專利名稱：一種用于治療或預(yù)防由高脂血癥和/或高血壓引起的勃起功能不全癥的藥物組合物的制作方法
一種用于治療或預(yù)防由高脂血癥和/或高血壓引起的勃起功能不全癥的藥物組合物技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防由高脂血癥和/或高血壓引起的勃起功能不全癥的 藥物組合物。背景技術(shù)：
近來，飲食生活的變化、環(huán)境污染以及過度的壓力等很大程度上改變了疾病的發(fā)生 率以及死亡原因，以心肌梗塞或腦中風(fēng)為代表的心血管類疾病日益增加。到現(xiàn)在為止， 雖然已知有多種病態(tài)生理能誘發(fā)勃起功能不全癥，但其中，已知血管性病態(tài)生理是引起 勃起功能不全癥的最重要因素。高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病、動(dòng)脈及靜脈疾病、骨盆損傷或高脂血癥等均是影響血管系 統(tǒng)的疾病及勃起功能不全癥的危險(xiǎn)因素。IO名患有血管類疾病的男性中的8名、3名患 有心臟病的患者中的2名、接受過冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)的患者中的半數(shù)以上均出現(xiàn)勃起功 能不全癥。在多種情況中，25%患有勃起功能不全癥的男性與其服用的藥物有關(guān)，還顯 示高血壓藥物服用者中有14%的勃起功能不全癥患病率，腎臟藥物的服用者中有28%的 勃起功能不全癥患病率。此外，已有報(bào)告50歲以上的男性中出現(xiàn)勃起功能不全癥的一 半人都是由血管類疾病誘發(fā)的。心血管系疾病的3代危險(xiǎn)因素之一的高脂血癥是出現(xiàn)血中膽固醇或中性脂肪非正常 升高的狀態(tài)，是受到例如西歐化的飲食、壓力、運(yùn)動(dòng)不足等環(huán)境要素以及遺傳要素影響 的多因素疾病。已有報(bào)告血管性勃起功能不全癥患者出現(xiàn)的脂質(zhì)代謝障礙是高膽固醇血 癥的越來越多，兩者之間具有密切關(guān)系(參見非專利文獻(xiàn)l)。高脂血癥是心血管疾病、 血管性勃起功能不全癥的主要危險(xiǎn)因素，已知其原因是陰莖海綿體平滑肌的內(nèi)皮依存性 松弛反應(yīng)障礙及平滑肌細(xì)胞自身的變形引起了勃起功能不全癥。高血壓將由于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌及細(xì)胞外基質(zhì)的變化而增加末梢血管的抗 力。高血壓是成人最常出現(xiàn)的心血管系疾病，是勃起功能不全癥的危險(xiǎn)因素之一，已顯 示30%的高血壓患者患有勃起功能不全癥。因此，勃起功能不全的程度與高血壓的程度 及謙發(fā)期間成一定比例(參見非專利文獻(xiàn)2 )。高血壓誘發(fā)勃起功能不全癥的機(jī)制是流向陰莖的動(dòng)脈血流減少，這可用心理因素及抗高血壓劑的影響來解釋。在誘發(fā)了高血壓的 動(dòng)物陰莖組織的病理學(xué)變化中，出現(xiàn)了陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞損傷及增殖、 骨膠原沉著、陰莖海綿體白膜弱化等。此外，在其機(jī)能的變化中，還出現(xiàn)一氧化氮(N O)活性減少、氧化壓力增加、平滑肌收縮增加、神經(jīng)因性NO依存性陰莖海綿體松弛 力減少等(參見非專利文獻(xiàn)3及非專利文獻(xiàn)4)。一氧化氮(N0)具有擴(kuò)張血管作用、抗凝固作用、抗氧化作用、抗炎作用等，是維 持血管恒久性的最重要部分。因此，血管內(nèi)皮中產(chǎn)生N0的NO S (—氧化氮合酶)的減 少、游離基的增加時(shí)將出現(xiàn)產(chǎn)生的N0是不活化的等，使NO的生理活性降低，結(jié)果是導(dǎo) 致出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化。NO最重要的任務(wù)是松弛陰莖海綿體，對(duì)與勃起功能不全相關(guān)的高 齡老化、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓及糖尿病等疾病模型的研究結(jié)果顯示勃起功能不全癥 的原因是以N O作用產(chǎn)生的非腎上腺素性-非膽堿性陰莖海綿體平滑肌松弛障礙、N 0 S活性減少、陰莖內(nèi)NOS表達(dá)障礙為表征示出的NO生理活性的減少。因此，高脂血 癥、高血壓及勃起功能不全癥的治療共通點(diǎn)是找到能提高NO生物利用度的物質(zhì)。現(xiàn)在，勃起功能不全癥治療劑是起到與c GMP (環(huán)磷酸鳥苷)竟?fàn)幏磻?yīng)的物質(zhì)作用 的合成衍生物，通過阻斷PDE - 5 (5型磷酸二酯酶)單一通路來增加陰莖海綿體內(nèi)的 cGMP濃度。由于不具有興奮性神經(jīng)系統(tǒng)的活性，換句話說由老化及內(nèi)分泌系疾病導(dǎo) 致n N O S基因表達(dá)減少或被抑制，而無法增加陰莖海綿體平滑肌內(nèi)c GM P濃度，因 此抑制了 P D E - 5的酶活性或無法出現(xiàn)陰莖勃起的效果。更具體地說，治療劑的概念 是與Q 0 L (生活質(zhì)量(Quality Of Life))制品的概念(雖然不與生命直接相關(guān)，但用 于治療使生活不便的癥狀而有助于使生活更加豐富的藥物)相近似的藥物，僅僅在必要 時(shí)服用可維持陰莖勃起的治療劑。此外，雖然已經(jīng)報(bào)告了這種化學(xué)合成的單一物質(zhì)具有 心肌梗塞、心功能不全、血壓降低、腦梗塞、面色潮紅、視力減退等副作用，但由于全 世界對(duì)勃起功能不全癥治療劑的迫切需求，它仍然被很頻繁地使用。雖然將丙酮酸衍生物、煙酸衍生物、義夕*》系衍生物等藥物用作高脂血癥治療劑， 但是長(zhǎng)時(shí)間服用將誘發(fā)消化不良、肝毒性、肌肉痛、橫紋肌變性、光過敏等副作用，必 須慎重使用，因此希望通過減少副作用來提高藥物的穩(wěn)定性。雖然在臨床上將硝苯地平(nifedipine)與卡托普利(captopril)用作高血壓治療 劑，但是，由于這些藥物的毒性與藥效的無效率性，希望開發(fā)一種新形態(tài)的抗高血壓劑。另一方面，通過對(duì)經(jīng)口服用勃起功能不全癥治療劑的高脂血癥患者、高血壓患者進(jìn) 行研究，不僅僅完成了通過改善病癥來治療勃起功能不全癥的研究報(bào)告也完成了針對(duì)藥物的有效性和副作用的研究報(bào)告。此外，雖然現(xiàn)在市售的經(jīng)口服用的勃起功能不全治療 劑在需要的時(shí)候服用后能獲得一次性及強(qiáng)制性的勃起效果，但是無法使其恢復(fù)到自然勃 起的效果。
因此，有必要研發(fā)一種在對(duì)高脂血癥、高血壓的個(gè)別病癥有所改善的同時(shí)，即使通 過慢性給藥來維持勃起功能也可能完全沒有副作用的藥物。
非專利文獻(xiàn)1Juenemann KP， Aufenanger J， Konrad T， Pill J, Berle B, Persson-Juenemann C. 1991. The effect of impaired lipid metabolism on the smooth muscle cells of rabbits. Urol Res. 19: 24-28
非專利文獻(xiàn)2 J BurchardtM， Burchardt T, Baer L， KissAJ， P認(rèn)r RV, Shabigh A, de la Taille， Hay OR, Shabsigh R. Hypertension is associated with severe erectile dysfunction. J Urol 2000; 164: 1181-9非專利文獻(xiàn)3Behr—Roussel D， Gorny D， Mevel K， CompagnieS， Kern P, Sivan V， Bernabe J"， Bedigian MP, Alexandre L, Giuliano F. Erectile dysfunction: an early marker for hypertension, A longitudinal study in spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005; 288: R276R28非專利文獻(xiàn)4Toblli JE， Stella I' Inerra F, Ferder L， Zeller F, Mazza ON. Morphological changes in cavernous tissue in spontaneously hypertensive rats. Am J Hypertension 2000; 13: 6869
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題
因此，本發(fā)明人潛心研究沒有副作用且經(jīng)過慢性給藥能維持勃起功能的，可有效治 療由高脂血癥和/或高血壓引起的勃起功能不全癥的藥劑，確認(rèn)特定比例配比的山茱萸 熱水提取物、覆盆子熱水提取物、菟絲子熱水提取物、枸杞子熱水提取物及五味子熱水 提取物的組合物可減少血中總膽固醇及LDL-膽固醇、增加HDL-膽固醇、降低血壓、增 加神經(jīng)系統(tǒng)及血管系統(tǒng)NOS蛋白質(zhì)的表達(dá)、增加最大海綿體內(nèi)壓，由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供一種用于治療或預(yù)防由高脂血癥和/或高血壓引起的勃起功能 不全癥的藥物組合物。
解決問題的技術(shù)手段
為了達(dá)到上述目的，依據(jù)本發(fā)明，提供了一種治療或預(yù)防由高脂血癥和/或高血壓引起的勃起功能不全癥的藥物組合物，其含有干燥重量比為5~10: 5-10: 1~ 5: 1-5: 0. 5-1. 5的山茱萸熱水提取物、枸杞子熱水提取物、覆盆子熱水提 取物、菟絲子熱水提取物及五味子熱水提取物。發(fā)明效果依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物將減少血中總膽固醇與LDL-膽固醇，增加HDL-月旦固醇，降低血壓，增加神經(jīng)系統(tǒng)及血管系統(tǒng)NOS蛋白質(zhì)的表達(dá)，增加最大海綿體內(nèi)壓， 不僅具有維持單純性陰莖勃起的治療效果，在提高身體NO生物利用度的同時(shí)，還可調(diào) 節(jié)伴隨有高脂血癥和/或高血壓的全部病態(tài)生理，維持自然勃起的功能。因此，依據(jù)本 發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物可有效用于治療或預(yù)防由高脂血癥和/或高血壓引起的勃起 功能不全癥。
圖1示出依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物的濃度與誘發(fā)了高脂血癥的小白鼠 血中總膽固醇、H D L -月旦固醇及L D L -月旦固醇的數(shù)值的關(guān)系圖。圖2 a示出依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物及單獨(dú)中藥熱水提取物與誘發(fā)了 高脂血癥的小白鼠陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)NO S的表達(dá)程度的關(guān)系圖。圖2 b示出依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物的濃度與誘發(fā)了高脂血癥的小白 鼠陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)NO S表達(dá)程度的關(guān)系圖。圖3示出依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物的濃度與誘發(fā)了高脂血癥的小白鼠 陰莖海綿體最大內(nèi)壓的關(guān)系圖。圖4示出依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物的濃度與誘發(fā)了高血壓的小白鼠血 壓変化的關(guān)系圖。圖5 a示出依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物及單獨(dú)中藥熱水提取物與誘發(fā)了 高血壓的小白鼠陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)N 0 S的表達(dá)程度的關(guān)系圖。圖5 b示出依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物的濃度與誘發(fā)了高血壓的小白鼠 陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)N S的表達(dá)程度的關(guān)系圖。圖6示出依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物的濃度與誘發(fā)了高血壓的小白鼠陰 莖海綿體最大內(nèi)壓的關(guān)系圖。
具體實(shí)施方式以下，從中藥方面詳細(xì)說明本發(fā)明組合物的組成成分。山茱萸是山茱萸科落葉小喬木山茱萸果實(shí)的干燥果肉，味酸，性溫，可用于精血虧 虛癥或腎陽不足癥。此外，還有降低高血壓及血糖作用、消炎抗菌作用及保護(hù)肝腎的效 果。山茱萸提取物中含有熊果酸(ursolic acid)、久乂酸、蘋果酸以及其他四種葡糖苷 (glucoside)等。熊果酸是具有抗糖尿病活性的脂溶性物質(zhì)；4種葡糖苷是莫諾苷 (morroniside)、 馬錢素(loganin)、 獐牙菜脊(sweroside)、 曱基莫諾苦 (methylmorroniside)(Lee YC， Kim YE， Lee BY, Kim CJ. Chemical Compositions of Corni Fructus and Separating Properties of Its Flesh by drying. Korean J Food Sci Technol 1992; 24: 447-50)。此外，已知山茱萸的齊墩果酸-3 - 0-單鎖鏈素 (oleanolic acid 3—0—mono desmosides)具有才中制葡萄#唐吸》1欠的才幾能(Matsuda H, Murakami T， Shimada H， Mats咖ura N, yoshikawa M, Yamahara J. Inhibitory mechanisms of oleanolic acid 3-0-mono desmosides on glucose absorption in rats, Biological and Pharmaceutical Bulletin 1997; 20: 717-9)。枸杞子是落葉灌木，高可達(dá)2.5m,枝頭下垂，短枝上有刺，長(zhǎng)枝下部叢生有2-3 片葉。它具有改善糖尿病、恢復(fù)疲勞、防止老化、降脂、保護(hù)肝功能以及抗癌抗菌等作 用。已知枸杞子中含有的類黃酮類,丁 (rutin)具有維持毛細(xì)血管正常抗力且降低血管 通透性的機(jī)能，對(duì)人體內(nèi)毛細(xì)血管具有強(qiáng)化作用和收縮作用，因此可作為循環(huán)系統(tǒng)疾病 的治療劑、抗糖尿病活性劑、降血壓劑等(KimHS, ParkYS， Kim CI. Changes of Serum Lipid Profiles after Eating Lycii Fructus in Rats Fed High Fat Diet. Korean J Nutr 1998; 31: 263-70)。覆盆子是薔薇科落葉灌木徳利苺的未成熟干燥果實(shí)，味酸，性溫，具有保護(hù)肝腎的 作用。東醫(yī)寶監(jiān)中記載覆盆子性平，無毒，味酸，固精、補(bǔ)肝明目、補(bǔ)腎氣、烏黑頭發(fā)。 此外，最近的研究證明其具有改善腎臟機(jī)能、不孕癥、陽痿、遺精及夢(mèng)遺，強(qiáng)身健體， 清滌血液，補(bǔ)肝明目的效果。此外，徳利苺未成熟果實(shí)加水分解性單寧中可分離出l種 單寧酸(gallotannin)及3種鞣花單寧(ellagitannin),理化性狀及光譜數(shù)據(jù)還報(bào)告具 有沒食子酸、2， 3 - (S)-HHDP-D -吡喃葡糖、地榆素(sanguiin) H - 4及 地榆素H- 6。在覆盆子中，確認(rèn)其成分中沒食子酸等酚性化合物對(duì)酶的脂質(zhì)及氧化有 較強(qiáng)的抑制活性。酚性化合物廣泛分布于食品類的2次代謝產(chǎn)物中，具有多種結(jié)構(gòu)及分山梨酸甲酯 0.002g 蒸餾水定容至60ml.制法按實(shí)施例一中的方法制備黃連阿膠湯提取物，加入處方各輔料和蒸餾水， 再經(jīng)超濾器超濾，超濾液灌裝，滅菌，即得。糊精 5g 水 適量制法按實(shí)施例二中的方法制備柴黃連阿膠湯提取物，加入處方量輔料按常 規(guī)方法制成顆粒劑，低溫干燥，壓丸即得。(三) 制備黃連阿膠湯軟膠囊 內(nèi)容物處方黃連阿膠湯提取物2 30.2g植物油 30g對(duì)羥基苯甲酸乙酯 0.02g蜂蠟 5g制法按實(shí)施例二中的方法制備黃連阿膠湯提取物，加入優(yōu)選處方百分量的植物油、 蜂蠟，對(duì)羥基苯甲酸乙酯按常規(guī)工藝制備而成。(四) 制備黃連阿膠湯膠囊劑 處方-.黃連阿膠湯提取物2 10-95%淀粉 5-55%硬酯酸鎂 0.1-5% 優(yōu)選處方黃連阿膠湯提取物2 30.2g淀粉 15g硬酯酸鎂 0.5g制法按實(shí)施例二中的方法制備柴黃連阿膠湯提取物，加入處方量輔料按常 規(guī)方法制成顆粒劑，低溫干燥，灌裝即得。實(shí)施例四黃連阿膠湯口服液體制劑制備方法 處方黃連阿膠湯提取物l 5-80%蔗糖 5.0-50%環(huán)己基氨基磺酸鈉 5.0-40%山梨酸甲酯 0.001-2%蒸餾水 10-卯％.優(yōu)選處方黃連阿膠湯提取物1 25.1g 蔗糖 3.0g 環(huán)己基氨基磺酸鈉 0.5g8精細(xì)粉碎?；旌戏鬯楹蟮纳杰镙? 2 g 、枸杞子3 2 g 、覆盆子1 6 g 、菟絲子1 6 g 及五味子4 g,加入l L水，沉淀4小時(shí)后，將完全沉淀的沉淀物填充入提取器中，1 0 0 。C時(shí)加熱提取5小時(shí)后，過濾。用減壓濃縮器將濾液濃縮成濾液1/10體積的液體， 冷凍干燥，得到粉末狀復(fù)合中藥熱水提取物。 對(duì)照例1 :單味中藥熱水提取物的制備用實(shí)施例1的相同方法分別提取山茱萸、枸杞子、覆盆子、菟絲子及五味子，獲得 各種粉末狀單味中藥熱水提取物。實(shí)驗(yàn)例1 :用誘發(fā)了高脂血癥的小白鼠測(cè)定血中總膽固醇、H D L -月旦固醇及L D L -膽固醇與本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物濃度的關(guān)系為了調(diào)查誘發(fā)高脂血癥的小白鼠血中總膽固醇、HDL -膽固醇及LDL -膽固醇 的數(shù)值與本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物的濃度關(guān)系，如下所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1-1.日常飲食性高脂血癥的誘導(dǎo)以及樣品的給藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是(株)S AMT AKOW^f才(烏山市、韓國(guó))提供的1 6周齡的3 60 g小白鼠4 8只，將其分成6組，每組8只。1組作為正常組，供給一般的日常飲食， 另5組實(shí)驗(yàn)組自由供給添加了 1. 5 %膽固醇、0. 2 5 %膽酸及2 5 %牛脂的高脂肪 曰常飲食4周，來誘導(dǎo)日常飲食性高脂血癥。正常組給予1 m L蒸餾水，實(shí)驗(yàn)組中的1組給予1 m L蒸餾水，剩余4組用注射器 (注射乂 > f )在8周內(nèi) 一 日 一次經(jīng)口給予溶解了上述實(shí)施例1制得的復(fù)合中藥熱水提 取物(50、 100、 200、 300mg/kg)的lmL蒸餾水。 1 )正常組2)高脂肪日常飲食組3 )高脂肪日常飲食組+實(shí)施例1制得的復(fù)合中藥熱水提取物5 0 m g / k g4 )高脂肪日常飲食組+實(shí)施例1制得的復(fù)合中藥熱水提取物1 0 0 m g / k g5 )高脂肪日常飲食組+實(shí)施例1制得的復(fù)合中藥熱水提取物200mg/kg6 )高脂肪日常飲食組+實(shí)施例1制得的復(fù)合中藥熱水提取物3 0 0 m g / k g 1_2.血中總膽固醇、HD L-膽固醇及LD L -膽固醇的測(cè)定 為了確定上述高脂肪日常飲食飼養(yǎng)的小白鼠是否誘發(fā)了高脂血癥，從眼窩靜脈取血，實(shí)驗(yàn)完了后從小白鼠腹部大動(dòng)脈取血。1 2小時(shí)絕食后取血、3 7。C時(shí)凝固2小時(shí)，1 5 0 0 0 r p m離心分離血清后，取上清液。用市售試劑盒(K i t ) ( A S AN制 藥、韓國(guó))在UV吸光度5 0 0 n m時(shí)通過R i c h m o n酶法測(cè)定膽固醇，通過N om a等酶法測(cè)定高密度脂質(zhì)膽固醇(H D L - C )。根據(jù)F ridewald form u 1 a式子計(jì)算低密度脂質(zhì)膽固醇(L D L - C )。低密度脂質(zhì)膽固醇(L D L - C )=總月旦固醇-[高密度脂質(zhì)膽固醇(H D L - C ) -(中性脂肪/ 5 )]圖1示出了結(jié)果。如圖l所示，在攝取高脂肪日常飲食3 0天時(shí)，正常組與高脂肪日常飲食組的血中 膽固醇濃度之間示出有顯著差異，確認(rèn)誘發(fā)了高膽固醇血癥。對(duì)高脂肪日常飲食組經(jīng)口 給予本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物(50、 100、 200、 300mg/kg)8周， 示出高脂肪日常飲食組的總膽固醇及L D L-C數(shù)值有減少的趨勢(shì)，以及H D L - C數(shù) 值有增加的趨勢(shì)。其中，給予本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物5 Omg / k g組的總膽固 醇是104. 5±32mg/dL,高脂肪日常飲食組的總膽固醇是17 4. 2 ± 3 8. 1m g / d L ,示出給予本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物5 0 m g / k g的給藥組與 高脂肪日常飲食組相比有顯著的減少。此外，給予本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物5 Om g / k g的給藥組的HDL- C是29. 7±4. 9mg/dL,高脂肪日常飲食組的 HDL- C是15. 5±8. 4mg/dL,給予本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物5 0 m g / k g的給藥組與高脂肪日常飲食組相比有顯著的增加。實(shí)驗(yàn)例2:誘發(fā)了高脂血癥的小白鼠的陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)NO S的表達(dá)程度與本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物濃度的關(guān)系為了調(diào)查誘發(fā)了高脂血癥的小白鼠陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)NO S的表達(dá)程度與本發(fā)明 的復(fù)合中藥熱水提取物濃度的關(guān)系，如下所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2-1.組織的采取及酶源的制備飼養(yǎng)結(jié)束后，用填充了乙醚的干燥器使小白鼠麻醉后，切開下腹部從腹部大動(dòng)脈取 血，使之死亡后，摘出陰莖和睪丸。將摘出的組織在O. 9 %生理食塩水中洗去血液， 用濾紙吸去鹽溶液，稱重后，立即用液氮急速冷凍。另一方面，將取得的血液立即轉(zhuǎn)移 到肝素處理的管內(nèi)，在2500rpm(4。C)時(shí)離心分離1 5分鐘，分離血漿。將分 離的血漿和臟器在使用前于-7 0 。C保存。在200nMHepes、 320 mM蔗 糖、1 mM乙二胺四乙酸(E D T A )、 1 mM二At蘇糖醇(D T T )、 10g/mL亮 肽素、2 g /m L抑肽酶、1 g /m L胃蛋白酶抑制劑、1 0 g /m L胰蛋白酶抑制劑、 1 mM苯甲基磺酰氟化物(PM S F )溶液中使組織內(nèi)酶源均質(zhì)化后，離心分離(4 。C、 1 0 0 0 0 r p m、 15分鐘)，蛋白質(zhì)定量后將上清液于-7 0 。C保存。2-2.蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)用牛血清白蛋白(bovine ser咖albumin、 B S A)才艮據(jù)布才立得福德(Bradford)方法 定量的蛋白質(zhì)3 0 g在9 5 。C時(shí)變性5分鐘后、用1 2 %不連續(xù)SDS- PAGE (discontinuous sodium dodecylsulfate) -聚丙烯酰胺凝股(polyacrylamide gel)進(jìn) 行電泳。進(jìn)行電泳的蛋白質(zhì)在2 5 v o 1 t下在O. 2 m聚偏(二)氟乙烯(P VD F (poly-vinylidenedif luoride) 、 Amershambioscience、 USA) 膜上移動(dòng)2小時(shí)3 0分。進(jìn)行電泳的膜是用抑制緩沖液(blocking buffer)(含有5 % 脫脂粉乳的TBS- T緩沖器)在室溫中反應(yīng)3 0分鐘后阻斷。使e N O S (內(nèi)皮細(xì)胞 一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase ) ) 、 nNOS(神經(jīng)源性一氧化 氮合酶(neuronal nitric oxide synthase) )(BD Biosciences 、 US A )各抗體反應(yīng)2小時(shí)后，用T TBS (Tris-Tween緩沖的生理鹽水(Buffered saline》 每隔1 0分鐘清洗3次。在室溫中使2次抗體抗-小鼠I g G - H R P 、抗-山羊I g G-HRP(l: 2000稀釋)(Zymed Laboratories, USA) 反應(yīng)1小時(shí)后，經(jīng)洗凈階段后再用T T B S 5分鐘洗6次。在顯色劑E C L (增強(qiáng)化學(xué) 發(fā)光法(enhanced cherailuminescence))溶液中反應(yīng)2分鐘，比較膜上感光出現(xiàn)的波 段的厚度來確定有無表達(dá)蛋白質(zhì)以及其差異。給高脂肪日常飲食組給予以麥酒蔵(匕'7 夕、，)為主要成分的'；^f大匕。A 1 m g / k g作為陽性對(duì)照組。圖2a示出了誘發(fā)了高脂血癥的小白鼠陰莖組織內(nèi)的蛋白質(zhì)N0S的表達(dá)程度與本發(fā) 明的復(fù)合中藥熱水提取物及單獨(dú)中藥熱水提取物的關(guān)系，圖2b示出了誘發(fā)了高脂血癥 的小白鼠陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)N0S的表達(dá)程度與本發(fā)明的復(fù)合中藥熱7jc提取物的濃度的關(guān) 系。如圖2 a所示，可以確認(rèn)將本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物給藥于誘發(fā)了高脂血癥的 小白鼠，其陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)N0S的表達(dá)較只給予單味中藥熱水提取物有顯著增加。此外，如圖2 b所示，可以確認(rèn)將本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物給藥于誘發(fā)了高脂 血癥的小白鼠，其陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)N0S的表達(dá)與陽性對(duì)照組(大匕V")相比有 顯著增加?？紤]到這種結(jié)果，大匕VL將是能通過不僅僅增加NO S酶表達(dá)增加機(jī) 制也增加cGMP的濃度來維持勃起功能的藥物。此外，這種結(jié)果還可來解釋依據(jù)本發(fā) 明的復(fù)合中藥熱水提取物的多種機(jī)制。特別地，依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物的濃 度越低，NO S酶的表達(dá)程度越好，其中5 Omg / k g給藥組最為明顯。雖然高脂血癥及高膽固醇癥可由于內(nèi)皮細(xì)胞依存性松弛因子(E D R F )之一的一氧化氮生成體系 的障礙而引起勃起功能不全癥，但依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物可通過增加e NOS與n N O S蛋白質(zhì)的表達(dá)程度，來很大程度地改善血管性勃起功能不全癥。實(shí)驗(yàn)例3:用誘發(fā)了高脂血癥的小白鼠測(cè)定陰莖海綿體最大內(nèi)壓與本發(fā)明的復(fù)合中 藥熱水提取物濃度的關(guān)系為了調(diào)查誘發(fā)了高血脂癥的小白鼠陰莖海綿體最大內(nèi)壓與本發(fā)明復(fù)合中藥熱水提 取物濃度的關(guān)系，如下所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。向誘發(fā)了高脂血癥的小白鼠腹腔內(nèi)注射乂"l^f ^(Zoletil) 0. 2mL將其全身麻 醉后，切開氣管插入氣道管(P E 2 4 0聚乙烯管)以確保氣道。將聚乙烯管(P E-5 0聚乙烯管)插入右側(cè)頸動(dòng)脈后，切開下腹部至龜頭表皮正中央的皮膚，露出腹腔 至陰莖海綿體的皮下組織后，將23G針插入右側(cè)陰莖海綿體中，聚乙烯管連接在壓力轉(zhuǎn) 換器及生理記錄器之間，同時(shí)測(cè)定全身血壓和陰莖海綿體內(nèi)壓。用i wo r y作為電算 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，將整個(gè)管用2 5 0 U/mL肝素進(jìn)行處理。將前列腺從露出的下腹部至 膀胱間小心剝離出后，將鉤狀的針電極懸掛在右側(cè)前列腺后外部位置上，來電刺激骨盆 神經(jīng)叢及海綿體神經(jīng)。1 0V、 2. 4mA電刺激后，同時(shí)測(cè)量海綿體內(nèi)壓及全身血壓。 與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較的主要勃起功能指標(biāo)是最大海綿體內(nèi)壓(intracavernosal pressure、I C P )和最大海綿體內(nèi)壓/平均動(dòng)脈血壓(ICP/mean arterial pressure、 I C P/MAP)。神經(jīng)刺激海綿體后，取血3 c c,稱量摘出的陰莖與睪丸的重量，液氮中 保存。圖3示出了結(jié)果。如圖3所示，本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物給藥組達(dá)到最大海綿體內(nèi)壓的平均時(shí)間 與高脂肪日常飲食組相比有顯著縮短，與正常組沒有差異。示出了本發(fā)明的復(fù)合中藥熱 7K提取物給藥組與高脂肪日常飲食組相比的最大海綿體內(nèi)壓(I C P )的增加，其中給 藥復(fù)合中藥熱水提取物5 0mg / k g組具有最顯著差異。在最大海綿體內(nèi)壓/平均動(dòng) 脈血壓(I C P / MA P )方面，按照正常組〉復(fù)合中藥熱水提耳又物5 0mg/kg給 藥組〉復(fù)合中藥熱水提取物1 0 0mg / k g給藥組的順序顯著增加。因此，依據(jù)本發(fā) 明的復(fù)合中藥熱水提取物實(shí)際上作用于陰莖內(nèi)，這是表明其與勃起功能具有密切關(guān)系的 直接證據(jù)。實(shí)驗(yàn)例4:誘發(fā)了高血壓的小白鼠血壓變化與本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物濃度的關(guān)系為了調(diào)查誘發(fā)了高血壓的小白鼠的血壓變化與本發(fā)明復(fù)合中藥熱水提取物濃度的 關(guān)系，如下所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4 - 1 .高血壓的誘導(dǎo)及樣品給藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是(抹)S AMTAK0^4才(烏山市、韓國(guó))提供的1 6周齡的2 5 0 ~ 3 0 0 g自發(fā)性高血壓雄性小白鼠(spontaneous hypertensive rat、 S HR ) 1 5只。將實(shí)驗(yàn)組分成3組(對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1組、及實(shí)驗(yàn)2組)，每1組中分有S H R小 白鼠5只。對(duì)照組經(jīng)口給予蒸餾水，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)口給予溶有根據(jù)上述實(shí)施例1制得的復(fù)合 中藥熱水提取物(100、 300mg/kg)的水4周。4 - 2 .血壓的測(cè)定將S H R雄性小白鼠裝入塑料筒使之固定不動(dòng)，在尾巴上用巻曲的電子血壓計(jì) (electro-sphygmomanometer) P E - 3 0 0 (I I T C 、 U S A )血流測(cè)定器 (plethysmography)測(cè)量藥物給藥前后的收縮壓3次，比4交平均值。圖4示出了結(jié)果。如圖4所示，對(duì)照組在藥物給藥前后的收縮壓分別是2 5 4. 3 ± 1 4. 5mmH g、 2 3 7. 7 ± 2 4. 8mmHg,沒有顯著差異。給予本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取 物100mg/kg的給藥組在藥物給藥前后的收縮壓分別是266. 7±14. 0m mHg、 187. 5±21. 6mmHg，復(fù)合中藥熱水提取物300mg/kg給藥 組在藥物給藥前后的收縮壓分別是2 71.8±23.9mmHg、178.0±14.6 mmHg。如上所述，全部本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物給藥組的收縮壓均有顯著降低 (p < 0 . 0 5)。實(shí)驗(yàn)例5 :誘發(fā)了高血壓的小白鼠陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)NOS表達(dá)程度與本發(fā)明的復(fù)合 中藥熱水提取物濃度的關(guān)系為了調(diào)查誘發(fā)了高血壓的小白鼠陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)eNO S、 nNO S的表達(dá)程度 與本發(fā)明的復(fù)合中藥熱7K提取物濃度的關(guān)系，用上述實(shí)驗(yàn)例2 - 2的蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行 觀察。圖5a示出誘發(fā)了高血壓的小白鼠陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)N0S的表達(dá)程度與依據(jù)本發(fā)明 的復(fù)合中藥熱水提取物及單獨(dú)中藥熱水提取物的關(guān)系，圖5b示出誘發(fā)了高血壓的小白 鼠陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)N0S的表達(dá)程度與依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物的濃度的關(guān) 系。如圖5 a所示，可確認(rèn)將本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物給藥于誘發(fā)了高血壓的小白鼠，其陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)N O S的表達(dá)程度較只單獨(dú)給予單味中藥熱水4是取物有非常顯 著的增加。此外，如圖5 b所示，將本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物給藥于誘發(fā)了高血壓的小白 鼠，其陰莖組織內(nèi)蛋白質(zhì)NO S的表達(dá)程度與對(duì)照組相比有顯著增加，特別是復(fù)合中藥 熱水提取物1 0 0 m g / k g給藥組的eNOS、 nNOS表達(dá)程度有較大增加。我們 發(fā)現(xiàn)，雖然復(fù)合中藥熱水提取物300mg/kg給藥組的eNOS、 nNOS表達(dá)程 度與對(duì)照組相比有增加，但是與復(fù)合中藥熱水提取物1 0 0 m g / k g給藥組相比則降 低了。實(shí)驗(yàn)例6:用誘發(fā)了高血壓的小白鼠測(cè)定陰莖海綿體最大內(nèi)壓與本發(fā)明的復(fù)合中藥 熱水提取物濃度的關(guān)系為了調(diào)查誘發(fā)了高血壓的小白鼠陰莖海綿體最大內(nèi)壓與本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提 取物濃度的關(guān)系，用上述實(shí)驗(yàn)例3的方法神經(jīng)刺激海綿體后，記錄結(jié)果。圖6示出了結(jié)果。如圖6所示，對(duì)照組的最大海綿體內(nèi)壓是2 7 . 1 ± 4 . 5 mmH g ,給予本發(fā)明 的復(fù)合中藥熱水提取物(100mg/kg、 300mg/kg)的給藥組的最大海綿 體內(nèi)壓分別是8 3. 3±1. 9mmHg、 5 5. 0±4. 6mmHg,給予本發(fā)明的 復(fù)合中藥熱7jc提取物的給藥組與全部的對(duì)照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著增加(p < 0. 0 5 )。對(duì)照組最大海綿體內(nèi)壓/平均動(dòng)脈壓(I C P / MAP )的百分比是l 4. 9 ± 1. 4 %,給予本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物(100mg/kg、 300mg/kg) 的給藥組的分別是6 2. 8 ± 3. 9 %、 4 4. 1 ± 3. 9 %，給予本發(fā)明的復(fù)合中藥 熱水提取物的給藥組與全部對(duì)照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著增加(p < 0. 0 5 )。給予 本發(fā)明的復(fù)合中藥熱水提取物(100mg/kg、 300mg/kg)的給藥組之間 沒有顯著差異。接下來，例證性示出了本發(fā)明組合物的制劑例。制劑例l:散劑的制備實(shí)施例1的復(fù)合中藥熱水提取物 2 g乳糖 1 g將上述成分混合，裝入密封的布袋中，制得散劑。制劑例2 :錠劑的制備實(shí)施例1的復(fù)合中藥熱水提取物 1 0 0 m g玉米淀粉 1 0 0 m g乳糖 1 0 0 m g硬脂酸鎂 2 m g混合上述成分后，根據(jù)常規(guī)的錠劑制備方法打錠，制得錠劑。制劑例3 :膠嚢劑的制備實(shí)施例1的復(fù)合中藥熱水提取物 1 0 0 m g玉米淀粉 1 0 0 m g乳糖 1 0 0 m g硬脂酸鎂 2 m g混合上述成分后，根據(jù)常規(guī)膠囊劑的制備方法填充入明膠膠囊內(nèi)，制得膠囊劑。
權(quán)利要求
1.一種用于治療或預(yù)防由高脂血癥引起的勃起功能不全癥的藥物組合物，其含有干燥重量比為5～10∶5～10∶1～5∶1～5∶0.5～1.5的山茱萸熱水提取物、枸杞子熱水提取物、覆盆子熱水提取物、菟絲子熱水提取物及五味子熱水提取物。
2. —種用于治療或預(yù)防由高血壓引起的勃起功能不全癥的藥物組合物，其含有干 燥重量比為5-10: 5-10: 1-5: 1-5: 0. 5-1. 5的山茱萸熱7jc提取 物、枸杞子熱水提取物、覆盆子熱水提取物、菟絲子熱水提取物及五味子熱水提取物。
3. —種用于治療或預(yù)防由高脂血癥及高血壓引起的勃起功能不全癥的藥物組合 物，其含有干燥重量比為5 ~ 1 0 : 5-10: 1~5: 1-5: 0. 5~1. 5的山 茱萸熱水提取物、枸杞子熱水提取物、覆盆子熱水提取物、菟絲子熱水提取物及五味子 熱水提取物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防由高脂血癥和/或高血壓引起的勃起功能不全癥的藥物組合物，其含有干燥重量比為5～10∶5～10∶1～5∶1～5∶0.5～1.5的山茱萸熱水提取物、枸杞子熱水提取物、覆盆子熱水提取物、菟絲子熱水提取物及五味子熱水提取物。
文檔編號(hào)A61P9/12GK101229274SQ200710307818
公開日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者李恩正, 黃成萬, 黃成淵 申請(qǐng)人:柳韓公司;黃成淵