然或者改進(jìn)的)。根據(jù)此處描述的方法，可以改進(jìn)IL-15和IL15Ra編碼序列中的一個(gè)或者兩個(gè)。本發(fā)明還提供協(xié)同產(chǎn)生IL-15和IL-15可溶性受體a(IL15sRa)的宿主細(xì)月包和細(xì)胞系，或者協(xié)同產(chǎn)生IL-15以及可溶性和全長IL15Ra混合物的細(xì)胞系。另一方面，本發(fā)明提供增強(qiáng)個(gè)體抗一種或者多種抗原的免疫應(yīng)答的方法，通過給予本發(fā)明改進(jìn)的單獨(dú)的IL-15核酸或者與IL15Ra組合的IL-15核酸。IL15Ra可以是野生型或者改進(jìn)的蛋白或者核酸形式。另一方面，本發(fā)明提供擴(kuò)增淋巴細(xì)胞數(shù)量的方法，例如，用于體內(nèi)或者體外減輕免疫缺陷狀況，通過給予本發(fā)明改進(jìn)的IL-15核酸(單獨(dú)的或者與IL15Ra組合)。IL15Ra可以是野生型或者改進(jìn)的蛋白或者核酸形式。在一些實(shí)施方式中，淋巴細(xì)胞選自B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)月包和NKT細(xì)J包。在一些實(shí)施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列促進(jìn)表達(dá)IL-2/IL-15j87受體的淋巴細(xì)胞群的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列刺激CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列在抗原刺激時(shí)誘導(dǎo)雙分泌IL-2和IFN-7的多功能細(xì)胞(例如，多功能T細(xì)胞)數(shù)量的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，通過注射和/或電穿孔給予DNA構(gòu)建體中的一個(gè)或者兩個(gè)。通過注射和電穿孔兩種途徑的給藥可以在相同或者不同的位點(diǎn)同時(shí)或者連續(xù)進(jìn)行。定義術(shù)語"天然哺乳動(dòng)物白介素-15(IL-15)"是指來自哺乳動(dòng)物種的IL-15的任何天然存在的白介素-15核酸和氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚白介素-15核酸和氨基酸序列在基因數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公開提供，例:i口，在萬纟,網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov上NationalCenterforBiotechnologicalInformation(國家生物技術(shù)信息中心)提供的GenBank。示例性的天然哺乳動(dòng)物IL-15核酸或者氨基酸序列可以來自于，例如，人、靈長類動(dòng)物、犬、貓、豬、馬、牛、綿羊、嚙齒目、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠，等等。示例性天然哺乳動(dòng)物IL-15核酸序列的登錄號(hào)包括NM一172174(人；SEQIDNO:l)、NM—172175(人)、NM—000585(人)、U19843(恒河猴；SEQIDNO:14)、DQ021912(恒河猴)、AB000555(恒河猴)、NM一214390(豬)、DQ152967(綿羊)、NMJ74090(牛)、NM_008357(小鼠)、NM—013129(鼠屬)、DQ083522(水牛)、XM一844053(犬)、DQ157452(兔類)、和NM—001009207(貓)。示例性天然哺乳動(dòng)物IL-15氨基酸序列的登錄號(hào)包括NP—751914(人；SEQIDNO:2)、CAG46804(人)、CAG46777(人)、AAB60398(恒河猴；SEQIDNO:15)、AAY45895(恒河猴)、NP—999555(豬)、NP_776515(牛)、AAY83832(水牛)、ABB02300(綿羊)、XP—849146(犬)、NP_001009207(貓)、NP—037261(鼠屬)、和NP_032383(小鼠)。術(shù)語"白介素-15"或者"IL-15"是指與天然哺乳動(dòng)物IL-15氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%序列同一性的多肽，或者編碼這種多肽的核苷酸，是有生物學(xué)活性的，意思指突變的蛋白("突變蛋白")與天然IL-15蛋白在至少一種功能檢測中具有功能性的相似(75%或者更高)。IL-15多肽的示例性功能檢測包括T細(xì)胞的增殖(參見，例如，Montes,等人，ClinExpImmunol(2005)142:292)，以及NK細(xì)胞、巨喧細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化。用于特定免疫細(xì)胞亞群的分離和增殖檢測(即，311-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入法)的方法是本領(lǐng)域公知的。細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測可用于測量NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞活化。細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測，包括同位素("Cr)、染料(例如四唑、中性紅)或者酶的釋放，也是本領(lǐng)域公知的，可利用商品化供應(yīng)的試劑盒(OxfordBiomedicalResearch,Oxford,M;Cambrex，Walkersville，MD;Invitrogen,Carlsbad,CA)。IL-15還顯示抑制Fas介導(dǎo)的凋亡(參見，DemirciandLi，CellMolImmunol(2004)1:123)。凋亡檢測，包括例如TUNEL檢測和膜聯(lián)蛋白V檢測，是本領(lǐng)域公知的，可利用商品化供應(yīng)的試劑盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)。還可參見，Coligan，等人，CurrentMethodsinImmunology,1991-2006，JohnWiley&Sons。術(shù)語"天然哺乳動(dòng)物白介素-15受體a(IL15Ra)"是指來自哺乳動(dòng)物種的IL-15受體a的任何天然存在的白介素-15受體a核酸和氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚白介素-15受體a核酸和氨基酸序列在基因數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公開提供，例如，在萬維網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov上國家生物技術(shù)信息中心提供的GenBank。示例性的天然哺乳動(dòng)物IL-15受體a核酸或者氨基酸序列可以來自于，例如，人、靈長類動(dòng)物、犬、貓、豬、馬、牛、綿羊、嚙齒目、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠，等等。示例性天然哺乳動(dòng)物IL-15核酸序列的登錄號(hào)包括NM一002189(智人白介素15受體，a(IL15RA)，轉(zhuǎn)錄變異體l，mRNA)。術(shù)語"白介素-15受體a"或者"IL15Ra"是指與天然哺乳動(dòng)物IL15Ra氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%序列同一性的多肽，或者編碼這種多肽的核苷酸，是有生物學(xué)活性的，意思指突變的蛋白("突變蛋白")與天然IL15Ra蛋白在至少一種功能檢測中具有功能性的相似(75%或者更高)。一種功能檢測是與天然IL-15蛋白的特異結(jié)合。術(shù)語"核酸"是指采用單-鏈或者雙-鏈形式的脫氧核糖核酸或者核糖核苷酸和其聚合物。該術(shù)語包括包含已知核苷酸類似物或者修飾的骨架殘基或者鍵的核酸，它們是合成的、天然存在的和非天然存在的，與參照核酸具有相似的結(jié)合性質(zhì)，以類似于參照核苷酸的方式進(jìn)行代謝。這種類似物的實(shí)例包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺脂、膦酸曱酯、手性-膦酸曱酯、2-0-曱基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另外指出，特定核酸序列還隱含的包括其保守修飾的變異體(例如，簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指定的序列。通過產(chǎn)生序列實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代，該序列中一個(gè)或者多個(gè)選擇的(或者所有的)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer等人,NucleicAcidRes.19:5081(1991);Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini等人，Mol.Cell,Probes8:91-98(1994))。術(shù)語核酸可以與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互換使用。天然存在氨基酸的簡并密碼子取代顯示于表1。表1第一個(gè)位置第二個(gè)位置第三個(gè)位置(5'端)CAG(3'端)PheSerTyrCysUCDPheSerTyrCyscLeuSer終止終止ALeuSer終止TrpGcLeuProHisArgU(T)LeuProHisArgCLeuProGinArgALeuProGinArgGAlieThrAsnSerU(T)lieThrAsnSerCHeThrLysArgAMetThrLysArgGGValAlaAspGlyU(T)ValAlaAspGlyCValAlaGluGlyAValAlaGluGlyG在兩種或更多種核酸或者多肽序列的上下文中，術(shù)語"相同的"或者百分比"同一性"是指相同的或者具有氨基酸殘基或者核苷酸特定百分比的兩種或更多種序列或者子序列，它們是相同的(即，當(dāng)用于比較窗口或者指定區(qū)域的最大對(duì)應(yīng)的比較和比對(duì)時(shí)，在特定區(qū)域(例如SEQIDNOs:l-23中的任意一個(gè))大約70%同一性，優(yōu)選的75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的同一性)，通過使用如下所述缺省參數(shù)的BLAST或者BLAST2.0序列比較算法、或者通過人工比對(duì)和目測檢查進(jìn)行測定(參見，例如NCBI網(wǎng)站等等)。然后這種序列被稱為"基本上相同的"。該定義還指，或者能夠用于，試驗(yàn)序列的互補(bǔ)物。該定義還包括有缺失和/或添加的序列，以及有取代的那些序列。如下所述，優(yōu)選的算法能夠解釋缺口等等。優(yōu)選的，同一性存在于至少長大約25、50、75、100、150、200個(gè)氨基酸或者核苷酸的區(qū)域中，常在長225、250、300、350、400、450、500個(gè)氨基酸或者核香酸或者氨基酸或者核酸序列全長的區(qū)域。對(duì)于序列比較，通常一個(gè)序列作為參照序列，試驗(yàn)序列與其比較(這里，完整的"天然哺乳動(dòng)物"IL-15氨基酸或者核酸序列)。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，試驗(yàn)和參照序列被輸入電腦，指定子序列坐標(biāo)，必要時(shí)，指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選的，可以使用缺省程序參數(shù)，或者可以指定替換參數(shù)?；诔绦騾?shù)，序列比較算法然后計(jì)算試驗(yàn)序列相對(duì)于參照序列的百分比序列同一性。適于確定百分比序列同一性和序列相似性的優(yōu)選算法實(shí)例是BLAST算法,其分別在Altschul等人，Nuc.AcidsRes.25:3389-3402(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中被描述。國家生物技術(shù)信息中心在萬維網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov/.上公開提供BLAST軟件。可以使用缺省參數(shù)或者其他非缺省參數(shù)。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用以下缺省字長(W)ll、期望值(E)10、M=5、N;4和兩條鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下缺省字長3、期望寸直(E)10、和BLOSUM62評(píng)分矩陣(參見Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915C1989))比對(duì)(B)50、期望值(E)10、M=5、N二4,和兩條鏈的比較。此處氨基酸可以用它們通常已知的3字母符號(hào)或者1字母符號(hào)表示，它們是IUPAC國IUBBiochemicalNomenclatureCommission(IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì))推薦的。同樣地，核苦酸可以用它們通常接受的單字母代碼表示。此處使用的"保守修飾的變異體"適用于氨基酸序列。技術(shù)人員清楚在編碼序列中改變、添加或者去除單個(gè)氨基酸或者小比例氨基酸的對(duì)核酸、肽、多肽或者蛋白序列的特定的取代、缺失或添加是"保守修飾的變異體"，其中改變導(dǎo)致用化學(xué)相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域公知的。這種保守修飾的變異體在本發(fā)明的多態(tài)性變異體、種間同系物和等位基因以外，但并不排除它們。下列八組每組包含互相保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A),甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);3)天門冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R),賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)，亮氨酸，曱硫氨酸(M),纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W);7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，曱硫氨酸(M)(參見例如Creighton，Proteins(1984))。術(shù)語"GC含量"是由脫氧鳥香(G)和/或脫氧胞苷(C)脫氧核糖核苷酸或者鳥苷(G)和/或胞苷(C)核糖核苦酸殘基組成的核酸序列的百分比。術(shù)語"哺乳動(dòng)物"或者"哺乳動(dòng)物的"是指分類學(xué)分類上的哺乳綱的任何動(dòng)物。哺乳動(dòng)物可以指人或者非人靈長類動(dòng)物。哺乳動(dòng)物可以指家畜(包括例如，犬、貓)、嚙齒目(包括兔類、小鼠、鼠屬)、倉鼠亞科(倉鼠)，等等。哺乳動(dòng)物可以指農(nóng)業(yè)動(dòng)物，包括例如，牛、綿羊、豬、馬，等等。術(shù)語"可操作的連接"是指第一核酸序列和第二核酸序列之間的功能鍵，這樣的話第一和第二核酸序列轉(zhuǎn)錄成單個(gè)核酸序列?？刹僮鬟B接的核酸序列無需物理上彼此鄰近。術(shù)語"可操作的連接"還指核酸表達(dá)操縱序列(例如啟動(dòng)子，或者轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的排列)和可轉(zhuǎn)錄核酸序列之間的功能鍵，其中表達(dá)操縱序列指導(dǎo)與可轉(zhuǎn)錄序列對(duì)應(yīng)的核酸的轉(zhuǎn)錄。附圖簡述圖1顯示改進(jìn)人白介素-15(IL-15)編碼序列的策略。IL-15多肽的區(qū)段1是指信號(hào)肽(氨基酸1-29);區(qū)段2是指前肽(氨基酸30-47);區(qū)段3是指成熟的IL-15(氨基酸47-115)。在IL-15optl中，IL-15的編碼序列具有更高的GC含量，潛在的剪接位點(diǎn)被改變。改變通常不影響編碼效能。在IL-15opt2中，編碼序列改進(jìn)類似于IL-15optl，但包括使用更"優(yōu)選的"密碼子，如美國專利5,786,464所定義。圖2顯示野生型IL-15(wt)、IL-15optl(optl)和IL-15opt2(opt2)的AU-GC含量模式的比較。與野生型IL-15cDNA相比，IL-15optl和IL-15opt2的GC含量具有顯著的增加。圖3顯示人野生型IL-15(SEQIDNO:l)和改進(jìn)的IL-15optl(opt)(SEQIDNO:3)核苷酸序列的比較。序列具有70.7%的序列同一性。圖4顯示野生型人IL-15(頂部；SEQIDNO:l)和改進(jìn)的IL-15optl(底部；SEQIDNO:3)核苷酸序列之間核苷酸改變的比較。改進(jìn)的人IL-15序列在總共162個(gè)密碼子中的121個(gè)(75%)發(fā)生改變。與野生型人IL-15核苷酸序列相比，四十一(41)個(gè)密碼子沒有改變。加才匡密碼子表示根據(jù)Seed的分類(美國專利5，786,464)改變?yōu)?更優(yōu)選的"密碼子(62個(gè)密碼子)。下劃線的密碼子表示根據(jù)Seed的分類改變?yōu)?次優(yōu)選的"密碼子(10個(gè)密碼子)，與Seed的方法相反?；疑吡溜@示的密碼子表示改變?yōu)?非優(yōu)選的"密碼子(49個(gè)密碼子)，也與Seed的方法相反。圖5顯示野生型IL-15(wt)(SEQIDNO:l)、IL-15optl(opt)(SEQIDNO:3)和IL-15opt2(opt-2)(SEQIDNO:4)核酸序列的序列比對(duì)。野生型IL-15具有總共162個(gè)密碼子。在IL-15optl中，162個(gè)密碼子中的121個(gè)被改變。在IL-15opt2中，162個(gè)密碼子中的122個(gè)^皮改變。圖6顯示野生型IL國15(wt;SEQIDNO:l)、IL-15optl(opt;SEQIDNO:3)和IL-15opt2(opt-2;SEQIDNO:4)核酸序列的序列比對(duì)。編碼序列的改進(jìn)包括使用"優(yōu)選"密碼子或者"次優(yōu)選"密碼子的核苷酸改變，如美國專利5,786,464所定義。IL-15optl具有72個(gè)優(yōu)選的/次優(yōu)選的密碼子，IL-15opt2具有103個(gè)優(yōu)選的/次優(yōu)選的密碼子。此外，IL-15編碼序列的改進(jìn)包括與美國專利5,786,464所定義方法相反的核苷酸改變。圖7顯示具有改進(jìn)的人IL-15編碼序列的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人IL-15蛋白的水平增加。圖示的是使用IL-15optl或者IL-15opt2核酸序列的典型的實(shí)驗(yàn)，顯示5倍增加。取7次實(shí)驗(yàn)的平均，與野生型人IL-15序列的表達(dá)相比，實(shí)現(xiàn)人IL-15蛋白生成的平均8倍增加。IL-15optl和IL-15opt2之間沒有IL-15蛋白生成的差異。這強(qiáng)調(diào)了我們的結(jié)論，即不是密碼子使用而是RNA序列的改變導(dǎo)致提高的基因表達(dá)。圖8顯示與野生型人IL-15(SEQIDNO:l)相比，IL-15optl(SEQIDNO:3)和IL-15opt2(SEQIDNO:4)序列中核苷酸改變的常見位置(高亮顯示)。指定的115個(gè)核苷酸(高亮顯示)位置的改變足以提高人IL-15的mRNA和蛋白表達(dá)(與野生型人IL-15相比大概8倍增加)。圖9顯示人IL-15信號(hào)和/或前肽的修飾導(dǎo)致IL-15的胞外積聚增加。圖10顯示改進(jìn)的與組織纖溶酶原活化因子(tPA)的信號(hào)肽和前肽融合的IL-15編碼序列4及大的提高IL-15在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的生成。/人IL-15opt-tPA2(其包含組織纖溶酶原活化因子信號(hào)肽和前肽序列)表達(dá)IL-15使哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的IL-15蛋白生成比改進(jìn)的IL-15(opt)另外平均增加2.5倍(使用l-3個(gè)獨(dú)立克隆的4次實(shí)驗(yàn)的平均)。具有不同替換結(jié)構(gòu)域的其他變異體導(dǎo)致IL-15蛋白生成減少或者沒有提高，所述其他變異體只有tPA信號(hào)肽(IL-15opt-tPAl)或tPA信號(hào)肽與IL-15前肽的組合(IL-15opt-tpA3)。圖11顯示與野生型人IL-15(IL-15wt)和改進(jìn)的IL-15(IL-15opt)相比，來自轉(zhuǎn)染的人293和RD4細(xì)胞的IL-15-tPA2的表達(dá)提高。圖12顯示tPA信號(hào)肽-IL-15結(jié)合處的改變以產(chǎn)生IL-15合適的N端。與野生型人IL-15(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)相比，IL-15opt-tPA2序列(SEQIDNO:37)在N端(SEQIDNO:38)具有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)和4個(gè)額外的氨基酸(GARA;SEQIDNO:41)。IL-15opt曙tPA5序列(SEQIDNO:39)在緊靠成熟IL-15(SEQIDNO:7和SEQIDNO:8)的N端(SEQIDNO:40)具有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)序列(R國X-(K/R)-R)和2個(gè)額外氨基酸(GA)。IL15opt=SEQIDNO:36。對(duì)從轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的上清獲得的IL-15蛋白進(jìn)行測序，顯示在緊靠成熟IL-15N端具有指定的額外氨基酸。圖13顯示來自修飾的tPA融合蛋白、IL-15opt-tPA2(opt-tPA2)和IL-15opt-tPA5(opt-tPA5)的IL-15蛋白的相似生成。圖14顯示人IL-15(h-IL15)(SEQIDNO:2)和恒河猴(Afacacamw/a"a)IL-15(rh-IL15)(SEQIDNO:15)蛋白具有96%的同一性，相差6個(gè)氨基酸。定位誘變用于在人IL-15叩tl編碼核苷酸序列中引入指定的ll核苷酸改變，產(chǎn)生恒河猴IL-15opt編碼核苷酸序列。圖15顯示人IL-15optl(huIL-15opt)(SEQIDNO:3)和恒河猴IL-15opt(rhlL-15opt)(SEQIDNO:16)核苦酸序列的比較。在人IL-15optl的489個(gè)核苷酸編碼區(qū)域引入十一(ll)個(gè)核普酸改變。圖16顯示恒河猴野生型IL-15(wt)(SEQIDNO:14)和恒河猴改進(jìn)的IL-15(opt)(SEQIDNO:16)核苷酸序列的比較。核苦酸序列具有71.3%的同一性。圖17顯示恒河猴IL-15編碼序列的改進(jìn)導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞中恒河猴IL-15的蛋白生成增加大約30倍。用tPA信號(hào)肽和前肽序列取代IL-15信號(hào)肽和前肽序列還導(dǎo)致進(jìn)一步的3倍提高，顯示兩種方法的協(xié)同作用。圖18顯示改進(jìn)IL-15編碼序列導(dǎo)致人和恒河猴IL-15蛋白生成的顯著增加。最終表達(dá)的增加對(duì)人來說是大約20倍，對(duì)恒河猴IL-15來說是大約90-100倍。在人和恒河猴IL-15載體中，用tPA信號(hào)肽和前肽序列取代IL-15信號(hào)肽和前肽導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞中IL-15蛋白生成的另外大約3倍增加。圖19顯示利用巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMVhuIL-15opt)表達(dá)優(yōu)化的人IL-15的表達(dá)載體的圖示。圖20顯示表達(dá)載體CMVhuIL-15(optl)(SEQIDNO:13)的序列圖譜。參見，對(duì)應(yīng)于利用巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMVrhlL-15opt)表達(dá)優(yōu)化的恒河猴IL-15的表達(dá)載體的SEQIDNO:21。人IL-15=SEQIDNO:2;卡那霉素標(biāo)記物=SEQIDNO:42。圖21顯示具有組織纖溶酶原活化因子蛋白的信號(hào)肽和前肽序列的優(yōu)化的人IL-15(huIL-15opt-tPA2)的圖示。200780003101.2說明書第17/42頁圖22顯示huIL-15optl-tPA2的核酸序列(SEQIDNO:9)和氨基酸序列(SEQIDNO:IO)。參見，對(duì)應(yīng)于具有組織纖溶酶原活化因子蛋白的信號(hào)肽和前肽序列的優(yōu)化的恒河猴IL-15(rhIL-15opt-tPA2)的核酸和氨基酸序列的SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。圖23顯示具有組織纖溶酶原活化因子蛋白的修飾的信號(hào)肽和前肽序列的優(yōu)化的人IL-15(huIL-15opt-tPA5)的圖示。圖24顯示huIL-15optl-tPA5的核酸序列(SEQIDNO:ll)和氨基酸序列(SEQIDNO:12)。參見，對(duì)應(yīng)于具有組織纖溶酶原活化因子蛋白的信號(hào)肽和前肽序列的優(yōu)化的恒河猴IL-15(rhlL-15opt-tPA2)的核酸和氨基酸序列的SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。圖25顯示野生型IL-15序列與RNA輸出元件(包括CTE或者RTEm26CTE)的融合導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞中IL-15蛋白生成大約2倍的增加。圖26顯示與野生型人IL-15可操作的連接到RNA輸出元件CTE或者RTEm26CTE相比，改進(jìn)人IL-15編碼序列還使IL-15在人293細(xì)胞中的蛋白生成增加5倍，與野生型人IL-15相比，增加10倍。型人IL-15相比，改進(jìn)人IL-15編碼序列還使IL-15在293細(xì)胞中的蛋白生成增加至少2倍。圖28顯示IL-15opt-tPA6和IL-15opt-tPA7中舉例說明的tPA-IL畫15融合的改變。IL-15opt-tPA6在緊靠成熟IL-15的N端(參見，SEQIDNOs:24和25)具有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)序列(R-X-(K/R)-R)和3個(gè)額外氨基酸(GAR)。IL-15opt-tPA7在緊靠成熟IL-15的N端(參見，SEQIDNOs:26和27)具有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)序列(R-X-(K/R)-R)和一個(gè)額外氨基酸(G)。對(duì)從轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的上清獲得的IL-15蛋白進(jìn)行測序，顯示在緊靠成熟IL-15N端具有指定的額外氨基酸。肽=SEQIDNOS:43-46。圖29顯示與人IL-15opt-tPA2和人IL-15opt-tPA5相比，改進(jìn)的人IL-15序列人IL-15opt-tPA6和人IL-15opt-tPA7顯示相似的IL-15生成的增加水平。從轉(zhuǎn)染的人293細(xì)胞測量由不同改進(jìn)序列產(chǎn)生的蛋白水平。生成的IL-15蛋白在N端不同，在緊靠N端具有GARA、GAR、GA或者G。表達(dá)融合到成熟IL-15端的tPA信號(hào)的不同質(zhì)粒顯示相似的改進(jìn)的IL-15生成水平。圖30顯示與恒河猴IL-15opt-tPA2和恒河猴IL-15opt-tPA5相比，改進(jìn)的恒河猴IL-15序列恒河猴IL-15opt-tPA6和恒河猴IL-15opt-tPA7顯示相似的IL-15生成的增加水平。從轉(zhuǎn)染的人293細(xì)胞測量由不同改進(jìn)的序列生成的蛋白水平。數(shù)據(jù)類似于上文使用改進(jìn)的人IL-15序列的那些數(shù)據(jù)。圖31顯示人IL-15opt-tPA6的圖示。圖32顯示人IL-15optl-tPA6的核酸序列(SEQIDNO:28)和氨基酸序列(SEQIDNO:29)。恒河猴IL-15opt-tPA6的核酸和氨基酸序列分別如SEQIDNOs:32和33所示。圖33顯示人IL-15opt-tPA7的圖示。圖34顯示人IL-15optl-tPA7的核酸序列(SEQIDNO:30)和氨基酸序列(SEQIDNO:31)。恒河猴IL-15opt-tPA7的核酸和氨基酸序列分別如SEQIDNOs:34和35所示。圖35顯示改進(jìn)的人IL-15受體a(IL15Ra)核酸序列(SEQIDNO:47)的核酸和編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:48)。圖36顯示改進(jìn)的人IL15Ra核酸序列(SEQIDNO:47)的核酸和編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:48)。圖37顯示改進(jìn)的人可溶性IL15Ra核酸序列(SEQIDNO:49)的核酸和編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:50)。圖38顯示改進(jìn)的人可溶性IL15Ra核酸序列(SEQIDNO:49)的核酸和編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:50)。IL-15受體a改進(jìn)的序列導(dǎo)致測量到的總IL-15水平顯著增加。通過Ca-P04共沉淀方法將100nghlL-15(天然(質(zhì)粒AG32)或者使用tPA前導(dǎo)序列(質(zhì)粒AG59))(單獨(dú)的或者與ML15Ra(質(zhì)粒AG79)組合)與100ngGFP和100ngSEAP—起轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。48小時(shí)后收集細(xì)胞，利用QuantikineHumanIL-15,RDsystems進(jìn)行Elisa以定量培養(yǎng)基(外)和細(xì)胞中的IL-15。還給出總IL-15(胞外和胞內(nèi))。倍數(shù)表明IL-15增加的倍數(shù)。圖40顯示體外使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法在人293細(xì)胞中共表達(dá)IL-15和IL-15受體a改進(jìn)的序列導(dǎo)致測量到的總IL-15水平顯著增加。利用Superfect將100ng質(zhì)粒hlL15-tPA6(單獨(dú)的或者與ML15受體a(質(zhì)粒AG79)或者WL15可溶性受體a(質(zhì)粒AG98)組合)與100ngGFP和100ngSEAP質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞，所述GFP和SEAP質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染對(duì)照。24和48小時(shí)后對(duì)培養(yǎng)基取樣。48小時(shí)后收集細(xì)^M利用QuantikineHumanIL-15(R&Dsystems)進(jìn)行Elisa以測定IL-15水平。圖41顯示當(dāng)IL-15和IL-15受體DNA在尾靜脈注射后^皮遞送到小鼠組織并在其中表達(dá)時(shí)，肺部NK細(xì)胞水平的顯著增加以及肺部CD3+CD49+細(xì)胞的增力口。在分析文件中給出每105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量。尾靜脈注射后3天對(duì)組織進(jìn)行分析。不同組的小鼠以流體力學(xué)法尾靜脈注射下列DNA:GFP,1Mg表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒(對(duì)照)；IL15,1jiig表達(dá)人IL-15的質(zhì)粒，利用我們臨時(shí)申請(qǐng)中描述的質(zhì)粒ML15tPA6Ra,1jHg表達(dá)人IL-15受體a的質(zhì)粒15+Ra2，2jug表達(dá)IL-15tPA6的質(zhì)粒和2jiig表達(dá)IL-15受體a的質(zhì)粒15+Ra1，1/xg表達(dá)IL-15tPA6的質(zhì)粒和1/ig表達(dá)人IL-15受體a的質(zhì)粒。圖42顯示在單獨(dú)的IL-15、IL-15+IL-15受體a或者IL-15+IL-15可溶性受體a的DNA注射后，小鼠肝臟中NK細(xì)胞和T細(xì)胞的增加。在分析文件中給出每106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量。用膠原酶消化器官以獲得單細(xì)胞懸浮液，所述器官來自用指定的IL-15tPA6和IL-15受體a質(zhì)粒DNA注射的小鼠。細(xì)胞用抗CD3、CD4、CD8、CD49b、CD44和CD62L的抗體染色，通過流式細(xì)胞術(shù)分析。小鼠NK細(xì)胞被鑒定為CD3-CD49b+表型。IL-15與質(zhì)粒IL-15tPA6—起注射。共轉(zhuǎn)染IL-15+IL誦15R、表達(dá)完整L15Ra的質(zhì)粒。IL-15+IL-15sR、表達(dá)可溶性IL-15受體a的質(zhì)粒與IL-15tPA6共轉(zhuǎn)染。圖43顯示脾中效應(yīng)細(xì)胞的增加(左欄和右欄分別為總效應(yīng)和CD8效應(yīng))。CD62L的缺失定義了一群具有效應(yīng)表型的小鼠記憶T細(xì)胞。對(duì)來自小鼠的脾進(jìn)行處理，所述小鼠被注射指定的IL-15和IL-15受體ce質(zhì)粒DNA,細(xì)胞用抗CD3、CD4、CD8、CD49b、CD44和CD62L的抗體染色，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。圖44顯示增加的IL-15水平導(dǎo)致增強(qiáng)的生物效應(yīng)，所述增加的IL-15水平通過IL15Ra對(duì)IL-15的穩(wěn)定來獲得。圖41顯示的使用所有實(shí)驗(yàn)小鼠組的IL-15表達(dá)水平與生物效應(yīng)相關(guān)。該圖顯示IL-15水平與NK細(xì)胞、CD3CD49細(xì)胞和T細(xì)胞水平的相關(guān)性，所述水平是DNA注射后3天在肺中測定的。這表明增加的IL-15水平導(dǎo)致諸如肺的外周組織中增強(qiáng)的生物效應(yīng)，所述增加的IL-15水平通過IL15Ra對(duì)IL-15的穩(wěn)定來獲得。圖45顯示IL15Ra穩(wěn)定IL-15。A:在IL-15受體表達(dá)質(zhì)粒IL15Ra或者IL15sRa存在或者缺失的條件下，用IL15tPA6(IL15t)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物和培養(yǎng)基中IL-15的測量(ELISA)。測定三份樣品，條(bars)代表胞外(Extra)、胞內(nèi)(Intra)和總IL-15產(chǎn)生的SD。B、C、D:轉(zhuǎn)染后生成的IL-15的Western印跡分析。將三4分轉(zhuǎn)染物上樣于12%NuPage丙烯酰胺凝膠。B，細(xì)胞抽提物；C，轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的培養(yǎng)基；D是C的更高曝光以顯示IL15t。電泳移動(dòng)的蛋白被轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，通過多克隆抗人IL-15抗體(AF315，R&D,l:3000稀釋)和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(ECL)顯示IL-15。圖46顯示IL-15與完整受體a的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致大量結(jié)合在細(xì)胞表面的IL-15(與IL15Ra復(fù)合)，而與可溶性受體a的共轉(zhuǎn)染不是這樣。用藻紅蛋白標(biāo)記的抗IL-15抗體(R&D)表面染色后通過流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-15的相應(yīng)水平顯示于右邊的表格(QuantikineElisa,R&D)。圖47顯示IL-15共表達(dá)穩(wěn)定IL15Ra。利用磷酸鉤共沉淀法用50ngAG79hlL15Ra或者AG98IL15sRa(單獨(dú)的或者與AG59ML15tPA6組合)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。72小時(shí)后收集細(xì)胞；通過凝膠電泳(10%NuPAGE凝膠)和western印跡分析培養(yǎng)基和細(xì)胞提取物的IL15Ra生成，所述western印跡使用山羊抗IL15Ra抗體(1:3000稀釋)和過氧化物酶-偶聯(lián)的兔抗山羊IgG(l:5000稀釋)。全長糖基化的受體a遷移為59kDa條帶，而受體a的可溶性胞外部分遷移為42kDa。1:2和1:4的樣品稀釋物按所示上樣于頂部以定量生成的受體量。Mock表示只用對(duì)照質(zhì)粒(GFP)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞。圖48顯示IL15Ra的N-糖基化模式。A:顯示IL15Ra和IL15sRa的預(yù)測結(jié)構(gòu)。標(biāo)明不同的結(jié)構(gòu)域。Nglyc表示潛在的N-糖基化位點(diǎn)。B、C:共表達(dá)導(dǎo)致更多表面全長受體的生成和更多的IL15sRa分泌到培養(yǎng)基中。共表達(dá)還從細(xì)胞釋放更低糖基化的IL15sRa。這些結(jié)果與IL-15存在條件下IL15Ra在細(xì)胞表面的快速轉(zhuǎn)運(yùn)和切割吻合。此外，生成的IL15Ra總量的比較表明IL-15缺失條件下全長受體可能在內(nèi)涵體途徑中快速降解。IL-15缺失條件下，IL15sRa中大部分生成的IL15sRa仍然與細(xì)胞結(jié)合，遷移為約28kDa的條帶，表明它不像全長IL15Ra—樣在翻譯后被快速加工或者降解。IL-15共表達(dá)增加分泌的IL15sRa，同時(shí)伴隨胞內(nèi)數(shù)量的減少。細(xì)胞結(jié)合的，1/110提取物上樣；培養(yǎng)基，1/450上樣。D是C的更高曝光以顯示培養(yǎng)基中低水平的IL15sRa(通過單獨(dú)的IL15Ra生成)。用(+)標(biāo)明的道包含用N-糖苷酶F(NEB)處理的物質(zhì)以鑒定生成的受體的N-糖基化程度。圖49A顯示小鼠血漿中IL-15的生成，所述小鼠被注射了指定的不同DNA表達(dá)載體。與優(yōu)化的載體(IL15t，IL15tPA6)相比，IL-15的野生型cDNA表達(dá)載體(IL15wt)的注射導(dǎo)致低水平表達(dá)，所述優(yōu)化載體4吏體內(nèi)血漿的IL-15增加約IOO倍。為測量野生型栽體的IL-15,該實(shí),驗(yàn)中每只小鼠被注射lpgDNA。IL15Ra或者IL15sRa質(zhì)粒對(duì)小鼠的共注射導(dǎo)致血漿IL-15水平額外約100倍的增加(106-倍總增加)。有趣地，盡管利用表達(dá)IL15sRa的構(gòu)建體IL-15的峰值產(chǎn)量是最高的，血漿水平反而降低得更快。因此與全長IL15Ra的共注射導(dǎo)致IL-15更加延長的血漿水平，與細(xì)胞表面更緩慢的切割和釋放吻合。國IL-15野生型；A具有tPA6SIGPRO肽的改進(jìn)的IL-15(IL15t,也稱為IL15tPA6);oIL15t和完整IL15Ra;IL15t和可溶性IL15Ra。圖49B顯示當(dāng)以1:3比例(w/w)給予編碼IL-15和ILRa的核酸載體時(shí)，IL-15的血漿濃度提高。對(duì)于每種質(zhì)粒小鼠均被注射0.2pgDNA,除了15+Ra3組，它注射0.2IL-15質(zhì)粒和0.6IL15Ra質(zhì)粒。條顯示SD。過量的全長受體導(dǎo)致IL-15在血漿中的停留延長，如第3天的高水平所示。因此，與sRa的共表達(dá)導(dǎo)致血漿IL-15的最高峰值，而與全長Ra的共表達(dá)導(dǎo)致更加延長的IL-15水平和可能的功能。這可能源于與受體結(jié)合的表面IL-15在sRa/IL-15復(fù)合物的切割和生成時(shí)更緩滿的釋放。這種復(fù)合物是有生物活性的，如共表達(dá)的IL-15/sRa的活性所示，其只生成可溶性復(fù)合物。△具有tPA6SIGPRO肽的改進(jìn)的IL-15(IL15t);oIL15t和完整IL15Ra(15+Ra);l:3(w/w)比例的IL15t和完整IL15Ra(15+Ra3);IL15t和可溶性IL15Ra(15+sRa)。圖50顯示用指定的DNA進(jìn)行DNA注射后3天腸系膜淋巴結(jié)和脾的大小。GFPDNA表達(dá)載體被用作陰性對(duì)照。與脾相比，單獨(dú)的IL-15(IL15t)表達(dá)更顯著增加腸系膜淋巴結(jié)的大小。這可能是IL15Ra在淋巴結(jié)中高表達(dá)的結(jié)果，所述淋巴結(jié)保留血漿IL-15。還給出第3天測量的血漿IL-15水平。圖51顯示IL15Ra和IL15sRa是O-糖基化的。O-糖苷酶(Roche)的處理表明受體a的分泌形式是O-糖基化的。用0-糖苷酶(標(biāo)為+的道)處理來自用指定構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的培養(yǎng)基并和未處理的物質(zhì)(-)進(jìn)行比較。圖52顯示在以流體力學(xué)法DNA遞送指定的質(zhì)粒到小鼠尾靜脈后3天，肺部NK細(xì)胞增加。不同組的小鼠被注射0.1/xg表達(dá)IL-15tPA6、IL曙15tPA6+IL15Ra(全長受體a)、IL-15tPA6+IL15sRa(可溶性受體a)的質(zhì)粒。標(biāo)為IL15t+Ra.3的組接受0.1/xgIL-15tPA6和0.3/igIL15Ra質(zhì)粒(l:3(w/w)比例的IL-15和IL15Ra)。IL-15與受體DNA的這種比例(大約1:3)顯示有更多肺NK細(xì)胞的傾向。單獨(dú)的IL-15和IL-15+sRa之間的差異是顯著的(PO.Ol，單向方差分析，鄧奈特(Dunnett)多次對(duì)比檢驗(yàn))。圖53顯示在恒河猴肌肉注射DNA后的血漿IL-15濃度(pg/ml)。在指定的天數(shù)通過Elisa(Quantiglo，R&D)測量恒河猴血漿中IL-15的平均血漿值。如箭頭所示，在第0、14和28天對(duì)每只恒河猴進(jìn)行單次IM注射然后用Advisys系統(tǒng)(Woodlands,TX，advisys.net)進(jìn)行電穿孔。顯示接受IL-15/15受體a(IL15/Ra，圓圈)組合或者只接受IL-15表達(dá)載體(IL15,三角形)的3只恒河猴的平均值。結(jié)果顯示IL15/15Ra載體組合顯著增加IL-15的血漿水平，而單獨(dú)的IL-15載體沒有增加。圖54顯示IL-15/15RaDNA載體的肌內(nèi)注射導(dǎo)致血漿IL-15水平的增加。6只恒河猴在單個(gè)位點(diǎn)被肌內(nèi)注射恒河猴IL-15/15RaDNA表達(dá)載體。第0和14天的兩次DNA注射利用每種質(zhì)粒的100/ig(動(dòng)物M100、M115、M120)或者250jtig(動(dòng)物M122、M125、M126)進(jìn)4亍。使用恒定電流脈沖圖形，在0.5安培、52毫秒脈沖長、80秒延遲時(shí)間的條件下，利用Advisys電穿孔系統(tǒng)將DNA(0.5ml)電穿孔進(jìn)肌肉。結(jié)果顯示在第一次接種期間，4/6恒河猴的血漿IL-15水平升高，第二次接種期間6/6恒河猴血漿IL-15水平升高。圖55顯示兩次免疫后第4、5、19和20天的IL-15血漿ELISA。用IL-15/15Ra—起進(jìn)行DNA疫苗接種后測量恒河猴血漿中的IL-15濃度(pg/ml)。5只恒河猴(M529、M531、M579、M581、M583)在第0和15天進(jìn)行電穿孔，在第4、5、19和20天獲取血漿，通過IL-15ELISA進(jìn)行分析。相同研究中的3只動(dòng)物(M530、M573、M575;虛線)不進(jìn)行免疫，用作對(duì)照。5只電穿孔動(dòng)物中的4只顯示血漿IL-15的顯著增加，而1只動(dòng)物(529M)不顯示。圖56顯示IL15/15Ra增強(qiáng)抗SIV的特異免疫應(yīng)答，并且參與多功能抗原-特異細(xì)胞因子生成細(xì)胞(IFN7和IL-2)和效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生。(頂部3欄)在分別用gag、env、nef、pol和tat的肽庫體外刺激時(shí)，每百萬淋巴細(xì)胞中的IFN^生成細(xì)胞。在第0、4、8周3只恒河猴用編碼SIV抗原、IL-15和IL15Ra的DNA載體混合物接種，如所示每2周分離和檢測PBMC。(底部欄)第11-21周(療法結(jié)束后2周)每百萬淋巴細(xì)胞中的SIV特異IL-2生成T細(xì)胞。分離PBMC，并在體外用對(duì)應(yīng)于SlVmac239的gag、env、nef、tat或者pol蛋白的肽庫進(jìn)行刺激。第11周是第一次在這些恒河猴中檢測到多功能的分泌IL-2的SIV特異細(xì)胞。這些動(dòng)物參與先前的免疫治療實(shí)驗(yàn)，但之前不具有IL-2生成細(xì)胞。圖57顯示第三次疫苗接種后2周在接種DNA的恒河猴中存在循環(huán)的多功能中央記憶(CM)和效應(yīng)記憶(EM)細(xì)胞。CM細(xì)胞被定義為CD28+CD45RA陽。EM細(xì)胞是CD28-CD45RAlow/+。圖58顯示協(xié)同表達(dá)IL-15和IL15Ra的構(gòu)建體圖語。圖59顯示協(xié)同表達(dá)IL-15tPA6和IL15Ra的構(gòu)建體圖謙。圖60顯示協(xié)同表達(dá)IL-15tPA6和IL15sRa的構(gòu)建體圖語。詳細(xì)說明1.引言發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子白介素-15以編碼核酸或者蛋白的形式作為免疫細(xì)胞刺激劑(例如，淋巴細(xì)胞擴(kuò)增和活化)和疫苗佐劑的用途。天然IL-15編碼序列沒有最優(yōu)表達(dá)IL-15，這是因?yàn)槿羟Р煌睦碛?，包括RNA序列內(nèi)的信號(hào)，例如嵌入編碼序列內(nèi)的潛在剪接位點(diǎn)和低穩(wěn)定性的決定子(通常A/T或者AAJ富集的)序列。通過將IL-15序列的剪接位點(diǎn)和低穩(wěn)定性序列減到最少，IL-15蛋白的表達(dá)與天然哺乳動(dòng)物IL-15序列的表達(dá)相比可以增加差不多4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、30倍或者更高。用于該目的的一般方法已經(jīng)建立，包括將若千編碼mRNA的密碼子變?yōu)榫幋a相同氨基酸的可選擇的密碼子(參見，例如5,965,726、5,972,596、6,174,666、6,291,664、6,414,132和6,794,498，為了所有目的其中公開的內(nèi)容在此完整以引用的方式并入本文)。這導(dǎo)致任何嵌入RNA的負(fù)作用信號(hào)的改變，但不改變生成的蛋白。通過將天然IL-15信號(hào)肽和/或前肽序列與異源蛋白(包括例如，組織纖溶酶原活化因子、生長激素或者免疫球蛋白)的信號(hào)肽和/或前肽序列交換可以進(jìn)一步增加IL-15蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的生成。利用融合到異源信號(hào)肽和/或前肽的成熟IL-15的改進(jìn)的編碼序列，IL-15在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平與野生型IL-15序列的表達(dá)相比可以增力口20倍、40倍、50倍、70倍、90倍或者更高，與具有天然信號(hào)肽和/或前肽序列的改進(jìn)的IL-15編碼序列的表達(dá)相比額外增加2倍、3倍、4倍、5倍或者更高(參見圖1)。2.核酸序列本發(fā)明改進(jìn)的高表達(dá)IL-15核酸序列通?；谔烊徊溉閯?dòng)物白介素-15編碼序列作為模板。編碼天然白介素-15的核酸序列可以非常方便的在公開可利用的數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，所述數(shù)據(jù)庫包括世界范圍內(nèi)可利用的核苷酸、蛋白和科學(xué)數(shù)據(jù)庫。詳細(xì)說明1.引言發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子白介素-15以編碼核酸或者蛋白的形式作為免疫細(xì)胞刺激劑(例如，淋巴細(xì)胞擴(kuò)增和活化)和疫苗佐劑的用途。天然IL-15編碼序列沒有最優(yōu)表達(dá)IL-15,這是因?yàn)槿舾刹煌睦碛桑≧NA序列內(nèi)的信號(hào)，例如嵌入編碼序列內(nèi)的潛在剪接位點(diǎn)和低穩(wěn)定性的決定子(通常A/T或者AAJ富集的)序列。通過將IL-15序列的剪接位點(diǎn)和低穩(wěn)定性序列減到最少，IL-15蛋白的表達(dá)與天然哺乳動(dòng)物IL-15序列的表達(dá)相比可以增加差不多4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、30倍或者更高。用于該目的的一般方法已經(jīng)建立，包括將若干編碼mRNA的密碼子變?yōu)榫幋a相同氨基酸的可選擇的密碼子(參見，例如5,965,726、5,972,596、6,174,666、6,291,664、6,414,132和6,794,498，為了所有目的其中公開的內(nèi)容在此以參考的方式完整并入本文)。這導(dǎo)致任何嵌入RNA的負(fù)作用信號(hào)的改變，但不改變生成的蛋白。通過將天然IL-15信號(hào)肽和/或前肽序列與異源蛋白(包括例如，組織纖溶酶原活化因子、生長激素或者免疫球蛋白)的信號(hào)肽和/或前肽序列交換可以進(jìn)一步增加IL-15蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的生成。利用融合到異源信號(hào)肽和/或前肽的成熟IL-15的改進(jìn)的編碼序列，IL-15在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平與野生型IL-15序列的表達(dá)相比可以增力口20倍、40倍、50倍、70倍、90倍或者更高，與具有天然信號(hào)肽和/或前肽序列的改進(jìn)的IL-15編碼序列的表達(dá)相比額外增加2倍、3倍、4倍、5倍或者更高(參見圖1)。2.核酸序列本發(fā)明改進(jìn)的高表達(dá)IL-15核酸序列通?；谔烊徊溉閯?dòng)物白介素-15編碼序列作為模板。編碼天然白介素-15的核酸序列可以非常方便的在公開可利用的數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，所述數(shù)據(jù)庫包括國家生物技術(shù)信息中心在萬維網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov上提供的核苷酸、蛋白和科學(xué)數(shù)據(jù)庫。天然IL-15核酸序列可以方便的從許多哺乳動(dòng)物組織中克隆，所述哺乳動(dòng)物組織包括胎盤、骨骼肌、腎、肺、心臟和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(參見，Grabstein,等人，Science(l994)264:965)。用于所需免疫細(xì)胞群的分離和刺激的實(shí)-瞼步驟是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，O/AreW尸ratoco/szw7wmimo/ogy(免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室指南)，Coligan，等人,eds.，1991-2006,JohnWiley&Sons。根據(jù)同時(shí)調(diào)整影響mRNA運(yùn)輸、穩(wěn)定性和表達(dá)的若干因素的方法對(duì)序列進(jìn)行修飾。改變密碼子以改變總的mRNAAT(AU)-含量、以將潛在剪接位點(diǎn)減到最少或者全部去除、以改變?nèi)魏纹渌囊种菩蛄泻鸵阎獙?duì)mRNA穩(wěn)定性有負(fù)面影響的影響mRNA穩(wěn)定性和加工的信號(hào)，例如連續(xù)的A或者T/U核苷酸、AATAAA、ATTTA和密切相關(guān)的變異序列。本申請(qǐng)中用于IL-15編碼核酸序列的方法已經(jīng)在美國專利6,794,498、6，414，132、6,291,664、5,972,596、和5,965,726中描述，為所有目的其中每個(gè)公開內(nèi)容在此以引用的方式完整并入本文。通常，編碼IL-15序列的核苷酸堿基或者密碼子的變化不改變包括IL-15蛋白的氨基酸序列，所述IL-15蛋白來自于天然IL-15蛋白。改變基于遺傳密碼的簡并性，利用相同氨基酸的可選擇的密碼子，如上面表1所概述。在某些實(shí)施方式中，需要改變一種或者多種密碼子以編碼相似的氨基酸殘基而不是相同的氨基酸殘基。編碼氨基酸殘基的適用保守取代如上所述。通常，在實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)IL-15編碼序列穩(wěn)定性的本方法中，特定氨基酸的A/T相對(duì)更富集的密碼子被替換為編碼相同氨基酸的G/C相對(duì)更富集的密碼子(參見，例如圖2和4)。例如，由A/T相對(duì)更富集的密碼子和G/C相對(duì)更富集的密碼子編碼的氨基酸如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>根據(jù)引入改變的數(shù)量，本發(fā)明改進(jìn)的IL-15和/或IL-15Ra核酸序列可以方便地作為全合成序列制備。用于構(gòu)建編碼蛋白的合成核酸序列或者合成基因序列的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。合成基因序列可以商業(yè)化購買自許多服務(wù)公司的任意一家，包括DNA2.0(MenloPark,CA)、Geneart(Toronto,Ontario,Canada)、CODAGenomics(Irvine,CA)、和GenScript，Corporation(Piscataway,NJ)。作為選擇，密碼子改變可以利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)引入。還可以例如通過體外位點(diǎn)特異的誘變作用或者通過PCR或者通過本領(lǐng)域已知的適于特異改變核酸序列的任何其他遺傳工程方法進(jìn)行修飾。體外誘變實(shí)驗(yàn)步驟描述于，例如，/m松raMi^age打eWsiVWoco/s(體外誘導(dǎo)突變實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，Braman,ed.,2002，HumanaPress,和Sankamnarayanan,iVotoco/sM齒gewes7'51(豫導(dǎo)突變實(shí)-驗(yàn)手冊(cè))，2001,ElsevierScienceLtd。通過改變整個(gè)天然IL-15和/或IL15Ra核酸序列的選擇密碼子、或者通過改變5'端、3'端或者中間子序列內(nèi)的密碼子，可以構(gòu)建高水平表達(dá)的改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra序列。沒有必要每個(gè)密碼子都被改變，但是足夠數(shù)量的密碼子被改變使得在相同條件下改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra核酸序列的表達(dá)(即，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)比天然IL-15和/或IL15Ra核酸序列的表達(dá)多至少約10%、25%、50%、75%、1倍、2倍、4倍、8倍、20倍、40倍、80倍或者更高?？梢噪S時(shí)間或者在指定終點(diǎn)檢測表達(dá)，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，例如，使用凝膠電泳或者液相或者固相結(jié)合反應(yīng)中的抗IL-15或者抗IL15Ra抗體(例如，ELISA、免疫組織化學(xué))。白介素-15ELISA^r測試劑盒由以下公司商品供應(yīng)，<列濁口,RayBiotech，Norcross，GA;AntigenixAmerica,HuntingtonStation,NY;eBioscience,SanDiego,CA;Biosource(Invitrogen)，Camarillo，CA;R&DSystems(Minneapolis,MN)和PeproTech，RockyHill,NJ。通常至少大約50%的圖8所標(biāo)識(shí)位置的改變的核苷酸或者密碼子被變?yōu)榱硪环N核苷酸或者密碼子使得相同或者相似的氨基酸殘基被編碼。在其他實(shí)施方式中，至少大約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、95%、97%、98%、99%的圖8中所標(biāo)識(shí)的改變的密碼子被變?yōu)榱硪环N核苷酸或者密碼子使得相同或者相似的氨基酸殘基被編碼。為了改進(jìn)IL-15核酸序列，如圖8所標(biāo)識(shí)的可以改變的核苷酸位置是6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486。當(dāng)^f吏用本方法時(shí)，與天然IL-15核酸序列相比，改進(jìn)的IL-15核酸序列的GC含量通常增加。例如，改進(jìn)的IL-15核酸序列的GC含量是至少大約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%或者更高。在一些實(shí)施方式中，天然IL-15信號(hào)肽(SIG)序列或者信號(hào)肽和前肽(SIG-PRO)序列被替換為異源蛋白(即，除IL-15以外的蛋白)的分泌SIG序列或者SIG-PRO序歹J(參見，例如，圖9)。示例性的信號(hào)肽和前肽序列包括那些來自組織纖溶酶原活化因子(tPA)蛋白、生長激素、GM-CSF和免疫球蛋白的信號(hào)肽和前肽序列。組織纖溶酶原活化因子信號(hào)肽和前肽序列是本領(lǐng)域已知的(參見，Delogu，等人，InfectImmun(2002)70:292;GenBank登錄號(hào)E08757)。生長激素信號(hào)肽和前肽序列也是本領(lǐng)域已知的(參見，Pecceu,等人，Gene(1991)97:253;GenBank登錄號(hào)M35049和X02891)。免疫球蛋白信號(hào)肽和前肽序列，例如免疫球蛋白重鏈的信號(hào)肽和前肽序列，也是本領(lǐng)域已知的(參見，Lo,等人，ProteinEng.(1998)11:495和GenBank登錄號(hào)Z75389和D14633)。信號(hào)肽-IL-15融合蛋白和SIG-PRO-IL-15融合蛋白可具有被位點(diǎn)特異性蛋白酶識(shí)別的切割序列，所述切割序列被摻入融合蛋白的1個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)，例如，緊挨在成熟IL-15的N端氨基酸殘基之前。凈皮位點(diǎn)特異性蛋白酶識(shí)別的大量切割序列是本領(lǐng)域已知的，包括那些弗林蛋白酶、凝血酶、腸激酶、因子Xa等等的切割序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，天然IL-15信號(hào)肽和前肽序列凈皮替換為tPA的信號(hào)肽和前肽序列序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，tPASIG-PRO序列被改變以去除一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基和/或摻入蛋白酶切割位點(diǎn)(例如，凝血酶、腸激、，因子Xa)。參見，圖12。在一些實(shí)施方式中，天然IL15Ra信號(hào)肽(SIG)序列或者信號(hào)肽和前肽(SIG-PRO)序列被替換為異源蛋白(即，除IL15Ra以外的蛋白)的分泌SIG序列或者SIG-PRO序列。示例性的信號(hào)肽和前肽序列包括上述討論的那些，例如，組織纖溶酶原活化因子(tPA)蛋白、GM-CSF、生長激素和免疫J求蛋白。在一些實(shí)施方式中，IL15Ra核酸序列不編碼免疫球蛋白序列，例如，可操作連接的Fc序列。一旦已經(jīng)構(gòu)建了高水平表達(dá)的改進(jìn)的IL-15核酸序列，它在經(jīng)受進(jìn)一步處理以便插入到一種或者多種表達(dá)載體前可以被克隆入克隆載體，例如TA克隆⑧載體(Invitrogen，Carlsbad,CA)。改進(jìn)的IL-15核酸序列的處理，包括重組修飾和純化，可以使用本領(lǐng)域公知的步驟進(jìn)行。這種步驟已經(jīng)7>開于，例如，SambrookandRussell，Mo/ecw/arC/om'"g:爿M"聰a/(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，2000，ColdSpringHarborLaboratoryPress和CMrmzf/Vo/oco/sMo/ecw/ar5zo/o"(分子生物學(xué)現(xiàn)行規(guī)范)，Ausubel,等人，eds.,1987-2006,JohnWiley&Sons。3.表達(dá)載體從包含改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra編碼序列的表達(dá)載體可以重組表達(dá)IL-15和IL15Ra序列?？梢愿倪M(jìn)IL-15和/或IL15Ra編碼序列中的一個(gè)或者兩個(gè)。本發(fā)明的表達(dá)載體具有表達(dá)盒，所述表達(dá)盒將在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)IL-15和IL15Ra中的一個(gè)或者兩個(gè)。IL-15和IL15Ra可以表達(dá)自同一個(gè)載體或者多個(gè)載體。IL-15和IL15Ra可以表達(dá)自同一載體的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒(例如，具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的單個(gè)表達(dá)盒；或者使用兩個(gè)啟動(dòng)子和兩個(gè)polyA位點(diǎn)的雙表達(dá)盒)。在每個(gè)表達(dá)盒內(nèi)，編碼IL-15和IL15Ra的序列被可操作的連接到表達(dá)調(diào)控序列。"可操作連接的"序列包括與感興趣的核酸鄰接的表達(dá)操縱序列和以反式作用或者間隔一段距離控制感興趣的基因的表達(dá)操縱序列。表達(dá)操縱序列包括合適的轉(zhuǎn)錄起始、終止、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列序列；有效的RNA加工信號(hào)例如剪接和多腺苷酸化信號(hào)；穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA的序列；促進(jìn)RNA輸出的序列(例如，組成性轉(zhuǎn)運(yùn)元件(CTE),RNA轉(zhuǎn)運(yùn)元件(RTE),或者其組合，包括RTEm26CTE);增強(qiáng)翻譯效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增強(qiáng)蛋白穩(wěn)定性的序列；和當(dāng)需要時(shí)，增強(qiáng)蛋白分泌的序列。任選地表達(dá)載體還具有用于表達(dá)選擇性標(biāo)記物的第3個(gè)獨(dú)立的表達(dá)載體。選4奪性標(biāo)記物是本領(lǐng)域/>知的，可以包括，例如，對(duì)抗生素具有抗性的蛋白、熒光蛋白、抗體表位等等。示例性的對(duì)抗生素具有抗性的標(biāo)記物包括編碼j8-內(nèi)酰胺酶的序列(抗j8-內(nèi)酰胺，包括青霉素、氨千青霉素、羧千青霉素)，或者編碼對(duì)四環(huán)素、氨基糖苷類(例如，卡那霉素，新霉素)抗性的序列等等。示例性的熒光蛋白包括綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白。一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒中包括的一個(gè)或者多個(gè)啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)促進(jìn)IL-15和/或IL15Ra多肽在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。一個(gè)或者多個(gè)啟動(dòng)子可以是病毒、組成性或者可誘導(dǎo)的天然哺乳動(dòng)物腫瘤病毒，或者優(yōu)選地在特定組織類型或者細(xì)胞類型(例如，"組織特異的")中可調(diào)控IL-15和/或IL15Ra的轉(zhuǎn)錄。"組成性"啟動(dòng)子是一種在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下都具有活性的啟動(dòng)子。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中示例性的組成性啟動(dòng)子包括腫瘤病毒啟動(dòng)子(例如，猿巨細(xì)胞病毒(CMV)、人CMV、猴病毒40(SV40)、勞氏肉瘤病毒(RSV))、免疫球蛋白元件(例如，IgH)的啟動(dòng)子、"管家"基因(例如，]8-肌動(dòng)蛋白、二氫葉酸還原酶)的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，需要可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。"可誘導(dǎo)的"啟動(dòng)子是一種在環(huán)境或者發(fā)育調(diào)控中具有活性的啟動(dòng)子?？烧T導(dǎo)的啟動(dòng)子是被外源供給化合物調(diào)控的那些啟動(dòng)子，包括但不限于，鋅-誘導(dǎo)的金屬硫蛋白(MT)啟動(dòng)子；異丙基疏代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，地塞米松(Dex)誘導(dǎo)的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子；四環(huán)素-阻遏系統(tǒng)(Gossen等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA，89:5547-5551(1992));四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)(Gossen等人，Science,268:1766-1769(1995);還可參見Harvey等人，Curr.Opin.Chem.Biol"2:512-518(1998));RU486-誘導(dǎo)系統(tǒng)(Wang等人，Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等人，GeneTher.,4:432-441(1997));和雷帕霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)(Magari等人J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))?？捎糜诒疚牡钠渌愋偷目烧T導(dǎo)啟動(dòng)子是那些通過特定生理狀態(tài)，例如，溫度、急性期，調(diào)控的或者只存在于復(fù)制細(xì)胞中的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用哺乳動(dòng)物IL-15的天然啟動(dòng)子。當(dāng)期望改進(jìn)的IL-15序列的表達(dá)模擬天然表達(dá)時(shí)，天然啟動(dòng)子可以是優(yōu)選的。當(dāng)改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra的表達(dá)必須被暫時(shí)或者發(fā)育的調(diào)控、或者以組織特異方式調(diào)控、或者響應(yīng)特異轉(zhuǎn)錄刺激時(shí)，可以使用天然啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，其他天然表達(dá)控制元件，例如增強(qiáng)子元件、多腺苷酸化位點(diǎn)或者Kozak共有序列，也可用于模擬天然IL-15和/或IL15Ra的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra序列可以可操作的連接到組織特異啟動(dòng)子。例如，如果期望在淋巴細(xì)胞或者單核細(xì)胞中表達(dá)，應(yīng)當(dāng)分別使用在淋巴細(xì)胞或者單核細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。已知許多組織的組織特異啟動(dòng)子的實(shí)例，包括肝(白蛋白，Miyatake等人，J.Virol.,71:5124-32(1997);乙肝病毒核心啟動(dòng)子，Sandig等人,GeneTher.,3:1002-9(1996);曱胎蛋白(AFP),Arbuthnot等人，Hum.GeneTher.7:1503-14(1996))、骨(骨鉤素，Stein等人，Mol.Biol.Rep.，24:185-96(1997);骨唾液蛋白，Chen等人，J.BoneMiner.Res"11:654-64(1996))、淋巴細(xì)胞(CD2，Hansal等人，J.Immunol.,161:1063-8(1998);免疫球蛋白重鏈；T細(xì)胞受體a鏈)、神經(jīng)元(神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)啟動(dòng)子，Andersen等人Cell.Mol.Neurobiol"13:503-15(1993);神經(jīng)微絲輕鏈基因，Piccioli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991);神經(jīng)元特異性vgf基因，Piccioli等人，Neuron,15:373-84(1995))等等。在一些實(shí)施方式中，改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra核酸序列被可操作的連接到一種或者多種mRNA輸出序列。示例性的mRNA輸出元件包括組成性轉(zhuǎn)運(yùn)元件(CTE)，其對(duì)猿D型逆轉(zhuǎn)錄病毒未剪切的RNA的核-細(xì)胞質(zhì)輸出非常重要。另一個(gè)示例性的RNA輸出元件包括RNA轉(zhuǎn)運(yùn)元件(RTE)，其存在于嚙齒類動(dòng)物池內(nèi)A顆粒反轉(zhuǎn)錄因子的亞群中。CTE和RTE元件可以單獨(dú)或者組合使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，RTE是RTEm26(例如，SEQIDNO:22)。在一個(gè)實(shí)施方式中，RTEM26和CTE位于表達(dá)盒編碼的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'-未翻譯區(qū)域。通常，RTE和CTE間隔100個(gè)核苷酸或者更少。在一些實(shí)施方式中，RTE和CTE間隔30個(gè)核苷酸或者更少。在一個(gè)實(shí)施方式中，RTE和CTE被包括在SEQIDNO:23所列的序歹'j(RTEm26CTE)。用于進(jìn)一步增加改進(jìn)的IL-15序列表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)運(yùn)元件描述于，例如，國際專利出版號(hào)WO04/113547,為所有目的其內(nèi)容在此以參考的方式完整并入本文。4.哺乳動(dòng)物細(xì)月包本發(fā)明的表達(dá)載體可以在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)。宿主細(xì)胞可以位于宿主體內(nèi)或者體外。例如，包含高水平表達(dá)IL-15和/或IL15Ra核酸序列的表達(dá)載體可以被轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，或者遞送到哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。可用于表達(dá)改進(jìn)的IL-15和/或IL-15Ra核酸序列的示例性宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物原代細(xì)胞和建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，包括COS、CHO、HeLa、NIH3T3、HEK293-T、RD和PC12細(xì)胞。用于從高水平表達(dá)的改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra核酸序列表達(dá)IL-15和/或IL15Ra蛋白的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)月包由例如，AmericanTypeTissueCollection(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)(ATCC)，Manassas,VA，商品化供應(yīng)。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)步驟也是本領(lǐng)域/>知的。參見，例如，Z/aw必ooA:化細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)哺乳動(dòng)物、微生物和植物細(xì)胞)，Vinci,等人，eds.,2003,HumanaPress和Mamma/z'awCW/CWZMm.5^ew"'a/7fec/mz々i/es(哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本方法)，DoyleandGriffiths,eds.,1997,JohnWiley&Sons。體外轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和表達(dá)重組核酸序列的實(shí)驗(yàn)步驟是本4頁i或公^口的。參見,侈寸i口，SambrookandRussell和Ausubel,等人,上7fec/jm々MM(基因遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞非病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù))，MethodsinMolecularBiologyseries,Heiser，ed.，2003,HumanaPress和Makrides,Gewe7hms/erad￡^/>ms^owAfamma//aw(哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)),NewComprehensiveBiochemistryseries,2003，ElsevierScience。重組載體可以瞬時(shí)或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞^皮修飾以表達(dá)改進(jìn)的IL-15核酸序列。改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra序列可以是外遺傳的或者染色體整合的。5.改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra序列的給藥高水平表達(dá)改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra核酸序列適于單獨(dú)給予個(gè)體，例如治療免疫缺陷(例如，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增，所述淋巴細(xì)胞包括B細(xì)胞，T細(xì)胞，NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞)，或者作為與一種或者多種疫苗抗原共遞送的佐劑。IL-15和/或IL15Ra用于免疫缺陷治療和作為佐劑的用途是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，Diab，等人，上述；Ahmad,等人，上述和AlpdoganandvandenBrink,上述)。在一個(gè)實(shí)施方式中，高水平表達(dá)改的進(jìn)IL-15和/或IL15Ra核酸序列與一種或者多種疫苗抗原共給藥，其中至少改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra核酸序列作為棵露DNA遞送。一種或者多種抗原可以采用一種或者多種多肽抗原或者編碼一種或者多種抗原的核酸形式遞送?？寐禗NA疫苗通常是本領(lǐng)域已知的；參見，Wolff,等人，Science(1990)247:1465;Brower,NatureBiotechnology(1998)16:1304和Wolff,等人，AdvGenet(2005)54:3。4吏用核酸作為DNA疫苗的方法對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是7>知的。參見，Z)AM^zcc/"es(DNA疫苗)，Ertl,ed.，2003,KluwerAcademicPub和^zcc/es..Me"o<isawJ/Votoco/s(DNA疫苗方法和步驟)，LowrieandWhalen，eds,，1999,HumanaPress。該方法包括將編碼一種或者多種抗原的核酸置于啟動(dòng)子控制之下以便在患者中表達(dá)。共給藥高水平表達(dá)改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra核酸序列還增強(qiáng)抗一種或者多種抗原的免疫應(yīng)答。不受理論約束，在DNA疫苗編碼的多肽表達(dá)后，誘導(dǎo)出細(xì)胞毒性T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞和抗體，它們識(shí)別并破壞或者消除表達(dá)抗原的細(xì)胞或者病原體。在一個(gè)實(shí)施方式中，IL-15和/或IL15Ra序列中的一個(gè)或者兩個(gè)作為蛋白共給藥。本發(fā)明關(guān)注了在生理學(xué)可接受載體中包括改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra氨基酸和核酸序列的組合物。盡管本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意合適的載體均可用于本發(fā)明的藥物組合物，但載體的類型將根據(jù)給藥方式而不同。對(duì)于腸胃外給藥，包括鼻內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下或者肌內(nèi)注射或者電穿孔，載體優(yōu)選地包括水、鹽水、和可選的醇、脂肪、聚合物、蠟、一種或者多種穩(wěn)定氨基酸或者緩沖液。常規(guī)配制技術(shù)是本領(lǐng)域才支術(shù)人員已知的(參見，例如，及em/wg化w:am/iVac"ceo/PAanwacy(雷明頓藥物科學(xué)與實(shí)踐)(20thedition),Gennaro:ed.,2000,LippincottWilliams&Wilkins;/"ye加6/ei)/577m^5y他臘For附w/a"ow，尸rac&w/wgPe/ybrmawce(可注射的分散系統(tǒng)制劑、酉己制和'l"生能)，Burgess,ed.，2005,CRCPress和尸/^rmacet/"ca/Formw/fl"owZ)eve/o/mewfo/尸e/^zWesawe/Vo/ez'ws(肽和蛋白的藥物制劑開發(fā))，F(xiàn)rkjr等人，eds.，2000，Taylor&Francis)。通過注射，通常通過動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或者肌內(nèi)途徑，棵露DNA可以在溶液中(例如，磷酸鹽緩沖鹽水溶液)遞送。通常，對(duì)于典型的70公斤患者，棵露核酸組合物的劑量從大約lOjtig到10mg。對(duì)于正常健康的70kg患者，棵露核酸(通常是編碼融合蛋白的DNA)的皮下或者肌內(nèi)劑量范圍從O.lmg到50mg?？梢越o予DNA疫苗接種一次或者多次。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)需要誘導(dǎo)想要的應(yīng)答時(shí)(例如，特異抗原應(yīng)答或者免疫細(xì)胞的增殖)，改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra核酸序列^皮給藥不止一次，例如，2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或者更多次。可以進(jìn)行多次給藥，例如，根據(jù)需要每兩周一次、每周一次、每兩月一次、每月一次、或者更頻繁或者稍不頻繁，使時(shí)段足以實(shí)現(xiàn)所需應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，通過基于脂質(zhì)體的方法、電穿孔或者基因槍粒子加速給予改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra核酸組合物?？梢允褂皿w內(nèi)將DNA遞送入細(xì)胞的遞送裝置(例如，"基因槍")。這種裝置是商品化供應(yīng)的(例如，BioRad，Hercules,CA，ChironVaccines,Emeryville,CA)。還可以通過將DNA與陽離子絡(luò)合把棵露DNA引入細(xì)胞，所述陽離子例如多聚賴氨酸，其被偶聯(lián)到細(xì)胞表面受體的配體(參見，例如,Wu,G.andWu,C.H.(1988)J.Biol.Chem.263:14621;Wilson等人(1992)J.Biol.Chem.267:963-967和美國專利5,166,320、6,846,809、6,733,777、6,720,001、6,290,987)。用于遞送棵露DNA到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的脂質(zhì)體制劑由例如，EncapsulaNanoSciences,Nashville,TN商品化供應(yīng)。用于遞送棵露DNA到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的電穿孔裝置由例如,InovioBiomedicalCorporation,SanDiego，CA商品化供應(yīng)。改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra核酸疫苗組合物被給藥于哺乳動(dòng)物宿主。哺乳動(dòng)物宿主通常是人或者靈長類動(dòng)物。在一些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物宿主可以是家畜，例如，犬、貓、兔類、嚙齒目、鼠屬、倉鼠、小鼠。在其他實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物宿主是農(nóng)業(yè)動(dòng)物，例如，牛、綿羊、豬、馬等等。6.在哺乳動(dòng)物細(xì)月包中表達(dá)IL-15和/或IL15Ra的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的方法用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)IL-15和/或IL15Ra，通過將重組載體引入細(xì)胞以表達(dá)此處描述的高水平改進(jìn)的IL-15和/或IL15Ra核酸序列。修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以位于體外或者哺乳動(dòng)物體內(nèi)。應(yīng)了解此處描述的實(shí)施例和實(shí)施方式只是用于說明目的，根據(jù)其啟示的不同改變或者變化是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的，包括在本申請(qǐng)的精神實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)以及所附權(quán)利要求范圍內(nèi)。為所有目的，所有此處引用的出版物、專利和專利申請(qǐng)均以參考的方式完整并入本文。實(shí)施例下列實(shí)施例用于說明，但不是限制所要求保護(hù)的發(fā)明。實(shí)施例1在IL-15序列中引入核苷酸改變的策略是同時(shí)調(diào)整影響mRNA運(yùn)輸、穩(wěn)定性和表達(dá)的若干因素。改變密碼子以改變總的mRNAAT(AU)-含量或者去除RNA內(nèi)任意其他抑制信號(hào)，例如所有潛在剪接位點(diǎn)(例^口在網(wǎng)3占i"列^口fruitfly.org/seq_tools/splice.html或者sunl.softberry.com/berry.phtml上可以發(fā)現(xiàn)計(jì)算機(jī)程序預(yù)測的潛在剪接位點(diǎn))，以及改變已知對(duì)mRNA有負(fù)面影響的序列，例如連續(xù)的A或者T/U核苷酸、AATAAA、ATTTA和密切相關(guān)的變異序列。通過用編碼相同氨基酸的不同密碼子取代密碼子，選擇的密碼子可以是GC更富集的，或者具有足以改變RNA結(jié)構(gòu)的不同序列。該方法已經(jīng)在it個(gè)專利中描述，其中每一個(gè)均在此以參考的方式完整并入本文美國專利5,965,726、5,972,596、6,174,666、6,291,664、6,414,132和6，794，498。步驟使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)產(chǎn)生、純化和測序質(zhì)粒DNA。利用鈣共沉淀技術(shù)(293細(xì)胞)和對(duì)于RD4細(xì)胞使用SuperFectReagent實(shí)驗(yàn)步驟(Qiagen)，1微克(l^g)包含指定IL-15編碼序列的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染入人293或者RD細(xì)胞，所述細(xì)胞在前一天以106細(xì)胞濃度種于60mm板。2-3天后，使用商品化試劑盒(R&Dsystem)測量胞內(nèi)和胞外以及總的IL-15蛋白。因?yàn)槿撕秃愫雍颕L-15蛋白的高同源性，利用相同的商品化ELISA試劑盒測量它們的蛋白水平。不同實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖7、10、11、13、25、26和27。實(shí)施例2本發(fā)明證明IL-15受體a和IL-15受體a的可溶(胞夕卜)部分(IL15sRa)的改進(jìn)表達(dá)序列。這些改進(jìn)序列增加IL-15受體a的蛋白表達(dá)，并提供一種在體內(nèi)和體外進(jìn)一步優(yōu)化IL-15活性的方法。結(jié)果圖39和40顯示體外使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法在人293細(xì)胞中共表達(dá)IL-15和IL-15受體a的優(yōu)化序列導(dǎo)致測量到的總IL-15水平顯著增加。這種增加是穩(wěn)定IL-15分子的結(jié)果，通過結(jié)合完整IL-15受體a或者IL-15受體a的胞外部分。如果IL-15和受體通過兩個(gè)不同的質(zhì)粒表達(dá)或者通過單個(gè)質(zhì)粒的兩個(gè)不同啟動(dòng)子表達(dá)，結(jié)果是相似的。圖41顯示當(dāng)IL-15和IL-15受體DNA在尾靜脈注射后被遞送到小鼠組織并在其中表達(dá)時(shí)，肺部NK細(xì)胞水平的顯著增加以及肺部CD3+CD49+細(xì)胞的增加。在分析文件中給出每105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量。圖42顯示在單獨(dú)IL-15、IL-15+IL-15受體a或者IL-15+IL-15可溶性受體a的DNA注射后，小鼠肝臟中NK細(xì)胞和T細(xì)胞的增加。在分析文件中給出每106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量。圖43顯示脾中效應(yīng)細(xì)月包的增加(分別為總效應(yīng)和CD8效應(yīng))。CD62L的缺失定義了一群具有效應(yīng)表型的小鼠記憶T細(xì)胞。圖44顯示增加的IL-15水平導(dǎo)致增加的生物效應(yīng)，所述增加的IL-15水平通過IL15Ra對(duì)IL-15的穩(wěn)定來獲得。方法^培券勿/S哞4這用0.1/ig單獨(dú)的人IL15tPA60PT質(zhì)?；蛘吲c0.1/ig表達(dá)人IL-15受體a全長形式(huIL15RaOPT)或者可溶形式(husIL15RaOPT)的RNA優(yōu)化形式的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后第24和48小時(shí)取出培養(yǎng)基，第48小時(shí)收集細(xì)胞。在從細(xì)胞釋放前利用Quantikine人IL-15免疫測定法(R&Dsystems)測量IL-15水平。^V、^哞衷這通過肌內(nèi)途徑注入兩個(gè)四頭肌或者以流體力學(xué)法通過尾靜脈向6周齡Balb/c小鼠注射DNA。對(duì)于流體力學(xué)法DNA遞送，用溶于1.6ml無菌0.9%NaCl的1/ig單獨(dú)的人IL15-tPA60PT質(zhì)粒或者與1Mg表達(dá)人IL-15受體a完整形式(huIL15RaOPT)或者可溶形式(husIL15RaOPT)的質(zhì)粒一起通過尾靜脈注射小鼠。3天后，處死小鼠，利用商品化的化學(xué)發(fā)光免疫測定法(Quantiglo,R&D)測量血漿中的IL-15水平。利用多色FACS測量肝、脾和肺中的IL-15生物活性。簡單來說，細(xì)胞用下列組的偶聯(lián)的大鼠抗-小鼠抗體進(jìn)行離體染色APCCy7-CD3、PerCP國CD4、PECy7-CD8、APC-CD44、FITC-CD49b和PE國CD62L、BD-Pharmingen,通過流式細(xì)胞術(shù)分析。小鼠NK細(xì)胞被鑒定為CD3-CD49b+表型。實(shí)施例3該實(shí)施例證明IL-15和IL-15受體a的相互穩(wěn)定作用。數(shù)據(jù)證明IL-15和IL15Ra內(nèi)源性組合生成4吏兩個(gè)分子可以有效地結(jié)合成功能性分泌形式。在IL-15存在的條件下，IL-15受體a被快速遞送到細(xì)胞表面(參見，圖46),并且它還被快速切割(參見，圖47)。因此，完整受體的表達(dá)導(dǎo)致快速成為可溶性受體/IL-15復(fù)合物，其被釋放到循環(huán)中，并且可以在遠(yuǎn)處組織中起作用。該實(shí)施例跟蹤IL-15的體內(nèi)生成，通過隨時(shí)間測量血漿水平(參見，圖49)?？扇苄允荏w/IL-15基因組合產(chǎn)生血漿IL-15的銳峰值，其迅速降低，而完整受體/IL-15組合產(chǎn)生稍低的峰值但衰退沒有那么快。這使不同制劑的遞送具有或多或少延長的體內(nèi)作用。結(jié)果單獨(dú)用IL-15轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無效率地表達(dá)和分泌IL-15。此外，<象許多細(xì)胞因子mRNA—樣，IL-15mRNA是不穩(wěn)定的，可以通過RNA/密碼子優(yōu)化進(jìn)行改進(jìn)。RNA/密碼子優(yōu)化可用于增加IL-15和IL15RamRNA的水平和表達(dá)。此外，IL-15的分泌性前肽可以與組織纖溶酶原活化因子(tPA)的分泌性前導(dǎo)肽、或者與其他分泌性肽例如IgE或者GM-CSF交換。這些改進(jìn)導(dǎo)致表達(dá)的100倍增加，在標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)載體中使用人CMV啟動(dòng)子和牛生長激素多腺苷酸化信號(hào)。圖45顯示人293細(xì)胞轉(zhuǎn)染后IL-15的體外表達(dá)。具有組織纖溶酶原活化因子(tPA)前體原前導(dǎo)序列的優(yōu)化表達(dá)載體(IL15t，其表示IL15tPA60PT)的使用在培養(yǎng)基(即，細(xì)胞外和胞內(nèi))中生成可輕易檢測水平的IL-15。此外，IL-15與IL15Ra的共表達(dá)導(dǎo)致IL-15生成在胞內(nèi)和細(xì)胞外的顯著增加。與野生型cDNA相比，該表達(dá)水平大約高20倍。IL-15與全長(即，完整)IL15Ra的共表達(dá)導(dǎo)致高水平的IL-15和IL15Ra分子定位于表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞表面(圖46),而IL-15與IL15Ra可溶性胞外部分(即，可溶性IL-15)的共表達(dá)導(dǎo)致復(fù)合物快速分泌到培養(yǎng)基中。通過ELISA測量，IL-15穩(wěn)態(tài)水平總的增加，在IL15Ra存在的條件下是4倍，在IL15sRa存在的條件下是7倍(圖45A)。相反，共表達(dá)IL-15的存在還增加IL15Ra和IL15sRa的水平(圖47)。利用IL-15存在或者缺失條件下用IL15Ra或者IL15sRa轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后的培養(yǎng)基和細(xì)胞提取物的不同稀釋物進(jìn)行的Western印跡分析顯示IL-15存在條件下受體穩(wěn)態(tài)水平3到8倍的增加。受體的增加大體上類似于上面測量的共表達(dá)時(shí)IL-15的增加。在膜結(jié)合的完整IL15Ra表達(dá)后，在培養(yǎng)基中檢測到大量可溶性胞外部分，與受體的快速切割和可溶形式的產(chǎn)生吻合。當(dāng)共表達(dá)IL-15時(shí)，培養(yǎng)基中可溶性受體的水平升高(圖47C)。IL15sRa的表達(dá)導(dǎo)致高水平約28kDa的受體胞內(nèi)形式，以及另外的N-糖基化的約30kDa的形式(見下文)，所述約28kDa的受體胞內(nèi)形式是轉(zhuǎn)染的cDNA的主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，未進(jìn)行任何糖基化。低水平的完全糖基化IL15sRa被發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞結(jié)合的，而大部分分泌到培養(yǎng)基中。在共表達(dá)IL-15存在的條件下，胞內(nèi)非糖基化形式顯著降低，而糖基化形式，尤其是胞外的，則極大增加。這些結(jié)果符合以下結(jié)論，即IL-15與其受體a的早期胞內(nèi)結(jié)合發(fā)生在這兩個(gè)分子的生成和分泌期間。在IL-15缺失的條件下，IL15sRa仍然很大程度保留在胞內(nèi)，它不被快速加工或者分泌。IL-15和IL15Ra是糖基化分子，在SDS-PAGE凝膠中作為多重條帶遷移。IL15Ra是N-和O-糖基化的(Dubois等人，1999JBiolChem274(38):26978-84)，而IL-15是N-糖基化的。已有報(bào)道不同的IL15Ra蛋白產(chǎn)品源于39kDa前體的交替N-和O-糖基化(Dubois等人，1999)。用N-或者O-糖普酶的處理顯示大部分與細(xì)胞結(jié)合的IL15Ra受體被快速糖基化。相反，單獨(dú)IL15sRa的表達(dá)顯示大約28kDa的IL15sRa條帶，這只見于胞內(nèi)。在IL15存在的條件下，這條胞內(nèi)條帶隨胞外糖基化形式的增加而顯著降低。為了確定增加的表達(dá)是否導(dǎo)致更好的生物活性，在以流體力學(xué)法通過尾靜脈注射進(jìn)行DNA遞送后在小鼠中表達(dá)IL-15和IL15Ra或者IL15sRaDNA分子。在這些實(shí)驗(yàn)中給小鼠給藥0.1/xg到2/igDNA,測量血漿中的IL-15水平。單次DNA注射后3天，處死小鼠，通過流式細(xì)胞術(shù)分析選定組織中的T細(xì)胞、NK細(xì)胞和其他、淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和表型。圖52顯示IL-15和受體a的共表達(dá)增加肺中NK細(xì)胞的數(shù)量。當(dāng)注射更高摩爾比例(3:1，0.1jiiglL-15質(zhì)粒和0.3/xglL15Ra質(zhì)粒)表達(dá)受體的質(zhì)粒時(shí)，這種增加是更顯著的。IL-15受體a可溶部分的共表達(dá)導(dǎo)致肺NK細(xì)胞的顯著增加。實(shí)施例4該實(shí)施例顯示IL-15/IL-15Ra組合在恒河猴治療性疫苗接種中的用途。IL-15/IL15Ra組合增加抗原特異性細(xì)胞，尤其是CD8效應(yīng)細(xì)胞，以及抗原刺激時(shí)表達(dá)IL-2或者IL-2和IFN7的細(xì)胞(即，多功能細(xì)胞，它們被認(rèn)為對(duì)于有效疫苗接種非產(chǎn)重要)。該實(shí)施例跟蹤恒河猴血漿中的IL-15表達(dá)，顯示IL-15/15Ra共表達(dá)實(shí)現(xiàn)恒河猴血漿中的可檢測生成。對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示與只接受IL-15DNA的動(dòng)物相比，這種生成高得多。3只恒河猴經(jīng)受第二輪抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療("ART")，并利用表達(dá)改進(jìn)的IL-15和IL-15受體《IL15Ra)的質(zhì)粒進(jìn)行DNA疫苗接種。使用下列質(zhì)粒混合物通過電穿孔完成免疫對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行兩次0.5ml的注射。在2周間隔時(shí)分離外周血單核細(xì)胞("PBMC，，)，使用10參數(shù)流式細(xì)力包術(shù)分析SIV-特異性細(xì)胞的數(shù)量。這允許對(duì)生成IFNg、IL-2或者TNFa的淋巴細(xì)胞的計(jì)數(shù)和表型分析，所述淋巴細(xì)胞響應(yīng)對(duì)應(yīng)于SlVmac259的gag、pol、env、nef和tat蛋白的肽庫的刺激。這種分析的結(jié)果(圖56)顯示SIV-特異性細(xì)胞因子生成細(xì)胞平均值和峰值應(yīng)答的顯著增加。在ART期間和DNA疫苗接種前，所有3只動(dòng)物具有低水平的IFNg生成細(xì)胞。這是能夠預(yù)期的，因?yàn)樵谒?只動(dòng)物中ART將SIV降低到不能4企測的水平。疫苗接種時(shí)檢測到SIV-特異性細(xì)胞的持久增加。更重要地，疫苗接種產(chǎn)生IL-2分泌細(xì)胞(圖56)以及IFNg和IL-2雙分泌細(xì)胞(即，多功能細(xì)胞)。這只發(fā)生在第三次DNA疫苗接種后，而在所有先前的測定中這些恒河猴在它們的外周血中沒有任何多功能細(xì)胞因子分泌細(xì)胞。3只已接種的恒河猴顯示PBMC中SIV-特異性細(xì)胞因子-生成細(xì)胞數(shù)量的顯著增加，所述細(xì)胞具有中央記憶(CM)或者效應(yīng)記憶(EM)表型(圖57)。用DNA的優(yōu)化混合物疫苗接種時(shí)PBMC中效應(yīng)細(xì)胞水平增加的表現(xiàn)與我們先前的經(jīng)驗(yàn)相反，先前經(jīng)驗(yàn)中DNA疫苗接種能夠產(chǎn)生SIV-特異性中央記憶而不是效應(yīng)記憶細(xì)胞。我們將其歸于更優(yōu)化的DNA疫苗混合物和IL15/IL15Ra細(xì)胞因子有效水平的存在。給藥編碼IL-15的DNA而不共給藥編碼IL15Ra的DNA的恒河猴沒有IL-2生成細(xì)胞。概括來說，優(yōu)化的DNA疫苗載體混合物以及包含優(yōu)化水平的表達(dá)IL-15和IL15Ra的DNA導(dǎo)致外周血中檢測到的抗原特異性細(xì)胞的顯著增加。除了增加的細(xì)胞水平以外，通過我們的分析檢測到重要的表型差異。顯示疫苗產(chǎn)生的抗原特異性細(xì)胞包括IL-2生成以及IFNg和IL-2雙生成細(xì)胞。除了中央記憶抗原特異性細(xì)l包以外，IL-15和IL15Ra疫苗接種產(chǎn)生具有效應(yīng)表型的抗原特異性細(xì)胞。CD8+效應(yīng)細(xì)胞預(yù)期有抗病毒感染細(xì)胞的活性，因此這些恒河猴在從ART釋放時(shí)能更好的控制病毒。令人驚訝地，作為對(duì)DNA疫苗接種顯著應(yīng)答的結(jié)果，大約l-2。/。的循環(huán)淋巴細(xì)胞是SIV特異性的。這表明在優(yōu)化條件下單獨(dú)的DNA疫苗接種可以產(chǎn)生有效、各種各樣、長久和多功能的抗原特異性細(xì)胞庫。成功地給予多次(多達(dá)共8次)DNA疫苗接種，沒有副作用。此外，重復(fù)給藥導(dǎo)致多功能T細(xì)胞的生成。與先前的疫苗接種方案相比，這代表了顯著的改進(jìn)。IL15/IL15Ra組合的DNA注射顯示導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞的極大動(dòng)員，這在它們前往外周位點(diǎn)的途中在PBMC中檢測到。如果是這種情況，這些結(jié)果表明作為DNA或者蛋白的優(yōu)化的IL15/IL15Ra組合在最佳時(shí)間間隔體內(nèi)增強(qiáng)淋巴細(xì)胞動(dòng)員和功能的有效性。IL-15的這種免疫治療可用于增強(qiáng)治療性疫苗接種的功效，還可用于在沒有治療性疫苗接種或者疫苗接種后長時(shí)間內(nèi)增強(qiáng)抗病毒的免疫應(yīng)答。這種治療性疫苗接種中使用的DNA疫苗載體是由6個(gè)SIV抗原表達(dá)質(zhì)粒和2個(gè)恒河猴IL-15/IL-15受體a表達(dá)質(zhì)粒組成的混合物。LAMP-pol和LAMP-NTV質(zhì)粒分別生成pol或者NefTatVif與人溶酶體結(jié)合膜蛋白的蛋白融合物。2S-CATEgagDX21S-MCP3p39gag99S-Env73S陽MCP3-env103S國LAMP-po1147S-LAMP-NTV恒河猴IL-15/IL-15受體a生成質(zhì)粒AG65-rhlL15tPA6AG120-rhlL15Ra權(quán)利要求1.編碼白介素-15(IL-15)蛋白的核酸序列，所述IL-15蛋白與天然哺乳動(dòng)物的IL-15蛋白具有至少90％的序列同一性，其中所述核酸序列與編碼天然哺乳動(dòng)物IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苷酸位置具有至少50％的差異。2.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述天然il-15是人il-15。3.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述天然il-15是靈長類動(dòng)物il-15。4.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述核酸序列與編碼天然il-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核香酸位置具有至少80%的差異。5.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述核酸序列與編碼天然il-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苷酸位置具有至少90%的差異。6.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述核酸序列,編碼天然il-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苷酸位置具有至少95%的差異。7.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述核酸序列與編碼天然il-15的核酸序列在下列核普酸位置不同6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486,其中所述核苷酸位置如圖8所鑒定的。8.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述核酸序列在下列核苷酸位置包括鳥噤呤(g)或者胞嘧啶(c)核苷酸6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486,其中所述核苷酸位置如圖8所鑒定的。9.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述核酸序列包括至少50%的GC含量。10.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述核酸序列與SEQIDNO:3具有至少90%的序列同一性。11.如^f又利要求1所述的核酸序列，其中所述編碼IL-15信號(hào)肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列被替換為編碼異源蛋白的SIG-PRO或者信號(hào)肽(SIG)的核酸序列。12.如權(quán)利要求11所述的核酸序列，其中所述異源蛋白選自組織纖溶酶原活化因子(tPA)、生長激素和免疫球蛋白。13.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述編碼IL-15SIG-PRO的核酸序列被替換為編碼tPASIG-PRO的核酸序列，所述tPASIG-PRO與SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:25或者SEQIDNO:27具有95%的序列同一性。14.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中與天然IL-15核酸序列的IL-15生成相比，所述核酸序列的IL-15生成增加至少5倍。15.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，被可操作的連接到編碼RNA輸出元件的核酸。16.包括如權(quán)利要求1所述核酸序列的表達(dá)載體。17.包括如權(quán)利要求1所述核酸序列的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。18.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，還包括藥物賦形劑。19.在哺乳動(dòng)物細(xì)月包中表達(dá)IL-15的方法，所述方法包括重組^l^飾哺乳動(dòng)物細(xì)胞以表達(dá)編碼IL-15蛋白的核酸，所述IL-15蛋白與天然哺乳動(dòng)物IL-15蛋白具有至少90%的序列同一性，其中所述核酸序列與編碼天然哺乳動(dòng)物IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苦酸位置具有至少50%的不同。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核普酸位置具有至少80%的差異。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苦酸位置具有至少90%的差異。22.如^5L利要求19所述的方法，其中所述核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苷酸位置具有至少95%的差異。23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在下列核苦酸位置不同6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486，其中所述核苦酸位置力'圖8所鑒定的。24.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述核酸序列在下列核苷酸位置包括鳥嘌呤(g)或者胞嘧啶(c)核苷酸6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、,55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486,其中所述核苷酸位置》'圖8所鑒定的。25.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述核酸序列包括至少50%的GC含量。26.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述核酸序列與SEQIDNO:3具有至少90%的序列同一性。27.編碼與SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:24或者SEQIDNO:26具有至少95%序列同一性的tPASIG-PRO序列的核酸序列，可操作地連接到編碼與天然哺乳動(dòng)物IL-15蛋白具有至少90%序列同一性的IL-15蛋白的核酸，其中所述編碼IL-15的核酸序列包括至少50%的GC含量。28.如權(quán)利要求27所述的核酸序列，其中所述天然IL-15是人IL-15。29.如權(quán)利要求27所述的核酸序列，其中所述天然IL-15是靈長類動(dòng)物IL-15。30.如權(quán)利要求27所述的核酸序列，其中所述核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苷酸位置具有至少50%的差異。31.如權(quán)利要求27所述的核酸序列，其中所述核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苷酸位置具有至少80%的差異。32.如權(quán)利要求27所述的核酸序列，其中所述核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苷酸位置具有至少90%的差異。33.如權(quán)利要求27所述的核酸序列，其中所述該核酸序列與編碼天然IL-15的核酸序列在下列核苷酸位置不同6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486,其中所述木苷酸位置如圖8所標(biāo)識(shí)的。34.如^L利要求27所述的核酸序列，其中所述該核酸序列在下列核苷酸位置包括鳥噤呤(g)或者胞嘧啶(c)核苷酸6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、卯、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486，其中所述核苦酸位置如圖8所鑒定的。35.如權(quán)利要求27所述的核酸序列，其中所述核酸序列與SEQIDNO:9或者SEQIDNO:11具有至少90%的序列同一性。36.如權(quán)利要求27所述的核酸序列，其中與天然IL-15核酸序列的IL-15生成相比，所述核酸序列的IL-15生成增加至少5倍。37.改進(jìn)的白介素15受體a編碼核酸序列，與圖35、36、37和38中任意一個(gè)所示的核酸序列具有至少90%的序列同一性。38.包括哺乳動(dòng)物IL-15和哺乳動(dòng)物IL15Ra的編碼序列的表達(dá)載體。39.如權(quán)利要求38所述的表達(dá)載體，其中所述哺乳動(dòng)物IL-15的編碼序列編碼與天然哺乳動(dòng)物IL-15蛋白具有至少90%序列同一性的IL-15蛋白，其中所述核酸序列與編碼天然哺乳動(dòng)物IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苷酸位置具有至少50%的差異。40.如權(quán)利要求38所述的表達(dá)載體，其中所述哺乳動(dòng)物IL15Ra的編碼序列與圖35、36、37和38中任意一個(gè)所示的核酸序列具有至少90%的序列同一性。41.包括IL-15序列和IL15Ra序列的藥物組合物。42.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是氨基酸序列。43.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是核酸序列。44.如;^又利要求43所述的藥物組合物，其中所述哺乳動(dòng)物IL-15的編碼序列編碼與天然哺乳動(dòng)物的IL-15蛋白具有至少90%序列同一性的IL-15蛋白，其中所述核酸序列與編碼天然哺乳動(dòng)物IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苷酸位置具有至少50%的差異。45.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述哺乳動(dòng)物IL15Ra的編碼序列與圖35、36、37和38中任意一個(gè)所示的核酸序列具有至少90%的序列同一性。46.如一又利要求43所述的藥物組合物，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列核酸序列位于單個(gè)表達(dá)載體中。47.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列核酸序列位于多個(gè)表達(dá)載體中。48.提高IL-15在個(gè)體中的穩(wěn)定性和效力的方法，包括對(duì)個(gè)體共給藥IL-15序列和IL15Ra序列。49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是氨基酸序列。50.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是核酸序列。51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物IL-15的編碼序列編碼與天然哺乳動(dòng)物的IL-15蛋白具有至少90%序列同一性的IL-15蛋白，其中所述核酸序列與編碼天然哺乳動(dòng)物IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核苦酸位置具有至少50%的差異。52.如^l利要求50所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物IL15Ra的編碼序列與圖35、36、37和38中任意一個(gè)所示的核酸序列具有至少90%的序列同一性。53.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述編碼IL-15和IL15Ra的核酸序列在單個(gè)表達(dá)載體中被給藥。54.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列核酸序列在多個(gè)表達(dá)載體中被給藥。55.在需要淋巴細(xì)胞的個(gè)體中擴(kuò)增淋巴細(xì)胞的方法，包括對(duì)個(gè)體共給藥IL-15序列和IL15Ra序列。56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是氨基酸序列。57.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是核酸序列。58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物IL-15的編碼序列編碼與天然哺乳動(dòng)物的IL-15蛋白具有至少90%序列同一性的IL-15蛋白，其中所述核酸序列與編碼天然哺乳動(dòng)物IL-15的核酸序列在圖8所標(biāo)識(shí)的核香酸位置具有至少50%的差異。59.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物IL15Ra的編碼序列與圖35、36、37和38中任意一個(gè)所示的核酸序列具有至少90%的序列同一性。60.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述編碼IL-15和IL15Ra的核酸序列在單個(gè)表達(dá)載體中被給藥。全文摘要本發(fā)明提供用于提高白介素-15(IL-15)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的核酸。本發(fā)明還提供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)IL-15的方法，通過用包括密碼子優(yōu)化的IL-15序列的核酸序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞。本發(fā)明還提供表達(dá)載體，以及IL-15和IL-15受體α組合(核酸和蛋白)，所述組合增加IL-15穩(wěn)定性以及體外和體內(nèi)的效力。本方法用于在對(duì)個(gè)體(例如哺乳動(dòng)物、人)的DNA、RNA或者蛋白給藥后增強(qiáng)IL-15的生物利用率和生物學(xué)功效。文檔編號(hào)A61K38/17GK101374950SQ200780003101公開日2009年2月25日申請(qǐng)日期2007年1月12日優(yōu)先權(quán)日2006年1月13日發(fā)明者喬治·N·巴甫拉吉斯,芭芭拉·K·費(fèi)爾博爾申請(qǐng)人:美國政府健康及人類服務(wù)部國立衛(wèi)生研究院