專利名稱：：致淀粉樣病的預(yù)防和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。發(fā)明背景阿爾茨海默病(早老性癡呆，AD)是一種導(dǎo)致老年性癡呆的進(jìn)行性疾病。一般參見Selkoe，TINS,16，403-409(1993);Hardy等，WO92/13069;Selkoe，J.Neuropathol.Exp.Neurol.53,438-447(1994);Duff等，自然，373，476-477(1995);Games等，自然，373,523(1995)。廣義上講，該疾病分為兩類，發(fā)生在晚年(65歲以上)的晚期發(fā)作，和老年期之前(即35-60歲)形成的早期發(fā)作。在該病的兩種類型中，病理學(xué)是相同的，但是如果在早年開始，異常可能更加嚴(yán)重且分布更廣泛。該疾病特征在于大腦兩種類型的損傷，衰老斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)。通過腦組織切片的顯微分析觀察到，衰老斑是直徑達(dá)15(Him、中心穿插有胞外淀粉樣沉積物的紊亂的神經(jīng)纖維網(wǎng)區(qū)域。神經(jīng)纖維纏結(jié)是含有兩根細(xì)絲(互相成對(duì)地纏繞在一起)的T蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)沉積物。衰老斑的主要成分是被稱為A(3或e-淀粉樣肽的肽。A(3肽是被稱為淀粉樣前體蛋白質(zhì)(APP)的前體蛋白質(zhì)的含39-43個(gè)氨基酸的內(nèi)部片斷。阿爾茨海默病的發(fā)生與APP蛋白質(zhì)的幾種突變有關(guān)。參見，例如Goate等，自然，349，704(1991)(纈氨酸717變?yōu)楫惲涟彼?；ChartierHarlan等，自然，353，844(1991)(纈氨酸717變?yōu)楦拾彼?；Murrell等，科學(xué)，254，97(1991)(纈氨酸717變?yōu)楸奖彼?；Mullan等，NatureGenet.，1，345(1992)(賴氨酸595-甲硫氨酸596變?yōu)樘於匪?95-亮氨酸596的雙突變)。認(rèn)為該突變通過增加或改變APP到A卩的加工，特別是使APP增量加工成為長型AP(即，A(31-42和A|31-43)，引起阿爾茨海默病。認(rèn)為其它基因(如早衰素(presenilin)基因，PS1和PS2)的突變，間接影響APP加工，產(chǎn)生長型AP的增量(參見Hardy,TINS,20，154(1997))。該觀察表明A(3，特別是它的長型，是引起阿爾茨海默病的病因。McMichael在EP526,511中提出了對(duì)已確定為AD的患者以順勢(shì)療法劑量給藥A(3(小于或等于1()Jmg/天)。對(duì)于具有5升血漿的一般人，甚至該劑量的上限可以為產(chǎn)生不超過2pg/ml濃度的劑量。在人血漿中Ap的正常濃度一般地在50-200pg/ml范圍內(nèi)(Seubert等，自然，359，325-327(1992))。因?yàn)樵贓P526，511中提出的劑量只是改變內(nèi)源性循環(huán)AP的水平，并因?yàn)樵贓P526,511中沒有推薦使用佐劑，似乎產(chǎn)生的任何治療性結(jié)果都是難以置信的。相反，本發(fā)明通過在患者體內(nèi)產(chǎn)生有益免疫應(yīng)答的條件下，對(duì)患者給藥AP或其它免疫原。因此本發(fā)明滿足了長期存在的對(duì)預(yù)防或改善阿爾茨海默病之神經(jīng)病理學(xué)的治療方案的需要。發(fā)明簡述一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療特征在于患者體內(nèi)淀粉樣沉積物的疾病的方法。該方法需要誘導(dǎo)針對(duì)患者體內(nèi)淀粉樣沉積物之肽成分的免疫應(yīng)答。該誘導(dǎo)可以是主動(dòng)的(通過給藥免疫原)，或是被動(dòng)的(通過給藥抗體或抗體的活性片斷或衍生物)。在一些患者中，AP肽聚集成淀粉樣沉積物，該疾病稱為阿爾茨海默病。在一些方法中，有些患者是無癥狀的。在一些方法中，有些患者年齡小于50歲。在一些方法中，有些患者遺傳獲得對(duì)阿爾茨海默病表現(xiàn)易感性的危險(xiǎn)因素。該危險(xiǎn)因素包括早衰基因PS1或PS2中的變異等位基因，和APP的變異型。在其它的方法中，有些患者沒有已知的有關(guān)阿爾茨海默病的危險(xiǎn)因素。對(duì)于患有阿爾茨海默病患者的治療，一個(gè)治療方案需要對(duì)患者給藥一定劑量的AP肽，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在一些方法中，AP肽和佐劑一起給藥，以提高對(duì)AP肽的免疫應(yīng)答。在一些方法中，佐劑為明礬。在一些方法中，佐劑為MPL。如果和佐劑共同給藥，對(duì)患者給藥A卩肽的劑量典型地至少為1或10貼，如果不和佐劑共同給藥，劑量至少為50ng。在一些方法中，劑量至少100pg。在一些方法中，A(3肽為Api-42。在一些方法中，A(3肽以聚集態(tài)給藥。在另一些方法中，AP肽以分離型給藥。在一些方法中，治療藥物為有效量的編碼AP或其活性片斷或衍生物的核酸。編碼A(3或其活性片斷或衍生物的核酸在患者體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生A(3或它們的活性片斷或衍生物，其可以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在一些方法中，核酸通過皮膚，任選經(jīng)貼片(patch)給藥。在一些方法中，通過篩選化合物文庫，鑒定與AJ3抗體反應(yīng)的化合物，然后給患者給藥該化合物以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，來鑒定治療藥物。在一些方法中，免疫應(yīng)答由聚集態(tài)AP肽引起，而不是由分離型A(3肽引起。例如，免疫應(yīng)答可以包括與聚集態(tài)AP肽結(jié)合而不與分離型AP肽結(jié)合的抗體。在一些方法中，免疫應(yīng)答包括與Ap結(jié)合的T-細(xì)胞，所述Af3與CD8或CD4細(xì)胞上的MCHI或MHCII復(fù)合。在其它方法中，免疫應(yīng)答通過對(duì)患者給藥AP的抗體進(jìn)行誘導(dǎo)。在一些方法中，通過從患者體內(nèi)分離出T-細(xì)胞，在T-細(xì)胞被激活的條件下使A卵太與T-細(xì)胞接觸，替換患者體內(nèi)的T-細(xì)胞，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。典型地，治療藥物可以通過口服、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、局部或靜脈內(nèi)給藥。在一些方法中，給藥后對(duì)患者迸行監(jiān)控，以評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答。如果監(jiān)控表明在一段時(shí)間后免疫應(yīng)答減少，可以給患者給藥一個(gè)或更多劑量的藥物。另一方面，本發(fā)明提供了含有A(3和適于口服或其它給藥途徑的賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明還提供了含有有效誘導(dǎo)患者對(duì)AP免疫應(yīng)答的藥物和可藥用的佐劑的藥物組合物。在一些該組合物中，藥物為AP或其活性片斷。在一些組合物中，佐劑含有明礬。在一些組合物中，佐劑含有水包油型乳劑。在一些組合物中，A(3或活性片斷是聚丙交酯聚乙交酯共聚物(PLPG)或其它顆粒的成分。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有連接有共軛分子的A(3或活性片斷的組合物，所述共軛物可以促進(jìn)A(3在患者血流中的傳遞和/或促進(jìn)對(duì)AJ3的免疫應(yīng)答。例如，共軛分子可以促進(jìn)對(duì)AI3的免疫應(yīng)答。在一些組合物中，共軛分子為霍亂毒素。在一些組合物中，共軛分子為免疫球蛋白。在一些組合物中，共軛分子為減毒的白喉毒素CRM197(Gupta，疫苗，15，1341-3(1997))。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其中含有在組合物不含完全弗氏佐劑的條件下有效誘導(dǎo)患者對(duì)AJ3免疫應(yīng)答的藥物。本發(fā)明還提供了含有病毒載體的組合物，所述病毒載體編碼能夠有效誘導(dǎo)對(duì)A(3產(chǎn)生免疫應(yīng)答的AP或其活性片斷。合適的病毒載體包括皰疹病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、新培斯病毒、塞姆利基森林病毒、痘苗病毒或禽痘病毒。本發(fā)明進(jìn)一步提供了預(yù)防或治療阿爾茨海默病的方法。在該方法中，給患者給藥有效劑量的AP肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供了Ap或其抗體在制備預(yù)防或治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供了對(duì)患者阿爾茨海默病治療方法之療效的評(píng)價(jià)方法。在該方法中，測(cè)定進(jìn)行藥物治療前患者的組織樣品中AP肽特異性抗體的基線量。將進(jìn)行治療后患者的組織樣品中AP肽特異性抗體的量，和AP肽特異性抗體的基線量進(jìn)行比較。如治療后測(cè)得的A(3肽特異性抗體的量明顯高于A(3肽特異性抗體的基線量，則表明治療結(jié)果是積極的。在對(duì)患者阿爾茨海默病治療方法進(jìn)行療效評(píng)價(jià)的其它方法中，測(cè)定進(jìn)行藥物治療前患者的組織樣品中A(3肽特異性抗體的基線量。將進(jìn)行藥物治療后患者的組織樣品中AP肽特異性抗體的量，和AP肽特異性抗體的基線量進(jìn)行比較。如治療后測(cè)得的AP肽特異性抗體的量和A(3肽特異性抗體的基線量相比減少了或沒有明顯區(qū)別，則表明治療結(jié)果是消極的。在對(duì)患者阿爾茨海默病治療方法進(jìn)行療效評(píng)價(jià)的其它方法中，測(cè)定對(duì)照群體的組織樣品中AP肽特異性抗體的對(duì)照量。將進(jìn)行藥物治療后患者的組織樣品中A(3肽特異性抗體的量，和AP肽特異性抗體的對(duì)照量進(jìn)行比較。如治療后測(cè)得的AI3肽特異性抗體的量明顯高于AP肽特異性抗體的對(duì)照量，則表明治療結(jié)果是積極的。在對(duì)患者阿爾茨海默病治療方法進(jìn)行療效評(píng)價(jià)的其它方法中，測(cè)定對(duì)照群體的組織樣品中A(3肽特異性抗體的對(duì)照量。將進(jìn)行藥物治療后患者的組織樣品中AP肽特異性抗體的量，和A(3肽特異性抗體的對(duì)照量進(jìn)行比較。治療后測(cè)得的A)3肽特異性抗體的量和AP肽特異性抗體的對(duì)照量相比沒有明顯區(qū)別，這表明治療結(jié)果是消極的。監(jiān)控患者阿爾茨海默病或其易感性的其它方法，包括檢測(cè)患者樣品中對(duì)于AP肽的免疫應(yīng)答。在一些方法中，對(duì)患者給予有效治療和預(yù)防阿爾茨海默病的藥物，應(yīng)答水平?jīng)Q定患者的進(jìn)一步治療方案。在對(duì)患者阿爾茨海默病治療方法進(jìn)行療效評(píng)價(jià)的其它方法中，測(cè)定已進(jìn)行藥物治療的患者的組織樣品中AP肽特異性抗體量的值。將該值與從由于藥物治療阿爾茨海默病癥狀改善或消失的患者群測(cè)得的對(duì)照值進(jìn)行比較。如患者的值至少等于對(duì)照值，這表明治療結(jié)果是積極的。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了實(shí)施上述方法的診斷試劑盒。典型地，該試劑盒包括特異性結(jié)合A(3抗體或刺激與A(3反應(yīng)的T-細(xì)胞增殖的試劑。圖l:給轉(zhuǎn)基因小鼠注射A(31-42后的抗體效價(jià)。圖2:海馬中的淀粉樣損傷。通過對(duì)免疫反應(yīng)腦切片進(jìn)行的計(jì)算機(jī)輔助定量圖像分析，測(cè)定了淀粉樣斑占據(jù)的海馬區(qū)面積百分率(由與AP-特異性mAP3D6的反應(yīng)性確定)。個(gè)體小鼠的該值表示成分類治療組。每組的橫線表示分布的中值。圖3:海馬中的神經(jīng)性營養(yǎng)不良。通過對(duì)免疫反應(yīng)腦切片進(jìn)行的計(jì)算機(jī)輔助定量圖像分析，測(cè)定了營養(yǎng)不良神經(jīng)占據(jù)的海馬區(qū)面積百分率(由它們與人APP-特異性mA|38E5的反應(yīng)性確定)。個(gè)體小鼠的該值表示為AN1792治療組和PBS治療對(duì)照組。每組的橫線表示分布的中值。圖4:夾肌后皮質(zhì)中的星形細(xì)胞增生。通過對(duì)免疫反應(yīng)腦切片進(jìn)行的計(jì)算機(jī)輔助定量圖像分析，測(cè)定了神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白質(zhì)(GFAP)-陽性星形細(xì)胞占據(jù)的皮質(zhì)區(qū)的面積百分率。個(gè)體小鼠的該值表示為分類治療組，組中值用橫線表示。圖5:用八種劑量的AN1792(0.14、0.4、1.2、3.7、11、33、100或300(ig)免疫后，Af31-42抗體效價(jià)的幾何平均值。圖6:對(duì)AN1792免疫的抗體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。效價(jià)通過每組6個(gè)動(dòng)物的幾何平均值表示。圖7:PBS-和AN1792-治療小鼠中皮質(zhì)淀粉樣損傷的定量圖像分析。圖8:PBS-和AN1792-治療小鼠中神經(jīng)性斑損傷的定量圖像分析。圖9:PBS-和AN1792-治療小鼠中星形細(xì)胞占據(jù)夾肌后皮質(zhì)的百分率的定量圖像分析。圖10:AN1792-處理(上圖)或PBS-處理(下圖)的脾細(xì)胞的淋巴細(xì)胞增殖分析。圖11:皮質(zhì)中AP的總體水平。用AP或APP衍生物結(jié)合弗氏佐劑免疫的小鼠中個(gè)體AJ3的散點(diǎn)圖。圖12:通過對(duì)用AP肽共軛物Api-5、Apl-12和Apl3-28;全長Ap聚集物AN1792(Af31-42)和AN1528(A|31-40)以及PBS治療對(duì)照組免疫的小鼠的免疫反應(yīng)腦切片進(jìn)行的定量圖像分析測(cè)定的皮質(zhì)中淀粉樣損傷。圖13:用AP或APP衍生物結(jié)合弗氏佐劑免疫的各組小鼠的AP特異性抗體的幾何平均效價(jià)。圖14:用AN1792或其棕櫚酸酯衍生物結(jié)合不同佐劑免疫的各組豚鼠的A(3肽特異性抗體的幾何平均效價(jià)。圖15:用AN1792或AN1528和不同的佐劑治療的12個(gè)月齡的PDAPP小鼠皮質(zhì)中的A(3水平。定義術(shù)語"基本上相同"是指兩個(gè)肽序列，當(dāng)最優(yōu)排列時(shí)，例如通過GAP或BESTFIT程序采用默認(rèn)間隙重量，具有至少65。/。的序列等同性，優(yōu)選至少80或90%的序列等同，更加優(yōu)選至少95%或更多的序列等同(例如，99%或更高的序列等同)。優(yōu)選不同的殘基位置通過保守氨基酸取代鑒別。進(jìn)行序列比較時(shí)，通常選定一個(gè)序列作為參照序列，將測(cè)試序列與其相比較。運(yùn)行序列比較程序時(shí)，將測(cè)試序列和參照序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要，指定序列等同物，并指定序列運(yùn)算程序。然后序列比較運(yùn)算程序根據(jù)指定的程序參數(shù)計(jì)算出測(cè)試序列相對(duì)于參照序列的序列等同百分率?？梢酝ㄟ^Smith和Waterman(應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展2:482(1981))的局部同源性運(yùn)算法則；Needleman和Wunsch(分子生物學(xué)雜志，48:443(1970))的同源性排列運(yùn)算法則；Pearson和Lipman(美國國家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展，85:2444(1988))的相似性檢索方法；運(yùn)算法則(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、禾nTFASTA，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，575科學(xué)Madison，WI博士)的計(jì)算機(jī)化實(shí)施，或者通過目檢(一般性參見Ausubel等，同上)進(jìn)行序列的優(yōu)化排列比較。適于確定序列等同性百分率和序列相似性百分率的運(yùn)算法則的一個(gè)實(shí)例是BLAST運(yùn)算法則，它由Altschul等描述，分子生物學(xué)，215:403-410(1990)。進(jìn)行BLAST分析的軟件由國家生物技術(shù)信息中心向公眾提供(http:〃www.ncbi.nlm.nig.gov/)。通常，可以用默認(rèn)程序參數(shù)進(jìn)行序列比較，當(dāng)然也可以使用用戶化參數(shù)。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序默認(rèn)單詞長度(W)為3,預(yù)期值(E)為10，BLOSUM62記錄矩陣(參見Henikoff和Henikoff，美國國家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展89，10915(1989))。為了將氨基酸取代分成保守或非保守取代，須將氨基酸如下分組組I(疏水側(cè)鏈)正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；組II(中性親水側(cè)鏈)半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸；組III(酸性側(cè)鏈)天冬氨酸，谷氨酸；組IV(堿性側(cè)鏈)天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸；組V(影響鏈方向的殘基)甘氨酸，脯氨酸；和組VI(芳香族側(cè)鏈)色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。保守取代涉及同類氨基酸之間的取代。非保守取代由一組中的一個(gè)成分改變成為另一組中的一個(gè)成分。本發(fā)明的治療藥物典型地是基本純的。這意味著藥物純度典型地至少約為50%w/w(重量/重量)，并且基本上沒有干擾蛋白質(zhì)和污染物。有時(shí)藥物純度至少約為80%w/w，更優(yōu)選純度至少90%或約95%w/w。然而，利用常規(guī)蛋白質(zhì)純化技術(shù)，可以得到至少99%w/w的均一多肽。兩個(gè)實(shí)體之間的特異性結(jié)合指親和力至少106、107、108、lOV1或10!V1。優(yōu)選親和力高于108M"。使用的術(shù)語"抗體"包括完整抗體和其結(jié)合片段。通常，片段與其來源的完整抗體競爭性地與抗原特異性結(jié)合。任選，抗體或其結(jié)合片段可以與其它蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)合，或者與其它蛋白質(zhì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)。APP695、APP7"和APP77G分別指由人APP基因編碼的695、751、和770個(gè)氨基酸殘基長的多肽。參見Kang等，自然，325,773(1987);Ponte等，自然，331，525(1988);和Kitaguchi等，自然，331，530(1988)。人淀粉樣前體蛋白(APP)中的氨基酸依照APP770同種型的序列指定編號(hào)。例如AP39、AJ340、AP41、AJ342、和Aj343指含氨基酸殘基1-39、1-40、1-41、1-42、和1-43的AP肽。術(shù)語"表位"或"抗原決定簇"指使B和/或T細(xì)胞應(yīng)答的抗原上的位點(diǎn)。B-細(xì)胞表位可以由相鄰氨基酸形成，也可以由通過蛋白質(zhì)三級(jí)折疊靠近的非相鄰氨基酸形成。由相鄰氨基酸形成的表位在接觸變性溶劑時(shí)通常維持結(jié)構(gòu)，而由三級(jí)折疊形成的表位在用變性溶劑處理時(shí)通常失去結(jié)構(gòu)。在一個(gè)單一立體構(gòu)型中表位通常包括至少3個(gè)，更經(jīng)常至少5或8-10個(gè)氨基酸。確定表位的立體構(gòu)型的方法包括，例如，X-射線晶體學(xué)和2維核磁共振。參見，例如，分子生物學(xué)方法中的表位成像方案(EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularbiology)66巻，GlennE.Morris編(1996)?？梢酝ㄟ^顯示一個(gè)抗體阻斷另一個(gè)抗體與耙抗原結(jié)合能力的簡單的免疫分析鑒定識(shí)別同樣表位的抗體。CD8T-細(xì)胞識(shí)別約9個(gè)氨基酸的連續(xù)表位，CD4T-細(xì)胞識(shí)別約3-15個(gè)氨基酸的連續(xù)表位。識(shí)別表位的T細(xì)胞可以通過測(cè)定抗原-依賴性增殖(通過3H-胸苷摻入對(duì)表位應(yīng)答的激活T-細(xì)胞確定)(Burke等，J.Inf.Dis.170,1110-19(1994)),通過抗原-依賴性殺傷(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分析，Tigges等，免疫學(xué)雜志，156，3901-1910)或者通過細(xì)胞因子分泌來鑒定。術(shù)語"免疫學(xué)"或"免疫"應(yīng)答是在接受治療的患者體內(nèi)形成對(duì)抗淀粉樣肽的有益的體液(抗體介導(dǎo)的)和/或細(xì)胞(抗原特異性T細(xì)胞或其分泌產(chǎn)物)應(yīng)答。該應(yīng)答可以是通過給藥免疫原誘導(dǎo)的主動(dòng)應(yīng)答，也可以是通過給藥抗體或激活的T-細(xì)胞誘導(dǎo)的被動(dòng)應(yīng)答。在存在與I類或II類MHC分子有關(guān)的多肽表位，以激活抗原特異性004+T輔助細(xì)胞和/或CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的條件下誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。應(yīng)答還可以涉及單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、樹狀細(xì)胞、星形細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞或其它具有天然免疫力成分的激活?？梢酝ㄟ^增殖檢測(cè)(CD4+T細(xì)胞)或CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)檢測(cè)確定細(xì)胞介導(dǎo)的免疫學(xué)應(yīng)答的出現(xiàn)(參見，Burke,同上；Tigges，同上)。體液和細(xì)胞應(yīng)答對(duì)免疫原產(chǎn)生的保護(hù)或治療效果的相對(duì)貢獻(xiàn)可以用下述方法區(qū)別，即從免疫的同系動(dòng)物體內(nèi)單獨(dú)分離IgG和T-細(xì)胞，然后在第二受試者體內(nèi)測(cè)定保護(hù)或治療效果。"免疫原性的藥物"或者"免疫原"是在對(duì)患者給藥(任選結(jié)合佐劑)后能夠誘導(dǎo)對(duì)它的免疫應(yīng)答。術(shù)語"裸多核苷酸"指沒有與膠狀材料復(fù)合的多核苷酸。裸多核苷酸有時(shí)被克隆到質(zhì)粒載體中。術(shù)語"佐劑"指當(dāng)與抗原結(jié)合給藥時(shí)增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，但當(dāng)單獨(dú)給藥時(shí)，不產(chǎn)生對(duì)抗原免疫應(yīng)答的化合物。佐劑可以通過幾種機(jī)制增強(qiáng)免疫應(yīng)答，包括征集淋巴細(xì)胞、激活B和/或T細(xì)胞、和激活巨噬細(xì)胞。術(shù)語"患者"包括接受預(yù)防性或治療性處理的人和其他哺乳動(dòng)物受試者。解聚或單體A財(cái)旨AJ3的可溶解、單體肽單元。制備單體AP的一種方法是在潔凈DMSO中超聲溶解凍干肽。將得到的溶液離心除去所有不溶顆粒。聚集AP是低聚體的混合物，其中單體單元通過非共價(jià)鍵結(jié)合到一起。"包括"一種或多種所提及元素的組合物或方法可以包括沒有具體提及的其他元素。例如，含有AP肽的組合物中包含分離的A即太和作為一種較長多肽序列成分的A(3肽。發(fā)明詳述I.總則本發(fā)明提供了預(yù)防和治療特征在于淀粉樣沉淀物累積的疾病的藥物組合物和方法。淀粉樣沉淀物包括聚集成不溶團(tuán)塊的肽。該肽的性質(zhì)隨不同疾病有所變化，但在大多數(shù)情況下，聚集物具有P-折疊的片層結(jié)構(gòu)，可以用剛果紅染料染色。特征在于淀粉樣沉淀物的疾病包括阿爾茨海默氏病(AD)，晚期發(fā)作和早期發(fā)作。在兩種疾病中，淀粉樣沉淀物包括被稱為AP的肽，其在被侵襲個(gè)體的腦中累積。特征在于淀粉樣沉淀物的疾病的其他一些例子是SAA淀粉樣變、遺傳性冰島綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤、和海綿狀腦病(參見Weissmann等，神經(jīng)生物學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)(Curr.Opin.Neurobiol.)7,695-700(1997);Smits等，獸醫(yī)季刊(VeterianryQuarterly)19,101-105(1997);Nathanson等，美洲流行病學(xué)雜志(Am.J.Epidemiol.)145,959-969(1997))。在這些疾病中形成聚集物肽的前三位分別是血清淀粉樣蛋白A，cystantinC、IgGk輕鏈，其次是感染性蛋白質(zhì)。II.治療藥物1.阿爾茨海默氏病本發(fā)明應(yīng)用的治療藥物誘導(dǎo)對(duì)A(3肽的免疫應(yīng)答。這些藥物包括A(3自身和其變異型，誘導(dǎo)和/或與A(3肽抗體交叉反應(yīng)的AP類似物和模擬物，與Ap肽反應(yīng)的抗體或T-細(xì)胞。免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)可以是主動(dòng)的，即對(duì)患者給藥免疫原，誘導(dǎo)對(duì)A(3反應(yīng)的抗體或T-細(xì)胞，或者可以是被動(dòng)的，即對(duì)患者給藥與AP結(jié)合的抗體本身。A(3，也被認(rèn)為是e-淀粉樣肽，或者A4肽(參見US4666829;Gle皿er和Wong，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)120,1131(1984))，它是一種含39-43個(gè)氮基酸的肽，是阿爾茨海默氏病特征斑的基本成分。AP是通過兩種酶(被稱為e和Y分泌酶)加工較長蛋白質(zhì)APP產(chǎn)生的(參見Hardy,Tins,20,154(1997))。已知的與阿爾茨海默氏病有關(guān)的APP中的突變發(fā)生在緊鄰e或Y分泌酶的位點(diǎn)，或者在A(3中。例如，在APP加工成AP時(shí)，位置717緊鄰APP的Y分泌酶酶切位點(diǎn)，位置670/671緊鄰e分泌酶酶切位點(diǎn)。據(jù)信突變通過與形成AP的酶切反應(yīng)相互作用，增加了產(chǎn)生的42/43個(gè)氨基酸形式的AP的量，從而導(dǎo)致AD。Ap具有不尋常的特性，即它能夠固定和激活典型和替代補(bǔ)體級(jí)聯(lián)。特別是，它結(jié)合Clq并最終結(jié)合C3bi。這種關(guān)系有利于結(jié)合導(dǎo)致B-細(xì)胞激活的巨噬細(xì)胞。另外，C3bi進(jìn)一步分解，然后與B細(xì)胞上的CR2以T細(xì)胞依賴性方式結(jié)合，導(dǎo)致這些細(xì)胞的激活增加10，000倍。這種機(jī)制導(dǎo)致AP比其他抗原產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。本申請(qǐng)要求保護(hù)的方法中用到的治療藥物可以是AP肽的任何自然存在形式，特別是人中的形式(即，AP39、A(340、AP41、A|342、或A(343)。這些肽的序列和他們與APP前體的關(guān)系如Hardy等(TINS,20,155-158(1997))圖1所示。例如，Ap42具有如下序列H-2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val隱Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OHA(341、AP40和Ap39與Ap42的不同之處在于，它們分別缺失C-末端的Ala、Ala-Ile、和Ala-Ile-Val。A卩43與A|342的不同之處在于，它在C-末端還具有一個(gè)蘇氨酸殘基。治療藥物也可以是含有對(duì)人給藥后誘導(dǎo)相似保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答的表位的天然Aj3肽的活性片段或類似物。免疫原性片段典型地具有來源于天然肽的至少3、5、6、10或20個(gè)相鄰氨基酸的序列。免疫原片段包括Api-5、1-6、1-12、13-28、17-28、25-25、35-40、和35-42。在一些方法中，來源于A(3N-端一半的片段是優(yōu)選的。類似物包括等位基因的、種的和誘導(dǎo)的變異體。類似物通常與自然發(fā)生肽在一個(gè)或幾個(gè)位置上不同，通常通過保守取代產(chǎn)生。類似物通常表現(xiàn)與天然肽至少80%或90%的序列等同性。一些類似物還包括非天然氨基酸或N-或C-末端氨基酸的修飾。非天然氨基酸的實(shí)例為a,ct-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、4-羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酰胺、s-N,N,N-三甲基賴氨酸、e-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、"-N-甲基精氨酸。可以按照下面的描述在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中篩選具有預(yù)防或治療效果的片段和類似物。Ap，其片段、類似物和其他致淀粉樣肽可以通過固相肽合成或重組表達(dá)合成，或者從天然來源提取。很多供應(yīng)商提供商品自動(dòng)肽合成儀，例如應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)，F(xiàn)osterCity，California。重組表達(dá)可以在細(xì)菌例如大腸桿菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞或晡乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行。重組表達(dá)的方法如Sambrook等描述(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(C.S.H.P.出版社，NY，第二版，1989))。也有一些商品提供的Ap月太(例如，AmericanPeptidesCompany,Inc.,Sunnyvale,CA禾口CaliforniaPeptideResearch,Inc.Napa,CA)。治療藥物還包括較長的多肽，包括，例如，與其它氨基酸在一起的AP肽、活性片段或類似物。例如，AP肽可以作為完整APP蛋白質(zhì)或其片段出現(xiàn)，例如，從AJ3N-末端開始并延續(xù)到APP末端的C-100片段。可以如下所述在動(dòng)物模型中篩選所述多肽的預(yù)防或治療功效。A(3肽、類似物、活性片段或其它多肽可以以結(jié)合形式給藥(即作為一種淀粉樣肽)，或者以分離形式給藥。治療藥物還包括單體免疫原藥物的多聚體。在進(jìn)一步的改進(jìn)中，免疫原肽，例如AP可以作為病毒或細(xì)菌疫苗的形式出現(xiàn)。將編碼免疫原肽的核酸插入病毒或細(xì)菌的基因組或游離體。任選地，核酸以如下方式插入，即免疫原肽以分泌蛋白或與病毒的外表面蛋白質(zhì)或細(xì)菌的跨膜蛋白質(zhì)一起表達(dá)的融合蛋白的形式表達(dá)，以使該肽出現(xiàn)。該方法中使用的病毒或細(xì)菌應(yīng)當(dāng)是非病原性的或減毒的。合適的病毒包括腺病毒、HSV、痘苗病毒和雞痘病毒。免疫原肽與HBV的HBsAg的融合體尤其合適。治療藥物還包括不必然具有與A(3的顯著氨基酸序列相似性，然而卻作為AP的模擬物并誘導(dǎo)類似免疫應(yīng)答的肽和其他化合物。例如，可以篩選所有形成e-折疊片層的肽和蛋白質(zhì)的適用性。也可以使用抗AP或其它致淀粉樣肽單克隆抗體的抗-獨(dú)特型抗體。該抗-Id的抗體類似抗原，產(chǎn)生對(duì)它的免疫應(yīng)答(參見基本免疫學(xué)(EssentialImmunology)(Roit等，Blackwell科學(xué)出版社，PaloAlto,第6版)，181頁)。還可以篩選肽或其它化合物隨機(jī)文庫的適用性。對(duì)于一些以按部就班方式合成的化合物類型可以創(chuàng)建組合文庫，這類化合物包括多肽、e-轉(zhuǎn)角模擬物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳香族化合物、雜環(huán)化合物、苯并二氮、低聚N-取代甘氨酸和低聚氨基甲酸?？梢酝ㄟ^Affymax,WO95/12608，Affymax,WO93/06121,Colubia大學(xué),WO94/08051,藥典，WO95/35503和Scripps，WO95/30642中描述的編碼合成文庫(ESL)法構(gòu)建化合物的大組合文庫(每一文獻(xiàn)為各種目的列入本文作為參考)。也可以通過噬菌體展示法產(chǎn)生肽文庫。參見，例如，Devlin,WO91/18980。首先通過確定組合文庫和其它化合物與己知的特異于A(3或其它致淀粉樣肽的抗體或淋巴細(xì)胞(B或T)的結(jié)合能力，篩選它們的適用性。例如，可以用任何A卩或其它致淀粉樣肽的多克隆血清或單克隆抗體進(jìn)行最初的篩選。然后進(jìn)一步分析該篩選鑒定的化合物誘導(dǎo)Ap或其它致淀粉樣肽的抗體或反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的能力。例如，可以在用A(3肽預(yù)涂的微量滴定平板上測(cè)試血清的多步稀釋物，可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA，以測(cè)試AP的反應(yīng)性抗體。然后按照實(shí)施例中的描述，在預(yù)先誘導(dǎo)致淀粉樣病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)測(cè)試化合物的預(yù)防和治療功效。所述動(dòng)物包括，例如，如Games等(同上)所述的帶有APP717突變的小鼠，和帶有APP瑞典突變的小鼠，例如，McConlogue等，US5，612，486和Hsiao等，科學(xué)，274，99(1996);Staufenbiel等，美國國家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展94，13287-13292(1997);Sturchler-Piermt等，美國國家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展94，13287-13292(1997);Borchelt等，神經(jīng)(Neuron)19，939-945(1997))?？梢詫⑼瑯拥暮Y選方法用于其它潛在藥物，例如前面所述的Ap片段、AP類似物和包括AP的更長肽。本發(fā)明的治療藥物還包括特異性結(jié)合A(3的抗體。該抗體可以是單克隆或多克隆的。這些抗體中的一些特異性結(jié)合聚集態(tài)的AP而不結(jié)合分離型的Ap。一些特異性結(jié)合分離型而不結(jié)合聚集態(tài)。一些既結(jié)合聚集態(tài)又結(jié)合分離型?？梢酝ㄟ^，例如，用A(3免疫動(dòng)物制備非人單克隆抗體，例如，鼠科動(dòng)物或大鼠。參見Harlow和Lane，抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(CSHP，NY，1988)(為各種目的列入本文作為參考)。這樣一種免疫原可以從天然來源獲得、通過肽合成或者通過重組表達(dá)獲得?？梢酝ㄟ^重組DNA技術(shù)將非人抗體的CDR區(qū)連接到人恒定區(qū)產(chǎn)生鼠抗體的人源化形式。參見Queen等，美國國家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展，86，10029-10033(1989)和WO90/07861(為各種目的列入本文作為參考)?？梢岳檬删w展示法獲得人抗體。參見，例如，Dower等，WO91/17271;McCafferty等，WO92/01047。在這些方法中，產(chǎn)生噬菌體文庫，其中的成員在它們的外表面上展示不同的抗體。抗體通常展示18為Fv或Fab片段。通過親合濃縮選擇對(duì)A(3或其片段具有理想特異性的噬菌體展示抗體。也可以從具有編碼至少一段人免疫球蛋白基因座和一種失活的內(nèi)源性免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物制備抗AP的人抗體。參見，例如，Lonberg等，W093/12227(1993);Kucherlapati,W091/10741(1991)(每篇文獻(xiàn)為各種目的全文參考插入)。人抗體可以通過競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)選擇，或相反，則具有與特殊小鼠抗體相同的表位特異性。該抗體非?？赡芟碛行∈罂贵w的有用功能特性。還可以從用免疫原藥物免疫的人血清中提供人多克隆抗體。任選，該多克隆抗體可以利用AP或其它淀粉樣肽作為親合試劑，通過親合純化濃縮。人或人源化抗體可以被設(shè)計(jì)為具有IgG、IgD、IgA和IGE恒定區(qū)，和所有同種型，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4?？贵w可以表達(dá)為含兩個(gè)輕鏈和兩個(gè)重鏈的四聚體，表達(dá)為單獨(dú)的重鏈、輕鏈，表達(dá)為Fab，F(xiàn)ab'F(ab')2、和Fv，或者表達(dá)成單鏈抗體，其中重鏈和輕鏈可變區(qū)通過間隔區(qū)連接起來。本發(fā)明中使用的治療藥物還包括與AP肽結(jié)合的T-細(xì)胞。例如，可以通過在昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)人MHCI類基因和人e-2-小球蛋白基因，由此在細(xì)胞表面形成一種空復(fù)合物，它可以結(jié)合A(3肽，來激活抗Af3肽的T-細(xì)胞。與細(xì)胞系接觸的T-細(xì)胞被肽特異性激活。參見，Peterson等，US5,314,813。表達(dá)MHCII類抗原的昆蟲細(xì)胞系同樣可以用于激活CD4T細(xì)胞。2.其它疾病同樣或類似的原則決定治療其它致淀粉樣病的藥物的生產(chǎn)。通常，前面提到的用于治療阿爾茨海默氏病的藥物也可以用于治療與伸舌樣白癡有關(guān)的早期發(fā)作的阿爾茨海默氏病。在瘋牛病中，感染性蛋白質(zhì)肽，活性片段，類似物，和感染性蛋白質(zhì)肽抗體被用于代替AP肽。在治療多發(fā)性骨髓瘤中，用到IgG輕鏈和類似物和其抗體，其它疾病中也如此。3.載體蛋白質(zhì)一些誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的物質(zhì)含有誘導(dǎo)對(duì)淀粉樣沉積物免疫應(yīng)答的合適表位，但它們太小而不具有免疫原性。在這種情況下，可以將肽免疫原連接到適當(dāng)?shù)妮d體上，以幫助誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。合適的載體包括血清白蛋白、鑰孔(keyholelimpet)血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白、破傷風(fēng)類毒素、或其它病原菌的類毒素，例如白喉，大腸桿菌，霍亂、或H.Pylori,或者減毒的毒素衍生物。刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的其它載體包括細(xì)胞因子例如IL-1、IL-1a和3肽，IL-2、YlNF、IL-IO、GM-CSF、和趨化因子，例如M1P1a和p和RANTES。免疫原性的藥物還可以如O，Mahony,WO97/17613和WO97/17614所述與增強(qiáng)跨組織運(yùn)輸作用的肽相連。免疫原性的藥物可以通過化學(xué)交聯(lián)連接到載體上。將免疫原連接到載體上的方法包括用N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基-硫基)-丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(SMCC)(如果肽缺乏巰基，可以通過添加半胱氨酸殘基提供)。這些試劑在其自身和一種蛋白質(zhì)肽的半胱氨酸殘基之間建立了二硫鍵，以及通過賴氨酸上的e-氨基或其它氨基酸中的其它游離氨基建立了酰胺鍵。免疫學(xué)研究(Immun.Rev.)62，185(1982)中描述了大量這類二硫/酰胺-形成試劑。其它的雙功能偶聯(lián)劑形成硫醚鍵而不是二硫鍵。商業(yè)提供了一些硫醚形成劑，包括6-馬來酰亞胺基己酸、2-溴乙酸、和2-碘乙酸、4-(N-馬來酰亞胺基-甲基)環(huán)己垸-l-羧酸。羧基可以通過將其與琥珀酰亞胺或l-羥基-2-硝基-4-磺酸鈉鹽結(jié)合而激活。免疫原性的肽還可以與載體以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)?？梢詫⒚庖咴缘碾倪B接到載體的氨基末端、羧基末端、或中間。任選，在融合蛋白質(zhì)中可以多次重復(fù)出現(xiàn)免疫原性的肽。4.編碼免疫原的核酸對(duì)淀粉樣沉積物的免疫應(yīng)答也可以通過給藥編碼AP肽或其它肽免疫原的核酸誘導(dǎo)。所述核酸可以是DNA或RNA。編碼免疫原的核酸片段典型地與調(diào)控元件相連，例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，這使DNA片段得以在患者的預(yù)期耙細(xì)胞中表達(dá)。對(duì)于在血細(xì)胞中的表達(dá)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答理想的是，來自免疫球蛋白輕鏈或重鏈基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件或者CMV主要即早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子適用于引導(dǎo)表達(dá)。相連的調(diào)控元件和編碼序列通常可克隆到載體中。公開的一些病毒載體系統(tǒng)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(參見例如，Lawrie和Tumin，遺傳學(xué)進(jìn)展的目前觀點(diǎn)(Cur.Opin.Genet.Develop.)3,102-109(1993));腺病毒載體(參見例如，Bett等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)67,5911(1993));腺相關(guān)病毒載體(參見例如，Zhou等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)179,1867(1994))，來自痘病毒家族的病毒載體，包括痘苗病毒和禽痘病毒，來自a病毒屬的病毒載體，例如來自新培斯病毒和塞姆利基森林病毒的載體(參見例如，Dubensky等，病毒學(xué)雜志，70，508-519(1996)，以及乳頭瘤病毒(Ohe等，人類基因治療(humangeneTherapy)6,325-333(1995);Woo等,WO94/12629和Xiao和Brandsma,核酸研究(NucleicAcidsRes.)24,2630-2622(1996))。編碼免疫原的DNA或含該DNA的載體可以包裝于脂質(zhì)體中。合適的脂質(zhì)和相關(guān)類似物如US5208036，US5264618,US5279833和US5283185。載體和編碼免疫原的DNA還可以吸附或連接到顆粒性載體上，載體的例子包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚丙交酯類以及聚(丙交酯-共-乙交酯)，參見例如，McGee等，J.MicroEncap.(1996)。可以通過對(duì)個(gè)體患者給藥，向體內(nèi)傳遞基因治療載體或裸DNA，典型地通過全身給藥(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻腔、胃、皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、或頭顱內(nèi)灌輸)或者局部給藥(參見例如US5399346)。還可以利用基因槍給藥DNA。參見Xiao和Brandsma,同上。編碼免疫原的DNA可以沉淀到極微金屬珠表面。用沖擊波或擴(kuò)散氦氣加速微拋射體，使它透過組織到達(dá)幾個(gè)細(xì)胞層的深度。例如，Agacetus,Inc.MiddletonWI生產(chǎn)的Accel基因傳送裝置是適用的?；蛘撸瑑H需將裸DNA點(diǎn)在皮膚上伴隨化學(xué)或機(jī)械刺激即可使DNA穿過皮膚到達(dá)血流(參見WO95/05853)。在進(jìn)一步的改進(jìn)中，可以將編碼免疫原的載體輸送給離體細(xì)胞，例如來自個(gè)體患者的移植細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞、骨髓穿剌液、組織活檢)或者一般供體的造血干細(xì)胞，通常在篩選插入了載體的細(xì)胞后，再次將細(xì)胞移植到患者體內(nèi)。III.接受治療的患者。接受治療的患者包括具有患病風(fēng)險(xiǎn)，但沒有表現(xiàn)出癥狀的個(gè)體，以及目前表現(xiàn)出癥狀的患者。對(duì)于阿爾茨海默氏病，實(shí)際上任何人，只要他或她活得足夠長，都存在患阿爾茨海默氏病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明可以對(duì)普遍群體預(yù)防性給藥，而沒有任何關(guān)于受試患者危險(xiǎn)的評(píng)價(jià)。本發(fā)明尤其對(duì)已知具有阿爾茨海默氏病遺傳危險(xiǎn)的個(gè)體有效。所述個(gè)體包括有患該病經(jīng)歷的親屬，和通過遺傳學(xué)和生化標(biāo)記分析確定存在風(fēng)險(xiǎn)的人群。對(duì)于阿爾茨海默氏病的風(fēng)險(xiǎn)遺傳學(xué)標(biāo)記包括APP基因的突變，尤其是在717位，670和671位(分別被稱為Hardy突變和瑞典突變(Swedishmutation))的突變(參見Hardy,TINS,同上)。其他危險(xiǎn)標(biāo)記是早衰素基因(PS1和PS2)以及ApoE4中的突變、AD家族史、血膽固醇過多或動(dòng)脈粥樣硬化。正患阿爾茨海默氏的個(gè)體可以通過特征性癡呆以及上述危險(xiǎn)因子的存在識(shí)別。另外，可利用大量鑒定患AD的患者的診斷實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)包括測(cè)定CSFt和A(342的水平。升高的t和A(342水平下降表示患有AD。也可以通過實(shí)施例部分論述的MMSE或ADRDA標(biāo)準(zhǔn)診斷患阿爾茨海默氏病的個(gè)體。對(duì)于無癥狀患者，可以在任何年齡開始治療(例如10，20，30)。然而，通常在患者到40，50，60或70歲時(shí)，才需要開始治療。治療通常需要在一段時(shí)期內(nèi)多劑量給藥。可以通過分析一段時(shí)間內(nèi)對(duì)治療藥物(例如A(3)的抗體、或激活的T-細(xì)胞或B-細(xì)胞應(yīng)答，來監(jiān)測(cè)治療。如果應(yīng)答失敗，表明需要升高劑量。對(duì)于潛在的唐氏綜合癥患者，可以在產(chǎn)前對(duì)母親給藥治療藥物開始治療，也可以在出生后不久對(duì)患者給藥。IV.治療方案在預(yù)防應(yīng)用中，對(duì)易感一種特殊疾病、或相反存在患一種特定疾病危險(xiǎn)的患者給藥足以消除或降低危險(xiǎn)或延緩疾病發(fā)作劑量的藥物組合物或藥物。在治療應(yīng)用中，對(duì)易感或已經(jīng)患所述疾病的患者給藥足以治愈或至少部分抑制疾病和其并發(fā)癥癥狀劑量的組合物或藥物。足以實(shí)現(xiàn)上述效果的量被稱為治療-或預(yù)防-有效劑量。在預(yù)防和治療方案中，通常均給藥幾個(gè)劑量，直到實(shí)現(xiàn)充分的免疫應(yīng)答。通常監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答，如果免疫應(yīng)答開始衰弱則重復(fù)給藥。對(duì)于治療上述病癥，本發(fā)明組合物的有效劑量隨一些不同因素而改變，包括給藥方法、靶部位、患者的生理狀況、患者是人還是動(dòng)物、給藥的其他藥物、以及處理是治療性的還是預(yù)防性的。通常，患者為人，但對(duì)于某些疾病，例如瘋牛病，患者可以是非人哺乳動(dòng)物，例如牛。需要測(cè)定治療劑量，以優(yōu)化安全性和有效性。免疫原的量依賴于是否還給藥佐劑，如果沒有佐劑則需要較高劑量。用于給藥的免疫原的量有時(shí)在每位患者lpg到500pg內(nèi)變化，更經(jīng)常每次對(duì)人注射5-500|ag。偶爾使用每次注射1-2mg的較高劑量。典型地每次對(duì)人注射約10、20、50、10(Hig。值得注意的是注射時(shí)間可以從一天一次、到一年一次、到十年一次變化。在任何預(yù)定的給用一劑量的免疫原的那一天，如果還給藥佐劑，則劑量高于lpg/位患者，通常高于10pg/位患者，如果沒有佐劑則劑量高于10ng/位患者，通常高于100)ag/位患者。典型療法包括一次免疫，然后以6周間隔加強(qiáng)注射。另一種療法包括一次免疫，隨后1、2和12個(gè)月后加強(qiáng)注射。另一種療法需要終生每兩周注射一次?；蛘?，可以如監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答所示，不定期加強(qiáng)注射。對(duì)于利用抗體的被動(dòng)免疫，劑量范圍為約0.0001到100mg/kg受體體重，更經(jīng)常為0.01到5mg/kg受體體重。編碼免疫原的核酸的劑量范圍為10ng到1g，100ng到100mg，lng到10mg，或30-300ngDNA每位患者。注射感染性病毒載體的劑量從每劑量IO個(gè)毒粒到109或更多毒粒。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物可以經(jīng)非腸道、局部、靜脈、口腔、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或肌內(nèi)方式給藥，用于預(yù)防和/或治療處理。最典型的給藥途徑的皮下給藥，當(dāng)然其它同樣有效。其次最常用的是肌內(nèi)注射。這種注射類型最典型地在胳膊或腿的肌肉內(nèi)注射。靜脈內(nèi)注射以及腹膜內(nèi)注射、動(dòng)脈內(nèi)注射、顱骨內(nèi)注射、或皮內(nèi)注射對(duì)于產(chǎn)生免疫應(yīng)答也是有效的。在一些方法中，直接將藥物注射到沉積物累積的特別組織中。本發(fā)明的藥物任選與其它治療致淀粉樣病至少部分有效的藥物組合給藥。對(duì)于腦中發(fā)生淀粉樣沉積物的阿爾茨海默氏病和唐氏綜合癥，還可以將本發(fā)明的藥物與其它促進(jìn)本發(fā)明藥物穿過血腦屏障的藥物組合給藥。本發(fā)明的免疫原藥物，例如肽，有時(shí)與佐劑聯(lián)合給藥?？梢允褂枚喾N佐劑與肽(例如Ap)聯(lián)合使用，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。優(yōu)選的佐劑增強(qiáng)對(duì)免疫原的固有應(yīng)答，而不導(dǎo)致影響應(yīng)答定性形式的免疫原的構(gòu)象改變。優(yōu)選的佐劑包括明礬、3脫-氧-?；瘑瘟柞Ｖ怉(MPL)(參見GB2220211)。QS21是從南美發(fā)現(xiàn)的QuillajaSaponariaMolina樹的樹皮中分離出的三萜糖甙或皂甙(參見Kensil等，疫苗設(shè)計(jì)亞基禾口佐劑研究(VaccineDesign:TheSubunitandAjuvantApproach)(Powell和Newman編，Plenum出版社，NY，1995);美國專利號(hào)5057540)。其它佐劑是水包油型乳劑(例如角鯊烯或花生油)，任選與免疫刺激物(例如單磷酰脂類A)組合(參見Stoute等，N.Engl.J.Med.336，86-91(1997))。另一種佐劑是CpG(今日生物世界，1998年ll月15日)?；蛘撸梢詫(3與佐劑偶聯(lián)。例如，可以如制備乙型肝炎抗原疫苗中所述將棕櫚酸或其它脂類直接與A(3的N-末端偶聯(lián)，制備脂肽形式的Ap(Livingston,免疫學(xué)雜志，159，1383-1392(1997))。然而，這種偶聯(lián)應(yīng)答基本上不改變Af3的結(jié)構(gòu)，以不影響其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的性質(zhì)。佐劑可以作為治療組合物的一種成分與活性藥物一起給藥，也可以在給藥治療藥物之前、同時(shí)、或之后單獨(dú)給藥。佐劑的優(yōu)選種類為鋁鹽(明礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁。這種佐劑可以與或不與其它特別的免疫刺激劑(例如MPL或3-DMP、QS21、多聚或單體氨基酸例如多聚谷氨酸或多聚賴氨酸)一起使用。另一種佐劑是水包油型乳劑。這種佐劑可以與或不與其它特別的免疫刺激劑(例如胞壁酰肽(例如，N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、忖-乙酰胞壁酰丄-丙氨酰-0-異谷氨酰胺酰丄-丙氨酸-2-(l'-2，二棕櫚酰-sn-丙三氧基-3-羥磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)、N-乙酰葡糖氨基-N-乙酰胞壁酰-L-鋁-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-二棕櫚酰氧基丙酰胺(DTP-DPP)theramide)，或者其它細(xì)菌細(xì)胞壁成分。水包油型乳劑包括(a)MF59(WO卯/14837)，含5%角鯊烯、0.5%吐溫80，禾卩0.5%Span85(任選含有各種量的MTP-PE)，用微型流化床器(例如110Y型微型流化床器，Microfluidics,NewtonMA)配制成亞微細(xì)顆粒，(b)SAF，含有10%角鯊烯、0.4%吐溫80、5%普羅尼克-嵌段共聚物L(fēng)121、和thr-MDP，微流化成亞微細(xì)粒乳劑或者旋渦振蕩產(chǎn)生較大顆粒的乳劑，以及(c)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem.Hamilton,MT)，含有2%角鯊烯、0.2%吐溫80、以及由下述成分組成的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分，單磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(Detox)。另一種優(yōu)選佐劑是皂甙佐劑，例如Stimulon(QS21，Aquila，Worcester,MA)或者由它們產(chǎn)生的顆粒例如ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)和ISCOMATRIX。其它佐劑包括完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。其它佐劑包括細(xì)胞因子，例如白介素(IL-1、IL-2和IL-12)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)。佐劑可以與免疫原一起作為單一組合物給藥，或者可以在免疫原給藥之前、同時(shí)或之后給藥。免疫原和佐劑可以包裝在同一個(gè)小藥水瓶中使用，也可以各自包裝于單獨(dú)小藥水瓶，使用前混合。通常將免疫原和佐劑包裝于貼有標(biāo)明預(yù)期治療應(yīng)用標(biāo)記的容器內(nèi)。如果免疫原和佐劑單獨(dú)包裝，包裝通常包括使用前混合的指示。佐劑和/或載體的選擇依賴于含佐劑的疫苗的穩(wěn)定性、給藥途徑、劑量方案、佐劑對(duì)被接種的物種的效力，對(duì)于人類，可藥用的佐劑是經(jīng)有關(guān)管理機(jī)構(gòu)認(rèn)可或可接受用于對(duì)人給藥的佐劑。例如，完全弗氏佐劑不適于對(duì)人給藥。明磯、MPL和QS21是優(yōu)選的。任選地，可以同時(shí)使用兩種或多種不同佐劑。優(yōu)選組合包括明礬與MPL，明礬與QS21，MPL與QS21，以及明礬、QS21禾卩MPL。也可以使用不完全弗氏佐劑(Chang等，先進(jìn)藥物傳送綜述(AdvancedDrugDeliveryReviews)32,173-186(1998))，任選與明砜、QS21、和MPL中的一種和它們的組合一起給藥。本發(fā)明的藥物通常作為包含活性治療藥物，和很多其它可藥用成分的藥物組合物給藥。參見Remington's藥物學(xué)(第15版，Mack出版公司，Easton,Pennsylvania,1980)。優(yōu)選劑型根據(jù)預(yù)期給藥和治療應(yīng)用方式?jīng)Q定。組合物還可以根據(jù)所需的劑型包括可藥用的、非毒性載體或稀釋劑，它們被認(rèn)為是常規(guī)用于配制給動(dòng)物或人給藥的藥物組合物的載體。稀釋劑根據(jù)不影響組合物的生物活性來選擇。這類稀釋劑的例子是蒸餾水、生理磷酸鹽緩沖液、林格液，葡萄糖溶液、和Hank's溶液。另外，藥物組合物或制劑還可以包括其它載體，佐劑，或非毒性、非治療性、非免疫原性穩(wěn)定劑等。然而，一些試劑適合對(duì)動(dòng)物給藥，例如完全弗氏佐劑通常不用在對(duì)人應(yīng)用的組合物中。藥物組合物還可以包括較大的、代謝緩慢的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚羥基乙酸和共聚物(例如樹膠功能化瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素等)，多聚氨基酸，氨基酸共聚物，和脂類聚集物(例如油滴或脂質(zhì)體)。另外，這些載體具備作為免疫刺激劑的功能(即佐劑)。對(duì)于非腸道給藥，本發(fā)明的藥物可以作為溶液或物質(zhì)在生理可接受稀釋劑中的懸浮液的可注射劑型與藥劑載體(可以是無菌液體，例如水油、鹽水、甘油、或乙醇)一起給藥。另外，組合物中還可以含有輔助物質(zhì)，例如保濕劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩沖物質(zhì)等。藥物組合物的其它成分是石油，動(dòng)物、植物、或合成來源的，例如，花生油、大豆油、和礦物油。液體載體通常優(yōu)選二醇例如丙二醇或聚乙二醇，尤其是可注射溶液。典型地，將組合物制備成液體溶液或懸浮液的可注射形式；也可以制備成注射前溶解于或懸浮于液體載體的固體劑型。如前面的論述，還可以將制劑乳化于或包埋于脂質(zhì)體或微顆粒，例如聚丙交酯、聚乙交酯、或共聚物中，用于增強(qiáng)佐劑效果(參見Langer,科學(xué)，249，152791990)和Hanes，先進(jìn)藥物傳送綜述28，97-119(1997)。本發(fā)明的藥物可以以儲(chǔ)存注射的形式或移植制劑的形式給藥，其中可以以使活性成分持續(xù)或脈動(dòng)釋放的方式配制它們。適合其它給藥方式的其它劑型包括口服、鼻內(nèi)應(yīng)用、和肺部應(yīng)用的制劑，栓劑、和透皮應(yīng)用制劑。對(duì)于栓劑，粘合劑和載體包括，例如，聚亞烷基二醇或甘油三酸酯；該栓劑可以通過含活性成分在0.5%到10%，優(yōu)選1%-2%范圍內(nèi)的混合物制備?？诜苿┌ㄙx形劑，例如藥用級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、和碳酸鎂。這些組合物配制成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、控釋制劑或粉劑的形式，含有10%-95%活性成分，優(yōu)選25%-70%活性成分。局部應(yīng)用可以制成透皮或皮內(nèi)給藥制劑。局部給藥可以通過共同給藥霍亂毒素或其脫毒衍生物或亞基，或者其它類似細(xì)菌毒素促進(jìn)(參見Glenn等，自然391，851(1998))。通過應(yīng)用經(jīng)化學(xué)交聯(lián)得到的作為混合劑或連接分子的成分，或者表達(dá)為融合蛋白，實(shí)現(xiàn)共同給藥。或者，利用皮膚通道或利用轉(zhuǎn)移體(transferosome)實(shí)現(xiàn)透皮給藥。(Paul等，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)25,3521-24(1995);Cevc等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(Biochem.Biophys.Acta)1368,201-15(1998))。V.診斷方法本發(fā)明提供了檢測(cè)患有或易感阿爾茨海默氏病的患者體內(nèi)對(duì)Ap的免疫應(yīng)答。本方法對(duì)于監(jiān)測(cè)接受給藥患者的治療過程尤其有用。本發(fā)明可以用于監(jiān)測(cè)有癥狀患者的治療處理以及無癥狀患者的預(yù)防處理。一些方法需要確定一個(gè)劑量的藥物給藥之前患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答基線水平，然后將該值與治療后的免疫應(yīng)答值相比較。免疫應(yīng)答水平的顯著增加(即同一樣品重復(fù)測(cè)定中，高于試驗(yàn)誤差的典型界限，表示為所述測(cè)定平均值基礎(chǔ)上的標(biāo)準(zhǔn)差)表明治療結(jié)果為陽性(即，藥物的給藥得到了或增強(qiáng)了免疫應(yīng)答)。如果免疫應(yīng)答的水平?jīng)]有顯著改變，或者有所降低，表明陰性治療結(jié)果。通常，接受藥物治療的患者使用連續(xù)劑量時(shí)在初期表現(xiàn)為增加的免疫應(yīng)答，其最終達(dá)到穩(wěn)定期。藥物的給藥通常的連續(xù)的，而免疫應(yīng)答是不斷增加的。穩(wěn)定期的獲得表明治療給藥可以間斷或者可以減少劑量或者次數(shù)。在其它方法中，測(cè)定對(duì)照組免疫應(yīng)答的對(duì)照值(即，平均值和標(biāo)準(zhǔn)差)。典型地，對(duì)照組中的個(gè)體沒有接受預(yù)先治療。然后將給藥治療劑后患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答測(cè)量值與對(duì)照值比較。相對(duì)于對(duì)照值的顯著增加(例如高于平均值的標(biāo)準(zhǔn)差)表明陽性治療結(jié)果。缺乏明顯的增加或降低表明陰性治療結(jié)果。通常連續(xù)給藥藥物，免疫應(yīng)答相對(duì)于對(duì)照值不斷增加。和前面一樣，相對(duì)于對(duì)照對(duì)照值出現(xiàn)穩(wěn)定期，表明治療給藥可以間斷，或者降低劑量或次數(shù)。在其它方法中，測(cè)定接受治療藥物處理并且免疫應(yīng)答對(duì)治療的響應(yīng)已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定期的個(gè)體對(duì)照組的免疫應(yīng)答對(duì)照值(例如平均值和標(biāo)準(zhǔn)差)?；颊唧w內(nèi)免疫應(yīng)答的測(cè)定值與對(duì)照值相比較。如果患者的測(cè)定值相對(duì)于對(duì)照值沒有顯著的不同(例如，高于一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)，則治療可以間斷。如果患者體內(nèi)的水平顯著低于對(duì)照值，則需要保證連續(xù)給藥藥物。如果患者體內(nèi)的水平持續(xù)低于對(duì)照值，則改變治療方案，例如，可能預(yù)示應(yīng)用不同的佐劑。在其它方法中，對(duì)目前沒有接受治療但以前曾接受一個(gè)療程治療的患者監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答，以確定是否需要再繼續(xù)治療。在早先一個(gè)療程治療之后，可以將患者體內(nèi)免疫應(yīng)答的測(cè)量值與患者以前獲得的免疫應(yīng)答值比較。相對(duì)于前期測(cè)量顯著降低(即在相同樣品的重復(fù)測(cè)量中，高于誤差的典型界限)表明可以恢復(fù)治療?；蛘?，可以將患者的測(cè)量值與接受一個(gè)療程治療后的患者組測(cè)定的對(duì)照值相比較(平均值+標(biāo)準(zhǔn)差)?；蛘?，可以將患者的測(cè)量值與接受預(yù)防處理、沒有遺留疾病綜合癥的患者組或者接受治療處理、表現(xiàn)疾病癥狀改善的患者組體內(nèi)的對(duì)照值相比較。在所有這些情況下，相對(duì)于對(duì)照水平的顯著降低(即，超過一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)表明患者應(yīng)當(dāng)再繼續(xù)治療。用于分析的組織樣品典型的是來自患者的血液、血漿、血清、粘液或腦脊液。分析樣品對(duì)任何形式的A(3肽，典型地是AP42的免疫應(yīng)答標(biāo)記?？梢酝ㄟ^例如，特異性結(jié)合Ap肽的抗體或T-細(xì)胞的存在確定免疫應(yīng)答。實(shí)施例部分描述了檢測(cè)特異于Af3的抗體的ELISA法。檢測(cè)反應(yīng)性T-細(xì)胞的方法前面已經(jīng)描述過(參見定義)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了進(jìn)行上述診斷方法的診斷試劑盒。通常，該試劑盒含有特異性結(jié)合AP抗體或與特異于A(3的T-細(xì)胞反應(yīng)的試劑。試劑盒含還包括一種標(biāo)記物。對(duì)于檢測(cè)AP抗體，標(biāo)記物通常是被標(biāo)記的抗獨(dú)特型抗體的形式。對(duì)于檢測(cè)抗體，可以預(yù)先將試劑結(jié)合到固相上使用，例如結(jié)合到微滴定平皿的孔中。對(duì)于反應(yīng)性T-細(xì)胞的檢測(cè)，可以應(yīng)用311-胸苷作為標(biāo)記物測(cè)量增殖反應(yīng)。試劑盒典型地還含有提供使用試劑盒指導(dǎo)的標(biāo)簽。該標(biāo)簽還可以包括顯示測(cè)量的標(biāo)記水平與A|3抗體或與A(3反應(yīng)的T-細(xì)胞之間相關(guān)性的圖或其他相應(yīng)方式。術(shù)語"標(biāo)簽"指在試劑盒的生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售或使用的任何時(shí)間，貼附于或包在試劑盒中的任何書寫或記錄材料。例如，術(shù)語"標(biāo)簽"包括廣告宣傳頁和手冊(cè)、包裝材料、說明書、音頻或視聽磁帶、計(jì)算機(jī)磁盤、以及直接印刷在試劑盒上的書寫印記。實(shí)施例I.抗AD的AP的預(yù)防功效這些實(shí)施例描述了對(duì)存在717突變的APP(APP717V—F)過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠給藥A(342肽，預(yù)先使它們形成阿爾茨海默氏病樣神經(jīng)病理學(xué)。Games等(自然，同上)描述了這些小鼠(PDAPP小鼠)的產(chǎn)生和特征。在這些動(dòng)物的雜合型中，六個(gè)月后開始沉積AP。到十五個(gè)月，它們表現(xiàn)出的AP沉積水平與阿爾茨海默氏病中觀察到的水平相同。給PDAPP小鼠注射聚集態(tài)A(342(聚集Ap42)或磷酸鹽緩沖鹽水。選擇聚集Ap42是因?yàn)樗軌蛘T導(dǎo)多表位AP的抗體。A.方法1.小鼠來源將三十只PDAPP雜合雌性小鼠隨機(jī)分成下列組10只小鼠注射聚集Ap42(轉(zhuǎn)運(yùn)中一只死亡)，5只小鼠注射PBS/佐劑或PBS，10只是沒有注射的對(duì)照。5只小鼠注射血清淀粉樣蛋白質(zhì)(SAP)。2.免疫原的制備聚集態(tài)八(342的制備將兩毫克Ap42(美國肽公司，lotk-42-12)溶解于0.9ml水，力口入O.lmlIOXPBS至1ml。將其旋渦振蕩，37°C保溫過夜，在該條件下，肽聚集。所有未利用的AP作為凍干粉末在-20'C儲(chǔ)藏，直到下次注射。3.注射劑的制備將對(duì)每只小鼠注射的PBS中的100pg聚集態(tài)A(342用完全弗氏佐劑(CFA)按照1:1的比例乳化，至終體積為40(^1的乳化劑，用于第一次免疫，之后2周，將不完全弗氏佐劑(IFA)中同樣量的免疫原用作加強(qiáng)免疫。以月為間隔用IFA進(jìn)行另外兩次免疫。隨后的免疫在500nlPBS中以月為間隔進(jìn)行。腹膜內(nèi)(i.p.)注射給藥。PBS注射遵循同樣的方案，每只小鼠用1:1的PBS/佐劑混合物400jal，或者用500plPBS注射。SAP注射劑遵循同樣的方案，每次注射劑量為lOO]ug。4.小鼠出血的滴定、組織準(zhǔn)備和免疫組織化學(xué)上述方法在下面的一般材料和方法中描述。B.結(jié)果用聚集態(tài)A(342(被聚集的A|342)、SAP肽、或磷酸鹽緩沖鹽水對(duì)一組PDAPP小鼠注射。另外留出一組PDAPP小鼠作為未注射的陽性對(duì)照。從第四次加強(qiáng)免疫開始每隔一個(gè)月監(jiān)測(cè)小鼠對(duì)聚集態(tài)AJ342的效價(jià)，直到小鼠長到l歲。在第13個(gè)月，處死小鼠。在所有檢査的時(shí)間點(diǎn)，九只聚集態(tài)A(342小鼠中的八只形成高抗體效價(jià)，其在一系列注射過程中，始終保持較高效價(jià)(效價(jià)高于1/10000)。第九只小鼠有點(diǎn)低，但也可測(cè)得效價(jià)約為1/1000(圖1，表1)。SAPP注射小鼠對(duì)該免疫原的效價(jià)為1:1000到1:30000，僅一只小鼠超過1:10,0000。在6、10和12個(gè)月測(cè)定PBS-處理小鼠對(duì)聚集AP42的效價(jià)。當(dāng)稀釋度為1/100時(shí)，對(duì)PBS小鼠測(cè)定的對(duì)聚集態(tài)A(342的效價(jià)，僅在一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)上比背景超過4倍，而在其它所有時(shí)間點(diǎn)上比背景少于4倍(表1)。SAP的特異性應(yīng)答可以忽略，在這些時(shí)間點(diǎn)上所有效價(jià)低于300。在聚集態(tài)A(3l42組中九只小鼠中的七只腦中沒有檢測(cè)到淀粉樣蛋白。相比較而言，在SAP和PBS組中，小鼠腦組織的海馬、以及前皮質(zhì)和色帶環(huán)繞皮質(zhì)中含有許多3D6-陽性淀粉樣沉積物。沉積模式類似于未處理對(duì)照的模式，特征在于累及易損亞區(qū)，例如海馬鋸齒狀腦回的外分子層。A(3i-42注射組的一只小鼠表現(xiàn)淀粉樣侵害的明顯降低，只限于海馬。在另一只APL42處理小鼠體內(nèi)鑒定了隔離斑。海馬中淀粉樣侵害的定量圖像分析證明，AN1792處理動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)淀粉樣侵害顯著降低(圖2)。PBS組淀粉樣侵害的中值(2.22%)和未處理的對(duì)照組的中值(2.56%)明顯高于用AN1792免疫小鼠的中值(0.00%，p=0.0005)。相比較而言，SAP肽(SAPP)免疫組的中值為5.74%。利用AP特異性單克隆抗體(mAb)3D6觀察到未處理的對(duì)照小鼠腦組織(海馬和夾肌后皮質(zhì)中)含有大量AP淀粉樣沉積物。用SAPP或PBS免疫小鼠也觀察到類似模式的淀粉樣沉積物(圖2)。另外，在AD中典型地觀察到，這后三組具有這樣的特征，即累及腦中的易損亞區(qū)，例如在后三組中，均累及海馬鋸齒狀腦回的外分子層。不含AP沉積物的腦中也缺乏在PDAPP小鼠中利用人APP抗體8E5通?？梢姷纳窠?jīng)炎斑。剩余組(SAP-注射、PBS注射和未注射小鼠)的所有腦中含有大量未處理PDAPP小鼠中典型存在的神經(jīng)炎斑。在一個(gè)只AN1792處理小鼠中存在少量神經(jīng)炎斑，在AN1792處理的第二只小鼠中發(fā)現(xiàn)一簇營養(yǎng)不良性軸突。顯示于圖3的海馬圖像分析表明，與PBS受體鼠(中值0.28%，p=0.0005)相比，AN1792處理小鼠(中值0.00%)營養(yǎng)不良性軸突實(shí)質(zhì)上消失。A(3m2注射組腦中也缺乏斑相關(guān)性發(fā)炎的星形細(xì)胞增生癥狀。其它組小鼠腦中富含，且叢生AP斑-相關(guān)性神經(jīng)膠質(zhì)過多癥典型的GFAP-陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞。用硫黃素S復(fù)染記數(shù)GFAP-反應(yīng)性玻片的一個(gè)子集，以定位AI3沉積物。SAP、PBS和未處理對(duì)照中，GFAP-陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞與AP斑有關(guān)。在斑-陰性A(3^2處理小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)該相關(guān)性，而在一只AN1792處理小鼠中鑒定了斑與神經(jīng)膠質(zhì)過多癥之間的弱相關(guān)性。圖4顯示的夾肌后皮質(zhì)的圖像分析證明，AN1792處理小鼠星形細(xì)胞增生降低顯著，中值為1.56%,而用SAP肽處理、PBS處理或未處理免疫組，中值高于6%(p=0.0017)。來自APm2和PBS注射小鼠子集的證據(jù)表明APm2注射小鼠中缺乏斑-相關(guān)性MHCII免疫反應(yīng)性，與AJ3-相關(guān)性炎性反應(yīng)的缺乏一致。還將小鼠腦切片與特異于MAC-l(—種細(xì)胞表面蛋白質(zhì))的mA(3反應(yīng)。MAC-1(CDllb)是整聯(lián)蛋白家族的成員，與CD18以異質(zhì)二聚體存在。CDllb/CD18復(fù)合物存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞上(Mak和Simard)。基于在MAC-1免疫反應(yīng)性切片中相似的表現(xiàn)型形態(tài)學(xué)，腦中固有的MAC-l-反應(yīng)性細(xì)胞類型可能是小膠質(zhì)細(xì)胞。與PBS對(duì)照組相比，AN1792處理小鼠腦中斑-相關(guān)性MAC1標(biāo)記較低，該結(jié)果與A(3誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的缺乏一致。C.結(jié)論用A(3m2注射的小鼠腺中，Ap斑和反應(yīng)性神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞改變的缺乏表明，在它們的腦中沒有或幾乎很少沉積淀粉樣蛋白，并且沒有出現(xiàn)病理結(jié)果，例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞過多癥和神經(jīng)炎病理學(xué)。APm2處理的PDAPP小鼠基本上顯示同樣缺乏如對(duì)照非轉(zhuǎn)基因小鼠的病理學(xué)。因此，注射A(3^2對(duì)于預(yù)防人AP沉積或從腦組織中清除人A|3，以及消除隨后神經(jīng)元和炎性變性性改變高度有效。因此，AP肽的給藥在預(yù)防AD方面具有治療優(yōu)點(diǎn)。II.劑量反應(yīng)研究用在CFA/IFA中配制的300、100、33、11、3.7、1.2、0.4、或0.13)LigAP對(duì)五周齡、雌性瑞士Webster小鼠組腹膜內(nèi)給藥免疫。以兩周間隔給藥三個(gè)劑量，一個(gè)月后給藥第4個(gè)劑量。第一個(gè)劑量用CFA乳化，其它的劑量用IFA乳化。每次免疫后4-7天(在下一個(gè)劑量之后開始)對(duì)動(dòng)物取血，測(cè)定抗體效價(jià)。用11、33、或300pg抗原免疫的三組動(dòng)物，在第四次免疫之后以月為間隔再取血四次，以監(jiān)測(cè)一定疫苗劑量范圍內(nèi)抗體應(yīng)答的衰落。這些動(dòng)物在研究開始之后的第七個(gè)月接受最后一次即第五次免疫。一周后處死動(dòng)物，測(cè)定對(duì)AN1792的抗體應(yīng)答并進(jìn)行毒理學(xué)分析。觀察到從300到3.7pg劑量應(yīng)答逐步衰減，最低兩個(gè)劑量沒有應(yīng)答。11-300pg抗原的3個(gè)劑量后平均抗體效價(jià)約為1:1000，4個(gè)劑量后約為1:10000(參見圖5)。第三次免疫后，除了最低劑量組，其它組抗體效價(jià)均顯著升高，GMT升高了5-25倍。甚至0.4pg抗原的受體也檢測(cè)到較低的抗體應(yīng)答。L2pg和3.7ing組效價(jià)相近，GMT約為1000，最高四個(gè)劑量集中，GMT約為25000，除了33lig劑量組GMT較低，為3000。大多數(shù)組在第四次免疫之后，效價(jià)增加不多。從0.14pg受體沒有檢測(cè)出抗體到lljig受體GMT為36000范圍內(nèi)的0.14pg到llpg較低抗原劑量組內(nèi)表現(xiàn)出了清楚的劑量應(yīng)答。此外，11到300pg的四個(gè)最高劑量組效價(jià)集中。因此，兩次免疫之后，對(duì)于從0.4到300ng的寬范圍內(nèi)，抗體效價(jià)依賴于抗原劑量。到第三次免疫，最高四個(gè)劑量的效價(jià)彼此接近，再次接受免疫后，它們保持在穩(wěn)定期上。第四次免疫之后一個(gè)月，300ng組中的效價(jià)比免疫之后5天取血測(cè)定的效價(jià)高2到3倍(圖6)。該觀測(cè)數(shù)據(jù)表明峰記憶抗體應(yīng)答發(fā)生在免疫后5天之后。33jLig組中，在該時(shí)間點(diǎn)，觀察到較為平緩的增加(50%)。在300ng劑量組中，最后一個(gè)劑量之后兩個(gè)月，GMT銳減約70%。再一個(gè)月后，衰減不太劇烈為45%(10(Vg)，對(duì)于33和llpg劑量約為14%。因此，終止免疫之后循環(huán)系統(tǒng)中抗體效價(jià)的衰減速率可能是雙相的，峰應(yīng)答之后的第一個(gè)月銳減，隨后衰減速率較為平緩。這些瑞士Webster小鼠的抗體效價(jià)和應(yīng)答動(dòng)力學(xué)類似于以平行方式免疫的幼年P(guān)DAPP轉(zhuǎn)基因小鼠。對(duì)于誘導(dǎo)人類免疫應(yīng)答的劑量有效性通常類似于小鼠的劑量有效性。III.對(duì)已確定AD的治療功效的篩選設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)免疫原性藥物在抑制或逆轉(zhuǎn)衰老動(dòng)物體內(nèi)AD的神經(jīng)病理學(xué)癥狀方面的活性。當(dāng)PDAPP小鼠腦中已經(jīng)出現(xiàn)淀粉樣斑時(shí)，開始用42個(gè)氨基酸長的A|3(AN1792)免疫。在該研究的過程中，未處理的PDAPP小鼠形成大量類似于AD中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)變性改變(Games等，同上和Johnson-wood等，美國國家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展94，1550-1555(1997))。A(3沉積成為淀粉樣斑與由異常軸突和樹狀元件(被稱為營養(yǎng)不良性神經(jīng)突)組成的變性神經(jīng)元應(yīng)答有關(guān)。被包圍且含有營養(yǎng)不良性神經(jīng)突的淀粉樣沉積物被稱為神經(jīng)炎斑。在AD和PDAPP小鼠中，營養(yǎng)不良性神經(jīng)突具有獨(dú)特的球狀結(jié)構(gòu)，與識(shí)別APP和細(xì)胞骨架成分的抗體平板發(fā)生免疫反應(yīng)，在亞顯微結(jié)構(gòu)水平上呈現(xiàn)復(fù)雜的亞細(xì)胞變性性改變。這些特征得以對(duì)PDAPP腦中祌經(jīng)炎斑進(jìn)行疾病相關(guān)性、選擇性和重現(xiàn)性地測(cè)量。PDAPP神經(jīng)炎斑的的營養(yǎng)不良性神經(jīng)元成分可以容易地用人APP特異性抗體觀察(mAJ38E5)，并可以通過計(jì)算機(jī)輔助的圖像分析方便地測(cè)定。因此，除了測(cè)定AN1792對(duì)淀粉樣斑形成的影響，我們還監(jiān)測(cè)了該治療對(duì)神經(jīng)炎性營養(yǎng)不良的發(fā)展的影響。星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是應(yīng)答和反應(yīng)神經(jīng)元損傷程度的非神經(jīng)元細(xì)胞。在AD中?？捎^察到GFAP-陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞和MHCII-陽性小膠質(zhì)細(xì)胞，它們活性的增加伴隨疾病的加重。因此，我們也監(jiān)測(cè)AN1792-處理小鼠體內(nèi)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)展。A.材料和方法將從CharlesRiver得到的四十八只雜合雌性PDAPP小鼠(11到11.5月齡)隨機(jī)分成兩組24只小鼠用100pgAN1792免疫，24只用PBS免疫，均與弗氏佐劑混合。當(dāng)AN1792組和PBS組長到約15月齡時(shí)再次分組。15月齡時(shí)對(duì)AN1792-和PBS-處理動(dòng)物組分別無痛處死約一半(n分別等于10和9)，其余的繼續(xù)接受免疫，直到約18個(gè)月終止(n分別等于9和12)。研究過程中總共8只動(dòng)物死亡(5只AN1792，3只PBS)。除了免疫動(dòng)物，另外包括一歲齡(n=10)、15月齡(n=10)和18月齡(n=10)未處理PDAPP小鼠，用于在ELISA中比較腦中的測(cè)量A(3和APP水平；一歲齡的動(dòng)物還用于免疫組織化學(xué)分析。除非另有說明，方法如實(shí)施例l所述。在15個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)之前，用AN1792的USPeptideslot12和CaliforniaPeptideslotME0339制備六次免疫給藥的抗原。在15到18個(gè)月之間用CaliforniaPeptideslotME0339和ME0439進(jìn)行另外三次給藥免疫。用于免疫時(shí)，200nlPBS中的100嗎AN1792或者單獨(dú)的PBS，按照l:l(體積體積)的比例，用完全弗氏佐劑(CFA)或不完全弗氏佐劑(IFA)或PBS乳化，至終體積為400pl。用CFA作為佐劑進(jìn)行第一次免疫給藥，接著的四個(gè)劑量與IFA—起給藥，最后四個(gè)劑量與單獨(dú)PBS不加佐劑給藥。在七個(gè)月的時(shí)間段內(nèi)總共進(jìn)行九次免疫，前三個(gè)劑量應(yīng)用兩周方案，隨后對(duì)于其他注射采用四周的間隔。在15月齡接受無痛處死的四個(gè)月治療組，僅接受前六次免疫。B.結(jié)果1.AN1792對(duì)于治療淀粉樣侵害的效果通過或定量圖像分析確定的AN1792對(duì)皮質(zhì)淀粉樣侵害的治療結(jié)果如圖7所示。在未處理的12月齡PDAPP小鼠組中，皮質(zhì)淀粉樣侵害的中值為0.28%，該值代表研究開始時(shí)小鼠體內(nèi)斑負(fù)荷。在18個(gè)月，在PBS-處理小鼠體內(nèi)淀粉樣侵害增長了17倍多，達(dá)到4.87%,而AN1792處理小鼠淀粉樣侵害顯著降低，僅為0.01%,明顯低于12個(gè)月的未處理組和15個(gè)月和18個(gè)月的PBS處理組。AN1792受體體內(nèi)，15個(gè)月和18個(gè)月淀粉樣侵害均顯著降低，分別為降低96%(=0.003)和降低>99%(p=0.0002)。典型地，PDAPP小鼠體內(nèi)皮質(zhì)淀粉樣沉積最早出現(xiàn)在前和夾肌后皮質(zhì)(RSC)中，在腹側(cè)方向上擴(kuò)展，累及枕葉和頂葉以及entorhinal皮質(zhì)(EC)。12月齡(大約是首次AN1792給藥的年齡)的EC中很少或沒有發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白。4個(gè)月的AN1792治療后，RSC中淀粉樣沉積物很大程度上消失了，AN1792處理完全消除了EC的進(jìn)行性累及。后一項(xiàng)觀察結(jié)果表明AN1792完全終止了通常會(huì)侵入枕葉和頂葉以及腹側(cè)皮質(zhì)的淀粉樣蛋白的擴(kuò)展，同時(shí)抑制或可能逆轉(zhuǎn)RSC中的沉積。進(jìn)一步通過已經(jīng)接受七個(gè)月治療的18個(gè)月組論證了AN1792治療PDAPP小鼠體內(nèi)發(fā)展性皮質(zhì)淀粉樣侵害的深遠(yuǎn)影響。在AN1792處理小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)淀粉樣蛋白幾乎完全消失，擴(kuò)散斑總體減少，以及緊密沉積物減少。2.與AN1792處理有關(guān)的細(xì)胞和形態(tài)學(xué)改變?cè)诘湫秃械矸蹣映练e物的腦區(qū)發(fā)現(xiàn)大群Ap陽性細(xì)胞。引人注目的是，幾個(gè)AN1792受體腦中，發(fā)現(xiàn)非常少或者沒有發(fā)現(xiàn)胞外皮質(zhì)淀粉樣斑。大多數(shù)AP免疫反應(yīng)性可能包含于具有大的小葉性和成群細(xì)胞體的細(xì)胞中。從表型上看，這些細(xì)胞類似激活的小膠質(zhì)細(xì)胞或單核細(xì)胞。它們與識(shí)別通過激活的單核細(xì)胞和小膠質(zhì)(MHCII和CDllb)表達(dá)的配體的抗體具有免疫反應(yīng)性，偶爾與血管壁或內(nèi)腔結(jié)合。用A卩和MHCII-特異性抗體標(biāo)記的相鄰切片的比較表明，這兩種抗體均可以識(shí)別這些細(xì)胞用固定條件下，細(xì)胞與識(shí)別T細(xì)胞(CD3、CD3e)或B細(xì)胞(CD45RA、CD45RB)配體或白細(xì)胞共同抗原(CD45)的抗體不具有免疫反應(yīng)性，但與識(shí)別與單核細(xì)胞交叉反應(yīng)的白涎素(CD43)的抗體發(fā)生反應(yīng)。任何PBS-處理小鼠體內(nèi)均沒有發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞。PDAPP小鼠毫無例外地在海馬鋸齒狀腦回的外分子層形成嚴(yán)重的淀粉樣沉積。沉積在穿孔通道(perforantpathway,在AD中典型地含有淀粉樣斑的亞區(qū))中形成明顯的條紋。PBS-處理小鼠體內(nèi)這些沉積物的特征性外觀類似于前面描述的未處理PDAPP小鼠體內(nèi)的特征。淀粉樣沉積由連續(xù)帶中的擴(kuò)散斑和緊密斑組成。相比較而言，在一些AN1792處理小鼠的腦中，這種模式徹底改變。海馬趾淀粉樣沉積不再含有擴(kuò)散淀粉樣蛋白，帶狀模式完全打破。實(shí)際上，出現(xiàn)了一些不常見的與抗-A(3抗體反應(yīng)的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，其中幾個(gè)出現(xiàn)在含淀粉樣蛋白的細(xì)胞中。MHCII-陽性細(xì)胞經(jīng)常在AN1792處理動(dòng)物的胞外淀粉樣蛋白附近觀察到。在幾只AN1792處理小鼠的腦中，A(3陽性細(xì)胞與淀粉樣蛋白的關(guān)系模式非常類似。這些單核細(xì)胞的分布被限制到沉積的淀粉樣蛋白附近，在沒有AP斑的其它腦區(qū)完全不存在。MHCII和MACI-標(biāo)記切片的定量圖像分析揭示了與PBS組相比AN1792處理小鼠的RSC和海馬中免疫反應(yīng)性增長趨勢(shì)，其顯示了在海馬中測(cè)定MAC1反應(yīng)性的重要性。這些結(jié)果表明，攜斑腦區(qū)淀粉樣蛋白的主動(dòng)的、由細(xì)胞介導(dǎo)的去除。3.AN1792對(duì)Ap水平的影響ELISA測(cè)定(a)皮質(zhì)水平在未處理PDAPP小鼠中，在12個(gè)月時(shí)皮質(zhì)中總AP的中值為1600ng/g，到第15個(gè)月，該值增加到8700ng/g(表2)。到18個(gè)月，該值為22000ng/g，在實(shí)驗(yàn)期間中，增加了IO倍多。PBS-處理動(dòng)物在15個(gè)月總AP為8600ng/g，到18個(gè)月增加到19000ng/g。相比較而言，AN1792處理動(dòng)物在15個(gè)月總AP(1600ng/g)比PBS免疫組低81%。在18個(gè)月將AN1792與PBS組比較時(shí)(表2)，發(fā)現(xiàn)總A(3(5200ng/g)顯著降低(p=0.0001)，比應(yīng)該出現(xiàn)的AP水平降低了72%。當(dāng)比較A(342的皮質(zhì)水平時(shí)得到類似的結(jié)果，即AN1792處理組含有很少的AP42，但在這種情況下AN1792和PBS組之間的差別在15個(gè)月(p=0.04)和18個(gè)月(p=0.0001,表2)顯著。表2:皮質(zhì)中Ap水平的中值(ng/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>(b)海馬中的水平在未處理PDAPP小鼠中，12月齡海馬中總AP的中值為15000ng/g，到15個(gè)月增加到51000ng/g，到18個(gè)月進(jìn)一步增加到81000ng/g(表3)。PBS免疫小鼠表現(xiàn)相似的值，15個(gè)月和18個(gè)月分別為40000ng/g和65000ng/g。AN1792免疫動(dòng)物表現(xiàn)較低的總A|3，具體在15個(gè)月和18個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)分別為25000ng/g和51000ng/g。18個(gè)月的AN1792處理組的值顯著低于PBS處理組的值(p=0.0105;表3)。對(duì)AP42的測(cè)定得出同樣的結(jié)果模式，即在18個(gè)月評(píng)價(jià)時(shí)，AN1792處理組中的水平明顯低于PBS組(分別為39000ng/g對(duì)57000ng/g;p=0.0022)(表3)。表3:海馬中A(3的中值(ng/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*p=0.0105**p=0.0022(c)小腦中的水平在12個(gè)月未處理的PDAPP小鼠中，小腦中總Ap水平的中值為15ng/g(表4)。在15個(gè)月，該值增加到28ng/g，到18個(gè)月增加到35ng/g。PBS處理動(dòng)物在15個(gè)月總AP的中值為21ng/g，18個(gè)月為43ng/g。發(fā)現(xiàn)15個(gè)月的AN1792處理動(dòng)物總A卩為22ng/g，18個(gè)月的總A(3(25ng/g)顯著低于(p=0.002)相應(yīng)的PBS組(表4)。表4:小腦中AP的中值(ng/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*p=0.00184.AN1792治療對(duì)APP水平的影響APP-a和全長APP分子均含有全部或部分A(3序列，因此可能潛在地被AN1792-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答影響。在對(duì)PDAPP小鼠的數(shù)據(jù)研究中，注意到隨著神經(jīng)病理學(xué)的增加，APP水平輕微上升。皮質(zhì)中，APP-a/FL(全長)或APP-a在治療中基本上沒有變化，除了在18個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)上，AN1792處理組比PBS處理組APP-a降低了19°/。。18個(gè)月的AN1792處理組APP值與12個(gè)月和15個(gè)月未處理組和15個(gè)月PBS組的值沒有明顯差異。在所有條件下，APP值均維持在PDAPP小鼠中正常出現(xiàn)的范圍內(nèi)。5.AN1792治療對(duì)神經(jīng)變性和神經(jīng)膠質(zhì)病理學(xué)的影響與15月齡和18月齡的PBS組相比，AN1792處理小鼠前皮質(zhì)中神經(jīng)炎斑侵害顯著降低(分別為84%，p=0.03;和55%，p=0.01)(圖8)。從15月齡到18個(gè)月齡PBS組神經(jīng)炎斑侵害的中值從0.32y。增加到0.49%。與此相比，AN1792組中神經(jīng)炎斑的形成顯著降低，15個(gè)月和18個(gè)月組中神經(jīng)炎斑侵害的中值分別為0.05%和0.22%?？磥砟軌蚝芎玫啬褪蹵N1792的免疫，當(dāng)與15月齡和18月齡的PBS組相比時(shí)，AN1792處理小鼠的RSC中反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞也明顯降低，分別降低了56%(p=0.011)和39%(p=0.028)(圖9)。從15個(gè)月到18個(gè)月，PBS組中星形膠質(zhì)細(xì)胞增加百分率的中值從4.26y。增加到5.21%。AN1792處理抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞增多的進(jìn)展，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上分別為1.89%和3.2%。這表明神經(jīng)纖維網(wǎng)沒有因該清除過程而破壞。6.抗體應(yīng)答如上所述，十一月齡、雜合PDAPP小鼠(N=24)接受用弗氏佐劑乳化的100lagAN1792連續(xù)五次免疫，在第O、2、4、8、和12周腹膜內(nèi)給藥，在第16周單獨(dú)用PBS(無弗氏佐劑)進(jìn)行第六次免疫。作為陰性對(duì)照，一系列平行的24只年齡相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因小鼠接受用同樣佐劑乳化的PBS免疫，按照同樣的方案給藥。第二個(gè)劑量之后，每次免疫后三至七天內(nèi)對(duì)動(dòng)物取血。通過ELISA測(cè)定對(duì)AN1792的抗體應(yīng)答。在第二、第三和最后(第六)一個(gè)劑量之后，AN1792免疫動(dòng)物的幾何平均效價(jià)(GMT)分別約1900、7600、和45000。對(duì)照動(dòng)物中，第六次免疫之后沒有測(cè)到AP特異性抗體。約一半的動(dòng)物接受另外三個(gè)月的處理，約在20、24和27周接受免疫。每個(gè)劑量分別在單獨(dú)的PBS(無弗氏佐劑)中給藥。在這段時(shí)間內(nèi)，平均抗體效價(jià)保持不便。事實(shí)上，相應(yīng)于涵蓋從第五次到第九次注射時(shí)期的第四次到第8次取血的抗體效價(jià)保持穩(wěn)定。為了確定在AN1792處理小鼠的血清中檢測(cè)到的、免疫誘導(dǎo)的AP特異性抗體是否也與沉積的腦淀粉樣蛋白結(jié)合，將一系列來自AN1792和PBS處理小鼠的切片與小鼠IgG特異性抗體反應(yīng)。與PBS組相比，AN1792處理的腦中AP斑被內(nèi)源IgG包圍。15月齡和18月齡的這兩組中均發(fā)現(xiàn)這種差別。尤其震驚的是PBS組沒有標(biāo)記，盡管在這些小鼠中存在嚴(yán)重的淀粉樣侵害。該結(jié)果表明，用合成的AP蛋白免疫產(chǎn)生識(shí)別和結(jié)合體內(nèi)淀粉樣斑中A(3的抗體。7.細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答9只AN1792免疫和12只PBS免疫的18個(gè)月齡的PDAPP小鼠在第九次免疫之后取出脾臟。分離脾細(xì)胞，在AP40、AP42、或AJ340-1(倒序蛋白質(zhì))存在下培養(yǎng)。促分裂原伴刀豆球蛋白A作為陽性對(duì)照。用〉1.7nM蛋白質(zhì)得到最佳應(yīng)答。來自所有九只AN1792處理動(dòng)物的細(xì)胞均對(duì)Af31-40或A|31-42蛋白質(zhì)應(yīng)答而增殖，兩種蛋白質(zhì)的摻入水平相同(圖10，上圖)。對(duì)A(340-l反向蛋白質(zhì)沒有應(yīng)答。來自對(duì)照動(dòng)物的細(xì)胞對(duì)任何AP蛋白質(zhì)均沒有應(yīng)答(圖IO，下圖)。C.結(jié)論該研究結(jié)果表明對(duì)存在淀粉樣沉積物的PDAPP小鼠進(jìn)行的AN1792免疫減慢和防止進(jìn)行性淀粉樣沉積，并延緩隨之發(fā)生的衰老PDAPP小鼠腦中神經(jīng)病理學(xué)改變。用AN1792免疫基本上終止了在結(jié)構(gòu)上的發(fā)展淀粉樣蛋白，其通常會(huì)形成淀粉樣變性病。因此，AP肽的給藥在治療AD方面具有治療優(yōu)點(diǎn)。IV.Aj3片段的篩選用9種不同的APP片段和A(3免疫100只9-11月齡的PDAPP小鼠，以確定哪些表位傳送應(yīng)答。9種不同的免疫原和一種對(duì)照如上述腹膜內(nèi)注射。免疫原包括四種人A(3肽共軛物1-12、13-28、32-42、1-5(均經(jīng)半胱氨酸鍵與綿羊抗-小鼠IgG偶聯(lián));APP多肽氨基酸592-695、聚集態(tài)人A(31-40、和聚集態(tài)人A(325-35、以及聚集態(tài)嚙齒動(dòng)物A^42。聚集態(tài)A卩42和PBS用作對(duì)照。每個(gè)治療組安排IO只小鼠。如上述監(jiān)測(cè)效價(jià)，在注射4個(gè)月末，對(duì)小鼠進(jìn)行無痛致死。處死后測(cè)定組織化學(xué)、AP水平、和毒理學(xué)。A.材料和方法1.免疫原的制備偶聯(lián)AP肽的制備通過利用交聯(lián)試劑磺基-EMCS加到Ap肽上的人工半胱氨酸偶聯(lián)制備四種人A卩肽共軛物(氨基酸殘基1-5、1-12、13-28、和33-42，均共軛結(jié)合綿羊抗小鼠IgG)。用下列終氨基酸序列合成A(3肽衍生物。在每種情況下，插入的半胱氨酸殘基的位置由下劃線指出。AP13-28肽衍生物在指出的羧基端半胱氨酸之前還具有兩個(gè)甘氨酸殘基。AJ31-12肽NH2-DAEFRHDSGYEVGCOOHA(31-5肽NH2-DAEFR￡COOHAP33-42肽NH,-C-氨基-庚酸-GLMVGGVVIACOOHA(313-28肽Ac-NH-HHOKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH為了進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，將10mg綿羊抗小鼠IgG(IacksonImmunoResearchLaboratories)對(duì)10mM硼酸鈉緩沖液(pH8.5)透析過夜。然后利用AmiconCentriprep管將透析抗體濃縮到體積為2ml。將10mg磺基EMCS(N-(e馬來酰亞胺銅氧基)琥珀酰亞胺)(分子科學(xué)公司(MolecularSciencesCo.))溶解于1ml去離子水。將40倍摩爾過量的磺基-EMCS在攪拌下逐滴加入綿羊抗-小鼠IgG，然后再次攪拌溶液十分鐘。純化活性的綿羊抗-小鼠IgG，通過經(jīng)O.lMNaP04、5mMEDTA、pH6.5的溶液平衡的10ml凝膠過濾柱(PiercePresto柱，從PierceChemicals獲得)，交換除去緩沖液。收集經(jīng)280nm吸收值鑒定的含抗體的組分，稀釋到濃度約為lmg/mL，應(yīng)用1.4mg/光密度作為消光系數(shù)。將40倍摩爾過量的A卩肽溶解于20mL10mM的NaPO4(pH8.0)，除了Af333-42肽不同，將其10mg首先溶解于0.5mLDMSO，然后用10mMNaPO4緩沖液稀釋到20mL。將肽溶液分別加到lOmL活化的綿羊抗-小鼠IgG中，室溫下振搖4小時(shí)。將得到的共軛結(jié)合物用AmiconCentriprep管濃縮到體積小于10mL，然后對(duì)PBS透析，以緩沖交換緩沖液，除去游離肽。使共軛物過0.22p孔尺寸的濾器，用于除菌，然后等分成lmg的組分，-20°(:冷凍儲(chǔ)藏。利用BCA蛋白質(zhì)分析(PierceChemicals)，用馬IgG作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定共軛物的濃度。通過結(jié)合肽相對(duì)于活化綿羊抗-小鼠IgG分子量的增加證明共軛結(jié)合。A(31-5綿羊抗-小鼠共軛物是兩次共軛偶聯(lián)的集合制品，其余的為單一制品。2.聚集態(tài)AP肽的制備用人1-40(AN1528;CaliforniaPeptidesInc.,LotME0541)、人l-42(AN1792;CaliforniaPeptidesInc.,Lot0339和ME0439)、人25-35、和嚙齒動(dòng)物1-42(CaliforniaPeptidesInc.,LotME0218)的-2(TC脫水儲(chǔ)藏的凍干粉末新溶解配制一系列注射液。對(duì)于這種目的，將2mg肽加入0.9ml去離子水，旋渦攪拌，產(chǎn)生相對(duì)均一的溶液或懸浮液。所有這四種中，AN1528是這一步唯一可溶的肽。當(dāng)AN1528開始沉淀時(shí)，加入100|Lil10XPBS溶液(1XPBS:0.15MNaCl、0.01M磷酸鈉，pH7.5)。懸浮液再次旋渦振蕩，在37'C保溫過夜留待次日使用。pBx6蛋白質(zhì)的制備按照Oltersdorf等(生物化學(xué)雜志，265，4492-4497(1990))的描述，構(gòu)建了編碼pBx6的表達(dá)質(zhì)粒，pBx6是由100個(gè)氨基酸的噬菌體MS-2聚合酶N-末端前導(dǎo)序列跟隨APP的592-695氨基酸(PAPP)組成的融合蛋白質(zhì)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到E.coli中，經(jīng)啟動(dòng)子誘導(dǎo)后蛋白質(zhì)得以表達(dá)。使細(xì)菌在8M脲中胞溶，通過制備性SDSPAGE部分純化pBx6。通過Western印記，利用兔抗-pBx6多克隆抗體，鑒定含pBx6的組分，合并組分，利用AmiconCentripr印管濃縮，對(duì)PBS透析。制品的純度，經(jīng)考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE評(píng)價(jià)，約為5-10%。B.結(jié)果和討論1.研究設(shè)計(jì)從CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室和Taconic實(shí)驗(yàn)室獲得一百只雄性和雌性、九到十一月齡的雜合PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠。將小鼠分成十組，接受由不同片段的AP或APP結(jié)合弗氏佐劑的免疫。使動(dòng)物組間性別、年齡、家系和動(dòng)物來源匹配，分布盡可能地接近。免疫原包括四種來源于人序列1-5、1-12、13-28、和33-42的AP肽，分別共軛結(jié)合綿羊抗-小鼠IgG;四種聚集態(tài)A(3肽，人1-40(AN1528)、人1-42(AN1792)、人25-35、和嚙齒動(dòng)物1-42;以及含有APP氨基酸殘基592-695的、被稱為pBx6的融合多肽。第十組用PBS結(jié)合佐劑免疫，作為對(duì)照。對(duì)于每一種免疫，將溶于200jalPBS的lOO)ig各種Ap肽或者將溶于同樣體積PBS的200pgAPP衍生的pBx6或者單獨(dú)PBS用完全弗氏佐劑(CFA)按照1:1(體積體積)的比例乳化，至終體積為40(Hxl，用于第一次免疫，隨后用不完全弗氏佐劑(IFA)中的同樣量的免疫原進(jìn)行其后四個(gè)劑量的加強(qiáng)免疫，用PBS作為最后一個(gè)劑量。前三個(gè)劑量以間隔兩周的方案腹膜內(nèi)給藥免疫，然后采用間隔一個(gè)月的方案。第二個(gè)劑量之后，每次免疫開始后四到七天對(duì)動(dòng)物取血，用于測(cè)定抗體效價(jià)。最后一個(gè)劑量之后約一周無痛處死動(dòng)物。2.腦中的A(3和APP水平用各種A(3肽或APP衍生物免疫約四個(gè)月后，對(duì)鹽水灌注動(dòng)物取腦。一個(gè)半球準(zhǔn)備用于免疫組織化學(xué)分析，另一個(gè)半球用于A(3或APP水平的定量分析。為了測(cè)定各種形式的e淀粉樣肽和淀粉樣蛋白前體蛋白質(zhì)的濃度，解剖半球，在5M胍中制備海馬趾、皮層、和小腦區(qū)的勻漿。將它們稀釋，通過與ELISA中安排的一系列已知濃度的A(3肽或APP標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度相比較，定量淀粉樣蛋白或APP的水平。用PBS免疫的對(duì)照組中，海馬中總A(3濃度的中值比皮層中總AP濃度的中值高5.8倍(海馬組織的中值為24318ng/g，皮層中為4221ng/g)。對(duì)照組小腦中的中值(23.4ng/g組織)比海馬中的中值約低1000倍。這些水平類似于我們以前報(bào)道的同年齡的雜合PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠的該水平(Johnson-Woods等，1997，同上)。對(duì)于皮層，處理組子集具有顯著不同于對(duì)照組的總AP和A(31-42水平的中值(p<0.05)，如圖ll所示，這些動(dòng)物接受AN1792、嚙齒動(dòng)物AJ31-42或者A(31-5肽共軛物。與對(duì)照相比，這些處理組總Ap的中值分別降低75%、79%和61%。所有組腦皮層區(qū)AP特異性抗體的效價(jià)和Ap水平之間沒有可辨別的相關(guān)性。在海馬中，與AN1792處理相關(guān)的總A(3中值的降低(46%，p=0.0543)不象在皮層中觀察到(75%，p=0.0021)的那么顯著。然而，在海馬中降低的量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于皮層，海馬中凈降低為11186ng/g組織，而皮層中為3171ng/g組織。對(duì)于接受嚙齒動(dòng)物AP1-42或Api-5的動(dòng)物組，總八卩水平的中值分別降低36%和26%。然而，假設(shè)組中個(gè)體較少，組內(nèi)動(dòng)物之間淀粉樣肽水平高度可變，這些降低就不明顯了。測(cè)定海馬中Api-42的水平時(shí)，沒有出現(xiàn)明顯的治療誘導(dǎo)的降低。因此，基于皮層中AP侵害較小，該區(qū)中的改變是治療效果的更為靈敏的指標(biāo)。經(jīng)ELISA測(cè)定的皮層中Ap水平的改變相似，但是免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果(見下面)卻不同。也測(cè)定了小腦中的總AP，該區(qū)在AD病理學(xué)中通常不受影響。用各種AP肽或APP衍生物免疫的所有組的Ap濃度的中值均與腦中該區(qū)的對(duì)照組沒有差別。該結(jié)果表明處理沒有影響AP的非病理水平。還通過ELISA測(cè)定了治療和對(duì)照小鼠皮層和小腦中的APP濃度。應(yīng)用兩種不同方法分析APP。其一，指定的APP-a/FL，識(shí)別兩種APP-a(a，APP的分泌型，其在A(3序列中被酶切)，以及APP的全長型(FL)，而第二種僅識(shí)別APP-a。在治療組子集中，與治療相關(guān)的A(3的降低相比，所有治療動(dòng)物的APP水平?jīng)]有相對(duì)于對(duì)照動(dòng)物改變。這些結(jié)果表明Ap肽的免疫沒有耗盡APP;治療作用對(duì)AP更專屬?？傊?，通過AN1792、嚙齒動(dòng)物Aj31-42或Api-5共軛物的治療，皮層中總AP和AP1-42的水平顯著降低。海馬中，僅AN1792治療組總AP降低顯著。在海馬趾、皮層或小腦區(qū)中，AP或APP水平?jīng)]有其它顯著的治療相關(guān)性改變。2.組織化學(xué)分析取來自六組動(dòng)物的腦用于免疫組織化學(xué)分析，三組用A(3肽共軛物Apl-5、Api-12、和Api3-28免疫；兩組用全長Ap聚集物AN1792和AN1528免疫，另一組用PBS處理作為對(duì)照組。來自這些組腦切片的淀粉樣侵害圖像分析結(jié)果如圖12所示。三組治療組比對(duì)照動(dòng)物皮層區(qū)中淀粉樣侵害顯著減少。在接受AN1792的組中觀察到淀粉樣侵害最大程度的降低，平均值降低了97%(p-O.OOl)。用AN1528和A卩l(xiāng)-5肽共軛物治療的動(dòng)物也觀察到顯著降低，分別降低95%(p=0.005)和67%(p=0.02)。通過ELISA定量測(cè)定總Ap或Apl-42得到的結(jié)果和通過圖像分析得到的淀粉樣侵害某種程度上不同。當(dāng)定量圖像分析測(cè)定時(shí)，AN1528處理對(duì)皮層淀粉樣侵害水平影響顯著，而當(dāng)ELISA測(cè)定時(shí)，該區(qū)種總Ap的濃度卻沒有被顯著影響。這兩種結(jié)果的差異可能因?yàn)榉治龅奶禺愋詫?dǎo)致。圖像分析僅測(cè)定聚集成斑的不溶性AP。相比較而言，ELISA測(cè)定所有形式的AP，包括可溶的和不溶的，單體和聚集體。既然認(rèn)為該病的病理與Ap的不溶斑相關(guān)型有關(guān)，圖像分析技術(shù)顯示治療效果可能更靈敏。然而，因?yàn)镋LISA更快速和容易分析，作為篩選目的它非常有效。而且，它可以顯示結(jié)合斑型比總Ap的治療相關(guān)性AP降低更大。為了確定治療動(dòng)物中免疫誘導(dǎo)的AP特異性抗體是否與沉積的腦淀粉樣蛋白反應(yīng)，將來自治療動(dòng)物和對(duì)照小鼠的一系列切片與小鼠IgG特異性抗體反應(yīng)。與PBS組相比，用A(3肽共軛物Api-5、A(31-12、和A(313-28和全長AP聚集物AN1792和AN1528免疫的動(dòng)物含Ap的斑被內(nèi)源IgG包圍。用其它A(3肽或APP肽pBx6免疫的動(dòng)物的腦沒有用該方法分析。3.抗體效價(jià)的測(cè)定第二次免疫之后，每次免疫開始后四到七天對(duì)小鼠取血，共取血五次。利用夾心ELISA，用A(31-42涂布的塑料多孔平板，測(cè)定作為A(31-42結(jié)合抗體的抗體效價(jià)。如圖13所示，對(duì)于誘導(dǎo)AN1792特異性抗體最高效價(jià)的四種疫苗AN1792，(峰GMT:94647);AN1528,(峰GMT:88231);A(31-12共軛物，(峰GMT:47216);和嚙齒動(dòng)物Api-42，(峰GMT:10766)，第四個(gè)劑量之后誘導(dǎo)抗體的效價(jià)達(dá)到峰位。這些組的效價(jià)在第五和第六個(gè)劑量之后有點(diǎn)衰減。對(duì)于其它五種免疫原，第五或第六個(gè)劑量之后達(dá)到峰效價(jià)，但它們的量比四種最高效價(jià)組低很多A(31-5共軛物(峰GMT:2356)、pBx6(峰GMT:1986)、Apl3-28共軛物(峰GMT:1183)、A(333-42共軛物(峰GMT:658)、AJ325-35(峰GMT:125)。還利用同樣的ELISA夾心模式測(cè)定了一系列免疫原(那些組用Api-5、A(313-28、A|325-35、A卩33-42或嚙齒動(dòng)物Aj31-42免疫)對(duì)同源肽的抗體效價(jià)，這些效價(jià)與對(duì)AP1-42測(cè)得的效價(jià)基本上相同，除了嚙齒動(dòng)物Apl-42為免疫原的情況下的抗體效價(jià)對(duì)同源免疫原約高兩倍。個(gè)體動(dòng)物的AN1792特異性抗體效價(jià)的量或治療組的平均值與由皮層中A(3降低測(cè)定的功效沒有相關(guān)性。4.淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)利用最后一次即第六次免疫之后約一周取到的脾細(xì)胞測(cè)定了A(3依賴性淋巴細(xì)胞增殖。在存在用于刺激的、濃度為5nM的AP1-40的條件下，以每孔105的量培養(yǎng)新鮮收獲的細(xì)胞。還在存在反向肽Ap40-1的條件下培養(yǎng)來自十組中七組的細(xì)胞。作為陽性對(duì)照，另外的細(xì)胞與T細(xì)胞促分裂原，PHA—起培養(yǎng)；作為陰性對(duì)照，細(xì)胞在不加肽下培養(yǎng)。來自大多數(shù)動(dòng)物的淋巴細(xì)胞對(duì)PHA反應(yīng)而增殖。對(duì)A(340-l反向肽沒有明顯的反應(yīng)。當(dāng)用AN1792受試者體內(nèi)最高cpm的A(31-40刺激時(shí)，來自較大的聚集態(tài)A(3肽、AN1792、嚙齒動(dòng)物A(31-42和AN1528免疫動(dòng)物的細(xì)胞增殖劇烈。用AP1-12共軛物、A(313-28共軛物和Af325-35免疫的各組中有一只動(dòng)物對(duì)A(31-40應(yīng)答增殖。接受A(31-5共軛物、A卩33-42共軛物、pBx6或PBS的其余組沒有動(dòng)物對(duì)A(3刺激應(yīng)答。結(jié)果如下表5概述。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>這些結(jié)果表明，AN1792強(qiáng)烈刺激T細(xì)胞(更可能是CD4+表型)應(yīng)答。用A(31-5免疫動(dòng)物的體內(nèi)缺乏AP特異性T細(xì)胞應(yīng)答并不奇怪，因?yàn)镃D4+T細(xì)胞識(shí)別的肽表位通常約15個(gè)氨基酸長度，當(dāng)然較短的肽有時(shí)也具有較低效果的功能。因此，四種結(jié)合肽的大量輔助T-細(xì)胞表位可能出現(xiàn)在IgG結(jié)合模式中，但不在AP區(qū)。上述每種治療組中動(dòng)物的增殖性應(yīng)答的幾率非常低，支持了該假設(shè)。既然AJ31-5共軛物對(duì)于顯著降低明顯缺乏AP特異性T細(xì)胞的腦中的A(3水平非常有效，通過這種肽免疫而誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的關(guān)鍵效應(yīng)物可能是抗體。對(duì)于包括所有A(3殘基、含APP氨基酸592-695的融合肽pBx6，缺乏T細(xì)胞應(yīng)答，且抗體應(yīng)答較低，可能因?yàn)檫@種特殊制品免疫原性較低。A(325-35聚集物的低免疫原性可能因?yàn)樵撾奶《赡懿缓o助誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的良好的T細(xì)胞表位。如果將該肽與載體蛋白質(zhì)結(jié)合，它將可能有更好的免疫原性。V.用于被動(dòng)保護(hù)的多克隆抗體的制備20只非轉(zhuǎn)基因小鼠用AP或其它免疫原免疫，任選添加佐劑，到第4-5月無痛處死小鼠。對(duì)免疫小鼠采血。任選將IgG與其它血液成分分離。可以通過親合層析部分純化特異于該免疫原的抗體。每只小鼠得到平均約0.5-1mg的免疫原特異性抗體，總量5-10rng。VI.用A(3抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫如下所示，對(duì)7-9月齡PDAPP小鼠組中的每一只注射0.5mg多克隆抗-AP抗體或特異性抗-AP單克隆抗體的PBS液。純化所有抗體制劑，使其具有較低的內(nèi)毒素水平?？梢酝ㄟ^將A(3片段或長型注射到小鼠體內(nèi)，制備雜交瘤、篩選特異性結(jié)合Af3目的片段而不結(jié)合其它Af3非重疊片段的抗體的雜交瘤，制備針對(duì)該片段的單克隆抗體。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>在4個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，按照需要對(duì)小鼠腹膜內(nèi)注射，以維持通過ELISA效價(jià)測(cè)定的高于1/1000(通過ELISA對(duì)A|342或其它免疫原確定)的循環(huán)抗體濃度。如上述監(jiān)測(cè)效價(jià)，在注射的四個(gè)月末無痛處死小鼠。處死后，研究組織化學(xué)、A(3水平和毒理學(xué)。每組安排十只小鼠。VII.不同佐劑的比較該實(shí)施例比較了CFA、明礬、水包油型乳劑和MPL刺激免疫應(yīng)答的能力。A.材料和方法1.研究方案設(shè)計(jì)將從ElmHill得到的100只雌性Hartley系六周齡豚鼠分成10組，用AN1792或其棕櫚?；苌锝Y(jié)合各種佐劑免疫。七組接受AN1792(33|ig，除非另有說明)結(jié)合a)PBS，b)弗氏佐劑，c)MPL，d)角鯊烯，e)MPL/角鯊烯，f)低劑量的明礬，或g)高劑量的明礬(300貼AN1792)的注射。兩組接受AN1792棕櫚酰化衍生物(33pg)結(jié)合a)PBS或b)角鯊烯的注射。最后一組，即第十組接受單獨(dú)PBS(無抗原或其它佐劑)的注射。對(duì)于接受弗氏佐劑的組，第一個(gè)劑量用CFA乳化，其余四個(gè)劑量用IFA乳化。除了高劑量明礬組接受300|_igAN1792,其它各組以33pg的劑量給藥抗原。對(duì)于CFA/IFA，腹膜內(nèi)注射給藥，對(duì)于其它各組，在后肢四頭肌左側(cè)和右側(cè)交替肌肉內(nèi)注射給藥。前三個(gè)劑量以兩周間隔方案給藥，隨后兩個(gè)劑量以每月間隔給藥。從第二個(gè)劑量之后開始，每次免疫后六到七天取血，用于測(cè)定抗體效價(jià)。2.免疫原的制備將2mgAP42(CaliforniaPeptide,LotME0339)加入0.9ml去離子水，旋渦振蕩混合物，產(chǎn)生相對(duì)均一的混懸液。加入100pl10XPBS(1XPBS，0.15MNaCl，0.01M磷酸鈉，pH7.5)?；鞈乙涸俅涡郎u振蕩，37'C保溫過夜留待次日使用。將不用的AJ31-42脫水成為凍干粉末，于-2(TC儲(chǔ)存。通過在二甲基甲酰胺液中，將棕櫚酸酐偶聯(lián)到AN1792的氨基末段殘基上，然后從氫氟酸處理的樹脂上提取新生肽，制備AN1792的棕櫚?；苌铩榱酥苽渑c完全弗氏佐劑(CFA)結(jié)合的疫苗制劑(組2)，將20(Hil中的33(igAN1792用CFA按照1:1(體積體積)的比例乳化至終體積為400(al，用于第一次免疫。對(duì)于隨后幾次免疫，用不完全弗氏佐劑(IFA)進(jìn)行類似乳化。為了制備第5組和第8組的結(jié)合MPL的疫苗制劑，將凍干粉末(RibiImmunoChemResearch,Inc.,Hamilton,MT)加入0.2%的三乙胺水溶液，至終濃度為lmg/ml，然后旋渦振蕩。加熱到將混合物加熱到65-7(TC保溫30秒，以制備輕微渾濁的均勻的膠束懸浮液。新鮮配制用于一系列注射的溶液。對(duì)于第5組的各次注射，將16.5^PBS、50pgMPL(50(^1)和162|idPBS中的33pgAN1792在硼硅酸鹽試管中混合后立即使用。為了制備與低水包油型乳劑形成的疫苗制劑，將AN1792的PBS液加入含5%角鯊烯、0.5%吐溫80、0.5%Span85的PBS液，至終單劑量濃度為250pl液體中33pgAN1792(第6組)。將混合物過兩倉手動(dòng)裝置乳化15到20次，直到顯微鏡下觀察可見乳滴直徑基本上等于l.Onm直徑的標(biāo)準(zhǔn)乳珠。得到的混懸液為牛奶狀乳白色。新鮮配制用于一系列注射的乳劑。對(duì)于第8組，將0.2%三甲胺中的MPL以每劑量50pg的濃度加入角鯊烯和去污劑混合物，用于進(jìn)行如上述的乳化。對(duì)于棕櫚酰衍生物(第7組)，將每劑量33pg棕櫚酰-NH-A(31-42加入角鯊烯，然后旋渦振蕩。然后在旋渦振蕩下，加入吐溫80和Span85。將該混合物加入PBS，至終濃度為5%角鯊烯、0.5%吐溫80、0.5%Span85，將混合物如上述乳化。為了制備結(jié)合明礬的疫苗制劑(第9組和第10組)，將AN1792的PBS液加入含鋁水凝膠(氫氧化鋁凝膠，Accurate,Westbury,NY)，達(dá)到250|xl終制劑體積中每5mg明礬33嗎(低劑量，第9組)或300pg(高劑量，第IO組)AN1792的濃度。混懸液在室溫下溫和混合4小時(shí)。3.抗體效價(jià)的測(cè)定從第二次免疫開始后，每次免疫后六到七天對(duì)豚鼠取血，總共取血四次。通過一般材料和方法中描述的ELISA測(cè)定抗A(342的抗體效價(jià)。4.組織制備約14周后，對(duì)所有豚鼠使用C02。收集腦脊液，取出腦，解剖三個(gè)腦區(qū)(海馬、皮層和小腦)，用于利用ELISA測(cè)定總A(3蛋白質(zhì)的濃度。B.結(jié)論1.抗體應(yīng)答當(dāng)測(cè)定免疫后對(duì)AN1792的抗體應(yīng)答時(shí)，各種佐劑產(chǎn)生效力范圍變化較大。如圖14所示，當(dāng)在PBS中給藥AN1792時(shí)，二或三次免疫后沒有檢測(cè)到抗體，第四和第五個(gè)劑量后檢測(cè)到的應(yīng)答可忽略不計(jì)，幾何平均效價(jià)(GMT)僅約為45。水包油型(o/w)乳劑第三個(gè)劑量后誘導(dǎo)中度效價(jià)(GMT255)，第四個(gè)劑量后該值維持(GMT301)，最后一個(gè)劑量后衰減(GMT54)。對(duì)于結(jié)合明礬的AN1792存在明顯的抗原劑量應(yīng)答，在所有時(shí)間點(diǎn)上300pg的抗原比33pg的抗原具有更好的免疫原性。在抗體應(yīng)答的峰位，即第四次免疫后，兩個(gè)劑量之間GMT的差異為43%，為1940(33ug)和3400(300ng)。對(duì)33貼AN1792加MPL產(chǎn)生的抗體應(yīng)答非常類似于劑量幾乎高出十倍的抗原(300ug)結(jié)合明礬產(chǎn)生的抗體應(yīng)答。將MPL加入o/w乳劑相對(duì)于MPL作為單獨(dú)佐劑使疫苗的效力降低近75%。AN1792的棕櫚酰衍生物在PBS中給藥時(shí)，完全沒有免疫原性，當(dāng)在o/w型乳劑中給藥時(shí)，在第三次和第四次取血時(shí)得到中度效價(jià)，GMT分別為340和105。用弗氏佐劑產(chǎn)生最高抗體效價(jià)，峰GMT約為87000，該值比其次兩個(gè)最有效疫苗(MPL和高劑量AN1792/明礬)的GMT高出近30倍。經(jīng)該研究鑒定的最值得推薦的佐劑是MPL和明礬。對(duì)于這兩種，MPL看起來更為優(yōu)選，因?yàn)樗恍枰?0倍的抗原劑量即可產(chǎn)生用明礬得到的相同的抗體應(yīng)答?？梢酝ㄟ^增加抗原和/或佐劑劑量，和通過優(yōu)化免疫方案促進(jìn)應(yīng)答。對(duì)于AN1792，0/w型乳劑是一種非常差的佐劑，將o/w型乳劑加入MPL佐劑削弱了單獨(dú)MPL的固有佐劑活性。2.腦中的AP水平在大約14周時(shí)，使豚鼠深度麻醉，提取腦脊液(CSF)，切下以下各組動(dòng)物的腦，它們是用弗氏佐劑(第2組)、MPL(第5組)、明礬與高劑量(300ug)AN1792(第10組)免疫的組和PBS免疫的對(duì)照組(第3組)。為了測(cè)定AP肽的水平，解剖一個(gè)大腦半球，在5M胍中制備海馬趾、皮層、和小腦區(qū)的勻漿。將它們稀釋，然后通過與ELISA模式中已知濃度的A(3標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的一系列稀釋度相比較對(duì)它們定量。所有四組的海馬、皮層和小腦中AP蛋白質(zhì)的水平都非常接近，盡管由這些疫苗誘導(dǎo)的對(duì)AP的抗體應(yīng)答的范圍非常寬。海馬中測(cè)定的平均A(3水平約為25ng/g組織，皮層中為21ng/g,小腦中為12ng/g。因此，在某些動(dòng)物中出現(xiàn)的近三個(gè)月對(duì)AP的高循環(huán)抗體效價(jià)沒有改變它們腦中的總AP水平。各組之間，CSF中的A(3水平也非常接近。AN1792免疫對(duì)內(nèi)源性AP缺乏巨大影響表明免疫應(yīng)答集中在A(3的病理學(xué)形成上。VIII.小鼠體內(nèi)對(duì)不同佐劑的免疫應(yīng)答用六周齡雌性瑞士Webster小鼠進(jìn)行該研究，每組10-13只動(dòng)物。在第0、14、28、60、90和20天皮下給藥進(jìn)行免疫，制劑體積為200fil。用PBS作為所有制劑的緩沖液。從第二個(gè)劑量開始后，每次免疫后7天對(duì)動(dòng)物取血，用于通過ELISA分析抗體效價(jià)。各組的治療方案如表7概述。表7丁氫萘心定研究010的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>角標(biāo)a實(shí)驗(yàn)開始時(shí)各組中小鼠的個(gè)數(shù)b表明佐劑。所有這些制劑的緩沖液均為PBS。對(duì)于第8組，沒有佐劑也沒有抗原。各組中針對(duì)A(3的抗體ELISA效價(jià)顯示于下表8中。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>該表顯示第4、5和18組得到最高效價(jià)，其中佐劑分別是125pgMPL，50ngMPL禾口QS21力口MPL。IX.不同佐劑的治療效果在PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠中，研究了一系列適合人類應(yīng)用的佐劑的治療效果，以確定它們?cè)鰪?qiáng)對(duì)A(3免疫應(yīng)答的能力和誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)的淀粉樣沉積物在腦中清除的能力。從CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室得到180只雄性和雌性7.5到8.5月齡的雜合PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠。將小鼠分成9組，每組含動(dòng)物15-23只，用AN1792或AN1528結(jié)合各種佐劑免疫。分配動(dòng)物時(shí)，使各組之間動(dòng)物的性別、年齡、和動(dòng)物家系盡可能匹配。佐劑包括明礬、MPL、和QS21，分別與兩種抗原混合，弗氏佐劑(FA)僅與AN1792組合。其它組用加有防腐劑硫柳汞的PBS緩沖液配制的AN1792不加佐劑免疫。第9組用單獨(dú)PBS免疫，作為陰性對(duì)照。聚集態(tài)AP肽的制備用人A(31-40(AN1528;CaliforniaPeptidesInc.,Napa,CA;LotME0541)和人Api-42(AN1792;CaliforniaPeptidesInc.,LotME0439)肽的脫水儲(chǔ)藏于-2(TC的凍干粉末新溶解配制一系列注射制劑。對(duì)于這種目的，將2mg肽加入0.9ml去離子水，旋渦振蕩，產(chǎn)生相對(duì)均一的溶液或懸浮液。與AN1792相比，AN1528在該步驟中是可溶的。當(dāng)AN1528開始沉淀時(shí)，加入100pl10XPBS溶液(IXPBS:0.15MNaCl、0.01M磷酸鈉，pH7.5)。懸浮液再次旋渦振蕩，在37°C保溫過夜留待次日使用。為了制備結(jié)合明砜的疫苗制劑(第1組和第5組)，將PBS中的Af3肽加入含鋁水凝膠中(Amydrogel，2%氫氧化鋁凝膠水溶液，Sargeant,Inc.,Clifton,NJ)，至每1mg明礬100|igAf3肽的濃度。加入10XPBS溶液至終制劑體積為1XPBS液200W。然后將混懸液在室溫下溫和混合約4小時(shí)，以便注射。為了制備結(jié)合MPL的疫苗制劑(第2組和第6組)，將凍干粉末(RibiImmunoChemResearch,Inc.,Hamilton,MT;Lot67039-E0896B)加入0.2%的三乙胺水溶液，至終濃度為1mg/ml，然后旋渦振蕩。將混合物加熱到65-70'C保溫30秒，以制備輕微渾濁的均勻的膠束懸浮液。該溶液在4'C儲(chǔ)藏。用于每組注射，將每劑量5(HilPBS中l(wèi)OOpg的肽、每劑量50pg的MPL(50jil)和每劑量lOOpl的PBS在硼硅酸鹽試管中混合后立即使用。為了制備結(jié)合QS21的疫苗制劑(第3組和第7組)，將凍干粉末(Aquila,Framingham,MA;LotA7018R)加入PBS(pH6.6-6.7)，至終濃度為1mg/ml，然后旋渦振蕩。將溶液在-20'C儲(chǔ)藏。用于每次注射時(shí)，將50|ilPBS中每劑量lOOpg的肽、25filPBS中每劑量25ng的QS21和每劑量125|il的PBS在硼硅酸鹽試管中混合后立即使用。為了制備與弗氏佐劑(CFA)結(jié)合的疫苗制劑(組4)，將200pl中的IOO貼AN1792用完全弗氏佐劑(CFA)按照1:1(體積體積)的比例乳化，終體積為40(^1，用于第一次免疫。對(duì)于隨后幾次免疫，用不完全弗氏佐劑(IFA)對(duì)抗原進(jìn)行類似乳化。對(duì)于含有佐劑明礬、MPL或QS21的疫苗，將每劑量lOOng的AN1792或AN1528與明磯(每劑量1mg)或MPL(每劑量50貼)或QS21(每劑量25|ag)混合，在PBS中至終體積為200fi1，在后背肩胛骨之間皮下接種給藥。對(duì)于接受FA的組，將lOO(ig的AN1792用完全弗氏佐劑(CFA)按照1:1(體積體積)的比例乳化，終體積為400W，腹膜內(nèi)給藥，作為第一次免疫，隨后用同樣量的免疫原在不完全弗氏佐劑(IFA)中進(jìn)行其后五個(gè)劑量的加強(qiáng)免疫。對(duì)于接受不含佐劑的AN1792治療的組來說，將lO^igAN1792與5|ig硫柳汞混合，在PBS中終體積為50(il，皮下給藥。第九組即對(duì)照組僅接受200plPBS皮下給藥。在第0、16、28、56、85和112天上，對(duì)前三個(gè)劑量采用兩周間隔方案進(jìn)行免疫，之后以一月間隔方案免疫。第二個(gè)劑量開始后，每次免疫后六到七天對(duì)動(dòng)物取血，用于測(cè)定抗體效價(jià)。最后一個(gè)劑量后約一周，無痛處死小鼠。通過腦中AP和APP水平的ELISA分析，以及通過腦區(qū)中存在的淀粉樣斑的免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)，測(cè)定結(jié)果。另外，確定AP特異性抗體效價(jià)、和Ap-依賴性增殖應(yīng)答和細(xì)胞因子應(yīng)答。表9表明，F(xiàn)A和AN1792誘導(dǎo)出對(duì)AI31-42的最高抗體效價(jià)，第四次免疫之后達(dá)到峰效價(jià)(峰GMT:75386)，最后一次免疫，即第六次免疫后，衰減了59%。由MPL和AN1792誘導(dǎo)的峰平均效價(jià)(峰GMT:28867)比與FA產(chǎn)生的峰平均效價(jià)低62%，并且也在免疫方案中很早(3個(gè)劑量之后)達(dá)到峰效價(jià)，之后到第六次免疫后，峰值衰減了28%。由QS21和AN1792產(chǎn)生的峰平均效價(jià)(GMT:1511)比用MPL得到的效價(jià)約低5倍。另外，應(yīng)答動(dòng)力學(xué)較慢，因此需要再一次免疫以達(dá)到峰應(yīng)答。由明砜-結(jié)合AN1792產(chǎn)生的效價(jià)略高于用QS21得到的效價(jià)，應(yīng)答動(dòng)力學(xué)也較QS21的迅速。對(duì)于在加有硫柳汞的PBS中給藥的AN1792，效價(jià)的頻率和大小僅高于PBS單獨(dú)處理組。MPL和AN1528產(chǎn)生的峰效價(jià)(峰GMT3099)比用AN1792產(chǎn)生的約低9倍。結(jié)合明礬的AN1528免疫原性非常低，僅在一些動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生較低效價(jià)。用單獨(dú)PBS免疫的對(duì)照動(dòng)物體內(nèi)沒有觀察到抗體應(yīng)答。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>角標(biāo)a測(cè)定對(duì)AP1-42的幾何平均抗體效價(jià)b每組應(yīng)答者的數(shù)目通過ELISA測(cè)定的，AN1792或AN1528結(jié)合各種佐劑、或者硫柳汞治療12月齡小鼠皮層淀粉樣侵害的治療結(jié)果如圖15所示。在PBS對(duì)照PDAPP小鼠中，12個(gè)月時(shí)，皮層中總AP的水平中值為1817ng/g。在用AN1792加CFA/IFA、AN1792加明礬、AN1792加MPL、和QS21加AN1792處理的小鼠中觀察到A(3水平顯著降低。僅AN1792加CFA/IFA的降低達(dá)到滿意的顯著度(P<0.05)。然而，如實(shí)施例I和III所示，在降低A(3水平方面的免疫效果在15月齡和18月齡小鼠中基本上較大。因此，期望AN1792加明礬、AN1792加MPL、AN1792加QS21組合物至少在治療年齡較大小鼠時(shí)將獲得滿意的顯著度。相反，AN1792加防腐劑硫柳汞顯示，Ap的中值與PBS治療小鼠基本上相同。當(dāng)比較皮層AP42的水平時(shí)，得到類似的結(jié)果。PBS對(duì)照組中A(342的中值為1624ng/g。用AN1792加CFA/IFA、AN1792加明礬、AN1792加MPL、AN1792加QS1處理小鼠中觀察到顯著降低的中值，分別為403、1149、620和714，AN1792CFA/IFA處理組的降低獲得滿意的顯著度(p=0.05)。AN1792硫柳汞處理小鼠中Ap42的中值為1619ng/g。X.毒性分析在實(shí)施例2、3和7描述的研究的末期，收集組織，用于組織病理學(xué)檢查。另外，對(duì)來自實(shí)施例3和7的末期血樣進(jìn)行血液血和臨床化學(xué)檢查。評(píng)價(jià)大多數(shù)主要器官，包括腦、肺、淋巴、胃腸道、肝、腎、腎上腺和性腺。雖然在研究動(dòng)物中觀察道偶發(fā)性損傷，但是在AN1792處理和未處理動(dòng)物之間，無論是受影響組織還是損傷嚴(yán)重性上均沒有明顯差異。AN1782免疫動(dòng)物與PBS處理或未處理動(dòng)物相比沒有特別的值得注意的組織病理學(xué)損傷。在實(shí)施例7中，佐劑組和PBS處理動(dòng)物之間臨床化學(xué)表現(xiàn)也沒有差異。雖然，實(shí)施例7中AN1792和弗氏佐劑處理動(dòng)物相對(duì)于PBS處理動(dòng)物，幾種血液學(xué)參數(shù)存在顯著增加，但是這些類型的影響是弗氏佐劑治療和伴生的腹膜炎帶來的能夠意料到的影響，它們不能說明AN1792治療帶來任何不利作用。雖然不是部分毒理學(xué)評(píng)價(jià)，但廣泛地檢查了PDAPP小鼠的腦部病理作為部分功效端點(diǎn)。在所有研究中沒有發(fā)現(xiàn)與治療有關(guān)的腦病理學(xué)不良影響的跡象。這些結(jié)果表明AN1792治療可以很好地耐受，至少基本上沒有副作用。XI.對(duì)受試者的預(yù)防和治療進(jìn)行單劑量相I試驗(yàn)確定安全性。以逐步增加的劑量對(duì)不同患者給予治療藥物，從約O.Ol(推測(cè)功效的水平)開始，以3為系數(shù)增長，直到達(dá)到IO倍有效小鼠劑量的水平。進(jìn)行相II試驗(yàn)確定治療功效。挑選利用阿爾茨海默氏病和相關(guān)病癥協(xié)會(huì)(ADRDA)為可能發(fā)生的AD制定的標(biāo)準(zhǔn)確定的早期患中度阿爾茨海默氏病的患者。按照微小精神狀況檢査(Mini-MentalStateExam，MMSE)，合適的患者積分在12-26范圍內(nèi)。其它選擇標(biāo)準(zhǔn)是，患者在研究期間容易存活，以及不會(huì)出現(xiàn)復(fù)雜問題，例如可能帶來干擾的伴隨藥物的使用。利用典型心理測(cè)量法(例如MMSE、ADAS，它們對(duì)于評(píng)價(jià)阿爾茨海默氏病的狀況和功能是一種內(nèi)容詳盡的標(biāo)尺)對(duì)患者功能作基線評(píng)價(jià)。這些心理測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)能夠測(cè)量阿爾茨海默氏病的發(fā)展。合適的定性生命標(biāo)準(zhǔn)也可以用來監(jiān)測(cè)治療。還可以通過MRI監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展。也可以監(jiān)測(cè)患者的血液數(shù)據(jù)，包括分析免疫原特異性抗體和T細(xì)胞應(yīng)答。測(cè)定基線后，患者開始接受治療。將它們完全打亂，以雙盲方式用治療藥物或安慰劑治療。至少每六個(gè)月監(jiān)測(cè)患者一次。通過進(jìn)展中治療組相對(duì)于安慰劑組有效降低確定效果。進(jìn)行第二次相II試驗(yàn)，評(píng)價(jià)患者從非阿爾茨海默氏病的早期記憶丟失(有時(shí)被稱為年齡有關(guān)的記憶損傷(AAMI))到經(jīng)ADRDA標(biāo)準(zhǔn)確定為可能的阿爾茨海默氏病的改變。通過篩選參照群體的記憶丟失早期跡象或其它與前阿爾茨海默氏病癥候?qū)W、阿爾茨海默氏病的家族史、遺傳危險(xiǎn)因素、年齡、性別和已發(fā)現(xiàn)的其它預(yù)示阿爾茨海默氏病高危特征有關(guān)的不利，從非臨床群體選擇具有轉(zhuǎn)化成阿爾茨海默氏病高風(fēng)險(xiǎn)的患者。收集基于包括MMSE和ADAS的合適法則和其它設(shè)計(jì)用來評(píng)價(jià)較為正常群體法則的基線積分。將這些患者群體分成合適的安慰劑對(duì)交替劑量藥物組。間隔六個(gè)月后，對(duì)這些患者群體進(jìn)行跟蹤，每個(gè)患者的端點(diǎn)是到觀察結(jié)束時(shí)他或她是否轉(zhuǎn)化成可能的阿爾茨海默氏病(按照ADRDA標(biāo)準(zhǔn)判斷)。XII.—般材料和方法1.抗體效價(jià)的測(cè)定.在小鼠尾靜脈切開小口取血，采集約200^1血置于微量離心管(microfugetube)。豚鼠如下取血，首先剃去后腿背面的毛，然后用18號(hào)針頭劃破跖骨靜脈，采血于微量離心管。室溫下(RT)靜置1小時(shí)使血液凝結(jié)成塊，旋渦振蕩，然后在14000Xg離心10分鐘，將血塊從血清中分離出來。然后將血清轉(zhuǎn)移到干凈的微量離心管中，4'C儲(chǔ)存直到測(cè)定效價(jià)。用ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。在Well涂層緩沖液(WellCoatingBuffer)(0.1M磷酸鈉，pH8.5，0.1%疊氮化鈉)中含有10ng/mlA(342或SAPP或其它抗原(如各單獨(dú)報(bào)道記錄)的100pl溶液涂布96孔微滴定平板(CostarEIA平板)，室溫過夜。吸千各孔，從1/100稀釋度的樣品稀釋液(0.014M磷酸鈉、pH7.4、0.15MNaCl、0.6%牛血清白蛋白、0.05%硫柳汞)開始向孔中加入血清。以三倍的跨度制備七個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品，置于平板中，終稀釋度為1/218700。稀釋液在經(jīng)涂布的平板的孔中室溫保溫1小時(shí)。然后用含0.05%吐溫20的PBS沖洗四次。將第二種抗體，結(jié)合辣根過氧化物酶的綿羊抗小鼠Ig(從BoehringerMannheim得到)，作為100|al1/3000稀釋度的樣品稀釋液加到孔中，室溫保溫l小時(shí)。再次用PBS、吐溫20沖洗平板四次。為了形成色原體，將100nl慢TMB(SlowTMB,3,3，,5,5，-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯，從PierceChemicals得到)加入各孔，室溫保溫15分鐘。加入25^12M硫酸終止反應(yīng)。然后在分子裝置Vmax(MolecularDevicesVmax)上記錄450nm-650nm處的光密度。效價(jià)表示為得到最大光密度一半時(shí)血清稀釋度的倒數(shù)。最大OD通常取自起始的1/100稀釋液，除非該條件下具有非常高的效價(jià)，在這種情況下，需要建立較高起始稀釋度的最大OD。如果兩種稀釋液之間下降了50%點(diǎn)位，則利用線性外推法計(jì)算最終效價(jià)。為了計(jì)算幾何平均抗體效價(jià)，低于100的效價(jià)被任意地指定效價(jià)值為25。2.淋巴細(xì)胞增殖分析用異氟烷麻醉小鼠。取出脾，用5ml含10%熱滅活胎牛血清的PBS(PBS-FBS)漂洗兩次，然后置于Medimachine(Dako)的50]uCentricon室(DakoA/S,Denmark),在1.5mlPBS-FBS中以100rpm勻漿10秒，然后經(jīng)100p孔徑的尼龍篩過濾。用15mlPBS-FBS沖洗脾細(xì)胞一次，然后在200Xg離心5分鐘沉淀。將沉淀重懸浮于5ml含0.15MNH4C1、1MKHC03、O.lMNaEDTA、pH7.4的緩沖液中室溫保持5分鐘，使紅細(xì)胞溶解。然后同上述沖洗白細(xì)胞。將新鮮分離的脾細(xì)胞(每孔105個(gè)細(xì)胞，每個(gè)樣品重復(fù)三次)置于96孔U-型底處理培養(yǎng)物微滴定平板(Corning,Cambridge,MA)中，在添加2.05mML-谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素、和10%熱滅活FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中(JRHBiosciences,Lenexa，KS)于37。C培養(yǎng)96小時(shí)。再加入5pM到0.18pM劑量范圍內(nèi)的各種Ap肽，Api-16、Api-40、A(31-42或AP40-1反向序列蛋白質(zhì)。對(duì)照孔中的細(xì)胞在伴刀豆球蛋白A(ConA)(Sigma,cat.#C-5275,濃度為lpig/ml)存在下不添加蛋白質(zhì)培養(yǎng)。向細(xì)胞中加入3H國胸苷(1(iCi/孔,從AmershamCo卬.,ArlingtonHeightsIL得到)培養(yǎng)最后24小時(shí)。然后收獲細(xì)胞置于UniFilter平板，在TopCount微平板發(fā)光計(jì)數(shù)儀(TopCountMicroplateScintillationCounter(PackardInstruments,DownersGrove，IL))上計(jì)數(shù)。結(jié)果表示為插入不溶性大分子的放射性的每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)。4.腦組織制備無痛處死后，取腦，一個(gè)大腦半球準(zhǔn)備進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，解剖另一個(gè)大腦半球的三個(gè)腦區(qū)(海馬、皮層和小腦)，用于利用特異性ELISA測(cè)定各種A(3蛋白質(zhì)和APP型的濃度。將用于ELISA的組織在10體積的冰冷胍緩沖液(5.0M胍-鹽酸，50mMTris-HCl，pH8.0)中勻漿。勻漿液利用Adams振動(dòng)器(Fisher)溫和振搖，室溫下混合三到四小時(shí)，然后于-20'C儲(chǔ)藏，留待定量AP和APP時(shí)使用。前面的試驗(yàn)已經(jīng)表明，在該儲(chǔ)藏條件下，分析物是穩(wěn)定的，當(dāng)合成的Ap蛋白(Bachem)混入同窩生小鼠的對(duì)照腦組織勻漿中時(shí)，可以定量提取(Johnson-Wood等，同上)。5.A(3水平的測(cè)定用冰冷卻的酪蛋白稀釋液(0.25%酪蛋白、PBS、0.05%疊氮化鈉、20)ig/ml抑肽酶、5mMEDTApH8.0，10ng/ml亮肽素)以1:10稀釋腦勻漿，然后在4'C，16000Xg離心20分鐘。制備合成的A(3蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(l-42氨基酸)和APP標(biāo)準(zhǔn)品，使終組合物中包括0.5M胍和0.1%牛血清白蛋白(BSA)。"總"A(3夾心ELISA利用單克隆抗體(mAp)266，特異于AP的氨基酸13-28(Seubert,等)作為捕捉抗體，生物素?；膍A(33D6，特異于Ap的氨基酸1-5(Johnson-Wood等)作為報(bào)道抗體。3D6mAp不能識(shí)別分泌型APP或全長APP，僅可檢測(cè)氨基末端為天冬氨酸的A(3類型。該分析法靈敏度下限約為50Pg/mlnPm),當(dāng)濃度高達(dá)1ng/ml時(shí)也不與內(nèi)源性鼠Aj3蛋白質(zhì)表現(xiàn)交叉反應(yīng)性(Johnson-Wood等，同上)。A|31-42特異性夾心ELISA應(yīng)用mAp21F12，特異于Af3的氨基酸33-42(Johnson-Wood等)作為捕捉抗體。該分析同樣用生物素酰化的mA卩3D6作為報(bào)道抗體，其靈敏度下限約為125Pg/ml(28Pm，Johnson-Wood等)。當(dāng)進(jìn)行ApELISA時(shí)，用lOO^ilmA(3266(10(ig/ml)或mA(321F12(5ng/ml)涂布96孔的免疫測(cè)試平板(Costar)，室溫下保溫過夜。通過吸氣除去溶液，向各孔中加入200(il0.25。/。的人血清蛋白PBS溶液，于室溫將各孔封閉至少1小時(shí)。除去封閉液，在4'C下儲(chǔ)藏干燥的平板直到使用。用沖洗緩沖液(Tris-緩沖鹽水(0.15MNaCl，0.01MTris-HCl，pH7.5)加0.05%吐溫20)在使用前使平板再水化。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入每孔100^d的三等份，然后于4'C保溫過夜。分析的每個(gè)步驟之間用沖洗緩沖液至少?zèng)_洗平板三次。加入生物素酰化的mA(33D6(用酪蛋白分析緩沖液(0.25%酪蛋白，PBS，0.05%吐溫20，pH7.4)稀釋到0.5(ig/ml),室溫下保溫1小時(shí)。將親合素-辣根過氧化物酶結(jié)合物((親合素-HRP得自Vector,Burlingame,CA)用酪蛋白分析緩沖液以1:4000的比例稀釋，)加到孔中，室溫保持1小時(shí)。加入比色物質(zhì)，慢TMB-ELISA(Pierce)，使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行15分鐘，之后，加入25nl2NH2S04終止反應(yīng)。利用分子裝置Vmax，測(cè)定450nm和650nm的吸收度差值，定量反應(yīng)產(chǎn)物。6.APP水平的測(cè)定應(yīng)用了兩種不同APP測(cè)定法。其一，特指的APP-a/FL，識(shí)別APP-a和APP的全長型(FL)。第二種分析特異于APP-ci。APP-a/FL分析法識(shí)別包括AJ3的前12個(gè)氨基酸的分泌型APP。因?yàn)閳?bào)道抗體(2H3)與a-發(fā)夾-位點(diǎn)(存在于APP695的氨基酸612-613之間，Esch等，科學(xué)，248，1122-1124(1990))不具有特異性；因此該分析也可以識(shí)別全長APP(APP-FL)。利用固定于APP-FL細(xì)胞質(zhì)末端的APP抗體消耗腦勻漿的APP-FL的初步試驗(yàn)表明，約30-40%的APP-a/FLAPP是FL(數(shù)據(jù)未顯示)。APP-a/FL和APP-a分析的捕捉抗體均為mAp8E5，對(duì)APP695型的氨基酸444-592升高(Games等，同上)。APP-a/FL分析的報(bào)道m(xù)Ap是mAp2H3，其特異于APP695的氨基酸597-608(Johnson-Wood等，同上)，APP-a分析的報(bào)道抗體是mA卩16H9的生物素?；苌铮瑢?duì)APP的氨基酸605-611升高。APP-a/FL分析的靈敏度下限約為11ng/ml(150PM)(Johnson-Wood等，同上)，APP-a特異性分析的靈敏度下限約為22ng/ml(0.3nM)。對(duì)于這兩種APP檢測(cè)，如前面mA(3266所述，將mA(38E5涂布到96孔EIA平板上。純化的重組分泌型APP-a用作APP-a分析和APP-a/FL分析的參照標(biāo)準(zhǔn)品(Esch等，同上)。5M胍中的腦勻漿樣品用ELISA樣品稀釋液(0.014M磷酸鹽緩沖液，pH7.4，0.6%牛血清白蛋白，0.05%硫柳汞，0.5MNaCl，0.1%NP40)以1:10的比例稀釋。然后用含0.5M胍的樣品稀釋液以l:4的比例稀釋它們。然后在室溫下，16000Xg離心稀釋的勻漿15秒。將APP標(biāo)準(zhǔn)品和樣品以兩等份加入平板，室溫下保溫1.5小時(shí)。將生物素酰化的報(bào)道抗體2H3或16H9與樣品一起在室溫下保溫1小時(shí)。鏈霉親和素堿性磷酸酶(BoehringerManneim)，在樣品稀釋液中稀釋1000倍，加入孔中室溫下保溫1小時(shí)。加入熒光物質(zhì)4-甲基-umbellipheryl-磷酸酯，室溫下保溫30分鐘，在Cytofluortm2350熒光讀數(shù)儀上在激發(fā)光365nm和發(fā)射光450nm下對(duì)平板讀數(shù)。7.免疫組織化學(xué)在4Q/。多聚甲醛的PBS液中于4。C固定腦三天，然后在1%多聚甲醛PBS液中于4。C儲(chǔ)存1到7天，直到被切片。在vibratome上室溫下將其切成40微米厚的冠狀切片，在防凍劑(30%甘油，30%乙二醇，在磷酸緩沖液中)中于-2(TC儲(chǔ)存直到進(jìn)行免疫組織化學(xué)處理。對(duì)于每個(gè)腦，在海馬背水平上的六個(gè)切片，連續(xù)間隔24(Vm使彼此分離，在下列之一的抗體中保溫過夜(1)生物素?；目?Ap(mAp，3D6，特異于人AP)在PBS和1%馬血清中稀釋到濃度為2pg/ml;或(2)特異于人APP，8E5的生物素?；膍A(3，在PBS和1.0%馬血清中稀釋到濃度為3(ag/ml;或(3)特異于神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白質(zhì)(GFAP;SigmaChemicalCo.)的mAp，用含0.25%TritonX-100和1%馬血清的Tris-緩沖鹽水(pH7.4)(TBS)以1:500的比例稀釋；或(4)特異于CDlib(MHC-l抗原)(ChemiconInternational)的mA|3，用0.25%TritonX-100和1。/o兔血清的TBS液以1:100的比例稀釋；或(5)特異于MHCII抗原的mAp(Pharmingen)，用含0.25%TritonX-100和1%兔血清的TBS液以1:100的比例稀釋；或(6)特異于CD43的大鼠mA(3(Pharmingen)，用含1%兔血清的PBS液以1:100的比例稀釋；或(7)特異于CD45RA的大鼠mA卩(Pharmingen)，用含P/o兔血清的PBS液以1:100的比例稀釋；或(8)特異于CD45RB的大鼠單克隆A(3(Pharmingen)，用含1%兔血清的PBS液以1:100的比例稀釋；或(9)特異于CD45的大鼠單克隆Ap(Pharmingen)，用含1%兔血清的PBS液以1:100的比例稀釋；或(10)特異于CD3e的生物素酰化多克隆倉鼠AP(Pharmingen)，用含1%兔血清的PBS液以1:100的比例稀釋；或(11)特異于CD3的大鼠mA卩(Serotec)，用含1%兔血清的PBS液以1:200的比例稀釋；或(12)含1%正常馬血清的無一級(jí)抗體的PBS溶液。與上面所列的1、2和6-12號(hào)抗體溶液反應(yīng)的切片首先用含1.0%TritonX-100，0.4%過氧化氫的PBS液在室溫下預(yù)處理20分鐘，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。接著將它們與一級(jí)抗體在4T:下保溫過夜。然后使與3D6或8E5或CD3emAp反應(yīng)的切片在室溫下與辣根過氧化物酶-親和素-生物素-復(fù)合物與用PBS稀釋75倍的試劑盒成分"A"和"B"(載體精英標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(VectorEliteStandardKit)，VectorLabs,Burlingame,CA)—起反應(yīng)1小時(shí)。與特異于CD45RA、CD45RB、CD45、CD3的抗體和無一級(jí)抗體的PBS溶液反應(yīng)的切片分別與生物素酰化的抗-大鼠IgG(Vector)(用PBS稀釋75倍)或者生物素?；目?小鼠IgG(Vector)(用PBS稀釋75倍)一起在室溫下保溫1小時(shí)。然后將切片與辣根過氧化物酶-親和素-生物素-復(fù)合物與試劑盒成分"A"和"B"(用PBS稀釋75倍)(載體精英標(biāo)準(zhǔn)試劑盒，VectorLabs，Burlingame,CA)在室溫下反應(yīng)一小時(shí)。將切片置于0.01%過氧化氫、0.05%3，3'-對(duì)二氨基聯(lián)苯(DAB)中室溫下顯影。用于與GFAP-、MAC-l-、和MHCII-特異性抗體一起保溫的切片首先用0.6%過氧化氫在室溫下預(yù)處理，一封閉內(nèi)源性過氧化物酶，然后與一級(jí)抗體在4'C下保溫過夜。與GFAP抗體反應(yīng)的切片與生物素?；鸟R體內(nèi)制備的抗-小鼠IgG(載體實(shí)驗(yàn)室(VectorLaboratories);VectastainEliteABC試劑盒)(用TBS稀釋200倍)在室溫下保溫1小時(shí)。接著將切片與親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(載體實(shí)驗(yàn)室;VectastainEliteABC試劑盒)(用TBS稀釋1000倍)反應(yīng)1小時(shí)。接著將與MAC-l-或MHCII-特異性mA(3作為一級(jí)抗體—同保溫的切片與生物素?；膩碜酝玫目?大鼠IgG(用TBS稀釋200倍)在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，隨后與親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(用TBS稀釋1000倍)保溫1小時(shí)。然后將與GFAP-、MAC-l-和MHCII-特異性抗體一同保溫的切片用0.05%DAB、0.01%過氧化氫、0.04%氯化鎳、TBS液分別處理4和ll分鐘，使它們顯色。將免疫標(biāo)記的切片在載玻片(VMR，Superfrost玻片)上制作成標(biāo)本，空氣干燥過夜，在Propar(Anatech)中浸漬，然后用Permount(Fisher)作為標(biāo)本介質(zhì)用蓋玻片覆蓋。為了復(fù)染色A(3斑，將一系列GFAP-陽性切片在免疫組織化學(xué)處理后置于Superfrost載玻片上制作成標(biāo)本，在1%硫黃素S(Sigma)水溶液中保持7分鐘。然后使切片脫水，在Propar中使其清晰，然后用Permount制作標(biāo)本加蓋玻片覆蓋。8.圖像分析通過CCD攝像機(jī)和SonyTrinitron監(jiān)測(cè)儀連接于NikonMicrophot-FX顯微鏡的圖像計(jì)150型圖像分析系統(tǒng)(Oncor,Inc.，Gaithersburg，MD)被用來定量免疫反應(yīng)切片。切片的圖像儲(chǔ)存于影象緩沖液中，確定基于顏色和飽和度的閾值以選擇和計(jì)算免疫標(biāo)記結(jié)構(gòu)物所占據(jù)的總像素面積。對(duì)于每個(gè)切片，人工描繪出海馬輪廓，計(jì)算海馬占據(jù)的總像素面積。如下測(cè)定淀粉樣侵害百分率(含與mAp3D6發(fā)生免疫反應(yīng)的A(5沉積物的海馬趾面積的分?jǐn)?shù))X100。同樣，神經(jīng)炎侵害的百分率如下測(cè)定(含與mAp8E5發(fā)生反應(yīng)的營養(yǎng)不良性神經(jīng)突的海馬趾面積的分?jǐn)?shù))X100。運(yùn)行簡單32軟件應(yīng)用程序的C-成像系統(tǒng)(Compix,Inc.,CranberryTownship,PA)通過光電子學(xué)照相機(jī)連接于NikonMicrophot-FX顯微鏡，用于定量GFAP-陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞和MAC-l-和MHCII-陽性小膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)的夾肌后皮層的百分率。免疫反應(yīng)切片的圖像儲(chǔ)存于顯影緩沖液中，確定單色閾值，以選擇和計(jì)算免疫標(biāo)記細(xì)胞占據(jù)的總像素面積。對(duì)于每個(gè)切片，手工繪制除夾肌后皮層(RSC)的輪廓，然后計(jì)算RSC占據(jù)的總像素面積。星形膠質(zhì)細(xì)胞增多百分率如下確定(GFAP-反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)的RSC的分?jǐn)?shù))X100。同樣，小膠質(zhì)細(xì)胞增多百分率如下確定(MAC-1-或MHCII-反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)的RSC的分?jǐn)?shù))xioo。對(duì)于所有的圖像分析，定量每個(gè)動(dòng)物的海馬背水平上的六個(gè)切片(彼此以連續(xù)240!iim的間隔分隔)。在所有條件下，動(dòng)物的治療狀況對(duì)于觀察者都是未知的。雖然為了便于清楚理解，如上述詳細(xì)描述了本發(fā)明，但顯然可以在附加權(quán)利要求范圍內(nèi)進(jìn)行某些改動(dòng)。本文為各種目的引證的所有出版物和專利文獻(xiàn)以其全文內(nèi)容引入，好象各自單獨(dú)全文列入本文那樣。表l50%最大光密度時(shí)的效價(jià)聚集態(tài)Ap注射的小鼠PDAPP的月齡小鼠100小鼠101小鼠102小鼠103小鼠104小鼠105小鼠106小鼠107小鼠10847000015000015000120000100015000500008000010000061500065000300005500030015000150005000060000820000550005000050000400150001800050000600001040000200006000050000900150005000020000400001225000300006000040000270020000700002500020000兩種免疫原的PBS注射小鼠效價(jià)為1/100PDAPP的月齡小鼠113小鼠114小鼠115小鼠116小鼠1176<4xbkg<4xbkg<4xbkg<4xbkg<4xbkg105xbkg<4xbkg<4xbkg<4xbkg<4xbkg12<4xbkg<4xbkg<4xbkg<4xbkg<4xbkg200710140839.5轉(zhuǎn)溢*被69/695t權(quán)利要求1.一種藥物組合物，包括特異性結(jié)合Aβ肽的人源化抗體，及藥用載體，其中所述抗體的同種型是人類IgG1。2.—種藥物組合物，包括特異性結(jié)合AP肽的人抗體，及藥用載體，其中所述抗體的同種型是人類IgGl。3.權(quán)利要求2的組合物，其中抗體是單克隆抗體。4.特異性結(jié)合AP肽的人源化抗體，在制備用于治療或預(yù)防特征在于患者體內(nèi)有淀粉樣沉積物之疾病的藥物中的用途，其中所述抗體的同種型是人類IgGl。5.特異性結(jié)合AP肽的人抗體，其中所述抗體的同種型是人類IgGl，在制備用于治療或預(yù)防特征在于患者體內(nèi)有淀粉樣沉積物之疾病的藥物中的用途。6.權(quán)利要求5的用途，其中抗體是單克隆抗體。7.權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)的用途，其中所述淀粉樣沉積物包括聚集態(tài)AP肽。8.權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)的用途，其中所述患者是人。9.權(quán)利要求4-8任一項(xiàng)的用途，其中所述疾病是阿耳茨海默氏病。10.權(quán)利要求4-9任一項(xiàng)的用途，其中所述患者年齡在50歲以下。11.權(quán)利要求4-10任一項(xiàng)的用途，其中所述患者具有顯示對(duì)阿耳茨海默氏病有易感性的遺傳危險(xiǎn)因素。12.權(quán)利要求4-ll任一項(xiàng)的用途，其中所述患者不具有已知的有關(guān)阿耳茨海默氏病的危險(xiǎn)因素。13.權(quán)利要求4-12任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物用于經(jīng)口服、皮下、肌內(nèi)、局部或靜脈內(nèi)給藥。14.權(quán)利要求13的用途，其中所述藥物用于經(jīng)靜脈內(nèi)給藥。15.權(quán)利要求4-14的用途，其中所述患者是無癥狀的，所述藥物用于預(yù)防特征在于患者體內(nèi)有淀粉樣沉積物之疾病。全文摘要本發(fā)明提供了治療致淀粉樣病的組合物和方法。該方法需要給患者使用一種誘導(dǎo)對(duì)淀粉樣沉積物產(chǎn)生有益免疫應(yīng)答的藥物。該方法在預(yù)防和治療阿耳茨海默氏病中尤其有用。在該方法中，合適的藥物是Aβ肽或其抗體。文檔編號(hào)A61P25/00GK101116746SQ200710140839公開日2008年2月6日申請(qǐng)日期1998年11月30日優(yōu)先權(quán)日1997年12月2日發(fā)明者戴爾·B·申克申請(qǐng)人:神經(jīng)實(shí)驗(yàn)室有限公司