專利名稱：聚天冬酰胺衍生物與阿霉素偶聯(lián)物的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種聚天冬酰胺的衍生物的制備方 法，以及它與抗癌藥物阿霉素偶聯(lián)物的制備方法及應(yīng)用。
二背景技術(shù)：
近年來，耙向給藥系統(tǒng)越來越受到人們的關(guān)注，它是將藥物選擇性分布于病 變部位，降低藥物對正常組織的毒副作用，從而提高藥物利用率。大分子前體藥 物(macromolecular prodrugs)是耙向給藥系統(tǒng)的一種，其設(shè)計(jì)模型包含了聚合 物載體、與載體相連接的小分子活性藥物、定位基團(tuán)(targeting group)，有時(shí)也有 用于連接載體和小分子藥物的連接基(spacer groups)。其特點(diǎn)是具有控釋作用和 靶向性。
阿霉素(DOX,doxorubidn)是一種廣譜、強(qiáng)效的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，對急性 白血病、惡性淋巴瘤及多種實(shí)體瘤都有很好的療效，但它又有骨髓抑制、心臟毒 性、消化道反應(yīng)等毒副作用。研究阿霉素的新劑型，降低其副作用，發(fā)揮它的抗 癌活性一直人們研究的一大目標(biāo)。阿霉素的大分子前藥就是其中一種新劑型，阿 霉素與合成大分子聚-N-2-羥丙基甲基丙烯酰胺(pHPMA)偶聯(lián)的前藥(商品名 PK1，PK2 )己進(jìn)入臨床研究[E. Gianasi等人，"International Journal of Pharmaceutics", 148巻第139—148頁，(1997年)]。但是pHPMA在體內(nèi)不可降 解，探索阿霉素新載體的工作一直在不斷進(jìn)行。 a, p-聚一 (2 —羥乙基)一D, L —天冬酰胺(a, p-Poly-(hydroxyethyl)- D, L-aspartamide,PHEA)是一種聚氨基酸衍生物，具有優(yōu)良的生物相容性、可生物 降解性、無毒副作用以及易于大規(guī)模制備等優(yōu)點(diǎn)，最初提出用作血漿膨脹劑[P. Neri等人，"Journal of medicinal chemistry", 16巻，第893-897頁(1973年)]， 近年來研究用作前體藥物的載體，比如偶聯(lián)上抗癌藥物紫杉醇(paclitaxel) [G. Cavallaro等人，"European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics" 58巻第 151-159頁(2004年)]、抗HIV感染藥物齊多夫定(zidovudine) [G. Giammona 等人，"Advanced Drug Delivery Reviews", 39巻，第153-164頁(1999年)]等后 可以控制藥物的釋放速度，還可以通過連接Oxytocin等靶向基團(tuán)把藥物帶到特 定部位[G. Cavallaro 等人，"European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics" 66巻第182-192頁(2007年)]。PHEA在體內(nèi)的降解速度與 其構(gòu)型有關(guān)，L型(a,卩陽Poly-(hydroxyethyl)-L-aspartamide)比D ， L型 (a,卩-Poly-(hydroxyethyl)- D,L-aspartamide)更容易在體內(nèi)酶解，可以作為藥物的載 體。
將PHEA的側(cè)鏈用琥珀酸酐來修飾(suc-PHEA)，琥珀酸基一方面可以充當(dāng) 載體與藥物之間的連接基，提供一COOH活性基團(tuán)與藥物偶聯(lián)，并且改變藥物的 釋放速度，另一方面又可以改變PHEA主鏈的性質(zhì)，進(jìn)而改變其在生物體內(nèi)的 性質(zhì)。suc-PHEA與藥物偶聯(lián)時(shí)，藥物只參與了一步反應(yīng)，反應(yīng)過程簡單方便， 減少了藥物的用量和活性喪失。之前有人把藥物先與琥珀酸酐反應(yīng)，再與PHEA 偶聯(lián)[G. Giammona等人，"Journal of Controlled Release", 54巻第321-331頁(1998 年)]，琥珀酸基僅起連接基作用，在此過程中藥物參與了兩步反應(yīng)，容易造成藥 物的損失和失活。
大分子載體常常通過修飾靶向基團(tuán)，將藥物主動帶向需要發(fā)揮治療作用的靶 部位，以便提高藥物的療效，減輕對全身的毒副作用。半乳糖基就是這樣一種耙 向配體。由于哺乳動物的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面具有大量的去唾液酸糖蛋白受體 (ASGR)，它可以與半乳糖基末端結(jié)合，人們常用半乳糖的衍生物(如乳糖酸) 來修飾載體，賦予所載藥物的肝臟靶向功能[Shuying Gao, "International Journal of Pharmaceutics", 255巻第57-68頁，(2003年)]。乳糖酸可以與suc-PHEA主鏈的 一OH偶聯(lián)，形成較為穩(wěn)定的酯鍵。
PHEA是一種優(yōu)良的生物材料，把它用琥珀酸酐和乳糖酸修飾后又賦予了其 新的功能。阿霉素與PHEA，尤其是與這種半乳糖化的PHEA的偶聯(lián)尚未見報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題
(1)提供一種a,P-聚一 (2 —羥乙基)一L一天冬酰胺的衍生物Gal-PHEA-suc， 它含有靶向基團(tuán)半乳糖基和活性基團(tuán)琥珀?；?，可用作具有肝臟靶向性的藥物載 體。其結(jié)構(gòu)為<formula>complex formula see original document page 7</formula>
制備方法為將PHEA與琥珀酸酐反應(yīng)，以N， N — 二甲基甲酰胺(DMF) 為溶劑，得到琥珀?；腜HEA (PHEA-suc);將PHEA-suc與乳糖酸反應(yīng)，在 N,N'-羰基二咪唑(CDI)作用下，以無水DMF做溶劑，三乙胺做催化劑，使 PHEA-suc的羥基與乳糖酸的羧基偶聯(lián)，得到半乳糖化的聚天冬酰胺衍生物
Gal-PHEA舊c
(2)提供阿霉素與所述聚天冬酰胺衍生物的偶聯(lián)物Gal-PHEA-DOX，用以改
善阿霉素的藥效，降低毒副作用。所述偶聯(lián)物Gal-PHEA-DOX的結(jié)構(gòu)為<formula>complex formula see original document page 8</formula>
制備方法為在l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)作用下， 以DMF為溶劑，將阿霉素的氨基與所述聚天冬酰胺衍生物的羧基偶聯(lián)得到 Gal-PHEA-DOX。
(3) 提供聚天冬酰胺阿霉素偶聯(lián)物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明所提供的Gal-PHEA-suc載體以聚一 (2—羥乙基)一L —天冬酰胺為 主鏈，具有生物降解性和生物相容性等特點(diǎn)；在主鏈上連接琥珀酸基，引入了活 性基團(tuán)羧基，便于修飾具有氨基的藥物，如阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素等；在
主鏈上連接半乳糖基，可以跟肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的去唾液酸糖蛋白受體相結(jié)合，把藥物 導(dǎo)向肝臟；原材料易得，合成方法簡單易行。
本發(fā)明制備的Gal-PHEA-DOX偶聯(lián)物水溶性好，具有肝靶向性，保留了阿 霉素的抗癌活性，降低了阿霉素的毒副作用，可制備成治療腫瘤的藥物。
四

圖1是Gal-PHEA-suc的紅外圖譜 (a: PHEA; B: PHEA-suc; C: Gal-PHEA-suc)。
圖2是PHEA和Gal-PHEA-suc對Hela的細(xì)胞毒性結(jié)果。
圖3是PHEA和Gal-PHEA-suc對HepG2的細(xì)胞毒性結(jié)果。
圖4是Gal-PHEA-DOX對Hela的細(xì)胞毒性結(jié)果。
圖5是Gal-PHEA-DOX對HepG2的細(xì)胞毒性結(jié)果。
圖6是Gal-PHEA-DOX在小鼠體內(nèi)的分布圖。
圖7是Gal-PHEA-DOX對S180小鼠的腫瘤體積的影響。
圖8是Gal-PHEA-DOX對S180小鼠的生存期的影響。
圖9是Gal-PHEA-DOX對S180小鼠的體重的影響。
五具體實(shí)施方式
本發(fā)明通過以下實(shí)施例做進(jìn)一步描述。
實(shí)施例l:聚天冬酰胺衍生物(Gal-PHEA-suc)的制備
稱取2.5克PHEA溶于100 ml DMF，加入2.5克琥珀酸酐，反應(yīng)在室溫下進(jìn) 行6小時(shí)，然后用蒸餾水透析，凍干，得到PHEA-Suc。紅外光譜分析見圖l， 產(chǎn)物具有特征峰Ve-。 1738.5 cm", Vas(HM;: 1164.7 cm"，元素分析得琥珀酸基的取代度為43%。
稱取2克N,N'-羰基二咪唑(CDI)和1.5克乳糖酸分別溶于30 ml無水 DMF，在0X:下，逐滴將CDI溶液加入乳糖酸溶液，并保持4小時(shí)；稱取1克 PHEA-suc，溶于20ml無水DMF，逐滴加入前述溶液，在0。C下反應(yīng)15分鐘， 加入數(shù)滴三乙胺做催化劑，在室溫條件下攪拌反應(yīng)四天。然后用蒸餾水透析，冷 凍干燥，得到Gal-PHEA-Suc。由紅外光譜分析，產(chǎn)物具有特征峰v^: 1797.1 cm—1， vc=。 1734.4 cm—1， Vase.。.c: 1166.2 cm—1 ，元素分析得半乳糖基的取代度為7.6%。
實(shí)施例2:聚天冬酰胺的衍生物一阿霉素偶聯(lián)物(Gal-PHEA-DOX)的制備
稱取0.5 g EDC溶于20 ml DMF, 0.125 g DOX，攪拌溶解。將0.5 g Gal-PHEA-suc溶于10 ml DMF，然后與上述阿霉素溶液混合，室溫條件下避光 攪拌24小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物用雙蒸水透析4天，凍干，得至lj Gal-PHEA-DOX，此過 程也是避光進(jìn)行。紫外可見光檢測Gal-PHEA-DOX的阿霉素含量為9.7 wt %。
實(shí)施例3: Gal-PHEA-suc禾B Gal-PHEA-DOX對人宮頸癌細(xì)胞Hela和肝癌細(xì)胞 HepG2生長的抑制
按lxlO"孔的密度將處于對數(shù)生長期的Hela及HepG2細(xì)胞分別傳至96孔板 上，力B 100 nl 1640培液(10%血清+雙抗)，貼壁培養(yǎng)24 h;取PHEA、 Gal-PHEA-suc、 DOX禾D Gal-PHEA-DOX，分別用培液稀釋成預(yù)先設(shè)定的濃度梯 度，每孔加入100pl，置37'C孵箱培養(yǎng)；設(shè)定時(shí)間后終止培養(yǎng)，用MTT法測定 細(xì)胞活性。圖2和圖3表明，經(jīng)過24h作用后，PHEA、 Gal-PHEA-suc在濃度 低于0.75 mg/ml時(shí)對Hela及HepG2沒有毒性，濃度上升到1 mg/ml時(shí)，細(xì)胞毒
性仍然很小。圖4和圖5表明，與細(xì)胞一起培育48 h后，Gal-PHEA-DOX對Hela 及HepG2都有抑制作用，其細(xì)胞毒性低于DOX，而當(dāng)濃度達(dá)100 ^g/ml時(shí)，其 毒性與DOX相當(dāng)。這是因?yàn)榘⒚顾厥菑腉al-PHEA-DOX逐步釋放出來的，因而 濃度低時(shí)Gal-PHEA-DOX對細(xì)胞的毒性不如DOX，而當(dāng)濃度高達(dá)100昭/ml時(shí)， Gal-PHEA-DOX中阿霉素的釋放量也足以殺滅大部分癌細(xì)胞。
實(shí)施例4: Gal-PHEA-DOX在小鼠體內(nèi)的靶向性
將小鼠肉瘤Sarcoma 180細(xì)胞以2.4x106個(gè)/只接種到18—22克ICR小鼠腋窩 皮下，七天后由尾靜脈注射2 mg/ml DOX和Gal-PHEA-DOX， 4小時(shí)后殺鼠， 取血、肝、肺、腎、心、脾、瘤，勻漿，熒光分析阿霉素含量。結(jié)果如圖6所示， Gal-PHEA-DOX在肝、瘤中的分布都比DOX多，并且血漿中停留時(shí)間更長些。
實(shí)施例5: Gal-PHEA-DOX的抗腫瘤活性
將肉瘤Sarcoma 180細(xì)胞以2.4 x 106個(gè)/只接種到18—22克ICR小鼠腋窩皮下， 一周后實(shí)體瘤尺寸約達(dá)到300mm3，此時(shí)把小鼠隨機(jī)分組，每組十只。 一次性在 瘤內(nèi)注射DOX和Gal-PHEA-DOX，劑量為5 mg DOX/kg，陰性對照組注射等量 的生理鹽水。用游標(biāo)卡尺測量各只小鼠瘤體的長短徑，按公式V=l/2*a*b2 (其中 a和b分別代表腫瘤的長徑和短徑)計(jì)算腫瘤的體積。通過測量瘤體尺寸、體 重和存活數(shù)來評價(jià)抗腫瘤作用。
如圖7所示，注射藥物20天后，與陰性對照組相比，DOX和Gal-PHEA-DOX 對小鼠的抑瘤率分別是41 %和47%。 Gal-PHEA-DOX比陽性對照組DOX具有 更好的抑瘤作用。如圖8所示，Gal-PHEA-DOX比陽性對照DOX組的存活時(shí)間
延長了，平均存活時(shí)間約延長了六天。如圖9所示，Gal-PHEA-DOX組小鼠的 體重穩(wěn)步增長，比陽性對照DOX組的體重增長快。
可見，Gal-PHEA-DOX比DOX對Sarcoma 180肉瘤的抑制作用有所增大， 而對荷瘤小鼠的副作用則減小了。
權(quán)利要求
1一種聚天冬酰胺衍生物，其特征是含有靶向基團(tuán)半乳糖基和活性基團(tuán)琥珀?；?，結(jié)構(gòu)式如下
2根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚天冬酰胺衍生物的制備方法，其特征是包括如下步驟(1) 將a, e-聚一 (2 —羥乙基)一L一天冬酰胺，即PHEA，溶于N， N -二甲基甲酰胺，加入琥珀酸酐反應(yīng)6小時(shí)，溶液經(jīng)透析凍干得到PHEA—sue;(2) 將PHEA-sue溶于無水N， N—二甲基甲酰胺，以N，N，-羰基二咪唑 作為偶聯(lián)劑，三乙胺作為催化劑，使raEA-suc的羥基與乳糖酸的羧基偶聯(lián)， 得到半乳糖化的聚天冬酰胺衍生物Gal-PHEA-suc。
3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚天冬酰胺衍生物與抗癌藥物阿霉素的偶聯(lián)物，其特
4 根據(jù)權(quán)利要求3所述的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是用l-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽作為偶聯(lián)劑，將阿霉素的氨基與所述聚天冬酰胺 衍生物的羧基偶聯(lián)。
5 權(quán)利要求3所述的聚天冬酰胺阿霉素偶聯(lián)物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng) 用。征是具有如下結(jié)構(gòu)式<formula>complex formula see original document page 3</formula>
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靶向高分子藥物載體的合成以及與抗癌藥物阿霉素偶聯(lián)后高分子藥物前體的合成。這種載體是α，β-聚-(2-羥乙基)-L-天冬酰胺的衍生物，它在羥基上修飾了靶向基團(tuán)半乳糖基和活性基團(tuán)琥珀?；?，是一種具有肝臟靶向性的安全的藥物載體。與抗癌藥物阿霉素偶聯(lián)制成的高分子前體藥物，保留了阿霉素的抗腫瘤作用，降低了阿霉素對機(jī)體的毒副作用，可以發(fā)展成一種有肝靶向性的阿霉素前體藥物。
文檔編號A61K47/48GK101195032SQ20071019222
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者刁華佳, 夏蘇華, 張峻峰, 成曉云, 陳江寧 申請人:南京大學(xué)