專利名稱：致淀粉樣病的預(yù)防和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病(早老性癡呆，AD)是一種導(dǎo)致老年性癡呆的進(jìn)行性疾病。一般參見Selkoe，TINS，16，403-409(1993)；Hardy等，WO92/13069；Selkoe，J.Neuropathol.Exp.Neurol.53，438-447(1994)；Duff等，Nature，373，476-477(1995)；Games等，Nature，373，523(1995)。廣義上講，該疾病分為兩類，發(fā)生在晚年(65歲以上)的晚期發(fā)作，和老年期之前(即35-60歲)形成的早期發(fā)作。在該病的兩種類型中，病理學(xué)是相同的，但是如果在早年開始，異常可能更加嚴(yán)重且分布更廣泛。該疾病特征在于大腦的至少兩種類型的損傷，衰老斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)。通過腦組織切片的顯微分析觀察到，衰老斑是直徑達(dá)150μm、中心穿插有胞外淀粉樣沉積物的紊亂的神經(jīng)纖維網(wǎng)區(qū)域。神經(jīng)纖維纏結(jié)是含有兩根細(xì)絲(互相成對地纏繞在一起)的τ蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)沉積物。
衰老斑的主要成分是被稱為Aβ或β-淀粉樣肽的肽。Aβ肽是被稱為淀粉樣前體蛋白質(zhì)(APP)的前體蛋白質(zhì)的含39-43個氨基酸的內(nèi)部片段。阿爾茨海默病的發(fā)生與APP蛋白質(zhì)的幾種突變有關(guān)。參見，例如Goate等，Nature，349，704(1991)(纈氨酸717變?yōu)楫惲涟彼?；ChartierHarlan等，Nature，353，844(1991)(纈氨酸717變?yōu)楦拾彼?；Murrell等，Sciences，254，97(1991)(纈氨酸717變?yōu)楸奖彼?；Mullan等，Nature Genet.，1，345(1992)(賴氨酸595-甲硫氨酸596變?yōu)樘於匪?95-亮氨酸596的雙突變)。認(rèn)為該突變通過增加或改變APP到Aβ的加工，特別是使APP增量加工成為長型Aβ(即，Aβ1-42和Aβ1-43)，引起阿爾茨海默病。認(rèn)為其它基因(如早衰素(presenilin)基因，PS1和PS2)的突變，間接影響APP加工，產(chǎn)生長型Aβ的增量(參見Hardy，TINS，20，154(1997))。該觀察表明Aβ，特別是它的長型，是引起阿爾茨海默氏病的病因。
McMichael在EP 526,511中提出了對已確定為AD的患者以順勢療法劑量給藥Aβ(小于或等于10-2mg/天)。對于具有5升血漿的一般人，甚至該劑量的上限可以為產(chǎn)生不超過2pg/ml濃度的劑量。在人血漿中Aβ的正常濃度一般地在50-200pg/ml范圍內(nèi)(Seubert等，Nature，359，325-327(1992))。因為在EP 526,511中提出的劑量只是改變內(nèi)源性循環(huán)Aβ的水平，并因為在EP 526,511中沒有推薦使用佐劑，似乎產(chǎn)生的任何治療性結(jié)果都是難以置信的。
相反，本發(fā)明通過在患者體內(nèi)產(chǎn)生有益免疫應(yīng)答的條件下，對患者給藥Aβ的片段，或Aβ內(nèi)某些表位的抗體，直接在體內(nèi)治療阿爾茨海默氏病或其它致淀粉樣病。因此本發(fā)明滿足了長期存在的對預(yù)防或改善阿爾茨海默氏病之神經(jīng)病理學(xué)的治療方案的需要。
本發(fā)明與申請于1998年11月30日的WO99/27944，申請于1997年12月2日的USSN 60/067,740，申請于1998年4月7日的USSN60/080,970以及申請于1998年11月30日的USSN 09/201,430有關(guān)，為各種目的在這里全文引用作為參考。
發(fā)明簡述一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療與患者腦部Aβ的淀粉樣沉積物相關(guān)之疾病的方法。這類疾病包括阿爾茨海默氏病、唐氏先天愚癥及認(rèn)知損傷。后者的產(chǎn)生可能有或沒有致淀粉樣疾病的其它特征。本發(fā)明的這些方法需要給患者施用有效劑量的可以特異性結(jié)合淀粉樣沉積物成分的抗體。這些方法特別適用于人類患者阿爾茨海默氏病的預(yù)防與治療。一些方法需要給藥有效劑量的結(jié)合Aβ的抗體。一些方法需要給藥有效劑量的特異性結(jié)合位于Aβ殘基1-10內(nèi)表位的抗體。在一些方法中，所述抗體特異性地結(jié)合位于Aβ殘基1-6內(nèi)的表位。在一些方法中，所述抗體特異性地結(jié)合位于Aβ殘基1-5內(nèi)的表位。在一些方法中，所述抗體特異性地結(jié)合位于Aβ殘基1-7內(nèi)的表位。在一些方法中，所述抗體特異性地結(jié)合位于Aβ殘基3-7內(nèi)的表位。在一些方法中，所述抗體特異性地結(jié)合位于Aβ殘基1-3內(nèi)的表位。在一些方法中，所述抗體特異性地結(jié)合位于Aβ殘基1-4內(nèi)的表位。在一些方法中，所述抗體特異性地結(jié)合含有Aβ自由N末端的表位。在一些方法中，所述抗體特異性地結(jié)合位于Aβ殘基1-10的表位，其中這種Aβ的殘基1和/或7是天冬氨酸。在一些方法中，所述抗體特異性地結(jié)合Aβ肽而不結(jié)合全長的淀粉樣前體蛋白質(zhì)(APP)。在一些方法中，所述抗體的同種型是人IgG1。
在一些方法中，所述抗體結(jié)合患者的淀粉樣沉積物并誘導(dǎo)對淀粉樣沉積物的清除應(yīng)答。例如，這種清除應(yīng)答可以由Fc受體介導(dǎo)的吞噬實現(xiàn)。
這些方法可以用于無癥狀的患者和那些目前出現(xiàn)癥狀的患者。在這些方法中使用的抗體可以是人抗體、人源化、嵌合及非人抗體，可以是單克隆或多克隆的抗體。一些方法中，所述抗體從用Aβ肽免疫的人中制備，該人可以是將由抗體治療的患者。
一些方法中，將所述抗體與一種藥物載體以藥物組合物的形式給藥。一些方法中，抗體以每千克體重0.0001到100毫克，優(yōu)選的至少1毫克的劑量給藥。一些方法中，抗體在一段長時期內(nèi)以多劑量給藥，如至少六個月。一些方法中，抗體以持續(xù)釋放組合物給藥?？贵w可以以例如腹膜內(nèi)、口腔、皮下、顱內(nèi)、肌內(nèi)、局部、鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。
一些方法中，抗體的給藥通過給患者施用一種編碼至少一個抗體鏈的多核苷酸完成。這種多核苷酸在患者體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生抗體鏈?？蛇x擇的是，多核苷酸編碼抗體的輕鏈和重鏈。這種多核苷酸在患者內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生輕鏈和重鏈。一些方法中，監(jiān)控患者血液中被給藥抗體的水平。
另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療與患者腦部Aβ的淀粉樣沉積物相關(guān)之疾病的方法。例如，這些方法可用于治療阿爾茨海默氏病、唐氏先天愚癥或認(rèn)知損傷。這些方法需要給藥Aβ片段或其類似物以誘導(dǎo)對Aβ中某些表位的免疫應(yīng)答。一些方法需要給患者施用有效劑量的包含至少含有Aβ第1-5殘基的N末端節(jié)段的多肽，Aβ的第一個殘基作為多肽的N末端殘基，且該多肽不含有Aβ的C末端節(jié)段。一些方法需要給患者施用有效劑量的含有AβN末端節(jié)段的多肽，這種節(jié)段起始于Aβ殘基1-3且終止于Aβ殘基7-11。一些方法需要給患者施用有效劑量的可誘導(dǎo)對AβN末端節(jié)段之免疫應(yīng)答的治療藥物，這種節(jié)段起始于Aβ殘基1-3且終止于Aβ殘基7-11，對位于Aβ43的12-43殘基內(nèi)的表位不產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
以上一些方法中，AβN末端節(jié)段的C端連接有一個異源多肽。以上一些方法中，AβN末端節(jié)段的N端連接有一個異源多肽。以上一些方法中，AβN末端節(jié)段的N端和C端分別連接有第一和第二異源多肽。以上一些方法中，AβN末端節(jié)段的N端連接有一個異源多肽，并且其C端連接有至少一個該N末端節(jié)段的附加拷貝。以上一些方法中，為異源多肽并因此產(chǎn)生B細(xì)胞對該N末端節(jié)段的應(yīng)答。以上一些方法中，所述多肽進(jìn)一步含有N末端節(jié)段的至少一個附加拷貝。以上一些方法中，所述多肽從N端到C端分別包括AβN末端節(jié)段、多個AβN末端節(jié)段的附加拷貝及異源氨基酸節(jié)段。以上一些方法中，AβN末端節(jié)段含有Aβ1-7。以上一些方法中，AβN末端節(jié)段含有Aβ3-7。
一些方法中，所述片段至少不含有Aβ43內(nèi)的5個C末端氨基酸。一些方法中，所述片段含有來自Aβ的多至10個連續(xù)的氨基酸。片段的典型的給藥為每人每劑多于10微克。
一些方法中，所述片段與可以增強(qiáng)對Aβ肽免疫應(yīng)答的佐劑共同給藥。佐劑和片段可依次給藥也可以組合物形式共同給藥。佐劑可以是例如氫氧化鋁，磷酸鋁，MPLTM，QS-21(StimulonTM)或不完全弗氏佐劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了藥物組合物，其含有一種佐劑和Aβ片段，或如以上所述其它可誘導(dǎo)對Aβ相同表位產(chǎn)生免疫應(yīng)答的治療藥物。本發(fā)明還提供了含有以上所述的任一種抗體與可藥用載體的藥物組合物。
另一方面，本發(fā)明提供了篩選在治療與患者腦部Aβ沉積物相關(guān)疾病(如阿爾茨海默氏病)中有活性的抗體的方法。這些方法包括使抗體接觸一種多肽，該多肽不含有AβC末端節(jié)段，但含有AβN末端節(jié)段的至少5個連續(xù)氨基酸，且這種連續(xù)的節(jié)段起始于Aβ1-3之間的某個殘基。籍此，可以確定是否這種抗體特異性地結(jié)合該多肽。特異性結(jié)合顯示該抗體對于這類疾病的治療有活性。
另一方面，本發(fā)明提供了篩選對清除與抗原相關(guān)的生物實體有活性的抗體的方法。這些方法包括將與抗原相關(guān)的生物實體、抗體及帶有Fc受體的吞噬細(xì)胞混合于一培養(yǎng)介質(zhì)中。然后監(jiān)測培養(yǎng)介質(zhì)中存留的與抗原相關(guān)的生物實體的含量?？乖嚓P(guān)的生物實體含量的減少暗示該抗體在清除抗原相關(guān)的生物實體中有活性?？乖梢允墙M織樣品或以分離的形式存在。例如，抗原可以是來自阿爾茨海默氏病患者或表現(xiàn)阿爾茨海默氏病病理學(xué)現(xiàn)象的哺乳動物腦部的組織樣品。在測試對清除抗原相關(guān)的生物實體有活性的抗體中，還可以使用其他組織樣品，包括癌化組織樣品、病毒感染的組織樣品、含有炎癥細(xì)胞、非惡性異常細(xì)胞增生的組織樣品或含有異常胞外基質(zhì)的組織樣品。
另一方面，本發(fā)明提供了檢測患者的淀粉樣沉積物的方法。這些方法包括給患者施用可特異性結(jié)合位于Aβ1-10氨基酸內(nèi)表位的抗體，并檢測抗體在患者腦部的存在。一些方法中，抗體結(jié)合位于Aβ4-10殘基內(nèi)的表位。一些方法中，抗體標(biāo)記有順磁標(biāo)記物，因此可以通過核磁共振X斷層照像檢測。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了適用于以上方法的診斷試劑盒。該試劑盒含有特異性結(jié)合含有Aβ1-10殘基的表位的抗體。一些試劑盒帶有體外診斷或監(jiān)測阿爾茨海默氏病的抗體的使用說明標(biāo)簽。


圖1給轉(zhuǎn)基因小鼠注射Aβ1-42后的抗體效價。
圖2海馬中的淀粉樣損傷。通過對免疫反應(yīng)腦切片進(jìn)行的計算機(jī)輔助定量圖像分析，測定了淀粉樣斑占據(jù)的海馬區(qū)面積百分率(由與Aβ-特異性mAβ3D6的反應(yīng)性確定)。個體小鼠的該值表示成分類治療組。每組的橫線表示分布的中值。
圖3海馬中的神經(jīng)性營養(yǎng)不良。通過對免疫反應(yīng)腦切片進(jìn)行的計算機(jī)輔助定量圖像分析，測定了營養(yǎng)不良神經(jīng)占據(jù)的海馬區(qū)面積百分率(由它們與人APP-特異性m Aβ8E5的反應(yīng)性確定)。個體小鼠的該值表示為AN1792治療組和PBS治療對照組。每組的橫線表示分布的中值。
圖4夾肌后皮質(zhì)中的星形細(xì)胞增生。通過對免疫反應(yīng)腦切片進(jìn)行的計算機(jī)輔助定量圖像分析，測定了神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白質(zhì)(GFAP)-陽性星形細(xì)胞占據(jù)的皮質(zhì)區(qū)的面積百分率。個體小鼠的該值表示為分類治療組，組中值用橫線表示。
圖5用八種劑量的AN1792(0.14、0.4、1.2、3.7、11、33、100或300μg)免疫后，Aβ1-42抗體效價的幾何平均值。
圖6對AN1792免疫的抗體反應(yīng)動力學(xué)。效價通過每組6個動物的幾何平均值表示。
圖7PBS-和AN1792-治療小鼠中皮質(zhì)淀粉樣損傷的定量圖像分析。
圖8PBS-和AN1792-治療小鼠中神經(jīng)性斑損傷的定量圖像分析。
圖9PBS-和AN1792-治療小鼠中星形細(xì)胞占據(jù)夾肌后皮質(zhì)的百分率的定量圖像分析。
圖10AN1792-處理(上圖)或PBS-處理(下圖)的脾細(xì)胞的淋巴細(xì)胞增殖分析。
圖11皮質(zhì)中Aβ的總體水平。用Aβ或APP衍生物結(jié)合弗氏佐劑免疫的小鼠中個體Aβ的散點(diǎn)圖。
圖12通過對用Aβ肽共軛物Aβ1-5、Aβ1-12和Aβ13-28；全長Aβ聚集物AN1792(Aβ1-42)和AN1528(Aβ1-40)以及PBS治療對照組免疫的小鼠的免疫反應(yīng)腦切片進(jìn)行的定量圖像分析測定的皮質(zhì)中淀粉樣損傷。
圖13用Aβ或APP衍生物結(jié)合弗氏佐劑免疫的各組小鼠的Aβ特異性抗體的幾何平均效價。
圖14用AN1792或其棕櫚酸酯衍生物結(jié)合不同佐劑免疫的各組豚鼠的Aβ肽特異性抗體的幾何平均效價。
圖15(A-E)用AN1792或AN1528和不同的佐劑治療的12個月齡的PDAPP小鼠皮質(zhì)中的Aβ水平。
圖16Aβ的多克隆抗體處理的小鼠的平均效價。
圖17Aβ的單克隆抗體10D5處理的小鼠的平均效價。
圖18Aβ的單克隆抗體2F12處理的小鼠的平均效價。
圖19表位成像限定于N末端應(yīng)答。ELISA測定175天的獼猴血清，檢測覆蓋AN1792完整序列的一系列十聚體重疊肽。F10920M號動物顯示對覆蓋作為免疫原的AN1792肽鏈1-10氨基酸的DAEFRHDSGY肽產(chǎn)生代表性的N末端限制性應(yīng)答。
圖20表位成像非限定性N末端應(yīng)答。ELISA測定175天的獼猴血清，檢測覆蓋AN1792完整序列的一系列十聚體重疊肽。F10975M號動物顯示代表性的N末端非限制性應(yīng)答，對覆蓋AN1792肽的第1-10氨基酸的DAEFRHDSGY肽兩個N末端和一個C末端產(chǎn)生了應(yīng)答反應(yīng)。
定義術(shù)語“基本上相同”是指兩個肽序列，當(dāng)最優(yōu)序列對比時，例如通過GAP或BESTFIT程序采用默認(rèn)間隙重量，具有至少65％的序列等同性，優(yōu)選至少80或90％的序列等同，更加優(yōu)選至少95％或更多的序列等同(例如，99％或更高的序列等同)。優(yōu)選不同的殘基位置通過保守氨基酸取代鑒別。
進(jìn)行序列比較時，通常選定一個序列作為參照序列，將測試序列與其相比較。運(yùn)行序列比較程序時，將測試序列和參照序列輸入計算機(jī)，如果需要，指定序列等同物，并指定序列運(yùn)算程序。然后序列比較運(yùn)算程序根據(jù)指定的程序參數(shù)計算出測試序列相對于參照序列的序列等同百分率。
可以通過Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2482(1981))的局部同源性運(yùn)算法則；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.，48443(1970))的同源性排列運(yùn)算法則；Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444(1988))的相似性檢索方法；運(yùn)算法則(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，遺傳學(xué)計算機(jī)組，575科學(xué)Madison，WI博士)的計算機(jī)化實施，或者通過目檢(一般性參見Ausubel等，同上)進(jìn)行序列的優(yōu)化排列比較。適于確定序列等同性百分率和序列相似性百分率的運(yùn)算法則的一個實例是BLAST運(yùn)算法則，它由Altschul等描述，J.Mol.Biol.，215403-410(1990)。進(jìn)行BLAST分析的軟件由國家生物技術(shù)信息中心向公眾提供(http//www.ncbi.nlm.nig.gov/)。通常，可以用默認(rèn)程序參數(shù)進(jìn)行序列比較，當(dāng)然也可以使用用戶化參數(shù)。對于氨基酸序列，BLASTP程序默認(rèn)單詞長度(W)為3，預(yù)期值(E)為10，BLOSUM62記錄矩陣(參見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10915(1989))。
為了將氨基酸替代分成保守或非保守替代，須將氨基酸如下分組組I(疏水側(cè)鏈)正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；組II(中性親水側(cè)鏈)半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸；組III(酸性側(cè)鏈)天冬氨酸，谷氨酸；組IV(堿性側(cè)鏈)天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸；組V(影響鏈方向的殘基)甘氨酸，脯氨酸；和組VI(芳香族側(cè)鏈)色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。保守替代涉及同類氨基酸之間的替代。非保守替代由一組中的一個成分改變成為另一組中的一個成分。
本發(fā)明的治療藥物典型地是基本純的，不含有所不期望的污染物。這意味著藥物純度典型地至少約為50％w/w(重量/重量)，并且基本上沒有干擾蛋白質(zhì)和污染物。有時藥物純度至少約為80％w/w，更優(yōu)選純度至少90％或約95％w/w。然而，利用常規(guī)蛋白質(zhì)純化技術(shù)，可以得到至少99％w/w的均一多肽。
兩個實體之間的特異性結(jié)合指親和力至少106、107、108、109M-1或1010M-1。優(yōu)選親和力高于108M-1。
使用的術(shù)語“抗體”或“免疫球蛋白”包括完整抗體和其結(jié)合片段。通常，片段與其來源的完整抗體競爭性地與抗原特異性結(jié)合，包括獨(dú)立的重鏈，輕鏈Fab，F(xiàn)ab’F(ab’)2，F(xiàn)abc，以及Fv。重組DNA技術(shù)或完整免疫球蛋白的酶法或化學(xué)法分離獲得片段。術(shù)語“抗體”也包括可以與其它蛋白質(zhì)化學(xué)偶聯(lián)，或者與其它蛋白質(zhì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)的一個或多個免疫球蛋白鏈。術(shù)語“抗體”也包括雙特異性抗體。雙特異性抗體或雙功能抗體是一種含有兩個不同重、輕鏈對和兩個不同結(jié)合位點(diǎn)的人工雜合抗體。雙特異性抗體可以通過多種方法獲得，包括雜交瘤融合或Fab’片段的交聯(lián)。參見，例如，Songsivilai& Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。
APP695、APP751和APP770分別指由人APP基因編碼的695、751、和770個氨基酸殘基長的多肽。參見Kang等，Nature，325，773(1987)；Ponte等，Nature，331，525(1988)；和Kitaguchi等，Nature，331，530(1988)。人淀粉樣前體蛋白(APP)中的氨基酸依照APP770同種型的序列指定編號。例如Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42、和Aβ43指含氨基酸殘基1-39、1-40、1-41、1-42、和1-43的Aβ肽。
“抗原”是與抗體特異性結(jié)合的實體。
術(shù)語“表位”或“抗原決定簇”指使B和/或T細(xì)胞應(yīng)答的抗原上的位點(diǎn)。B-細(xì)胞表位可以由相鄰氨基酸形成，也可以由通過蛋白質(zhì)三級折疊靠近的非相鄰氨基酸形成。由相鄰氨基酸形成的表位在接觸變性溶劑時通常維持結(jié)構(gòu)，而由三級折疊形成的表位在用變性溶劑處理時通常失去結(jié)構(gòu)。在一個單一立體構(gòu)型中表位通常包括至少3個，更經(jīng)常至少5或8-10個氨基酸。確定表位的立體構(gòu)型的方法包括，例如，X-射線晶體學(xué)和2維核磁共振。參見，例如，分子生物學(xué)方法中的表位成像方案(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecularbiology)66卷，Glenn E.Morris編(1996)。通過顯示一個抗體阻斷另一個抗體與靶抗原結(jié)合能力的簡單的免疫分析可以鑒定識別同樣表位的抗體。CD8 T-細(xì)胞識別約9個氨基酸的連續(xù)表位，CD4 T-細(xì)胞識別約13-15個氨基酸的連續(xù)表位。識別表位的T細(xì)胞可以通過測定抗原-依賴性增殖的體外分析來鑒定(如通過3H-胸苷摻入對表位應(yīng)答的激活T-細(xì)胞確定)(Burke等，J.Inf.Dis.170，1110-19(1994))，通過抗原-依賴性殺傷(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分析，Tigges等，J.Immunol.，156，3901-1910)或者通過細(xì)胞因子分泌。
術(shù)語“免疫學(xué)”或“免疫”應(yīng)答是在接受治療的患者體內(nèi)形成對抗淀粉樣肽的有益的體液(抗體介導(dǎo)的)和/或細(xì)胞(抗原特異性T細(xì)胞或其分泌產(chǎn)物)應(yīng)答。該應(yīng)答可以是通過給藥免疫原誘導(dǎo)的主動應(yīng)答，也可以是通過給藥抗體或激活的T-細(xì)胞誘導(dǎo)的被動應(yīng)答。在存在與I類或II類MHC分子有關(guān)的多肽表位，以激活抗原特異性CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的條件下誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。應(yīng)答還可以涉及單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、樹狀細(xì)胞、星形細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞或其它具有天然免疫力成分的激活?？梢酝ㄟ^增殖檢測(CD4+T細(xì)胞)或CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)檢測確定細(xì)胞介導(dǎo)的免疫學(xué)應(yīng)答的出現(xiàn)(參見，Burke，同上；Tigges，同上)。體液和細(xì)胞應(yīng)答對免疫原產(chǎn)生的保護(hù)或治療效果的相對貢獻(xiàn)可以用下述方法區(qū)別，即從免疫的同系動物體內(nèi)單獨(dú)分離抗體和T-細(xì)胞，然后在第二受試者體內(nèi)測定保護(hù)或治療效果。
“免疫原性的藥物”或者“免疫原”是在對哺乳動物給藥(任選結(jié)合佐劑)后能夠誘導(dǎo)對自己的免疫應(yīng)答。
術(shù)語“裸多核苷酸”指沒有與膠狀材料復(fù)合的多核苷酸。裸多核苷酸有時被克隆到質(zhì)粒載體中。
術(shù)語“佐劑”指當(dāng)與抗原結(jié)合給藥時增強(qiáng)對抗原的免疫應(yīng)答，但當(dāng)單獨(dú)給藥時，對抗原不產(chǎn)生免疫應(yīng)答的化合物。佐劑可以通過幾種機(jī)制增強(qiáng)免疫應(yīng)答，包括征集淋巴細(xì)胞、激活B和/或T細(xì)胞、和激活巨噬細(xì)胞。
術(shù)語“患者”包括接受預(yù)防性或治療性處理的人和其他哺乳動物受試者。
解聚或單體Aβ指Aβ的可溶解、單體肽單元。制備單體Aβ的一種方法是在潔凈DMSO中超聲溶解凍干肽。將得到的溶液離心除去所有不溶顆粒。聚集Aβ是低聚體的混合物，其中單體單元通過非共價鍵結(jié)合到一起。
分析受測免疫球蛋白對參照抗體和普通抗原(如Aβ)之間特異性結(jié)合的抑制，以確定抗體間的競爭。業(yè)已知道多種競爭結(jié)合分析類型。例如，直接或間接的固相放射性免疫分析(RIA)、直接或間接的固相酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見Stahli等，Methods InEnzymology.9242-253(1983))、直接固相生物素-親合素EIA(參見Kirkland等，J.Immunol.1373614-3619(1986))、直接固相標(biāo)記分析、直接固相標(biāo)記夾心分析(參見Harlow & Lane，“Antibodies，A LaboratoryManual，”冷泉港出版社(1988))、I-125標(biāo)記的直接固相標(biāo)記RIA(參見Morel等，Molec.Immunol.25(1)7-15(1988))、直接固相生物素-親合素EIA(參見Cheung等，Virology 176546-552(1990))、直接標(biāo)記RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.3277-82(1990))。典型地，這些分析需要使用結(jié)合于固體表面的純化抗原或帶之的細(xì)胞、未標(biāo)記的受測免疫球蛋白以及標(biāo)記的參照免疫球蛋白。通過確定受測免疫球蛋白存在時結(jié)合于固體表面或細(xì)胞的標(biāo)記可以量化競爭性抑制。通常受測免疫球蛋白過量存在。競爭分析法測定出的抗體(競爭性抗體)包括與參照抗體結(jié)合同一表位的抗體，以及其結(jié)合的表位與參照抗體所結(jié)合的表位足夠接近以至于產(chǎn)生空間上阻礙的抗體。通常，當(dāng)競爭性抗體過量存在，至少可以抑制參照抗體與普通抗原間50或75％的特異性結(jié)合。
“包括”一種或多種所提及元素的組合物或方法可以包括沒有具體提及的其他元素。例如，含有Aβ肽的組合物中包含分離的Aβ肽和作為一種較長多肽序列成分的Aβ肽。
發(fā)明詳述I.總則一些致淀粉樣疾病及癥狀的特征是患者腦部出現(xiàn)沉積的聚集成不溶團(tuán)塊的Aβ肽。該疾病包括阿爾茨海默氏病、唐氏先天愚癥及認(rèn)知損傷。后者是阿爾茨海默氏病和唐氏先天愚癥的一個癥狀，但也可以沒有這二者的其它癥狀。例如，輕度認(rèn)知損傷或與衰老相關(guān)的記憶喪失出現(xiàn)于一些至今仍未患阿爾茨海默氏病或永遠(yuǎn)不會患該病的患者中。約定俗成地認(rèn)為，輕度認(rèn)知損傷可以通過微型智力狀況測試的得分確認(rèn)。這類疾病的特征是具有β折疊片層結(jié)構(gòu)的Aβ聚集及剛果紅染色。預(yù)防或治療阿爾茨海默氏病或其它致淀粉樣疾病的基本方法是對患者的淀粉樣沉積物成分產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這種方法在WO99/27944中作了描述(在此引入以作參考)。本發(fā)明重復(fù)并肯定了這種基本方法的有效性。然而，本發(fā)明主要在于改進(jìn)的治療藥物和方法。這些改進(jìn)部分基于這樣的前提本發(fā)明人定位了免疫應(yīng)答所針對的Aβ內(nèi)的優(yōu)選表位。Aβ內(nèi)優(yōu)選表位的定位導(dǎo)致了效率增加、不良負(fù)效降低、和/或制備、配制和給藥更加容易的治療藥物和方法。
II.治療藥物免疫應(yīng)答可以是主動的，如給藥免疫原以誘導(dǎo)與患者Aβ反應(yīng)的抗體，也可以是被動的，如給藥與患者Aβ直接結(jié)合的抗體。
1.誘導(dǎo)主動免疫應(yīng)答的藥物治療藥物誘導(dǎo)特異性針對Aβ肽內(nèi)某些表位的免疫應(yīng)答。優(yōu)選的藥物是Aβ肽本身和其節(jié)段。也可以使用誘導(dǎo)和/或與Aβ肽優(yōu)選表位的抗體有交叉反應(yīng)的天然Aβ肽的節(jié)段變體、類似物和嵌合體。
Aβ，也被認(rèn)為是β-淀粉樣肽，或者A4肽(參見US4666829；Glenner和Wong，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)120，1131(1984))，它是一種含39-43個氨基酸的肽，是阿爾茨海默氏病特征斑的基本成分。Aβ是通過兩種酶(被稱為β和γ分泌酶)加工較長蛋白質(zhì)APP產(chǎn)生的(參見Hardy，TINS，20，154(1997))。已知的與阿爾茨海默氏病有關(guān)的APP中的突變發(fā)生在緊鄰β或γ分泌酶的位點(diǎn)，或者在Aβ中。例如，在APP加工成Aβ時，位置717緊鄰APP的γ分泌酶酶切位點(diǎn)，位置670/671緊鄰β分泌酶酶切位點(diǎn)。據(jù)信突變通過與形成Aβ的酶切反應(yīng)相互作用，增加了產(chǎn)生的42/43個氨基酸形式的Aβ的量，從而導(dǎo)致AD。
Aβ具有不尋常的特性，即它能夠固定和激活典型和替代補(bǔ)體級聯(lián)。特別是，它結(jié)合Clq并最終結(jié)合C3bi。這種關(guān)系有利于結(jié)合導(dǎo)致B-細(xì)胞激活的巨噬細(xì)胞。另外，C3bi進(jìn)一步分解，然后與B細(xì)胞上的CR2以T細(xì)胞依賴性方式結(jié)合，導(dǎo)致這些細(xì)胞的激活增加10000倍。這種機(jī)制導(dǎo)致Aβ比其他抗原產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
Aβ肽有幾種天然存在的形式。Aβ的人中的形式為Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42或Aβ43。這些肽的序列和他們與APP前體的關(guān)系如Hardy等(TINS，20，155-158(1997))圖1所示。例如，Aβ42具有如下序列H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OHAβ41、Aβ40和Aβ39與Aβ42的不同之處在于，它們分別缺失C-末端的Ala、Ala-Ile、和Ala-Ile-Val。Aβ43與Aβ42的不同之處在于，它在C-末端還具有一個蘇氨酸殘基。
相對于目前方法使用的完整分子，Aβ的免疫原性片段在幾個方面有其優(yōu)勢。第一，由于Aβ內(nèi)只有某些表位可以誘導(dǎo)對阿爾茨海默氏病的免疫應(yīng)答，帶有這些表位的片段比同樣劑量完整Aβ在有用免疫原性表位上有更高的摩爾濃度。第二，Aβ的某些免疫原片段在產(chǎn)生對淀粉樣沉積物的免疫應(yīng)答時，對Aβ來源的APP蛋白不產(chǎn)生顯著的免疫應(yīng)答。第三，由于其分子更小，Aβ的片段比完整Aβ更容易操作。第四，Aβ的片段不象完整Aβ一樣聚集，簡化了藥物組合物和其給藥的準(zhǔn)備。
一些Aβ的免疫原片段具有來源于天然肽的至少2、3、5、6、10或20個連續(xù)氨基酸的序列。一些免疫原片段具有來源于Aβ的不超過10、9、8、7、5或3個連續(xù)氨基酸的序列。來源于AβN-端一半的片段是優(yōu)選的。優(yōu)選的免疫原片段包括Aβ1-5、1-6、1-7、1-10、3-7、1-3和1-4。例如，Aβ1-5表示含有Aβ第1-5殘基但缺乏Aβ其它殘基的一個片段。特別優(yōu)選起始于Aβ1-3殘基且終止于Aβ7-11殘基的片段。也可以使用Aβ1-12殘基，但優(yōu)選性稍差。一些方法中，是除Aβ1-10以外的N-端片段。其它優(yōu)選性稍差的片段包括Aβ13-28、17-28、1-28、25-35、35-40和35-42。這些片段在使用之前需要按照實施例的說明，篩選其清除或預(yù)防淀粉樣沉積的活性。一些方法中使用的片段至少缺少一個，有時缺少Aβ天然形式中的至少5到10個C末端氨基酸。例如，缺少Aβ43C末端起的5個氨基酸的片段包括AβN末端最初的38個氨基酸。淀粉樣斑的其它成分，如同型核蛋白及其表位片段也可以用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
除非有另外的說明，Aβ包括以上所述天然的人氨基酸序列及其類似物，包括等位基因的、種的和誘導(dǎo)的變異體。類似物通常與天然存在的肽在一個、兩個或幾個位置上不同，通常通過保守替代產(chǎn)生。類似物通常表現(xiàn)與天然肽至少有80％或90％的序列等同性。一些類似物還包括非天然氨基酸或N-或C-末端氨基酸在一個、兩個或幾個位置上的修飾。例如，Aβ的第1和/或7位的天然天冬氨酸殘基可以被同型天冬氨酸所替代。非天然氨基酸的實例為D-氨基酸、α，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、4-羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酰胺、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、ω-N-甲基精氨酸及同型天冬氨酸?？梢园凑障旅娴拿枋?，與未處理或安慰劑對照的對比，在轉(zhuǎn)基因動物模型中篩選具有預(yù)防或治療效果的片段和類似物。
Aβ，其片段和類似物可以通過固相肽合成或重組表達(dá)合成，或者從天然來源提取。很多供應(yīng)商提供商品自動肽合成儀，例如應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)，F(xiàn)oster City，California。重組表達(dá)可以在細(xì)菌例如大腸桿菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行。重組表達(dá)的方法如Sambrook等描述(分子克隆實驗室手冊(C.S.H.P.出版社，NY，第二版，1989))。也有一些商品提供的Aβ肽(例如，AmericanPeptides Company，Inc.，Sunnyvale，CA和California Peptide Research，Inc.Napa，CA)。
治療藥物還包括更長的多肽，其包括，例如，具有其它氨基酸的Aβ肽的活性片段。例如，優(yōu)選的藥物包括含有Aβ的節(jié)段與異源氨基酸序列融合的融合蛋白，可以誘導(dǎo)針對所述異源氨基酸序列的輔助T細(xì)胞應(yīng)答，及針對所述Aβ節(jié)段的B細(xì)胞應(yīng)答。與如下所述的未處理或安慰劑對照對比，可以在動物模型中篩選預(yù)防或治療功效的所述多肽。Aβ肽、類似物、活性片段或其它多肽可以以結(jié)合形式給藥，或者以多聚體形式給藥，或者以分離形式給藥。治療藥物還包括單體免疫原藥物的多聚體。
在進(jìn)一步的改進(jìn)中，免疫原肽，例如Aβ的片段可以以一種部分免疫組合物的病毒或細(xì)菌形式出現(xiàn)。將編碼免疫原肽的核酸插入病毒或細(xì)菌的基因組或游離體。任選地，核酸以如下方式插入，即免疫原肽以分泌蛋白或與病毒的外殼蛋白或細(xì)菌的跨膜蛋白一起表達(dá)的融合蛋白的形式表達(dá)，以使該肽出現(xiàn)。該方法中使用的病毒或細(xì)菌應(yīng)當(dāng)是非病原性的或減毒的。合適的病毒包括腺病毒、HSV、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒及其它甲病毒、水泡性口膜炎病毒、其它桿狀病毒、痘苗病毒和雞痘病毒。合適的細(xì)菌包括沙門氏菌屬和志賀氏菌屬。免疫原肽與HBV的HBsAg的融合尤其合適。治療藥物還包括不必具有與Aβ顯著的氨基酸序列相似性，然而卻作為Aβ的模擬物并誘導(dǎo)類似免疫應(yīng)答的肽和其他化合物。例如，可以篩選所有形成β-折疊片層的肽和蛋白質(zhì)的適用性。也可以使用抗Aβ或其它致淀粉樣肽單克隆抗體的抗-獨(dú)特型抗體。該抗-Id的抗體類似抗原，產(chǎn)生對它的免疫應(yīng)答(參見基本免疫學(xué)(Essential Immunology)(Roit等，Blackwell科學(xué)出版社，Palo Alto，第6版)，181頁)。除了Aβ肽以外的藥物可以誘導(dǎo)抗一個或多個以上列出Aβ優(yōu)選節(jié)段(如，1-10，1-7，1-3和3-7)的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，這些藥物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答特異性地針對這些節(jié)段之一，而不針對Aβ的其它節(jié)段。
還可以篩選肽或其它化合物隨機(jī)文庫的適用性。對于一些以按部就班方式合成的化合物類型可以創(chuàng)建組合文庫，這類化合物包括多肽、β-轉(zhuǎn)角模擬物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳香族化合物、雜環(huán)化合物、苯并二氮、低聚N-取代甘氨酸和低聚氨基甲酸?？梢酝ㄟ^Affymax，WO 95/12608，Affymax，WO 93/06121，Columbia大學(xué)，WO 94/08051，藥典，WO 95/35503和Scripps，WO 95/30642中描述的編碼合成文庫(ESL)法構(gòu)建化合物的大組合文庫(每一文獻(xiàn)為各種目的列入本文作為參考)。也可以通過噬菌體展示法產(chǎn)生肽文庫。參見，例如，Devlin，WO 91/18980。
首先通過確定組合文庫和其它化合物與已知的特異于Aβ或其它致淀粉樣肽的抗體或淋巴細(xì)胞(B或T)的結(jié)合能力，篩選它們的適用性。例如，可以用任何Aβ或其片段的多克隆血清或單克隆抗體進(jìn)行最初的篩選。然后篩選結(jié)合Aβ內(nèi)特定表位(如，1-10，1-7，1-3，1-4，1-5和3-7)的化合物?；衔锏臋z測與抗體表位特異性成像的說明方法相同。然后進(jìn)一步分析該篩選鑒定的化合物誘導(dǎo)Aβ或其中片段的抗體或反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的能力。例如，可以在用Aβ肽或其片段預(yù)涂的微量滴定平板上測試血清的多步稀釋物，可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA，以測試Aβ或其片段的反應(yīng)性抗體。然后按照實施例中的描述，在預(yù)先誘導(dǎo)致淀粉樣病的轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)測試化合物的預(yù)防和治療功效。所述動物包括，例如，Games等(同上)所述的帶有APP 717突變的小鼠，和帶有APP 670/671瑞典突變的小鼠，例如，McConlogue等，US5,612,486和Hsiao等，科學(xué)，274，99(1996)；Staufenbiel等，美國國家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展94，13287-13292(1997)；Sturchler-Pierrat等，美國國家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展94，13287-13292(1997)；Borchelt等，神經(jīng)(Neuron)19，939-945(1997))?？梢詫⑼瑯拥暮Y選方法用于其它潛在藥物，例如前面所述的Aβ類似物和包括Aβ片段的更長肽。
2.誘導(dǎo)被動免疫應(yīng)答的藥物本發(fā)明的治療藥物也包括特異性結(jié)合Aβ或淀粉樣斑其它成分的抗體。該抗體可以是單克隆或多克隆的。這些抗體中的有些特異性結(jié)合聚集態(tài)的Aβ而不結(jié)合分離型的Aβ。有些特異性結(jié)合分離型而不結(jié)合聚集態(tài)。有些既結(jié)合聚集態(tài)又結(jié)合分離型。這些抗體中的一些結(jié)合Aβ的天然短型(即Aβ39、40或41)，而不結(jié)合Aβ的天然長型(即Aβ42或43)。一些抗體結(jié)合長型而不結(jié)合短型。一些抗體結(jié)合Aβ而不結(jié)合全長的淀粉樣前體蛋白質(zhì)。治療中所用的抗體通常有完整的恒定區(qū)或至少足夠的恒定區(qū)，使其可與Fc受體相互作用。優(yōu)選人同種型IgG1，因為其在人同種型中對吞噬細(xì)胞上的FcRI受體有最高的親合力。也可以使用雙特異性Fab片段，其抗體的一個臂對Aβ有特異性，另一個對Fc受體有特異性。一些抗體與Aβ的結(jié)合親和力大于或等于106、107、108、109或1010M-1。
典型的，多克隆抗血清含有結(jié)合Aβ全長上一些表位的抗體的混合體。然而，多克隆抗血清可以特異性的針對Aβ的個別節(jié)段，如Aβ1-10。單克隆抗體結(jié)合Aβ內(nèi)的構(gòu)象化或非構(gòu)象化的特異性表位。利用實施例所述的轉(zhuǎn)基因動物模型測試抗體的預(yù)防和治療效果。優(yōu)選的單克隆抗體結(jié)合位于Aβ1-10殘基內(nèi)的表位(將天然Aβ第一個N末端殘基設(shè)定為1)。一些優(yōu)選單克隆抗體結(jié)合1-5殘基內(nèi)的表位，一些結(jié)合位于5-10殘基內(nèi)的表位。一些優(yōu)選抗體結(jié)合氨基酸1-3、1-4、1-5、1-6、1-7或3-7內(nèi)的表位。一些優(yōu)選抗體結(jié)合起始于Aβ1-3殘基終止于7-11殘基的表位。稍差的優(yōu)選抗體包括那些結(jié)合Aβ10-15、15-20、25-30、10-20、20、30、或10-25殘基內(nèi)的表位。建議使用前在實施例所述的小鼠模型中對這些抗體進(jìn)行活性篩選。例如，已發(fā)現(xiàn)10-18、16-24、18-21和33-42殘基內(nèi)表位的抗體缺乏活性。一些方法中，使用結(jié)合不同表位的多種單克隆抗體?？贵w可以順序或同時給藥。除Aβ以外的淀粉樣成分的抗體也可以應(yīng)用。例如，抗體可以是針對淀粉樣相關(guān)蛋白同型核蛋白。
所述抗體結(jié)合特定殘基(如Aβ1-5)內(nèi)的表位，是指抗體特異性地結(jié)合具有特定殘基(此例中是Aβ1-5)的多肽。這類抗體不一定與Aβ1-5內(nèi)的每個殘基接觸。也不是Aβ1-5內(nèi)的每個氨基酸替代或缺失一定會影響結(jié)合親和力?？贵w表位特異性的確定可以通過構(gòu)成噬菌體展示文庫，其不同的成員顯示Aβ的不同序列。然后，篩選特異性地結(jié)合受測抗體的噬菌體展示文庫成員。分離序列家族。典型的，這種家族含有一個普遍的核心序列，以及不同成員的不同長度側(cè)翼序列。特異性結(jié)合抗體的最短核心序列表明該抗體結(jié)合的表位。用已知表位特異性的抗體進(jìn)行競爭性分析，也可以測定抗體的表位特異性。例如，與結(jié)合Aβ的3D6抗體競爭的抗體與3D6有相同或相似的表位結(jié)合，即，位于Aβ1-5殘基內(nèi)。同樣的，與10D5抗體競爭的抗體與10D5有相同或相似的表位結(jié)合，即，位于Aβ3-6殘基內(nèi)。對抗體表位特異性的篩選是治療效果的有用預(yù)示。例如，確定為結(jié)合位于Aβ1-7殘基內(nèi)表位的抗體可能有效預(yù)防和治療阿爾茨海默氏病。
特異性結(jié)合Aβ優(yōu)選節(jié)段，且不結(jié)合Aβ其它區(qū)域的單克隆或多克隆抗體，相對于結(jié)合Aβ其它區(qū)域的單克隆抗體或結(jié)合完整Aβ的多克隆抗血清而言，有許多優(yōu)勢。第一，同樣劑量時，特異性結(jié)合Aβ優(yōu)選節(jié)段的抗體含有更高的有效清除淀粉樣斑的抗體量。第二，特異性結(jié)合優(yōu)選節(jié)段的抗體可以誘導(dǎo)對淀粉樣蛋白斑的清除應(yīng)答，而不誘導(dǎo)對完整APP多肽的清除應(yīng)答。因此降低了負(fù)作用的潛在可能。
i免疫球蛋白的一般特征已知基本的抗體結(jié)構(gòu)單位包括亞單位的四聚體。每個四聚體包含兩個相同的多肽鏈對，每對含有一個“輕”鏈(約25kDa)和一個“重”鏈(約50-70kDa)。每個鏈的氨基末端包括一個約100-110或更多氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識別。每個鏈的羧基末端包括一個主要負(fù)責(zé)效應(yīng)物功能的恒定區(qū)。
輕鏈分為κ或λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，分別定義為抗體的同種型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。輕鏈和重鏈中約12或更多氨基酸形成的“J”區(qū)連接可變區(qū)與恒定區(qū)，重鏈還包括10或更多氨基酸形成的“D”區(qū)。(一般參見Fundamental Immunology(Paul，W.，編，第二版，Raven Press，N.Y.，1989第七章)，為各種目的在此全文引入以作參考)。
每對輕鏈/重鏈的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，完整的抗體有兩個結(jié)合位點(diǎn)。除了雙功能或雙特異性抗體，這兩個結(jié)合位點(diǎn)是相同的。所有的鏈都顯示同樣的一般結(jié)構(gòu)，三個高度可變區(qū)(也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDRs)連接了相對保守的框架區(qū)。每對兩個鏈的CDRs由框架區(qū)排列，使其可以結(jié)合特定表位。從N末端到C末端，輕鏈和重鏈的組成都包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4區(qū)。每區(qū)的氨基酸排列與以下文獻(xiàn)一致Kabat，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991)，或Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等，Nature 342878-883(1989)。
ii.非人抗體的獲得非人單克隆抗體，如，鼠科動物、豚鼠、靈長類動物、兔或大鼠可以通過Aβ免疫動物制備。也可以使用含有Aβ、Aβ的免疫原性片段或Aβ抗體的抗-獨(dú)特型抗體的更長多肽鏈。參見Harlow和Lane，抗體，實驗室手冊(CSHP，NY，1988)(為各種目的列入本文作為參考)。這樣一種免疫原可以從天然來源獲得、通過肽合成或者通過重組表達(dá)獲得。選擇的，如以下所述，免疫原可以融合載體蛋白或與其復(fù)合給藥。選擇的，免疫原可以結(jié)合佐劑給藥。可以使用如以下所述的幾種佐劑。免疫實驗動物時，優(yōu)選不完全弗氏佐劑和完全弗氏佐劑的依次使用。兔和豚鼠典型的用于獲得多克隆抗體。小鼠典型的用于獲得單克隆抗體?？贵w結(jié)合Aβ的特異性篩選。選擇的，進(jìn)一步篩選結(jié)合Aβ特定區(qū)域的抗體。通過抗體與Aβ缺失突變?nèi)旱慕Y(jié)合，確定與抗體結(jié)合的缺失突變體，完成后者的篩選?？梢酝ㄟ^如Western Blot和ELISA的方法估計結(jié)合作用。顯示特異性結(jié)合抗體的最小片段定位了該抗體的表位。另一方面，表位的特異性可以通過分析測試所用抗體的參照抗體對Aβ的競爭結(jié)合進(jìn)行確定。如果受測抗體與參照抗體競爭，則它們結(jié)合相同表位，或其結(jié)合的表位足夠接近，以至一個的結(jié)合干擾了另一個的結(jié)合。這些抗體的優(yōu)選同種型是小鼠同種型IgG2a或其它種屬的相當(dāng)同種型。小鼠同種型IgG2a是人同種型IgG1的相當(dāng)同種型。
iii.嵌合和人源化抗體嵌合和人源化抗體與提供構(gòu)建該嵌合和人源化抗體的小鼠或其它非人抗體有同樣或相似的結(jié)合特異性及親和力。嵌合抗體典型地是通過基因工程，將屬于不同種的免疫球蛋白基因片段構(gòu)建成其輕鏈和重鏈。例如，小鼠單克隆抗體基因的可變區(qū)(V)可能結(jié)合人恒定區(qū)(C)節(jié)段，如IgG1和IgG4。優(yōu)選人同種型IgG1。因此，典型的嵌合抗體為這樣一個雜種蛋白，含有小鼠抗體V或抗原結(jié)合區(qū)和人抗體的C或效應(yīng)區(qū)。
人源化抗體的可變區(qū)結(jié)構(gòu)殘基主要來自人抗體(稱為受體抗體)，互補(bǔ)性確定區(qū)主要來自鼠抗體(稱為供體免疫球蛋白)。參見Queen等，美國國家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，8610029-10033(1989)和WO 90/07861，US 5,693,762、US 5,693,761和US5,585,089、US 5,530,101及Winter，US 5,225,539(為各種目的列入本文作為參考)。如果存在，恒定區(qū)主要或全部來自人免疫球蛋白。人可變區(qū)通常選自這種人抗體，其結(jié)構(gòu)序列與該CDRs來源的小鼠可變區(qū)有高度的一致性。輕鏈和重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)殘基可以來源于相同或不同的人抗體序列。人抗體序列可以是天然產(chǎn)生的人抗體序列，也可以是幾種人抗體的一致序列。參見Carter等，WO92/22653?；谄鋵DR構(gòu)象和/或抗原結(jié)合的可能影響，選擇某些可變區(qū)的結(jié)構(gòu)氨基酸殘基，進(jìn)行替代。對這些可能影響的研究包括建立模型，檢驗特定位點(diǎn)氨基酸的特性，或?qū)μ囟ò被岬奶娲⑼蛔兘Y(jié)果進(jìn)行經(jīng)驗性觀察。
例如，當(dāng)某個氨基酸在鼠可變區(qū)結(jié)構(gòu)殘基和選擇的人可變區(qū)結(jié)構(gòu)殘基之間不同，在以下情況，人結(jié)構(gòu)氨基酸通常將被來自小鼠抗體中的相當(dāng)?shù)陌被崽娲?。即，合理地預(yù)期該氨基酸(1)直接非共價地結(jié)合抗原，(2)鄰近一個CDR區(qū)，(3)或者與一個CDR區(qū)相互作用(如位于CDR區(qū)約6A)，或(4)參與VL-VH界面。
其它被用來替代的，候選在人免疫球蛋白這一位點(diǎn)不尋常的人受體結(jié)構(gòu)氨基酸。這些氨基酸可以被鼠供體抗體相應(yīng)位置上的氨基酸，或更加典型的人免疫球蛋白相應(yīng)位置上的氨基酸替代。其它被用來替代的，候選在人免疫球蛋白這一位點(diǎn)不尋常的人受體結(jié)構(gòu)氨基酸。人源化免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)通常與人可變區(qū)結(jié)構(gòu)序列或這些序列的一致序列至少有85％的序列一致性。
iv.人抗體人抗Aβ抗體由以下所述的多種技術(shù)提供。一些人抗體選自競爭性結(jié)合實驗，或與特定的小鼠抗體(如實施例XI中說明的某個小鼠單克隆抗體)有同樣的表位特異性。也可以通過僅用Aβ的一個片段作為免疫原，和/或通過篩選抗Aβ缺失突變體組的抗體，篩選具有特定表位特異性人抗體。優(yōu)選的人抗體有同種型特異性人IgG1。
(1)三雜交瘤(trioma)法Oestberg等描述了基本方法和本方法中作為范例的細(xì)胞融合組分，SPAZ-4，Hybridoma 2361-367(1983)；Oestberg，US專利申請?zhí)?,634,664；Engleman等，US專利申請?zhí)?,634,666(為各種目的分別列入本文作為參考)。由于抗體產(chǎn)生細(xì)胞系來自三個細(xì)胞兩個人細(xì)胞和一個小鼠細(xì)胞，這種獲得抗體表達(dá)細(xì)胞系的方法稱為三雜交瘤法。最初，一個小鼠骨髓瘤細(xì)胞與一個人B淋巴細(xì)胞融合，得到非抗體產(chǎn)生細(xì)胞的異種雜交細(xì)胞，如Oestberg(同上)所述的SPAZ-4細(xì)胞系。接著，該異種細(xì)胞與免疫化的人B淋巴細(xì)胞融合，獲得產(chǎn)生抗體的三雜交瘤細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)三雜交瘤比來自人細(xì)胞的普通雜交瘤細(xì)胞有更穩(wěn)定的抗體表達(dá)。
免疫化的B淋巴細(xì)胞從人供體的血液、脾臟、淋巴結(jié)或骨髓中獲得。如果期望抗體抗特定抗原或表位，優(yōu)選使用該抗原或其表位免疫。免疫可以是體外或體內(nèi)。體內(nèi)免疫中，B細(xì)胞典型的從免疫的人中獲得，包括Aβ、其片段、帶有Aβ或其片段的更大的多肽，或Aβ抗體的抗-獨(dú)特型抗體。一些方法中，B細(xì)胞來自最終被給藥抗體治療的同一患者。體外免疫中，典型的，B淋巴細(xì)胞在添加有10％人血漿的培養(yǎng)介質(zhì)中(如RPMI-1640，參見Engleman，同上)，7-14天的時期接觸抗原。
利用眾所周知的方法，免疫化的B淋巴細(xì)胞與異種雜交細(xì)胞(如SPAZ-4)融合。例如，細(xì)胞用40-50％聚乙二醇(分子量1000-4000)在37度處理5-10分鐘。從融合混合物中分離細(xì)胞，在選擇性培養(yǎng)介質(zhì)中擴(kuò)增期望的雜交細(xì)胞(如HAT或AH)。通過分析三雜交瘤培養(yǎng)介質(zhì)中結(jié)合Aβ或其片段的能力，可以確定分泌具有所期望結(jié)合特異性的抗體的克隆。表達(dá)具有所期望特異性之人抗體的三雜交瘤細(xì)胞用限制稀釋技術(shù)亞克隆，并在培養(yǎng)介質(zhì)中體外培養(yǎng)。然后，測定獲得的三雜交瘤細(xì)胞系結(jié)合Aβ或其片段的能力。
盡管三雜交瘤細(xì)胞遺傳上穩(wěn)定，但并不高量表達(dá)抗體?？梢詫碜匀s交瘤細(xì)胞的抗體基因克隆于一個或多個表達(dá)載體，載體轉(zhuǎn)化標(biāo)準(zhǔn)哺乳動物、細(xì)菌或酵母細(xì)胞系，以增加表達(dá)水平。
(2)轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物人抗Aβ抗體也可以由轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物表達(dá)，其具有編碼至少一個人免疫球蛋白基因座節(jié)段的轉(zhuǎn)基因。通常，這種轉(zhuǎn)基因哺乳動物的內(nèi)源免疫球蛋白基因座功能上是無活性的。優(yōu)選的，人免疫球蛋白基因座節(jié)段具有重鏈和輕鏈成分的未經(jīng)重排的序列。內(nèi)源免疫球蛋白基因的失活和外源免疫球蛋白基因的導(dǎo)入都可以通過定向同源重組，或YAC染色體的導(dǎo)入實現(xiàn)。由此獲得的轉(zhuǎn)基因哺乳動物能夠功能性的重排免疫球蛋白成分的序列，大量表達(dá)人免疫球蛋白基因編碼的各種同種型抗體，且不表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白基因。具有這些性質(zhì)的哺乳動物的獲得與特性詳細(xì)說明于如Lonberg等，WO93/12227(1993)；US5,877,397，US5,874,299，US5,814,318，US5,789,650，US 5,770,429，US 5,661,016，US 5,633,425，US 5,625,126，US 5,569,825，US 5,545,806，Nature 1481547-1553(1994)，NatureBiotechnology 14，826(1996)，Kucherlapati，WO 91/10741(1991)(為各種目的分別列入本文作為參考)。轉(zhuǎn)基因小鼠特別合適。Aβ或其片段免疫轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物中可以獲得抗Aβ抗體，如Lonberg或Kucherlapati所述(同上)。利用已知的Kohler-Milstein技術(shù)制備單克隆抗體，如，將來自這些哺乳動物的B細(xì)胞和合適雜交瘤細(xì)胞系融合。還可以從用免疫原藥物免疫的人血清中提供人多克隆抗體。任選，該多克隆抗體可以利用Aβ或其它淀粉樣肽作為親合試劑，通過親合純化濃縮。
(3)噬菌體展示法更進(jìn)一步獲得人抗Aβ抗體的方法是篩選人B細(xì)胞DNA文庫，一般的方案見Huse等，Sciences 2461275-1281(1989)。在三雜交瘤法中說明的，B細(xì)胞可以從免疫的人中獲得，包括Aβ、其片段、帶有Aβ或片段的更大的多肽，或抗-獨(dú)特型抗體。選擇的，B細(xì)胞可以從最終接受抗體治療的患者中獲得。選擇結(jié)合Aβ或其片段的抗體。接著，克隆并擴(kuò)增編碼這些抗體(或結(jié)合片段)的序列。Huse所述方案和噬菌體展示法一同使用將更加有效。參見，如，Dower等，WO91/17271和McCafferty等，WO92/01047，US 5,877,218，US 5,871,907，US5,858,657，US 5,837,242，US 5,733,743，US 5,565,322(為各種目的分別列入本文作為參考)。在這些方法中，產(chǎn)生噬菌體文庫，其中的成員在它們的外表面上展示不同的抗體?？贵w通常展示為Fv或Fab片段。通過親合濃縮選擇對Aβ或其片段具有理想特異性的噬菌體展示抗體。
在變化的噬菌體展示方法中，具有選擇的鼠抗體結(jié)合特異性的人抗體被表達(dá)。參見Winter WO 92/20791。這種方法中，選擇的鼠抗體的輕鏈或重鏈的可變區(qū)被用作起始材料。例如，如果輕鏈的可變區(qū)被用作起始材料，構(gòu)建的噬菌體文庫其成員展示相同的輕鏈可變區(qū)(即，鼠起始材料)和不同的重鏈可變區(qū)。重鏈可變區(qū)來自重排的人重鏈可變區(qū)文庫。選擇對Aβ有強(qiáng)特異性結(jié)合(如，至少108，優(yōu)選的至少109M-1)的噬菌體。來自該噬菌體的人重鏈可變區(qū)接著作為構(gòu)建另一個噬菌體文庫的起始材料。該文庫中，每個噬菌體展示相同的重鏈可變區(qū)(即，從第一個展示文庫中鑒定的區(qū)域)和不同的輕鏈可變區(qū)。輕鏈可變區(qū)來自重排的人輕鏈可變區(qū)文庫。又一次，選擇對Aβ有強(qiáng)特異性結(jié)合的噬菌體。這些噬菌體展示完全的人抗Aβ抗體的可變區(qū)。這些抗體與小鼠起始材料有同樣或相似的表位特異性。
v恒定區(qū)的選擇嵌合的、人源化的、或人抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)可以與至少部分的人恒定區(qū)相連。恒定區(qū)的選擇部分依賴于是否期望的是抗體依賴性補(bǔ)體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的毒性。例如，同種型IgG1和IgG3有補(bǔ)體活性，而同種型IgG2和IgG4沒有補(bǔ)體活性。同種型的選擇也影響抗體進(jìn)入腦部的途徑。優(yōu)選人同種型IgG1。輕鏈恒定區(qū)可以是λ或κ?？贵w可以表達(dá)為含有兩個輕鏈和重鏈的四聚體，可以是獨(dú)立的輕鏈和重鏈，F(xiàn)ab、Fab’F(ab)’2和Fv，也可以作為輕鏈和重鏈通過間隔區(qū)域連接的單鏈抗體。
vi重組抗體的表達(dá)嵌合的、人源化的、或人抗體典型的可以通過重組表達(dá)獲得。重組多核苷酸構(gòu)建體典型的包括可操作的連接有表達(dá)調(diào)控序列的抗體鏈編碼序列，包括天然的或異源的啟動子區(qū)。優(yōu)選的，表達(dá)調(diào)控序列是能轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體內(nèi)的真核啟動子系統(tǒng)。在該載體進(jìn)入合適的宿主后，使宿主維持在適合該核苷酸序列高水平表達(dá)、以及適合交叉反應(yīng)抗體的收集和純化的環(huán)境中。
這些表達(dá)載體典型的可在宿主有機(jī)體中以附加體或宿主染色體DNA中的整合部分復(fù)制。一般的，表達(dá)載體帶有選擇標(biāo)記(如青霉素抗性或潮霉素抗性)，使轉(zhuǎn)化了所期望DNA的細(xì)胞得以檢出。
E.coli是一種特別適用于克隆本發(fā)明DNA序列的原核宿主。微生物，如酵母，也可用于表達(dá)。釀酒酵母是一種優(yōu)選的酵母宿主，具有合適的帶有表達(dá)調(diào)控序列的載體、復(fù)制起始位點(diǎn)、終止序列及其它希望的特點(diǎn)。典型的啟動子包括3磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶?？烧T導(dǎo)的酵母啟動子包括，來自乙醇脫氫酶，同型細(xì)胞色素C和其它參與麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。
哺乳動物細(xì)胞是表達(dá)編碼免疫球蛋白及其片段的核苷酸序列的優(yōu)選宿主。參見，Winnacker，F(xiàn)rom Genes to Clones，(VCH Publishers，NY，1987)。本領(lǐng)域中發(fā)展了許多可以分泌完整異源蛋白的合適宿主細(xì)胞系，包括CHO細(xì)胞系、各種COS細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞、L細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系。優(yōu)選非人的細(xì)胞。這些細(xì)胞的表達(dá)載體包含表達(dá)調(diào)控序列，如復(fù)制起始位點(diǎn)、啟動子和增強(qiáng)子(Queen等，Immunol.Rev.8949(1986))，以及必須的加工信號位點(diǎn)，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪切位點(diǎn)、多聚腺苷酸位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選的表達(dá)調(diào)控序列是來自內(nèi)源基因、巨細(xì)胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒之類的啟動子。參見Co等，J.Immunol.1481149(1992)。
替代的，抗體編碼序列引入轉(zhuǎn)基因中，導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動物基因組并在轉(zhuǎn)基因動物乳汁中的后續(xù)表達(dá)(參見，例如US5,741,957，US5,304,489，US5,849,992)。合適的轉(zhuǎn)基因包括可操作的連接哺乳動物乳腺特異性基因(如酪蛋白或β乳球蛋白)的啟動子和增強(qiáng)子的輕鏈和重鏈的編碼序列。
根據(jù)宿主細(xì)胞類型，含有目的DNA節(jié)段的載體可以眾所周知的方式轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染常用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理、電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、粒子轟擊或病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染可用于其它細(xì)胞宿主。轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞的其它方法包括使用1，5-二甲基-1，5二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)、原生質(zhì)融合，脂質(zhì)體，電穿孔和顯微注射(一般參見Sambrook等，同上)。欲獲得轉(zhuǎn)基因動物，轉(zhuǎn)基因可以注射入受精卵細(xì)胞，或可以引入胚胎干細(xì)胞的基因組中，以及轉(zhuǎn)入去核卵細(xì)胞的核中。
表達(dá)后，可以根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)進(jìn)行純化，技術(shù)包括HPLC純化、柱層析，及凝膠電泳之類(一般參見Scopes，ProteinPurification(Springer-Verlag，NY，1982))。
3.載體蛋白質(zhì)一些誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物含有誘導(dǎo)對淀粉樣沉積物免疫應(yīng)答的合適表位，但它們太小而不具有免疫原性。在這種情況下，可以將肽免疫原連接到適當(dāng)?shù)妮d體上，以幫助誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。合適的載體包括血清白蛋白、鑰孔(keyhole limpet)血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白、破傷風(fēng)類毒素、或其它病原菌的類毒素，例如白喉，大腸桿菌，霍亂、或H.Pylori，或者減毒的毒素衍生物。其它載體包括結(jié)合多個MHC等位基因的T細(xì)胞表位，如，至少75％的全部人MHC等位基因。這些載體有時在本領(lǐng)域被稱為“通用T細(xì)胞表位”。通用T細(xì)胞表位的例子包括流感血凝素HA307-319PKYVKQNTLKLATPADRE(常見殘基由黑體表示)AKXVAAWTLKAAA瘧疾CST3表位EKKIAKMEKASSVFNV乙肝表面抗原HbsAg19-28FFLLTRILTI
熱激蛋白65hsp65153-171DQSIGDLIAEAMDKVGNEG卡介苗QVHFQPLPPAVVKL破傷風(fēng)毒素TT830-844QYIKANSKFIGITEL破傷風(fēng)毒素TT947-967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEHIV gp120T1KQIINMWQEVGKAMYA刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的其它載體包括細(xì)胞因子例如IL-1、IL-1α和β肽，IL-2、γINF、IL-10、GM-CSF、和趨化因子，例如M1P1α和β和RANTES。免疫原性的藥物還可以如O’Mahony，WO 97/17613和WO 97/17614所述與增強(qiáng)跨組織運(yùn)輸作用的肽相連。
免疫原性的藥物可以通過化學(xué)交聯(lián)連接到載體上。將免疫原連接到載體上的方法包括用N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基-硫基)-丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)(如果肽缺乏巰基，可以通過添加半胱氨酸殘基提供)形成二硫鍵連接。這些試劑在其自身和肽的半胱氨酸殘基之間建立了二硫鍵，以及通過賴氨酸上的ε-氨基或其它氨基酸中的其它游離氨基建立了酰胺鍵。免疫學(xué)研究(Immun.Rev.)62，185(1982)中描述了大量這類二硫/酰胺-形成試劑。其它的雙功能偶聯(lián)劑形成硫醚鍵而不是二硫鍵。商業(yè)提供了一些硫醚形成劑，包括6-馬來酰亞胺基己酸、2-溴乙酸、和2-碘乙酸、4-(N-馬來酰亞胺基-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸。羧基可以通過將其與琥珀酰亞胺或1-羥基-2-硝基-4-磺酸鈉鹽結(jié)合而激活。
免疫原性的肽還可以與載體(即異源肽)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)?？梢詫⒚庖咴缘碾牡陌被┒?、羧基末端、或兩端都連接載體。任選，在融合蛋白質(zhì)中可以多次重復(fù)出現(xiàn)免疫原性的肽。任選，免疫原性的肽可以連接異源肽的多個拷貝，例如，在該肽的N和C末端。一些載體肽誘導(dǎo)對該載體肽的幫助T細(xì)胞應(yīng)答。被誘導(dǎo)的幫助T細(xì)胞又誘導(dǎo)對該載體肽連接的免疫原性的肽的B細(xì)胞應(yīng)答。
本發(fā)明的一些藥物包括一種融合蛋白，其AβN末端片段的C端連有一載體肽。這些藥物中，Aβ片段的N末端殘基構(gòu)成融合蛋白的N末端殘基。相應(yīng)的，這種融合蛋白有效誘導(dǎo)那些結(jié)合需要AβN末端殘基以自由形式存在的表位的抗體。本發(fā)明的一些藥物包括多個其C端連接有一個或多個載體肽拷貝的AβN末端節(jié)段。并入融合蛋白的AβN末端片段有時開始于Aβ1-3，終止于Aβ7-11。Aβ1-7、Aβ1-3、1-4、1-5和3-7是優(yōu)選的AβN末端片段。一些融合蛋白含有不同AβN末端節(jié)段的串聯(lián)重復(fù)。例如，融合蛋白可以包括Aβ1-7，跟隨著Aβ1-3和一個異源多肽。
一些融合蛋白中，AβN末端節(jié)段在其N端融合了一個異源載體多肽。也可以使用與AβN末端節(jié)段的相同種類的C端融合物。一些融合蛋白含有異源多肽，其連接了AβN末端節(jié)段的N端，而該Aβ的N末端片段又連接以串聯(lián)形式存在的一個或多個另外的AβN末端節(jié)段。
適用于本發(fā)明的融合蛋白的例子在以下有所表明。這些融合蛋白中的一些融合蛋白含有與破傷風(fēng)毒素表位連接的Aβ節(jié)段，在US 5,196,512，EP 378,881和EP 427,347中作了說明。一些融合蛋白含有與載體肽(說明于US 5,736,142中)連接的Aβ節(jié)段。一些異源肽是通用T細(xì)胞表位。一些方法中，給藥的藥物簡單的是單一的融合蛋白，其中Aβ片段與一個異源多肽以線性構(gòu)象連接。一些方法中，藥物是代表結(jié)構(gòu)為2X的融合蛋白多聚體，其中X是1-5的整數(shù)形式。優(yōu)選的，X是1、2或3，其中2是最優(yōu)選的。當(dāng)X為2時，這種多聚體具有以優(yōu)選構(gòu)象相連的四個融合蛋白，稱為MAP 4(參見US 5,229,490)。Aβ的表位是下畫線的。
以下展示了MAP 4的構(gòu)象，其中分支結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生是通過在N末端和賴氨酸的惻鏈氨基上起始肽鏈的合成?；谛蛄兄泻驮试S分支的賴氨酸的數(shù)量，產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)具有多個N末端。在此例中，帶有賴氨酸的核心上產(chǎn)生了四個相同的N末端。這種多重性極大的增強(qiáng)了關(guān)聯(lián)B細(xì)胞的應(yīng)答性。
肽KGG肽KA肽KGG肽AN90549(MAP4構(gòu)象中的Aβ1-7/破傷風(fēng)毒素830-844)DAEFRHDQYIKANSKFIGITELAN90550(MAP4構(gòu)象中的Aβ1-7/破傷風(fēng)毒素947-967)DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEAN90542(線性構(gòu)象中的Aβ1-7/破傷風(fēng)毒素830-844+947-967)DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEAN90576(MAP4構(gòu)象中的Aβ3-9/破傷風(fēng)毒素830-844)EFRHDSGQYIKANSKFIGITELUS 5,736,142中所述肽(均為線性構(gòu)象)AN90562(Aβ1-7/肽)AKXVAAWTLKAAADAEFRHDAN90543(Aβ1-7x3/肽)DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA其它融合蛋白的例子(Aβ的免疫原表位黑體)有AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHDDAEFRHD-AKXVAAWTLKAAADAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGRFRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGREFRHDSG-
ISQAVHAAHAEINEAGRPKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHDDAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHDDAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLATDAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLATDAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHDDAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEDAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-CFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEDAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-CFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD位于具有兩個分支的一個樹脂上的DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL肽Lys-Gly-Cys肽EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR(MAP4構(gòu)象中的同型核蛋白融合蛋白)相同或相似的載體蛋白以及連接方法可用于獲得被用來制備被動免疫中抗Aβ抗體的免疫原。例如，連接載體的Aβ或片段可以給藥實驗動物，以獲得Aβ的單克隆抗體。
4.編碼治療藥物的核酸對淀粉樣沉積物的免疫應(yīng)答也可以通過給藥編碼Aβ肽的節(jié)段、或其片段，或其它肽免疫原、或用于被動免疫的抗體及其鏈組分的核酸進(jìn)行誘導(dǎo)。所述核酸可以是DNA或RNA。編碼免疫原的核酸節(jié)段典型地與調(diào)控元件相連，例如啟動子和增強(qiáng)子，這使DNA節(jié)段得以在患者的預(yù)期靶細(xì)胞中表達(dá)。對于在血細(xì)胞中的表達(dá)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答理想的是，來自免疫球蛋白輕鏈或重鏈基因的啟動子和增強(qiáng)子元件或者CMV主要中早期啟動子和增強(qiáng)子適用于指導(dǎo)表達(dá)。相連的調(diào)控元件和編碼序列通?？寺〉捷d體中。給藥雙鏈抗體時，其兩條鏈可以克隆于同一個載體中，也可以分別克隆于不同載體中。
公開的一些病毒載體系統(tǒng)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(參見例如，Lawrie和Tumin，遺傳學(xué)進(jìn)展的目前觀點(diǎn)(Cur.Opin.Genet.Develop.)3，102-109(1993))；腺病毒載體(參見例如，Bett等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)67，5911(1993))；腺相關(guān)病毒載體(參見例如，Zhou等，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)179，1867(1994))，來自痘病毒家族的病毒載體，包括痘苗病毒和禽痘病毒，來自α病毒屬的病毒載體，例如來自新培斯病毒和塞姆利基森林病毒的載體(參見例如，Dubensky等，病毒學(xué)雜志，70，508-519(1996)，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(參見US5,643,576)和甲病毒如水泡性口膜炎病毒(參見WO96/34635)以及乳頭瘤病毒(Ohe等，人類基因治療(Human Gene Therapy)6，325-333(1995)；Woo等，WO94/12629和Xiao和Brandsma，核酸研究(Nucleic Acids.Res.)24，2630-2622(1996))。
編碼免疫原的DNA或含該DNA的載體可以包裝于脂質(zhì)體中。合適的脂質(zhì)和相關(guān)類似物由US 5208036，5264618，5279833和5283185所描述。載體和編碼免疫原的DNA還可以吸附或連接到顆粒性載體上，載體的例子包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚丙交酯類以及聚(丙交酯-共-乙交酯)，參見例如，McGee等，J.Micro Encap.(1996)。
可以通過對個體患者給藥，向體內(nèi)傳遞基因治療載體或裸DNA，典型地通過全身給藥(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻腔、胃、皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、或頭顱內(nèi)灌輸)或者局部給藥(參見例如US 5,399,346)。這種載體進(jìn)一步可以包含如丁哌卡因的輔助藥物(US 5,593,970)。還可以利用基因槍給藥DNA。參見Xiao和Brandsma，同上。編碼免疫原的DNA可以沉淀到極微金屬珠表面。用沖擊波或擴(kuò)散氦氣加速微拋射體，使它透過組織到達(dá)幾個細(xì)胞層的深度。例如，Agacetus，Inc.Middleton WI生產(chǎn)的AccelTM基因傳送裝置是適用的?；蛘?，僅需將裸DNA點(diǎn)在皮膚上伴隨化學(xué)或機(jī)械刺激即可使DNA穿過皮膚到達(dá)血流(參見WO 95/05853)。
在進(jìn)一步的改進(jìn)中，可以將編碼免疫原的載體輸送給離體細(xì)胞，例如來自個體患者的移植細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞、骨髓穿刺液、組織活檢)或者一般供體的造血干細(xì)胞，通常在篩選插入了載體的細(xì)胞后，再次將細(xì)胞移植到患者體內(nèi)。
III.篩選具有清除活性的抗體本發(fā)明提供在淀粉樣沉積物，或其它抗原，或相關(guān)生物實體的清除中具有活性的抗體的篩選方法，這種清除活性是所期望的。篩選對淀粉樣沉積物的清除活性，來自阿爾茨海默氏病患者或具有阿爾茨海默氏病病理現(xiàn)象之動物的腦部組織樣品與帶有Fc受體的吞噬細(xì)胞(如小膠質(zhì)細(xì)胞)，以及受測抗體在體外培養(yǎng)介質(zhì)中接觸。吞噬細(xì)胞可以是初級培養(yǎng)物或如BV-2、C8-B4、THP-1之類的細(xì)胞系。一些方法中，這些成分被集合于顯微載玻片上以便顯微監(jiān)控。一些方法中，多個反應(yīng)在微量滴定板的孔中平行進(jìn)行。這種方式中，獨(dú)立的微型顯微載玻片可以放置在獨(dú)立的小孔中，或者，在可以使用非顯微檢測的方式，如Aβ的ELISA檢測。優(yōu)選的，對體外反應(yīng)混合物中淀粉樣沉積物的數(shù)量進(jìn)行量化，從反應(yīng)前的基線水平開始，反應(yīng)進(jìn)行中的一個或多個測試值。抗原可以通過染色檢測，如熒光標(biāo)記的抗Aβ或其它淀粉樣沉積物的抗體。用于染色的抗體可以與受測清除活性的抗體相同，也可以不同。如果在淀粉樣沉積的反應(yīng)中出現(xiàn)相對于基線的降低，則認(rèn)為受測抗體具有清除活性。這些抗體可能可以用于預(yù)防或治療阿爾茨海默氏病和其它致淀粉樣病。
類似的方法可以用于篩選在清除其它類型生物實體中具有活性的抗體。該分析可以用于對幾乎任何類型生物實體的清除活性的檢測。典型的，生物實體在人和動物的疾病中有其作用。生物實體可以組織樣品或獨(dú)立的形式提供。如果是組織樣品，優(yōu)選非固定的組織樣品，使其成分易于接觸，以及可以避免在固定狀況時對成分構(gòu)象的干擾。在本分析中可用于測試的組織樣品包括癌組織、癌變前組織、良性生長的組織如瘤或痣、感染了病原微生物的組織、炎癥細(xì)胞所浸潤的組織、含有細(xì)胞間病理基質(zhì)(如纖維蛋白性心包炎)的組織、帶有異常抗原的組織，以及芽痕組織?？梢允褂玫囊逊蛛x的生物實體包括Aβ、病毒抗原或病毒、蛋白聚糖、其它病原微生物的抗原、腫瘤抗原，以及粘連分子。這些抗原可以從天然來源、重組表達(dá)或化學(xué)合成方法，或其它方式獲得。該組織樣品或已分離的生物實體與帶有Fc受體的吞噬細(xì)胞(如小膠質(zhì)細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞)，以及受測抗體在培養(yǎng)介質(zhì)中接觸。該抗體可能針對受測生物實體或與之相關(guān)的抗原。在后一種情況，目的在于測試是否帶有該抗原的生物實體間接地被吞噬。通常的，盡管并不一定，抗體與生物實體(有時是相關(guān)抗原)的接觸發(fā)生在吞噬細(xì)胞加入之前。然后監(jiān)測殘存于培養(yǎng)介質(zhì)中的生物實體和/或相關(guān)抗原(如果存在)的濃度。培養(yǎng)介質(zhì)中的生物實體或相關(guān)抗原濃度或數(shù)量的減少顯示，在吞噬細(xì)胞參與時，該抗體對于該生物實體和/或相關(guān)抗原具有清除活性。
IV.接受治療的患者。
接受治療的患者包括具有患病風(fēng)險，但沒有表現(xiàn)出癥狀的個體，以及目前表現(xiàn)出癥狀的患者。對于阿爾茨海默氏病，實際上任何人，只要他或她活得足夠長，都存在患阿爾茨海默氏病的風(fēng)險。因此，本發(fā)明可以對普遍群體預(yù)防性給藥，而無需評估受試患者的危險。本發(fā)明尤其對已知具有阿爾茨海默氏病遺傳危險的個體有效。所述個體包括有患該病經(jīng)歷的親屬，和通過遺傳學(xué)和生化標(biāo)記分析確定存在風(fēng)險的人群。對于阿爾茨海默氏病的風(fēng)險遺傳學(xué)標(biāo)記包括APP基因的突變，尤其是在717位，670和671位的突變(分別被稱為Hardy突變和瑞典突變(Swedish mutation))(參見Hardy，TINS，同上)。其他危險標(biāo)記是早衰素基因(PS1和PS2)以及ApoE4中的突變、AD家族史、血膽固醇過多或動脈粥樣硬化。正患阿爾茨海默氏的個體可以通過特征性癡呆以及上述危險因子的存在識別。另外，可利用大量鑒定患AD的患者的診斷實驗。這些實驗包括測定CSFτ和Aβ42的水平。升高的τ和Aβ42水平下降表示患有AD。也可以通過實施例部分論述的ADRDA標(biāo)準(zhǔn)診斷患阿爾茨海默氏病的個體。
對于無癥狀患者，可以在任何年齡開始治療(例如10，20，30)。然而，通常在患者到40，50，60或70歲時，才需要開始治療。治療通常需要在一段時期內(nèi)多劑量給藥?？梢酝ㄟ^分析抗體、或激活的T-細(xì)胞或B-細(xì)胞對超時治療藥物(例如Aβ肽)的應(yīng)答，來監(jiān)測治療。如果應(yīng)答失敗，表明需要升高劑量。對于潛在的唐氏綜合癥患者，可以在產(chǎn)前對母親給藥治療藥物開始治療，也可以在出生后不久對患者給藥。
V.治療方案在預(yù)防應(yīng)用中，對易感阿爾茨海默氏病、或相反存在患阿爾茨海默氏病危險的患者給藥足以消除或降低危險、減輕重癥、或延緩疾病發(fā)作劑量的藥物組合物或藥物，癥狀包括疾病的生化、組織學(xué)和/或行為癥狀，疾病發(fā)展中出現(xiàn)的中間病理現(xiàn)象及其復(fù)雜性。在治療應(yīng)用中，對易感或已經(jīng)患所述疾病的患者給藥足以治愈或至少部分抑制疾病癥狀(生化、組織學(xué)和/或行為癥狀，包括疾病發(fā)展中出現(xiàn)的中間病理現(xiàn)象及其復(fù)雜性)劑量的組合物或藥物。一些方法中，藥物的給藥減少或消除了尚未表現(xiàn)典型阿爾茨海默氏病病理現(xiàn)象的患者的認(rèn)知損傷。足以實現(xiàn)上述效果的量被稱為治療-或預(yù)防-有效劑量。在預(yù)防和治療方案中，通常均給藥幾個劑量，直到實現(xiàn)充分的免疫應(yīng)答。通常監(jiān)測免疫應(yīng)答，如果免疫應(yīng)答開始衰弱則重復(fù)給藥。
對于治療上述病癥，本發(fā)明組合物的有效劑量隨一些不同因素而改變，包括給藥方法、靶部位、患者的生理狀況、患者是人還是動物、給藥的其他藥物、以及處理是治療性的還是預(yù)防性的。通常，患者為人，但也可以治療包括轉(zhuǎn)基因哺乳動物在內(nèi)的非人哺乳動物。需要測定治療劑量，以優(yōu)化安全性和有效性。免疫原的量依賴于是否還給藥佐劑，如果沒有佐劑則需要較高劑量。用于給藥的免疫原的量有時在每位患者1μg到500μg內(nèi)變化，更經(jīng)常每次對人注射5-500μg。偶爾使用每次注射1-2mg的較高劑量。典型地每次對人注射約10、20、50、100μg。免疫原的量也依賴于免疫原內(nèi)免疫原表位在整體免疫原總量中的比率。典型的，微克的免疫原使用10-3到10-5微摩爾的免疫原表位。值得注意的是注射時間可以從一天一次、到一年一次、到十年一次變化。在任何預(yù)定的給用一劑量的免疫原的那一天，如果還給藥佐劑，則劑量高于1μg/位患者，通常高于10μg/位患者，如果沒有佐劑則劑量高于10μg/位患者，通常高于100μg/位患者。典型療法包括一次免疫，然后以6周間隔加強(qiáng)注射。另一種療法包括一次免疫，隨后1、2和12個月后加強(qiáng)注射。另一種療法需要終生每兩周注射一次?；蛘?，可以如監(jiān)測免疫應(yīng)答所示，不定期加強(qiáng)注射。
對于利用抗體的被動免疫，劑量范圍為約0.0001到100mg/kg受體體重，更經(jīng)常為0.01到5mg/kg受體體重。例如，劑量可能為1mg/kg受體體重或10mg/kg受體體重或在1-10mg/kg受體體重范圍之內(nèi)。典型的治療方案包括每兩周、或每個月，或每3-6個月給藥。一些方法中，同時給藥兩個或多個具有不同結(jié)合特異性的抗體，這種情況每種抗體的給藥劑量降到說明的范圍內(nèi)。抗體通常多次給藥。每次的間隔可以是以周、月、年記。間隔也可以是不定期的，如通過測試患者Aβ的抗體血液水平所示。一些方法中，劑量被調(diào)整到使血漿中抗體濃度為1-1000μg/ml，一些方法中為25-300μg/ml。替代的，抗體可以持續(xù)釋放劑量給藥，這種情況下，不能頻繁給藥。根據(jù)患者的抗體半衰期改變劑量和頻率。一般，人抗體有最長的半衰期，接下來依次為人源化抗體、嵌合抗體、和非人抗體。給藥劑量和頻率也依賴是否治療性或預(yù)防性目的。在預(yù)防性應(yīng)用中，在一段長的時期內(nèi)，以相對不頻繁的間隔，給藥相對較低的劑量。一些患者在其余生中繼續(xù)受到治療。在治療性應(yīng)用中，要求以相對較短的間隔給藥相對較高的劑量，直到疾病的發(fā)展得以減輕或終止，更優(yōu)選的，直到該患者的疾病癥狀有部分或完全的改善。在此之后，可以給藥患者一種預(yù)防性的方案。
編碼免疫原的核酸的劑量范圍為10ng到1g，100ng到100mg，1μg到10mg，或30-300μgDNA每位患者。注射感染性病毒載體的劑量為每劑量10-100個毒?；蚋喽玖?。
誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物可以經(jīng)非腸道、局部、靜脈、口腔、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或肌內(nèi)方式給藥，用于預(yù)防和/或治療處理。最典型的免疫原藥物給藥途徑為皮下給藥，當(dāng)然其它同樣有效。其次最常用的是肌內(nèi)注射。這種注射類型最典型地在胳膊或腿的肌肉內(nèi)注射。在一些方法中，直接將藥物注射到沉積物累積的特別組織中，例如顱內(nèi)注射?？贵w給藥優(yōu)選靜脈輸注的肌內(nèi)注射。一些方法中，特異性的治療抗體直接注射于顱內(nèi)。一些方法中，抗體以一種緩釋組合物或裝置(如MedipadTM裝置)給藥。
本發(fā)明的藥物任選與其它治療致淀粉樣病至少部分有效的藥物組合給藥。對于腦中發(fā)生淀粉樣沉積物的阿爾茨海默氏病和唐氏綜合癥，還可以將本發(fā)明的藥物與其它促進(jìn)本發(fā)明藥物穿過血腦屏障的藥物組合給藥。
本發(fā)明的免疫原藥物，例如肽，有時與佐劑聯(lián)合給藥。可以使用多種佐劑與肽(例如Aβ)聯(lián)合使用，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。優(yōu)選的佐劑增強(qiáng)對免疫原的固有應(yīng)答，而不導(dǎo)致影響應(yīng)答定性形式的免疫原的構(gòu)象改變。優(yōu)選的佐劑包括氫氧化鋁和磷酸鋁、3脫-氧-?；瘑瘟柞Ｖ怉(MPLTM)(參見GB 2220211RIBI ImmunoChem Reseach Inc.，Hamilton，Montana，現(xiàn)為Corixa的一部分)。StimulonTMQS21是從南美發(fā)現(xiàn)的Quillaja Saponaria Molina樹的樹皮中分離出的三萜糖甙或皂甙(參見Kensil等，疫苗設(shè)計亞基和佐劑研究(Vaccine DesignThe Subunit andAjuvant Approach)(Powell和Newman編，Plenum出版社，NY，1995)；美國專利號5057540)(Aguila Bio Pharmaleaticals，F(xiàn)ramingham，MA)。其它佐劑是水包油型乳劑(例如角鯊烯或花生油)，任選與免疫刺激物(例如單磷酰脂類A)組合(參見Stoute等，N.Engl.J.Med.336，86-91(1997))。另一種佐劑是CpG(WO98/40100)?；蛘?，可以將Aβ與佐劑偶聯(lián)。然而，這種偶聯(lián)應(yīng)答基本上不改變Aβ的結(jié)構(gòu)，以不影響其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的性質(zhì)。佐劑可以作為治療組合物的一種成分與活性藥物一起給藥，也可以在給藥治療藥物之前、同時、或之后單獨(dú)給藥。
佐劑的優(yōu)選種類為鋁鹽(明礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁。這種佐劑可以與或不與其它特別的免疫刺激劑(例如MPL或3-DMP、QS21、多聚或單體氨基酸例如多聚谷氨酸或多聚賴氨酸)一起使用。另一種佐劑是水包油型乳劑。這種佐劑可以與或不與其它特別的免疫刺激劑(例如胞壁酰肽(例如，N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕櫚酰-sn-丙三氧基-3-羥磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)、N-乙酰葡糖氨基-N-乙酰胞壁酰-L-鋁-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-二棕櫚酰氧基丙酰胺(DTP-DPP)theramideTM))，或者其它細(xì)菌細(xì)胞壁成分。水包油型乳劑包括(a)MF59(WO 90/14837)，含5％角鯊烯、0.5％吐溫80，和0.5％Span 85(任選含有各種量的MTP-PE)，用微型流化床器(例如110Y型微型流化床器，Microfluidics，Newton MA)配制成亞微細(xì)顆粒，(b)SAF，含有10％角鯊烯、0.4％吐溫80、5％普羅尼克-嵌段共聚物L(fēng)121、和thr-MDP，微流化成亞微細(xì)粒乳劑或者旋渦振蕩產(chǎn)生較大顆粒的乳劑，以及(c)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(Ribi ImmunoChem.Hamilton，MT)，含有2％角鯊烯、0.2％吐溫80、以及由下述成分組成的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分，單磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM)。另一種優(yōu)選佐劑是皂甙佐劑，例如StimulonTM(QS21，Aquila，F(xiàn)ramingham，MA)或者由它們產(chǎn)生的顆粒例如ISCOMs(免疫刺激復(fù)合物)和ISCOMATRIX。其它佐劑包括完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。其它佐劑包括細(xì)胞因子，例如白介素(IL-1、IL-2和IL-12)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)。
佐劑可以與免疫原一起作為單一組合物給藥，或者可以在免疫原給藥之前、同時或之后給藥。免疫原和佐劑可以包裝在同一個小藥水瓶中使用，也可以各自包裝于單獨(dú)小藥水瓶，使用前混合。通常將免疫原和佐劑包裝于貼有標(biāo)明預(yù)期治療應(yīng)用標(biāo)記的容器內(nèi)。如果免疫原和佐劑單獨(dú)包裝，包裝通常包括使用前混合的指示。佐劑和/或載體的選擇依賴于含佐劑的免疫原制劑的穩(wěn)定性、給藥途徑、劑量方案、佐劑對被接種的物種的效力，對于人類，可藥用的佐劑是經(jīng)有關(guān)管理機(jī)構(gòu)認(rèn)可或可接受用于對人給藥的佐劑。例如，完全弗氏佐劑不適于對人給藥。明礬、MPL和QS21是優(yōu)選的。任選地，可以同時使用兩種或多種不同佐劑。優(yōu)選組合包括明礬與MPL，明礬與QS21，MPL與QS21，以及明礬、QS21和MPL。也可以使用不完全弗氏佐劑(Chang等，先進(jìn)藥物傳送綜述(Advanced Drug Delivery Reviews)32，173-186(1998))，任選與明礬、QS21、和MPL中的一種和它們的組合一起給藥。
本發(fā)明的藥物通常作為包含活性治療藥物，和很多其它可藥用成分的藥物組合物給藥。參見Remington’s藥物學(xué)(第15版，Mack出版公司，Easton，Pennsylvania，1980)。優(yōu)選劑型根據(jù)預(yù)期給藥和治療應(yīng)用方式?jīng)Q定。組合物還可以根據(jù)所需的劑型包括可藥用的、非毒性載體或稀釋劑，它們被認(rèn)為是常規(guī)用于配制給動物或人給藥的藥物組合物的載體。稀釋劑根據(jù)不影響組合物的生物活性來選擇。這類稀釋劑的例子是蒸餾水、生理磷酸鹽緩沖液、林格液，葡萄糖溶液、和Hank’s溶液。另外，藥物組合物或制劑還可以包括其它載體，佐劑，或非毒性、非治療性、非免疫原性穩(wěn)定劑等。
藥物組合物還可以包括較大的、代謝緩慢的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖如聚氨基葡糖、聚乳酸、聚羥基乙酸和共聚物(例如樹膠功能化瓊脂糖凝膠TM、瓊脂糖、纖維素等)，多聚氨基酸，氨基酸共聚物，和脂類聚集物(例如油滴或脂質(zhì)體)。另外，這些載體具備作為免疫刺激劑的功能(即佐劑)。
對于非腸道給藥，本發(fā)明的藥物可以作為溶液或物質(zhì)在生理可接受稀釋劑中的懸浮液的可注射劑型與藥劑載體(可以是無菌液體，例如水油、鹽水、甘油、或乙醇)一起給藥。另外，組合物中還可以含有輔助物質(zhì)，例如保濕劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩沖物質(zhì)等。藥物組合物的其它成分是石油，動物、植物、或合成來源的，例如，花生油、大豆油、和礦物油。液體載體通常優(yōu)選二醇例如丙二醇或聚乙二醇，尤其是可注射溶液?？贵w可以以儲存注射的形式或移植制劑的形式給藥，其中可以以使活性成分持續(xù)或脈動釋放的方式配制它們。一個范例的組合物包括5mg/ml的單克隆抗體存在于水相緩沖液(含有50mM L-組氨酸，150mM NaCl，用HCl調(diào)整pH到6.0)中。
典型地，將組合物制備成液體溶液或懸浮液的可注射形式；也可以制備成注射前溶解于或懸浮于液體載體的固體劑型。如前面的論述，還可以將制劑乳化于或包埋于脂質(zhì)體或微顆粒，例如聚丙交酯、聚乙交酯、或共聚物中，用于增強(qiáng)佐劑效果(參見Langer，科學(xué)，249，1527(1990)和Hanes，先進(jìn)藥物傳送綜述28，97-119(1997)。本發(fā)明的藥物可以以儲存注射的形式或移植制劑的形式給藥，其中可以以使活性成分持續(xù)或脈動釋放的方式配制它們。
適合其它給藥方式的其它劑型包括口服、鼻內(nèi)應(yīng)用、和肺部應(yīng)用的制劑，栓劑、和透皮應(yīng)用制劑。
對于栓劑，粘合劑和載體包括，例如，聚亞烷基二醇或甘油三酸酯；該栓劑可以通過含活性成分在0.5％到10％，優(yōu)選1％-2％范圍內(nèi)的混合物制備?？诜苿┌ㄙx形劑，例如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、和碳酸鎂。這些組合物配制成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、控釋制劑或粉劑的形式，含有10％-95％活性成分，優(yōu)選25％-70％活性成分。
局部應(yīng)用可以制成透皮或皮內(nèi)給藥制劑。局部給藥可以通過共同給藥霍亂毒素或其脫毒衍生物或亞基，或者其它類似細(xì)菌毒素促進(jìn)(參見Glenn等，自然391，851(1998))。通過應(yīng)用經(jīng)化學(xué)交聯(lián)得到的作為混合劑或連接分子的成分，或者表達(dá)為融合蛋白，實現(xiàn)共同給藥。
或者，利用皮膚通道或利用轉(zhuǎn)移體(transferosome)實現(xiàn)透皮給藥。(Paul等，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)25，3521-24(1995)；Cevc等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(Biochem.Biophys.Acta)1368，201-15(1998))。
VI.診斷方法本發(fā)明提供了檢測患有或易感阿爾茨海默氏病的患者體內(nèi)對Aβ的免疫應(yīng)答。本方法對于監(jiān)測接受給藥患者的治療過程尤其有用。本發(fā)明可以用于監(jiān)測有癥狀患者的治療處理以及無癥狀患者的預(yù)防處理。本發(fā)明可以用于監(jiān)測主動免疫(例如，對給藥免疫原應(yīng)答表達(dá)的抗體)和被動免疫(例如，檢測給藥抗體的水平)。
I.主動免疫一些方法需要確定一個劑量的藥物給藥之前患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答基線水平，然后將該值與治療后的免疫應(yīng)答值相比較。免疫應(yīng)答水平的顯著增加(即同一樣品重復(fù)測定中，高于試驗誤差的典型界限，表示為所述測定平均值基礎(chǔ)上的標(biāo)準(zhǔn)差)表明治療結(jié)果為陽性(即，藥物的給藥得到了或增強(qiáng)了免疫應(yīng)答)。如果免疫應(yīng)答的水平?jīng)]有顯著改變，或者有所降低，表明陰性治療結(jié)果。通常，接受藥物治療的患者使用連續(xù)劑量時在初期表現(xiàn)為增加的免疫應(yīng)答，其最終達(dá)到穩(wěn)定期。藥物的給藥通常是連續(xù)的，而免疫應(yīng)答是不斷增加的。穩(wěn)定期的獲得表明治療給藥可以間斷或者可以減少劑量或者次數(shù)。
在其它方法中，測定對照組免疫應(yīng)答的對照值(即，平均值和標(biāo)準(zhǔn)差)。典型地，對照組中的個體沒有接受預(yù)先治療。然后將給藥治療劑后患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答測量值與對照值比較。相對于對照值的顯著增加(例如高于平均值的一個標(biāo)準(zhǔn)差)表明陽性治療結(jié)果。缺乏明顯的增加或降低表明陰性治療結(jié)果。通常連續(xù)給藥藥物，免疫應(yīng)答相對于對照值不斷增加。和前面一樣，相對于對照對照值出現(xiàn)穩(wěn)定期，表明治療給藥可以間斷，或者降低劑量或次數(shù)。
在其它方法中，測定接受治療藥物處理并且免疫應(yīng)答對治療的響應(yīng)已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定期的個體對照組的免疫應(yīng)答對照值(例如平均值和標(biāo)準(zhǔn)差)?；颊唧w內(nèi)免疫應(yīng)答的測定值與對照值相比較。如果患者的測定值相對于對照值沒有顯著的不同(例如，高于一個標(biāo)準(zhǔn)差)，則治療可以間斷。如果患者體內(nèi)的水平顯著低于對照值，則需要保證連續(xù)給藥藥物。如果患者體內(nèi)的水平持續(xù)低于對照值，則改變治療方案，例如，可能預(yù)示應(yīng)用不同的佐劑。
在其它方法中，對目前沒有接受治療但以前曾接受一個療程治療的患者監(jiān)測免疫應(yīng)答，以確定是否需要再繼續(xù)治療。在早先一個療程治療之后，可以將患者體內(nèi)免疫應(yīng)答的測量值與患者以前獲得的免疫應(yīng)答值比較。相對于前期測量顯著降低(即在相同樣品的重復(fù)測量中，高于誤差的典型界限)表明可以恢復(fù)治療。或者，可以將患者的測量值與接受一個療程治療后的患者組測定的對照值相比較(平均值+標(biāo)準(zhǔn)差)?；蛘撸梢詫⒒颊叩臏y量值與接受預(yù)防處理、沒有遺留疾病綜合癥的患者組或者接受治療處理、表現(xiàn)疾病癥狀改善的患者組體內(nèi)的對照值相比較。在所有這些情況下，相對于對照水平的顯著降低(即，超過一個標(biāo)準(zhǔn)差)表明患者應(yīng)當(dāng)再繼續(xù)治療。
用于分析的組織樣品典型的是來自患者的血液、血漿、血清、粘液或腦脊液。分析樣品對任何形式的Aβ肽，典型地是Aβ42的免疫應(yīng)答標(biāo)記?？梢酝ㄟ^例如，特異性結(jié)合Aβ肽的抗體或T-細(xì)胞的存在確定免疫應(yīng)答。實施例部分描述了檢測特異于Aβ的抗體的ELISA法。檢測反應(yīng)性T-細(xì)胞的方法前面已經(jīng)描述過(參見定義)。一些方法中，免疫應(yīng)答的確定是通過上述第三部分中的清除分析。這些方法中，來自被測試患者的組織樣品與淀粉樣沉積物(例如，來自PDAPP鼠)及帶有Fc受體的吞噬細(xì)胞接觸。檢測隨之而來的淀粉樣沉積物的清除。清除應(yīng)答的存在和程度顯示了在被測患者組織樣品中有效清除Aβ的抗體的存在和水平。
2.被動免疫一般的，監(jiān)測被動免疫的方法與上述的監(jiān)測主動免疫的方法相似。然而，被動免疫后的抗體濃度先是迅速上升到峰值，接著指數(shù)性降低。如果沒有另外的給藥，根據(jù)給藥抗體半衰期的不同，將在幾天到幾月的時期內(nèi)降低至處理前的水平。例如，人抗體半衰期為20天。
一些方法中，在給藥前對患者的Aβ抗體進(jìn)行基線量測，在此之后的第二次量測是為確定抗體的峰值，間隔進(jìn)行一次或更多次的量測，以監(jiān)測抗體的下降?？贵w降低到基線或預(yù)先確定的峰值的更低基線(如50％、25％、或10％)，給藥另一劑量的抗體。一些方法中，峰值或其后測定的更低背景與預(yù)先確定的參照相比較，以構(gòu)成對其他患者產(chǎn)生有益的預(yù)防性或治療性處理方案。如果測得的抗體水平明顯小于參照水平(例如，小于治療受益的患者群中參照值平均數(shù)減去一個標(biāo)準(zhǔn)差)，表明需要施用額外劑量的抗體。
3.診斷試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步提供了進(jìn)行上述診斷方法的診斷試劑盒。通常，該試劑盒含有特異性結(jié)合Aβ抗體的試劑。試劑盒還包括一種標(biāo)記物。對于檢測Aβ抗體，標(biāo)記物通常是被標(biāo)記的抗獨(dú)特型抗體的形式。對于檢測抗體，可以預(yù)先將試劑結(jié)合到固相上使用，例如結(jié)合到微滴定平皿的孔中。試劑盒典型地還含有提供使用試劑盒指導(dǎo)的標(biāo)簽。該標(biāo)簽還可以包括顯示測量的標(biāo)記水平與Aβ抗體之間相關(guān)性的圖或其他相應(yīng)方式。術(shù)語“標(biāo)簽”指在試劑盒的生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售或使用的任何時間，貼附于或包在試劑盒中的任何書寫或記錄材料。例如，術(shù)語“標(biāo)簽”包括廣告宣傳頁和手冊、包裝材料、說明書、音頻或視聽磁帶、計算機(jī)磁盤、以及直接印刷在試劑盒上的書寫印記。
本發(fā)明還提供了進(jìn)行體內(nèi)成像的診斷試劑盒。該試劑盒典型地含有結(jié)合Aβ表位的抗體，優(yōu)選是1-10殘基。優(yōu)選的，試劑盒含有標(biāo)記抗體或二級標(biāo)記藥物。優(yōu)選的，試劑盒含有提供進(jìn)行體內(nèi)成像分析的說明的標(biāo)簽。
VII.體內(nèi)成像本發(fā)明提供了對患者淀粉樣沉積物的體內(nèi)成像方法。這種方法可用于診斷或確證阿爾茨海默氏病，或?qū)ζ涞膽岩?。例如，該方法可用于出現(xiàn)癡呆癥狀的患者。如果患者有異常的淀粉樣沉積物，則該患者可能患有阿爾茨海默氏病。該方法也可用于無癥狀的患者。異常淀粉樣沉積物的存在表明將來易發(fā)展為有癥狀疾病。該方法也可用于監(jiān)測疾病的發(fā)展和/或早先被診斷為阿爾茨海默氏病患者對治療的應(yīng)答。
該方法給藥一種結(jié)合患者Aβ的藥物，如抗體，并在其結(jié)合后檢測該藥物。優(yōu)選的抗體結(jié)合患者的Aβ沉積物，但不結(jié)合全長的APP多肽。特別優(yōu)選結(jié)合于Aβ氨基酸1-10內(nèi)表位的抗體。一些方法中，抗體結(jié)合于Aβ氨基酸7-10內(nèi)的表位。這類抗體典型地結(jié)合且不誘導(dǎo)顯著的清除應(yīng)答。其它方法中，抗體結(jié)合于Aβ氨基酸1-7內(nèi)的表位。這類抗體典型地結(jié)合并誘導(dǎo)對Aβ的清除應(yīng)答。然而，利用缺少一個全長恒定區(qū)的抗體片段，如Fab，可以避免這種清除應(yīng)答。一些方法中，同樣的抗體可以作為治療和診斷藥物。一般的，結(jié)合Aβ10的C末端表位的抗體沒有與結(jié)合1-10內(nèi)表位的抗體相似的強(qiáng)信號。可能因為淀粉樣沉積物內(nèi)的C末端表位是難于接觸的。相應(yīng)的，這種抗體較不被優(yōu)選。
可以通過靜脈注射患者身體，或顱內(nèi)注射(或滴入頭骨的小孔)腦部，給藥診斷性藥物。藥物的劑量應(yīng)處于治療方法中劑量范圍內(nèi)。典型的，藥物是標(biāo)記的。盡管在一些方法中，與Aβ親和的一級藥物未標(biāo)記，而使用結(jié)合一級藥物的標(biāo)記二級藥物，標(biāo)記的選擇基于檢測方式。例如，熒光標(biāo)記適用于光學(xué)檢測。順磁標(biāo)記適用于無須手術(shù)參與的X射線斷層檢測。活性放射標(biāo)記也可以用PET或SPECT檢測。
比較標(biāo)記位點(diǎn)與相應(yīng)基線值的數(shù)目、大小和/或強(qiáng)度以進(jìn)行診斷。基線值代表未感病群體的平均水平。基線值也代表同一患者先前確定的水平。例如，基線值可以在患者治療開始前確定，而之后的數(shù)值可與基線值比較。相對于基線的數(shù)值的下降是治療陽性的信號。
實施例I.抗AD的Aβ的預(yù)防功效這些實施例描述了對存在717位突變的APP(APP717V→F)過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠給藥Aβ42肽，預(yù)先使它們形成阿爾茨海默氏病樣神經(jīng)病理學(xué)。Games等(自然，同上)描述了這些小鼠(PDAPP小鼠)的產(chǎn)生和特征。在這些動物的雜合型中，六個月后開始沉積Aβ。到十五個月，它們表現(xiàn)出的Aβ沉積水平與阿爾茨海默氏病中觀察到的水平相同。給PDAPP小鼠注射聚集態(tài)Aβ42(聚集Aβ42)或磷酸鹽緩沖鹽水。選擇聚集Aβ42是因為它能夠誘導(dǎo)Aβ多表位的抗體。
A.方法1.小鼠來源將三十只PDAPP雜合雌性小鼠隨機(jī)分成下列組10只小鼠注射聚集Aβ42(轉(zhuǎn)運(yùn)中一只死亡)，5只小鼠注射PBS/佐劑或PBS，10只是沒有注射的對照。5只小鼠注射來自血清淀粉樣蛋白質(zhì)(SAP)序列的肽。
2.免疫原的制備聚集態(tài)Aβ42的制備將兩毫克Aβ42(美國肽公司，lot k-42-12)溶解于0.9ml水，加入0.1ml 10×PBS至1ml。將其旋渦振蕩，37℃保溫過夜，在該條件下，肽聚集。所有未利用的Aβ作為凍干粉末在-20℃儲藏，直到下次注射。
3.注射劑的制備每次注射時，將對每只小鼠注射的PBS中的100μg聚集態(tài)Aβ42用完全弗氏佐劑(CFA)按照1∶1的比例乳化，至終體積為400μl的乳化劑，用于第一次免疫，之后2周，將不完全弗氏佐劑(IFA)中同樣量的免疫原用作加強(qiáng)免疫。以月為間隔用IFA進(jìn)行另外兩次免疫。隨后的免疫在500μl PBS中以月為間隔進(jìn)行。腹膜內(nèi)(i.p.)注射給藥。
PBS注射遵循同樣的方案，每只小鼠用1∶1的PBS/佐劑混合物400μl，或者用500μl PBS注射。SAP注射劑遵循同樣的方案，每次注射劑量為100μg。
4.小鼠出血的滴定、組織準(zhǔn)備和免疫組織化學(xué)上述方法在下面的一般材料和方法中描述。
B.結(jié)果用聚集態(tài)Aβ42(被聚集的Aβ42)、SAP肽、或磷酸鹽緩沖鹽水對一組PDAPP小鼠注射。另外留出一組PDAPP小鼠作為未注射的陽性對照。從第四次加強(qiáng)免疫開始每隔一個月監(jiān)測小鼠對聚集態(tài)Aβ42的效價，直到小鼠長到1歲。在第13個月，處死小鼠。在所有檢查的時間點(diǎn)，九只聚集態(tài)Aβ42小鼠中的八只形成高抗體效價，其在一系列注射過程中，始終保持較高效價(效價高于1/10000)。第九只小鼠有點(diǎn)低，但也可測得效價約為1/1000(圖1，表1)。SAPP注射小鼠對該免疫原的效價為1∶1000到1∶30000，僅一只小鼠超過1∶100000。
在6、10和12個月測定PBS-處理小鼠對聚集Aβ42的效價。當(dāng)稀釋度為1/100時，對PBS小鼠測定的對聚集態(tài)Aβ42的效價，僅在一個數(shù)據(jù)點(diǎn)上比背景超過4倍，而在其它所有時間點(diǎn)上比背景少于4倍(表1)。SAP的特異性應(yīng)答可以忽略，在這些時間點(diǎn)上所有效價低于300。
在聚集態(tài)Aβ1-42組中九只小鼠中的七只腦中沒有檢測到淀粉樣蛋白。相比較而言，在SAP和PBS組中，小鼠腦組織的海馬、以及前皮質(zhì)和色帶環(huán)繞皮質(zhì)中含有許多淀粉樣沉積物。沉積模式類似于未處理對照的模式，特征在于累及易損亞區(qū)，例如海馬鋸齒狀腦回的外分子層。Aβ1-42注射組的一只小鼠表現(xiàn)淀粉樣侵害的明顯降低，只限于海馬。在另一只Aβ1-42處理小鼠體內(nèi)鑒定了隔離斑。
海馬中淀粉樣侵害的定量圖像分析證明，Aβ42(AN1792)處理動物中實現(xiàn)淀粉樣侵害顯著降低(圖2)。PBS組淀粉樣侵害的中值(2.22％)和未處理的對照組的中值(2.56％)明顯高于用AN1792免疫小鼠的中值(0.00％，p＝0.0005)。相比較而言，SAP肽(SAPP)免疫組的中值為5.74％。利用Aβ特異性單克隆抗體(mAb)3D6觀察到未處理的對照小鼠腦組織(海馬和夾肌后皮質(zhì)中)含有大量Aβ淀粉樣沉積物。用SAPP或PBS免疫小鼠也觀察到類似模式的淀粉樣沉積物(圖2)。另外，在AD中典型地觀察到，這后三組具有這樣的特征，即累及腦中的易損亞區(qū)，例如在后三組中，均累及海馬鋸齒狀腦回的外分子層。
不含Aβ沉積物的腦中也缺乏在PDAPP小鼠中利用人APP抗體8E5通?？梢姷纳窠?jīng)炎斑。剩余組(SAP-注射、PBS注射和未注射小鼠)的所有腦中含有大量未處理PDAPP小鼠中典型存在的神經(jīng)炎斑。在一只AN1792處理小鼠中存在少量神經(jīng)炎斑，在AN1792處理的第二只小鼠中發(fā)現(xiàn)一簇營養(yǎng)不良性軸突。顯示于圖3的海馬圖像分析表明，與PBS受體鼠(中值0.28％，p＝0.0005)相比，AN1792處理小鼠(中值0.00％)營養(yǎng)不良性軸突實質(zhì)上消失。
Aβ1-42注射組腦中也缺乏斑相關(guān)性發(fā)炎的星形細(xì)胞增生癥狀。其它組小鼠腦中富含，且叢生Aβ斑相關(guān)性神經(jīng)膠質(zhì)過多癥典型的GFAP-陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞。用硫黃素S復(fù)染記數(shù)GFAP-反應(yīng)性玻片的一個子集，以定位Aβ沉積物。SAP、PBS和未處理對照中，GFAP-陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞與Aβ斑有關(guān)。在斑-陰性Aβ1-42處理小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)該相關(guān)性，而在一只AN1792處理小鼠中鑒定了斑與神經(jīng)膠質(zhì)過多癥之間的弱相關(guān)性。
圖4顯示的夾肌后皮質(zhì)的圖像分析證明，AN1792處理小鼠星形細(xì)胞增生降低顯著，中值為1.56％，而用SAP肽處理、PBS處理或未處理免疫組，中值高于6％(p＝0.0017)。
來自Aβ1-42和PBS注射小鼠子集的證據(jù)表明Aβ1-42注射小鼠中缺乏斑-相關(guān)性MHC II免疫反應(yīng)性，與Aβ-相關(guān)性炎性反應(yīng)的缺乏一致。
還將小鼠腦切片與特異于MAC-1(一種細(xì)胞表面蛋白質(zhì))的mAb反應(yīng)。MAC-1(CD11b)是整聯(lián)蛋白家族的成員，與CD18以異質(zhì)二聚體存在。CD11b/CD18復(fù)合物存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞上(Mak和Simard)?；谠贛AC-1免疫反應(yīng)性切片中相似的表現(xiàn)型形態(tài)學(xué)，腦中固有的MAC-1-反應(yīng)性細(xì)胞類型可能是小膠質(zhì)細(xì)胞。與PBS對照組相比，AN1792處理小鼠腦中斑-相關(guān)性MAC1標(biāo)記較低，該結(jié)果與Aβ誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的缺乏一致。
C.結(jié)論用Aβ1-42注射的小鼠腦中，Aβ斑和反應(yīng)性神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞改變的缺乏表明，在它們的腦中沒有或幾乎很少沉積淀粉樣蛋白，并且沒有出現(xiàn)病理結(jié)果，例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞過多癥和神經(jīng)炎病理學(xué)。Aβ1-42處理的PDAPP小鼠基本上顯示同樣缺乏如對照非轉(zhuǎn)基因小鼠的病理學(xué)。因此，注射Aβ1-42對于預(yù)防人Aβ沉積或從腦組織中清除人Aβ，以及消除隨后神經(jīng)元和炎性變性性改變高度有效。因此，Aβ肽的給藥在預(yù)防AD方面具有治療優(yōu)點(diǎn)。
II.劑量反應(yīng)研究用在CFA/IFA中配制的300、100、33、11、3.7、1.2、0.4、或0.13μgAβ對幾組五周齡、雌性瑞士Webster小鼠腹膜內(nèi)給藥免疫(每組N＝6)。以兩周間隔給藥三個劑量，一個月后給藥第4個劑量。第一個劑量用CFA乳化，其它的劑量用IFA乳化。每次免疫后4-7天(第二次劑量之后開始)對動物取血，測定抗體效價。用11、33、或300μg抗原免疫的三組動物，在第四次免疫之后以月為間隔再取血四月，以監(jiān)測一定免疫原制劑劑量范圍內(nèi)抗體應(yīng)答的衰落。這些動物在研究開始之后的第七個月接受最后一次即第五次免疫。一周后處死動物，測定對AN1792的抗體應(yīng)答并進(jìn)行毒理學(xué)分析。
觀察到從300到3.7μg劑量應(yīng)答逐步衰減，最低兩個劑量沒有應(yīng)答。11-300μg抗原的3個劑量后平均抗體效價約為1∶1000，4個劑量后約為1∶10000(參見圖5)。
第三次免疫后，除了最低劑量組，其它組抗體效價均顯著升高，GMTs升高了5-25倍。甚至0.4μg抗原的受體也檢測到較低的抗體應(yīng)答。1.2μg和3.7μg組效價相近，GMTs約為1000，最高四個劑量集中，GMTs約為25000，除了33μg劑量組GMT較低，為3000。大多數(shù)組在第四次免疫之后，效價增加不多。從0.14μg受體沒有檢測出抗體到11μg受體GMT為36000范圍內(nèi)的0.14μg到11μg較低抗原劑量組內(nèi)表現(xiàn)出了清楚的劑量應(yīng)答。此外，11到300μg的四個最高劑量組效價集中。因此，兩次免疫之后，對于從0.4到300μg的寬范圍內(nèi)，抗體效價依賴于抗原劑量。到第三次免疫，最高四個劑量的效價彼此接近，再次接受免疫后，它們保持在穩(wěn)定期上。
第四次免疫之后一個月，300μg組中的效價比免疫之后5天取血測定的效價高2到3倍(圖6)。該觀測數(shù)據(jù)表明峰記憶抗體應(yīng)答發(fā)生在免疫后5天之后。33μg組中，在該時間點(diǎn)，觀察到較為平緩的增加(50％)。在300μg劑量組中，最后一個劑量之后兩個月，GMTs銳減約70％。再一個月后，衰減不太劇烈為45％(100μg)，對于33和11μg劑量約為14％。因此，終止免疫之后循環(huán)系統(tǒng)中抗體效價的衰減速率可能是雙相的，峰應(yīng)答之后的第一個月銳減，隨后衰減速率較為平緩。
這些瑞士Webster小鼠的抗體效價和應(yīng)答動力學(xué)類似于以平行方式免疫的幼年P(guān)DAPP轉(zhuǎn)基因小鼠。對于誘導(dǎo)人類免疫應(yīng)答的劑量有效性通常類似于小鼠的劑量有效性。
III.對已確定AD的治療功效的篩選設(shè)計本實驗用于檢測免疫原性藥物在抑制或逆轉(zhuǎn)衰老動物體內(nèi)AD的神經(jīng)病理學(xué)癥狀方面的活性。當(dāng)PDAPP小鼠腦中已經(jīng)出現(xiàn)淀粉樣斑時，開始用42個氨基酸長的Aβ(AN1792)免疫。
在該研究的過程中，未處理的PDAPP小鼠形成大量類似于AD中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)變性改變(Games等，同上和Johnson-wood等，美國國家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展94，1550-1555(1997))。Aβ沉積成為淀粉樣斑與由異常軸突和樹狀元件(被稱為營養(yǎng)不良性神經(jīng)突)組成的變性神經(jīng)元應(yīng)答有關(guān)。被包圍且含有營養(yǎng)不良性神經(jīng)突的淀粉樣沉積物被稱為神經(jīng)炎斑。在AD和PDAPP小鼠中，營養(yǎng)不良性神經(jīng)突具有獨(dú)特的球狀結(jié)構(gòu)，與識別APP和細(xì)胞骨架成分的抗體平板發(fā)生免疫反應(yīng)，在亞顯微結(jié)構(gòu)水平上呈現(xiàn)復(fù)雜的亞細(xì)胞變性性改變。這些特征得以對PDAPP腦中神經(jīng)炎斑進(jìn)行疾病相關(guān)性、選擇性和重現(xiàn)性地測量。PDAPP神經(jīng)炎斑的的營養(yǎng)不良性神經(jīng)元成分可以容易地用人APP特異性抗體觀察(單克隆抗體8E5)，并可以通過計算機(jī)輔助的圖像分析方便地測定。因此，除了測定AN1792對淀粉樣斑形成的影響，我們還監(jiān)測了該治療對神經(jīng)炎性營養(yǎng)不良的發(fā)展的影響。
星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是應(yīng)答和反應(yīng)神經(jīng)元損傷程度的非神經(jīng)元細(xì)胞。在AD中?？捎^察到GFAP-陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞和MHC II-陽性小膠質(zhì)細(xì)胞，它們活性的增加伴隨疾病的加重。因此，我們也監(jiān)測AN1792-處理小鼠體內(nèi)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)展。
A.材料和方法將從Charles River得到的四十八只雜合雌性PDAPP小鼠(11到11.5月齡)隨機(jī)分成兩組24只小鼠用100μg AN1792免疫，24只用PBS免疫，均與弗氏佐劑混合。當(dāng)AN1792組和PBS組長到約15月齡時再次分組。15月齡時對AN1792-和PBS-處理動物組分別無痛處死約一半(n分別等于10和9)，其余的繼續(xù)接受免疫，直到約18個月終止(n分別等于9和12)。研究過程中總共8只動物死亡(5只AN1792，3只PBS)。除了免疫動物，另外包括一歲齡(n＝10)、15月齡(n＝10)和18月齡(n＝10)未處理PDAPP小鼠，用于在ELISA中比較腦中的測量Aβ和APP水平；一歲齡的動物還用于免疫組織化學(xué)分析。
除非另有說明，方法如實施例1所述。在15個月的時間點(diǎn)之前，用AN1792的US Peptides lot 12和California Peptides lot ME0339制備六次免疫給藥的抗原。在15到18個月之間用California Peptides lotME0339和ME0439進(jìn)行另外三次給藥免疫。
用于免疫時，200μl PBS中的100μg AN1792或者單獨(dú)的PBS，按照1∶1(體積∶體積)的比例，用完全弗氏佐劑(CFA)或不完全弗氏佐劑(IFA)或PBS乳化，至終體積為400μl。用CFA作為佐劑進(jìn)行第一次免疫給藥，接著的四個劑量與IFA一起給藥，最后四個劑量與單獨(dú)PBS不加佐劑給藥。在七個月的時間段內(nèi)總共進(jìn)行九次免疫，前三個劑量應(yīng)用兩周方案，隨后對于其他注射采用四周的間隔。在15月齡接受無痛處死的四個月治療組，僅接受前六次免疫。
B.結(jié)果1.AN1792對于治療淀粉樣侵害的效果通過定量圖像分析確定的AN1792對皮質(zhì)淀粉樣侵害的治療結(jié)果如圖7所示。在未處理的12月齡PDAPP小鼠組中，皮質(zhì)淀粉樣侵害的中值為0.28％，該值代表研究開始時小鼠體內(nèi)斑負(fù)荷。在18個月，在PBS-處理小鼠體內(nèi)淀粉樣侵害增長了17倍多，達(dá)到4.87％，而AN1792處理小鼠淀粉樣侵害顯著降低，僅為0.01％，明顯低于12個月的未處理組和15個月和18個月的PBS處理組。AN1792受體體內(nèi)，15個月和18個月淀粉樣侵害均顯著降低，分別為降低96％(p＝0.003)和降低＞99％(p＝0.0002)。
典型地，PDAPP小鼠體內(nèi)皮質(zhì)淀粉樣沉積最早出現(xiàn)在前和夾肌后皮質(zhì)(RSC)中，在腹側(cè)方向上擴(kuò)展，累及枕葉和頂葉以及entorhinal皮質(zhì)(EC)。12月齡(大約是首次AN1792給藥的年齡)的EC中很少或沒有發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白。4個月的AN1792治療后，RSC中淀粉樣沉積物很大程度上消失了，AN1792處理完全消除了EC的進(jìn)行性累及。后一項觀察結(jié)果表明AN1792完全終止了通常會侵入枕葉和頂葉以及腹側(cè)皮質(zhì)的淀粉樣蛋白的擴(kuò)展，同時抑制或可能逆轉(zhuǎn)RSC中的沉積。
進(jìn)一步通過已經(jīng)接受七個月治療的18個月組論證了AN1792治療PDAPP小鼠體內(nèi)發(fā)展性皮質(zhì)淀粉樣侵害的深遠(yuǎn)影響。在AN1792處理小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)淀粉樣蛋白幾乎完全消失，擴(kuò)散斑總體減少，以及緊密沉積物減少。
2.與AN1792處理有關(guān)的細(xì)胞和形態(tài)學(xué)改變在典型含有淀粉樣沉積物的腦區(qū)發(fā)現(xiàn)大群Aβ陽性細(xì)胞。引人注目的是，幾個AN1792受體腦中，發(fā)現(xiàn)非常少或者沒有發(fā)現(xiàn)胞外皮質(zhì)淀粉樣斑。大多數(shù)Aβ免疫反應(yīng)性可能包含于具有大的小葉性和成群細(xì)胞體的細(xì)胞中。從表型上看，這些細(xì)胞類似激活的小膠質(zhì)細(xì)胞或單核細(xì)胞。它們與識別通過激活的單核細(xì)胞和小膠質(zhì)(MHC II和CD11b)表達(dá)的配體的抗體具有免疫反應(yīng)性，偶爾與血管壁或內(nèi)腔結(jié)合。用Aβ和MHC II-特異性抗體標(biāo)記的相鄰切片的比較表明，這兩種抗體均可以識別這些細(xì)胞的類似模式。對AN1792處理腦仔細(xì)檢查發(fā)現(xiàn)，MHCII-陽性細(xì)胞被限制到殘留在這些動物體內(nèi)的有限淀粉樣蛋白附近。在所用固定條件下，細(xì)胞與識別T細(xì)胞(CD3、CD3e)或B細(xì)胞(CD45RA、CD45RB)配體或白細(xì)胞共同抗原(CD45)的抗體不具有免疫反應(yīng)性，但與識別與單核細(xì)胞交叉反應(yīng)的白涎素(CD43)的抗體發(fā)生反應(yīng)。任何PBS-處理小鼠體內(nèi)均沒有發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞。
PDAPP小鼠毫無例外地在海馬鋸齒狀腦回的外分子層形成嚴(yán)重的淀粉樣沉積。沉積在穿孔通道(perforant pathway，在AD中典型地含有淀粉樣斑的亞區(qū))中形成明顯的條紋。PBS-處理小鼠體內(nèi)這些沉積物的特征性外觀類似于前面描述的未處理PDAPP小鼠體內(nèi)的特征。淀粉樣沉積由連續(xù)帶中的擴(kuò)散斑和緊密斑組成。相比較而言，在一些AN1792處理小鼠的腦中，這種模式徹底改變。海馬趾淀粉樣沉積不再含有擴(kuò)散淀粉樣蛋白，帶狀模式完全打破。實際上，出現(xiàn)了一些不常見的與抗-Aβ抗體反應(yīng)的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，其中幾個出現(xiàn)在含淀粉樣蛋白的細(xì)胞中。
MHC II-陽性細(xì)胞經(jīng)常在AN1792處理動物的胞外淀粉樣蛋白附近觀察到。在幾只AN1792處理小鼠的腦中，Aβ陽性細(xì)胞與淀粉樣蛋白的關(guān)系模式非常類似。這些單核細(xì)胞的分布被限制到沉積的淀粉樣蛋白附近，在沒有Aβ斑的其它腦區(qū)完全不存在。MHC II-和Aβ-標(biāo)記切片的共聚焦顯微分析表明淀粉樣斑物質(zhì)存在于許多單核細(xì)胞中。
MHC II和MAC I-標(biāo)記切片的定量圖像分析揭示了與PBS組相比AN1792處理小鼠的RSC和海馬中免疫反應(yīng)性增長趨勢，其顯示了在海馬中測定MAC 1反應(yīng)性的重要性。
這些結(jié)果表明，攜斑腦區(qū)淀粉樣蛋白的主動的、由細(xì)胞介導(dǎo)的清除。
3.AN1792對Aβ水平的影響ELISA測定(a)皮質(zhì)水平在未處理PDAPP小鼠中，在12個月時皮質(zhì)中總Aβ的中值為1600ng/g，到第15個月，該值增加到8700ng/g(表2)。到18個月，該值為22000ng/g，在實驗期間中，增加了10倍多。PBS-處理動物在15個月總Aβ為8600ng/g，到18個月增加到19000ng/g。相比較而言，AN1792處理動物在15個月總Aβ(1600ng/g)比PBS免疫組低81％。在18個月將AN1792與PBS組比較時(表2)，發(fā)現(xiàn)總Aβ(5200ng/g)顯著降低(p＝0.0001)，比應(yīng)該出現(xiàn)的Aβ水平降低了72％。當(dāng)比較Aβ42的皮質(zhì)水平時得到類似的結(jié)果，即AN1792處理組含有很少的Aβ42，但在這種情況下AN1792和PBS組之間的差別在15個月(p＝0.04)和18個月(p＝0.0001，表2)顯著。
表2皮質(zhì)中Aβ水平的中值(ng/g)

*p＝0.0412**p＝0.0001(b)海馬中的水平在未處理PDAPP小鼠中，12月齡海馬中總Aβ的中值為15000ng/g，到15個月增加到51000ng/g，到18個月進(jìn)一步增加到81000ng/g(表3)。PBS免疫小鼠表現(xiàn)相似的值，15個月和18個月分別為40000ng/g和65000ng/g。AN1792免疫動物表現(xiàn)較低的總Aβ，具體在15個月和18個月的時間點(diǎn)分別為25000ng/g和51000ng/g。18個月的AN1792處理組的值顯著低于PBS處理組的值(p＝0.0105；表3)。對Aβ42的測定得出同樣的結(jié)果模式，即在18個月評價時，AN1792處理組中的水平明顯低于PBS組(分別為39000ng/g對57000ng/g；p＝0.0022)(表3)。
表3海馬中Aβ的中值(ng/g)

*p＝0.0105**p＝0.0022(c)小腦中的水平在12個月未處理的PDAPP小鼠中，小腦中總Aβ水平的中值為15ng/g(表4)。在15個月，該值增加到28ng/g，到18個月增加到35ng/g。PBS處理動物在15個月總Aβ的中值為21ng/g，18個月為43ng/g。發(fā)現(xiàn)15個月的AN1792處理動物總Aβ為22ng/g，18個月的總Aβ(25ng/g)顯著低于(p＝0.002)相應(yīng)的PBS組(表4)。
表4小腦中Aβ的中值(ng/g)

*p＝0.00184.AN1792治療對APP水平的影響APP-α和全長APP分子均含有全部或部分Aβ序列，因此可能潛在地被AN1792-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答影響。在對PDAPP小鼠的研究中，注意到隨著神經(jīng)病理學(xué)的增加，APP水平輕微上升。皮質(zhì)中，APP-α/FL(全長)或APP-α在治療中基本上沒有變化，除了在18個月的時間點(diǎn)上，AN1792處理組比PBS處理組APP-α降低了19％。18個月的AN1792處理組APP值與12個月和15個月未處理組和15個月PBS組的值沒有明顯差異。在所有條件下，APP值均維持在PDAPP小鼠中正常出現(xiàn)的范圍內(nèi)。
5.AN1792治療對神經(jīng)變性和神經(jīng)膠質(zhì)病理學(xué)的影響與15月齡和18月齡的PBS組相比，AN1792處理小鼠前皮質(zhì)中神經(jīng)炎斑侵害顯著降低(分別為84％，p＝0.03；和55％，p＝0.01)(圖8)。從15月齡到18個月齡PBS組神經(jīng)炎斑侵害的中值從0.32％增加到0.49％。與此相比，AN1792組中神經(jīng)炎斑的形成顯著降低，15個月和18個月組中神經(jīng)炎斑侵害的中值分別為0.05％和0.22％。
看來能夠很好地耐受AN1792的免疫，當(dāng)與15月齡和18月齡的PBS組相比時，AN1792處理小鼠的RSC中反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞也明顯降低，分別降低了56％(p＝0.011)和39％(p＝0.028)(圖9)。從15個月到18個月，PBS組中星形膠質(zhì)細(xì)胞增加百分率的中值從4.26％增加到5.21％。AN1792處理抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞增多的進(jìn)展，兩個時間點(diǎn)上分別為1.89％和3.2％。這表明神經(jīng)纖維網(wǎng)沒有因該清除過程而破壞。
6.抗體應(yīng)答如上所述，十一月齡、雜合PDAPP小鼠(N＝24)接受用弗氏佐劑乳化的100μg AN1792連續(xù)五次免疫，在第0、2、4、8、和12周腹膜內(nèi)給藥，在第16周單獨(dú)用PBS(無弗氏佐劑)進(jìn)行第六次免疫。作為陰性對照，一系列平行的24只年齡相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因小鼠接受用同樣佐劑乳化的PBS免疫，按照同樣的方案給藥。第二個劑量之后，每次免疫后三至七天內(nèi)對動物取血。通過ELISA測定對AN1792的抗體應(yīng)答。在第二、第三和最后(第六)一個劑量之后，AN1792免疫動物的幾何平均效價(GMT)分別約1900、7600、和45000。對照動物中，第六次免疫之后沒有測到Aβ特異性抗體。
約一半的動物接受另外三個月的處理，約在20、24和27周接受免疫。每個劑量分別在單獨(dú)的PBS(無弗氏佐劑)中給藥。在這段時間內(nèi)，平均抗體效價保持不變。事實上，相應(yīng)于涵蓋從第五次到第九次注射時期的第四次到第8次取血的抗體效價保持穩(wěn)定。
為了確定在AN1792處理小鼠的血清中檢測到的、免疫誘導(dǎo)的Aβ特異性抗體是否也與沉積的腦淀粉樣蛋白結(jié)合，將一系列來自AN1792和PBS處理小鼠的切片與小鼠IgG特異性抗體反應(yīng)。與PBS組相比，AN1792處理的腦中Aβ斑被內(nèi)源IgG包圍。15月齡和18月齡的這兩組中均發(fā)現(xiàn)這種差別。尤其震驚的是PBS組沒有標(biāo)記，盡管在這些小鼠中存在嚴(yán)重的淀粉樣侵害。該結(jié)果表明，用合成的Aβ蛋白免疫產(chǎn)生識別和結(jié)合體內(nèi)淀粉樣斑中Aβ的抗體。
7.細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答9只AN1792免疫和12只PBS免疫的18個月齡的PDAPP小鼠在第九次免疫之后取出脾臟。分離脾細(xì)胞，在Aβ40、Aβ42、或Aβ40-1(倒序蛋白質(zhì))存在下培養(yǎng)。促分裂原伴刀豆球蛋白A作為陽性對照。用＞1.7μM蛋白質(zhì)得到最佳應(yīng)答。來自所有九只AN1792處理動物的細(xì)胞均對Aβ1-40或Aβ1-42蛋白質(zhì)應(yīng)答而增殖，兩種蛋白質(zhì)的摻入水平相同(圖10，上圖)。對Aβ40-1反向蛋白質(zhì)沒有應(yīng)答。來自對照動物的細(xì)胞對任何Aβ蛋白質(zhì)均沒有應(yīng)答(圖10，下圖)。
C.結(jié)論該研究結(jié)果表明對存在淀粉樣沉積物的PDAPP小鼠進(jìn)行的AN1792免疫減慢和防止進(jìn)行性淀粉樣沉積，并延緩隨之發(fā)生的衰老PDAPP小鼠腦中神經(jīng)病理學(xué)改變。用AN1792免疫基本上終止了在結(jié)構(gòu)上的發(fā)展淀粉樣蛋白，其通常會形成淀粉樣變性病。因此，Aβ肽的給藥在治療AD方面具有治療優(yōu)點(diǎn)。
IV.Aβ片段的篩選用9種不同的APP區(qū)域和Aβ免疫100只9-11月齡的PDAPP小鼠，以確定哪些表位傳送有效應(yīng)答。9種不同的免疫原和一種對照如上述腹膜內(nèi)注射。免疫原包括四種人Aβ肽共軛物1-12、13-28、32-42、1-5(均經(jīng)半胱氨酸鍵與綿羊抗-小鼠IgG偶聯(lián))；APP多肽氨基酸592-695、聚集態(tài)人Aβ1-40、和聚集態(tài)人Aβ25-35、以及聚集態(tài)嚙齒動物Aβ42。聚集態(tài)Aβ42和PBS分別用作正負(fù)對照。每個治療組安排10只小鼠。如上述監(jiān)測效價，在注射4個月末，對小鼠進(jìn)行無痛致死。處死后測定組織化學(xué)、Aβ水平、和毒理學(xué)。
A.材料和方法1.免疫原的制備偶聯(lián)Aβ肽的制備通過利用交聯(lián)試劑磺基-EMCS加到Aβ肽上的人工半胱氨酸偶聯(lián)制備四種人Aβ肽共軛物(氨基酸殘基1-5、1-12、13-28、和33-42，均共軛結(jié)合綿羊抗小鼠IgG)。用下列終氨基酸序列合成Aβ肽衍生物。在每種情況下，插入的半胱氨酸殘基的位置由下劃線指出。Aβ13-28肽衍生物在指出的羧基端半胱氨酸之前還具有兩個甘氨酸殘基。
Aβ1-12肽 NH2-DAEFRHDSGYEVCCOOHAβ1-5肽NH2-DAEFRCCOOHAβ33-42肽 NH2-C-氨基-庚酸-GLMVGGVVIA COOHAβ13-28肽 Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH為了進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，將10mg綿羊抗小鼠IgG(Iackson ImmunoResearch Laboratories)對10mM硼酸鈉緩沖液(pH 8.5)透析過夜。然后利用Amicon Centriprep管將透析抗體濃縮到體積為2ml。將10mg磺基EMCS(N-(ε馬來酰亞胺銅氧基)琥珀酰亞胺)(分子科學(xué)公司(Molecular Sciences Co.))溶解于1ml去離子水。將40倍摩爾過量的磺基-EMCS在攪拌下逐滴加入綿羊抗-小鼠IgG，然后再次攪拌溶液十分鐘。純化活性的綿羊抗-小鼠IgG，通過經(jīng)0.1M NaPO4、5mM EDTA、pH 6.5的溶液平衡的10ml凝膠過濾柱(Pierce Presto柱，從PierceChemicals獲得)，交換除去緩沖液。收集經(jīng)280nm吸收值鑒定的含抗體的組分，稀釋到濃度約為1mg/mL，應(yīng)用1.4mg/光密度作為消光系數(shù)。將40倍摩爾過量的Aβ肽溶解于20mL 10mM的NaPO4(pH8.0)，除了Aβ33-42肽不同，將其10mg首先溶解于0.5mL DMSO，然后用10mM NaPO4緩沖液稀釋到20mL。將肽溶液分別加到10mL活化的綿羊抗-小鼠IgG中，室溫下振搖4小時。將得到的共軛結(jié)合物用AmiconCentriprep管濃縮到體積小于10mL，然后對PBS透析，以緩沖交換緩沖液，除去游離肽。使共軛物過0.22μ孔尺寸的濾器，用于除菌，然后等分成1mg的組分，-20℃冷凍儲藏。利用BCA蛋白質(zhì)分析(PierceChemicals)，用馬IgG作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定共軛物的濃度。通過結(jié)合肽相對于活化綿羊抗-小鼠IgG分子量的增加證明共軛結(jié)合。Aβ1-5綿羊抗-小鼠共軛物是兩次共軛偶聯(lián)的集合制品，其余的為單一制品。
2.聚集態(tài)Aβ肽的制備用人1-40(AN1528；California Peptides Inc.，Lot ME0541)、人1-42(AN1792；California Peptides Inc.，Lot 0339和ME0439)、人25-35、和嚙齒動物1-42(Califomia Peptides Inc.，Lot ME0218)的-20℃脫水儲藏的凍干粉末新溶解配制一系列注射液。對于這種目的，將2mg肽加入0.9ml去離子水，旋渦攪拌，產(chǎn)生相對均一的溶液或懸浮液。所有這四種中，AN1528是這一步唯一可溶的肽。當(dāng)AN1528開始沉淀時，加入100μl 10×PBS溶液(1×PBS0.15M NaCl、0.01M磷酸鈉，pH7.5)。懸浮液再次旋渦振蕩，在37℃保溫過夜留待次日使用。
pBx6蛋白質(zhì)的制備按照Oltersdorf等(生物化學(xué)雜志，265，4492-4497(1990))的描述，構(gòu)建了編碼pBx6的表達(dá)質(zhì)粒，pBx6是由100個氨基酸的噬菌體MS-2聚合酶N-末端前導(dǎo)序列跟隨APP的592-695氨基酸(βAPP)組成的融合蛋白質(zhì)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到E.coli中，經(jīng)啟動子誘導(dǎo)后蛋白質(zhì)得以表達(dá)。使細(xì)菌在8M脲中胞溶，通過制備性SDSPAGE部分純化pBx6。通過Western印記，利用兔抗-pBx6多克隆抗體，鑒定含pBx6的組分，合并組分，利用Amicon Centriprep管濃縮，對PBS透析。制品的純度，經(jīng)考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE評價，約為5-10％。
B.結(jié)果和討論1.研究設(shè)計從Charles River實驗室和Taconic實驗室獲得一百只雄性和雌性、九到十一月齡的雜合PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠。將小鼠分成十組，接受由不同區(qū)域的Aβ或APP結(jié)合弗氏佐劑的免疫。使動物組內(nèi)性別、年齡、家系和動物來源匹配，分布盡可能地接近。免疫原包括四種來源于人序列1-5、1-12、13-28、和33-42的Aβ肽，分別共軛結(jié)合綿羊抗-小鼠IgG；四種聚集態(tài)Aβ肽，人1-40(AN1528)、人1-42(AN1792)、人25-35、和嚙齒動物1-42；以及含有APP氨基酸殘基592-695的、被稱為pBx6的融合多肽。第十組用PBS結(jié)合佐劑免疫，作為對照。
對于每一種免疫，將溶于200μl PBS的100μg各種Aβ肽或者將溶于同樣體積PBS的200μg APP衍生的pBx6或者單獨(dú)PBS用完全弗氏佐劑(CFA)按照1∶1(體積∶體積)的比例乳化，至終體積為400μl，用于第一次免疫，隨后用不完全弗氏佐劑(IFA)中的同樣量的免疫原進(jìn)行其后四個劑量的加強(qiáng)免疫，用PBS作為最后一個劑量。前三個劑量以間隔兩周的方案腹膜內(nèi)給藥免疫，然后采用間隔一個月的方案。第二個劑量之后，每次免疫開始后四到七天對動物取血，用于測定抗體效價。最后一個劑量之后約一周無痛處死動物。
2.腦中的Aβ和APP水平用各種Aβ肽或APP衍生物免疫約四個月后，對鹽水灌注動物取腦。一個半球準(zhǔn)備用于免疫組織化學(xué)分析，另一個半球用于Aβ或APP水平的定量分析。為了測定各種形式的β淀粉樣肽和淀粉樣蛋白前體蛋白質(zhì)的濃度，解剖半球，在5M胍中制備海馬趾、皮層、和小腦區(qū)的勻漿。將它們稀釋，通過與ELISA中安排的一系列已知濃度的Aβ肽或APP標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度相比較，定量淀粉樣蛋白或APP的水平。
用PBS免疫的對照組中，海馬中總Aβ濃度的中值比皮層中總Aβ濃度的中值高5.8倍(海馬組織的中值為24318ng/g，皮層中為4221ng/g)。對照組小腦中的中值(23.4ng/g組織)比海馬中的中值約低1000倍。這些水平類似于我們以前報道的同年齡的雜合PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠的該水平(Johnson-Woods等，1997，同上)。
對于皮層，處理組子集具有顯著不同于對照組的總Aβ和Aβ1-42水平的中值(p＜0.05)，如圖11所示，這些動物接受AN1792、嚙齒動物Aβ1-42或者Aβ1-5肽共軛物。與對照相比，這些處理組總Aβ的中值分別降低75％、79％和61％。所有組腦皮層區(qū)Aβ特異性抗體的效價和Aβ水平之間沒有可辨別的相關(guān)性。
在海馬中，與AN1792處理相關(guān)的總Aβ中值的降低(46％，p＝0.0543)不象在皮層中觀察到(75％，p＝0.0021)的那么顯著。然而，在海馬中降低的量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于皮層，海馬中凈降低為11186ng/g組織，而皮層中為3171ng/g組織。對于接受嚙齒動物Aβ1-42或Aβ1-5的動物組，總Aβ水平的中值分別降低36％和26％。然而，假設(shè)組中個體較少，組內(nèi)動物之間淀粉樣肽水平高度可變，這些降低就不明顯了。測定海馬中Aβ1-42的水平時，沒有出現(xiàn)明顯的治療誘導(dǎo)的降低。因此，基于皮層中Aβ侵害較小，該區(qū)中的改變是治療效果的更為靈敏的指標(biāo)。經(jīng)ELISA測定的皮層中Aβ水平的改變相似，但是免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果(見下面)卻不同。
也測定了小腦中的總Aβ，該區(qū)在AD病理學(xué)中通常極少受影響。用各種Aβ肽或APP衍生物免疫的所有組的Aβ濃度的中值均與腦中該區(qū)的對照組沒有差別。該結(jié)果表明處理沒有影響Aβ的非病理水平。
還通過ELISA測定了治療和對照小鼠皮層和小腦中的APP濃度。應(yīng)用兩種不同方法分析APP。其一，指定的APP-α/FL，識別兩種APP-α(α，APP的分泌型，其在Aβ序列中被酶切)，以及APP的全長型(FL)，而第二種僅識別APP-α。在治療組子集中，與治療相關(guān)的Aβ的降低相比，所有治療動物的APP水平?jīng)]有相對于對照動物改變。這些結(jié)果表明Aβ肽的免疫沒有耗盡APP；治療作用對Aβ更專屬。
總之，通過AN1792、嚙齒動物Aβ1-42或Aβ1-5共軛物的治療，皮層中總Aβ和Aβ1-42的水平顯著降低。海馬中，僅AN1792治療組總Aβ降低顯著。在海馬趾、皮層或小腦區(qū)中，Aβ或APP水平?jīng)]有其它顯著的治療相關(guān)性改變。
2.組織化學(xué)分析取來自六組動物的腦用于免疫組織化學(xué)分析，三組用Aβ肽共軛物Aβ1-5、Aβ1-12、和Aβ13-28免疫；兩組用全長Aβ聚集物AN1792和AN1528免疫，另一組用PBS處理作為對照組。來自這些組腦切片的淀粉樣侵害圖像分析結(jié)果如圖12所示。三組治療組比對照動物皮層區(qū)中淀粉樣侵害顯著減少。在接受AN1792的組中觀察到淀粉樣侵害最大程度的降低，平均值降低了97％(p＝0.001)。用AN1528和Aβ1-5肽共軛物治療的動物也觀察到顯著降低，分別降低95％(p＝0.005)和67％(p＝0.02)。
通過ELISA定量測定總Aβ或Aβ1-42得到的結(jié)果和通過圖像分析得到的淀粉樣侵害某種程度上不同。當(dāng)定量圖像分析測定時，AN1528處理對皮層淀粉樣侵害水平影響顯著，而當(dāng)ELISA測定時，該區(qū)種總Aβ的濃度卻沒有被顯著影響。這兩種結(jié)果的差異可能因為分析的特異性導(dǎo)致。圖像分析僅測定聚集成斑的不溶性Aβ。相比較而言，ELISA測定所有形式的Aβ，包括可溶的和不溶的，單體和聚集體。既然認(rèn)為該病的病理與Aβ的不溶斑相關(guān)型有關(guān)，圖像分析技術(shù)顯示治療效果可能更靈敏。然而，因為ELISA更快速和容易分析，作為篩選目的它非常有效。而且，它可以顯示結(jié)合斑型比總Aβ的治療相關(guān)性Aβ降低更大。
為了確定治療動物中免疫誘導(dǎo)的Aβ特異性抗體是否與沉積的腦淀粉樣蛋白反應(yīng)，將來自治療動物和對照小鼠的一系列切片與小鼠IgG特異性抗體反應(yīng)。與PBS組相比，用Aβ肽共軛物Aβ1-5、Aβ1-12、和Aβ13-28和全長Aβ聚集物AN1792和AN1528免疫的動物含Aβ的斑被內(nèi)源IgG包圍。用其它Aβ肽或APP肽pBx6免疫的動物的腦沒有用該方法分析。
3.抗體效價的測定第二次免疫之后，每次免疫開始后四到七天對小鼠取血，共取血五次。利用夾心ELISA，用Aβ1-42包被的塑料多孔平板，測定作為Aβ1-42結(jié)合抗體的抗體效價。如圖13所示，對于誘導(dǎo)AN1792特異性抗體最高效價的四種免疫原制劑AN1792，(峰GMT94647)；AN1528，(峰GMT88231)；Aβ1-12共軛物，(峰GMT47216)；和嚙齒動物Aβ1-42，(峰GMT10766)，第四個劑量之后誘導(dǎo)抗體的效價達(dá)到峰位。這些組的效價在第五和第六個劑量之后有點(diǎn)衰減。對于其它五種免疫原，第五或第六個劑量之后達(dá)到峰效價，但它們的量比四種最高效價組低很多Aβ1-5共軛物(峰GMT2356)、pBx6(峰GMT1986)、Aβ13-28共軛物(峰GMT1183)、Aβ33-42共軛物(峰GMT658)、Aβ25-35(峰GMT125)。還利用同樣的ELISA夾心模式測定了一系列免疫原(那些組用Aβ1-5、Aβ13-28、Aβ25-35、Aβ33-42或嚙齒動物Aβ1-42免疫)對同源肽的抗體效價，這些效價與對Aβ1-42測得的效價基本上相同，除了嚙齒動物Aβ1-42為免疫原的情況下的抗體效價對同源免疫原約高兩倍。個體動物的AN1792特異性抗體效價的量或治療組的平均值與由皮層中Aβ降低測定的功效沒有相關(guān)性。
4.淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)利用最后一次即第六次免疫之后約一周取到的脾細(xì)胞測定了Aβ依賴性淋巴細(xì)胞增殖。在存在用于刺激的、濃度為5μM的Aβ1-40的條件下，以每孔105的量培養(yǎng)新鮮收獲的細(xì)胞。還在存在反向肽Aβ40-1的條件下培養(yǎng)來自十組中七組的細(xì)胞。作為陽性對照，另外的細(xì)胞與T細(xì)胞促分裂原，PHA一起培養(yǎng)；作為陰性對照，細(xì)胞在不加肽下培養(yǎng)。
來自大多數(shù)動物的淋巴細(xì)胞對PHA反應(yīng)而增殖。對Aβ40-1反向肽沒有明顯的反應(yīng)。當(dāng)用AN1792受試者體內(nèi)最高cpm的Aβ1-40刺激時，來自較大的聚集態(tài)Aβ肽、AN1792、嚙齒動物Aβ1-42和AN1528免疫動物的細(xì)胞增殖劇烈。用Aβ1-12共軛物、Aβ13-28共軛物和Aβ25-35免疫的各組中有一只動物對Aβ1-40應(yīng)答增殖。接受Aβ1-5共軛物、Aβ33-42共軛物、pBx6或PBS的其余組沒有動物對Aβ刺激應(yīng)答。結(jié)果如下表5概述。

這些結(jié)果表明，AN1792和AN1528強(qiáng)烈刺激T細(xì)胞(更可能是CD4+表型)應(yīng)答。用Aβ1-5免疫動物的體內(nèi)缺乏Aβ特異性T細(xì)胞應(yīng)答并不奇怪，因為CD4+T細(xì)胞識別的肽表位通常約15個氨基酸長度，當(dāng)然較短的肽有時也具有較低效果的功能。因此，四種結(jié)合肽的大量輔助T-細(xì)胞表位可能出現(xiàn)在IgG結(jié)合模式中，但不在Aβ區(qū)。上述每種治療組中動物的增殖性應(yīng)答的幾率非常低，支持了該假設(shè)。既然Aβ1-5共軛物對于顯著降低明顯缺乏Aβ特異性T細(xì)胞的腦中的Aβ水平非常有效，通過這種肽免疫而誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的關(guān)鍵效應(yīng)物可能是抗體。
對于包括所有Aβ殘基、含APP氨基酸592-695的融合肽pBx6，缺乏T細(xì)胞應(yīng)答，且抗體應(yīng)答較低，可能因為這種特殊制品免疫原性較低。Aβ25-35聚集物的低免疫原性可能因為該肽太小而可能不含輔助誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的良好的T細(xì)胞表位。如果將該肽與載體蛋白質(zhì)結(jié)合，它將可能有更好的免疫原性。
V.用于被動保護(hù)的多克隆抗體的制備125只非轉(zhuǎn)基因小鼠用100μg Aβ1-42，添加佐劑CFA或IFA進(jìn)行免疫，到第4-5月無痛處死小鼠。對免疫小鼠采血。將IgG與其它血液成分分離。可以通過親合層析部分純化特異于該免疫原的抗體。每只小鼠得到平均約0.5-1mg的免疫原特異性抗體，總量60-120mg。
VI.用Aβ抗體進(jìn)行被動免疫如下所示，對7-9月齡PDAPP小鼠組中的每一只注射0.5mg多克隆抗-Aβ抗體或特異性抗-Aβ單克隆抗體的PBS液。純化所有抗體制劑，使其具有較低的內(nèi)毒素水平?？梢酝ㄟ^將Aβ片段或長型注射到小鼠體內(nèi)，制備雜交瘤、篩選特異性結(jié)合Aβ目的片段而不結(jié)合其它Aβ非重疊片段的抗體的雜交瘤，制備針對該片段的單克隆抗體。
表6

在4個月的時間內(nèi)，按照需要對小鼠腹膜內(nèi)注射，以維持通過ELISA效價測定的高于1/1000(通過ELISA對Aβ42或其它免疫原確定)的循環(huán)抗體濃度。如上述監(jiān)測效價，在注射的六個月末無痛處死小鼠。處死后，研究組織化學(xué)、Aβ水平和毒理學(xué)。每組安排十只小鼠。其它被動免疫研究在以下實例XI和XII中作了說明。
VII.不同佐劑的比較該實施例比較了CFA、明礬、水包油型乳劑和MPL刺激免疫應(yīng)答的能力。
A.材料和方法1.研究方案設(shè)計將從Elm Hill得到的100只雌性Hartley系六周齡豚鼠分成10組，用AN1792或其棕櫚酰化衍生物結(jié)合各種佐劑免疫。七組接受AN1792(33μg，除非另有說明)結(jié)合a)PBS，b)弗氏佐劑，c)MPL，d)角鯊烯，e)MPL/角鯊烯，f)低劑量的明礬，或g)高劑量的明礬(300μgAN1792)的注射。兩組接受AN1792棕櫚?；苌?33μg)結(jié)合a)PBS或b)角鯊烯的注射。最后一組，即第十組接受單獨(dú)PBS(無抗原或其它佐劑)的注射。對于接受弗氏佐劑的組，第一個劑量用CFA乳化，其余四個劑量用IFA乳化。除了高劑量明礬組接受300μg AN1792，其它各組以33μg的劑量給藥抗原。對于CFA/IFA，腹膜內(nèi)注射給藥，對于其它各組，在后肢四頭肌左側(cè)和右側(cè)交替肌肉內(nèi)注射給藥。前三個劑量以兩周間隔方案給藥，隨后兩個劑量以每月間隔給藥。從第二個劑量之后開始，每次免疫后六到七天取血，用于測定抗體效價。
2.免疫原的制備將2mg Aβ42(California Peptide，Lot ME0339)加入0.9ml去離子水，旋渦振蕩混合物，產(chǎn)生相對均一的混懸液。加入100μl 10×PBS(1×PBS，0.15M NaCl，0.01M磷酸鈉，pH7.5)?；鞈乙涸俅涡郎u振蕩，37℃保溫過夜留待次日使用。將不用的Aβ1-42脫水成為凍干粉末，于-20℃儲存。
通過在二甲基甲酰胺液中，將棕櫚酸酐偶聯(lián)到AN1792的氨基末段殘基上，然后從氫氟酸處理的樹脂上提取新生肽，制備AN1792的棕櫚?；苌?。
為了制備與完全弗氏佐劑(CFA)結(jié)合的制劑(組2)，將200μl中的33μg AN1792用CFA按照1∶1(體積∶體積)的比例乳化至終體積為400μl，用于第一次免疫。對于隨后幾次免疫，用不完全弗氏佐劑(IFA)進(jìn)行類似乳化。
為了制備第5組和第8組的結(jié)合MPL的制劑，將凍干粉末(RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)加入到0.2％的三乙胺水溶液，至終濃度為1mg/ml，然后旋渦振蕩。將混合物加熱到65-70℃保溫30秒，以制備輕微渾濁的均勻的膠束懸浮液。新鮮配制用于一系列注射的溶液。對于第5組的各次注射，將16.5μl PBS、50μg MPL(50μl)和162μl PBS中的33μg AN1792在硼硅酸鹽試管中混合后立即使用。
為了制備與低水包油型乳劑形成的制劑，將AN1792的PBS液加入含5％角鯊烯、0.5％吐溫80、0.5％ Span 85的PBS液，至終單劑量濃度為250μl液體中33μg AN1792(第6組)。將混合物過兩倉手動裝置乳化15到20次，直到顯微鏡下觀察可見乳滴直徑基本上等于1.0μm直徑的標(biāo)準(zhǔn)乳珠。得到的混懸液為牛奶狀乳白色。新鮮配制用于一系列注射的乳劑。對于第8組，將0.2％三甲胺中的MPL以每劑量50μg的濃度加入角鯊烯和去污劑混合物，用于進(jìn)行如上述的乳化。對于棕櫚酰衍生物(第7組)，將每劑量33μg棕櫚酰-NH-Aβ1-42加入角鯊烯，然后旋渦振蕩。然后在旋渦振蕩下，加入吐溫80和Span 85。將該混合物加入PBS，至終濃度為5％角鯊烯、0.5％吐溫80、0.5％ Span 85，將混合物如上述乳化。
為了制備結(jié)合明礬的制劑(第9組和第10組)，將AN1792的PBS液加入含鋁水凝膠(氫氧化鋁凝膠，Accurate，Westbury，NY)，達(dá)到250μl終制劑體積中每5mg明礬33μg(低劑量，第9組)或300μg(高劑量，第10組)AN1792的濃度?；鞈乙涸谑覝叵聹睾突旌?小時。
3.抗體效價的測定從第二次免疫開始后，每次免疫后六到七天對豚鼠取血，總共取血四次。通過一般材料和方法中描述的ELISA測定抗Aβ42的抗體效價。
4.組織制備約14周后，對所有豚鼠使用CO2無痛處死。收集腦脊液，取出腦，解剖三個腦區(qū)(海馬、皮層和小腦)，用于利用ELISA測定總Aβ蛋白質(zhì)的濃度。
B.結(jié)果1.抗體應(yīng)答當(dāng)測定免疫后對AN1792的抗體應(yīng)答時，各種佐劑產(chǎn)生效力范圍變化較大。如圖14所示，當(dāng)在PBS中給藥AN1792時，二或三次免疫后沒有檢測到抗體，第四和第五個劑量后檢測到的應(yīng)答可忽略不計，幾何平均效價(GMT)僅約為45。水包油型(o/w)乳劑第三個劑量后誘導(dǎo)中度效價(GMT 255)，第四個劑量后該值維持(GMT 301)，最后一個劑量后衰減(GMT 54)。對于結(jié)合明礬的AN1792存在明顯的抗原劑量應(yīng)答，在所有時間點(diǎn)上300μg的抗原比33μg的抗原具有更好的免疫原性。在抗體應(yīng)答的峰位，即第四次免疫后，兩個劑量之間GMT的差異為43％，為1940(33μg)和3400(300μg)。對33μg AN1792加MPL產(chǎn)生的抗體應(yīng)答非常類似于劑量幾乎高出十倍的抗原(300μg)結(jié)合明礬產(chǎn)生的抗體應(yīng)答。將MPL加入o/w乳劑相對于MPL作為單獨(dú)佐劑使制劑的效力降低近75％。AN1792的棕櫚酰衍生物在PBS中給藥時，完全沒有免疫原性，當(dāng)在o/w型乳劑中給藥時，在第三次和第四次取血時得到中度效價，GMT分別為340和105。用弗氏佐劑產(chǎn)生最高抗體效價，峰GMT約為87000，該值比其次兩個最有效制劑(MPL和高劑量AN1792/明礬)的GMT高出近30倍。
經(jīng)該研究鑒定的最值得推薦的佐劑是MPL和明礬。對于這兩種，MPL看起來更為優(yōu)選，因為它只需要低10倍的抗原劑量即可產(chǎn)生用明礬得到的相同的抗體應(yīng)答。可以通過增加抗原和/或佐劑劑量，和通過優(yōu)化免疫方案促進(jìn)應(yīng)答。對于AN1792，o/w型乳劑是一種非常差的佐劑，將o/w型乳劑加入MPL佐劑削弱了單獨(dú)MPL的固有佐劑活性。
2.腦中的Aβ水平在大約14周時，使豚鼠深度麻醉，提取腦脊液(CSF)，切下以下各組動物的腦，它們是用弗氏佐劑(第2組)、MPL(第5組)、明礬與高劑量(300μg)AN1792(第10組)免疫的組和PBS免疫的對照組(第3組)。為了測定Aβ肽的水平，解剖一個大腦半球，在5M胍中制備海馬趾、皮層、和小腦區(qū)的勻漿。將它們稀釋，然后通過與ELISA模式中已知濃度的Aβ標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的一系列稀釋度相比較對它們定量。所有四組的海馬、皮層和小腦中Aβ蛋白質(zhì)的水平都非常接近，盡管由這些制劑誘導(dǎo)的對Aβ的抗體應(yīng)答的范圍非常寬。海馬中測定的平均Aβ水平約為25ng/g組織，皮層中為21ng/g，小腦中為12ng/g。因此，在某些動物中出現(xiàn)的近三個月對Aβ的高循環(huán)抗體效價沒有改變它們腦中的總Aβ水平。各組之間，CSF中的Aβ水平也非常接近。AN1792免疫對內(nèi)源性Aβ缺乏巨大影響表明免疫應(yīng)答集中在Aβ的病理學(xué)形成上。
VIII.小鼠體內(nèi)對不同佐劑的免疫應(yīng)答用六周齡雌性瑞士Webster小鼠進(jìn)行該研究，每組10-13只動物。在第0、14、28、60、90和20天皮下給藥進(jìn)行免疫，制劑體積為200μl。用PBS作為所有制劑的緩沖液。從第二個劑量開始后，每次免疫后7天對動物取血，通過ELISA分析抗體效價。各組的治療方案如表7概述。
表7

腳注a實驗開始時各組中小鼠的個數(shù)b表明佐劑。所有這些制劑的緩沖液均為PBS。對于第8組，沒有佐劑也沒有抗原。
各組中針對Aβ42的抗體ELISA效價顯示于下表8中。
表8

該表顯示第4、5和18組得到最高效價，其中佐劑是125μg MPL，50μg MPL和QS21加MPL。
IX.不同佐劑的治療效果在PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠中，研究了一系列適合人類應(yīng)用的佐劑的治療效果，以確定它們增強(qiáng)對Aβ免疫應(yīng)答的能力和誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)的淀粉樣沉積物在腦中清除的能力。
從Charles River實驗室得到180只雄性和雌性7.5到8.5月齡的雜合PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠。將小鼠分成9組，每組含動物15-23只，用AN1792或AN1528結(jié)合各種佐劑免疫。分配動物時，使各組之間動物的性別、年齡、和動物家系盡可能匹配。佐劑包括明礬、MPL、和QS21，分別與兩種抗原混合，弗氏佐劑(FA)僅與AN1792組合。另外一組用加有防腐劑硫柳汞的PBS緩沖液配制的AN1792不加佐劑免疫。第9組單獨(dú)用PBS免疫，作為陰性對照。
聚集態(tài)Aβ肽的制備用人Aβ1-40(AN1528；California Peptides Inc.，Napa，CA；Lot ME0541)和人Aβ1-42(AN1792；California Peptides Inc.，Lot ME0439)肽的脫水儲藏于-20℃的凍干粉末新溶解配制一系列注射制劑。對于這種目的，將2mg肽加入0.9ml去離子水，旋渦振蕩，產(chǎn)生相對均一的溶液或懸浮液。與AN1792相比，AN1528在該步驟中是可溶的。當(dāng)AN1528開始沉淀時，加入100μl 10×PBS溶液(1×PBS0.15M NaCl、0.01M磷酸鈉，pH 7.5)。懸浮液再次旋渦振蕩，在37℃保溫過夜留待次日使用。
為了制備結(jié)合明礬的制劑(第1組和第5組)，將PBS中的Aβ肽加入含鋁水凝膠中(Alhydrogel，2％氫氧化鋁凝膠水溶液，Sargeant，Inc.，Clifton，NJ)，至每1mg明礬100μg Aβ肽的濃度。加入10×PBS溶液至終制劑體積為1×PBS液200μl。然后將混懸液在室溫下溫和混合約4小時，以便注射。
為了制備結(jié)合MPL的制劑(第2組和第6組)，將凍干粉末(RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT；Lot 67039-E0896B)加入0.2％的三乙胺水溶液，至終濃度為1mg/ml，然后旋渦振蕩。將混合物加熱到65-70℃保溫30秒，以制備輕微渾濁的均勻的膠束懸浮液。該溶液在4℃儲藏。用于每組注射，將每劑量50μl PBS中100μg的肽、每劑量50μg的MPL(50μl)和每劑量100μl的PBS在硼硅酸鹽試管中混合后立即使用。
為了制備結(jié)合QS21的制劑(第3組和第7組)，將凍干粉末(Aquila，F(xiàn)ramingham，MA；Lot A7018R)加入PBS(pH6.6-6.7)，至終濃度為1mg/ml，然后旋渦振蕩。將溶液在-20℃儲藏。用于每次注射時，將50μlPBS中每劑量100μg的肽、25μl PBS中每劑量25μg 的QS21和每劑量125μl的PBS在硼硅酸鹽試管中混合后立即使用。
為了制備與弗氏佐劑(CFA)結(jié)合的制劑(組4)，將200μl PBS中的100μg AN1792用完全弗氏佐劑(CFA)按照1∶1(體積∶體積)的比例乳化，終體積為400μl，用于第一次免疫。對于隨后幾次免疫，用不完全弗氏佐劑(IFA)對抗原進(jìn)行類似乳化。對于含有佐劑明礬、MPL或QS21的制劑，將每劑量100μg的AN1792或AN1528與明礬(每劑量1mg)或MPL(每劑量50μg)或QS21(每劑量25μg)混合，在PBS中至終體積為200μl，在后背肩胛骨之間皮下接種給藥。對于接受FA的組，將100μg的AN1792用完全弗氏佐劑(CFA)按照1∶1(體積∶體積)的比例乳化，終體積為400μl，腹膜內(nèi)給藥，作為第一次免疫，隨后用同樣量的免疫原在不完全弗氏佐劑(IFA)中進(jìn)行其后五個劑量的加強(qiáng)免疫。對于接受不含佐劑的AN1792治療的組來說，將10μg AN1792與5μg硫柳汞混合，在PBS中終體積為50μl，皮下給藥。第九組即對照組僅接受200μl PBS皮下給藥。在第0、16、28、56、85和112天上，對前三個劑量采用兩周間隔方案進(jìn)行免疫，之后以一月間隔方案免疫。第二個劑量開始后，每次免疫后六到七天對動物取血，用于測定抗體效價。最后一個劑量后約一周，無痛處死小鼠。通過腦中Aβ和APP水平的ELISA分析，以及通過腦切片中存在的淀粉樣斑的免疫組織化學(xué)評價，測定結(jié)果。另外，確定Aβ特異性抗體效價、和Aβ-依賴性增殖應(yīng)答和細(xì)胞因子應(yīng)答。
表9表明，F(xiàn)A和AN1792誘導(dǎo)出對Aβ1-42的最高抗體效價，第四次免疫之后達(dá)到峰效價(峰GMT75386)，最后一次免疫，即第六次免疫后，衰減了59％。由MPL和AN1792誘導(dǎo)的峰平均效價(峰GMT28867)比與FA產(chǎn)生的峰平均效價低62％，并且也在免疫方案中很早(3個劑量之后)達(dá)到峰，之后到第六次免疫后，峰值衰減到28％。由QS21和AN1792產(chǎn)生的峰平均效價(GMT1511)比用MPL得到的效價約低5倍。另外，應(yīng)答動力學(xué)較慢，因此需要再一次免疫以達(dá)到峰應(yīng)答。由明礬-結(jié)合AN1792產(chǎn)生的效價略高于用QS21得到的效價，應(yīng)答動力學(xué)也較QS21的迅速。對于在加有硫柳汞的PBS中給藥的AN1792，效價的頻率和大小僅高于PBS單獨(dú)處理組。MPL和AN1528產(chǎn)生的峰效價(峰GMT3099)比用AN1792產(chǎn)生的約低9倍。結(jié)合明礬的AN1528免疫原性非常低，僅在一些動物體內(nèi)產(chǎn)生較低效價。用單獨(dú)PBS免疫的對照動物體內(nèi)沒有觀察到抗體應(yīng)答。
表9

腳注a測定對Aβ1-42的幾何平均抗體效價b每組應(yīng)答者的數(shù)目通過ELISA測定的，AN1792或AN1528結(jié)合各種佐劑、或者硫柳汞治療12月齡小鼠皮層淀粉樣侵害的結(jié)果如圖15所示。在PBS對照PDAPP小鼠中，12個月時，皮層中總Aβ的水平中值為1817ng/g。在用AN1792加CFA/IFA、AN1792加明礬、AN1792加MPL和QS21加AN1792處理的小鼠中觀察到Aβ水平顯著降低。僅AN1792加CFA/IFA的降低達(dá)到統(tǒng)計的顯著度(P＜0.05)。然而，如實施例I和III所示，在降低Aβ水平方面的免疫效果在15月齡和18月齡小鼠中基本上較大。因此，期望AN1792加明礬、AN1792加MPL、AN1792加QS21組合物至少在治療年齡較大小鼠時將獲得統(tǒng)計的顯著度。相反，AN1792加防腐劑硫柳汞顯示，Aβ的中值與PBS治療小鼠基本上相同。當(dāng)比較皮層Aβ42的水平時，得到類似的結(jié)果。PBS對照組中Aβ42的中值為1624ng/g。用AN1792加CFA/IFA、AN1792加明礬、AN1792加MPL、AN1792加QS1處理小鼠中觀察到顯著降低的中值，分別為403、1149、620和714，AN1792 CFA/IFA處理組的降低獲得統(tǒng)計的顯著度(p＝0.05)。AN1792硫柳汞處理小鼠中Aβ42的中值為1619ng/g。
進(jìn)一步的治療佐劑或免疫原效率分析實施于9-10.5月齡的雄性和雌性異源PADPP轉(zhuǎn)基因小鼠中。每個處理組29-40只動物，研究期為25周；所以在實驗結(jié)束時動物為15-16.5月齡。處理組顯示于下表10中。

表10縮寫MAP-多抗原性肽；TT-破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位(830-844)；SQ-皮下；IP-腹膜內(nèi)；PBS-磷酸緩沖鹽溶液；ISA-51類似IFA的商業(yè)化佐劑；GCS-由甘氨酸/檸檬酸/蔗糖溶液構(gòu)成；MPL-SE是穩(wěn)定水油乳濁液中的MPL。
免疫方案除了第三組(縮短的QS21/AN1792)外，各處理組都相同。在0、2、4、8、12、16、20和24周注射小鼠，在3、5、9、13、17、21和25周取血。在本研究的25周內(nèi)，第一、二組注射8次而第三組4次。第四組，QS21/AN1792的縮減方案，僅在第0、2、4、和8周接受注射。盡管以同樣的取血方案對其取血以跟蹤效價的下降，在其它之后的周中，該組不受注射。第三和第五組，分別是QS21/AN1792和PBS，在本實驗中作為陽性和陰性對照。
通過抗Aβ抗體效價分析確定各效價。
第一組，MPL-SE/AN1792組。第九周幾何平均效價(GMT)上升至峰值17,100，25周時GMT降至10,000。初始時，MPL-SE效價上升至略高于QS21/AN1792對照組(第四組)。
第二組，ISA-51/AN1792組。在整個實驗中產(chǎn)生高效價，后9周內(nèi)GMT超過100,000。
第三組，QS21/AN1792對照組。效價在17周達(dá)到峰值，GMT 16,000。然后效價在以后的8周中下降，最后以GMT8,700結(jié)束。本組中一只動物在實驗的全過程中未升高效價。
第四組，QS21/AN1792縮減的注射方案組。效價在最后一次注射的5周后的第13周達(dá)到峰值7,300。最后取血時(25周)效價降至GMT2,100。在此對照組中，一只動物無可檢出的升高效價，而另一只動物在下降期結(jié)束后喪失所有的效價。
第五組，PBS獨(dú)立處理的組，無效價。
評價皮層Aβ的水平，可用ELISA量化總Aβ和Aβ1-42。簡述如下，腦半球分離為皮層、海馬和小腦組織，5M的胍緩沖液中勻漿并分析腦部Aβ。皮層的總Aβ和Aβ42有相似結(jié)果。進(jìn)行Mann-Whitney統(tǒng)計學(xué)分析以確定在P值為0.05(表明Aβ顯著變化)的組之間的顯著度。
與PBS對照組相比，所有的處理組顯著降低了總Aβ的水平(見表11)。MPL-SE/AN1792組的Aβ變化最大，并顯著優(yōu)于其它處理組。QS21/AN1792縮減組在Aβ總體變化上與接受所有8次注射的QS21對照組相似。與CFA/IFA-MAP(Aβ1-7)組相比，ISA51/AN1792組的Aβ水平也有相似的降低。
表11皮層Aβ水平

總之，佐劑MPL-SE、ISA-51和QS-21與AN1792結(jié)合可以有效的誘導(dǎo)足量的免疫應(yīng)答，顯著減緩Aβ在皮層中的沉著。
X.毒性分析在實施例2、3和7描述的研究的末期，收集組織，用于組織病理學(xué)檢查。另外，對來自實施例3和7的末期血樣進(jìn)行血液學(xué)和臨床化學(xué)檢查。評價大多數(shù)主要器官，包括腦、肺、淋巴、胃腸道、肝、腎、腎上腺和性腺。雖然在研究動物中觀察到偶發(fā)性損傷，但是在AN1792處理和未處理動物之間，無論是受影響組織還是損傷嚴(yán)重性上均沒有明顯差異。AN1528免疫動物與PBS處理或未處理動物相比沒有特別的值得注意的組織病理學(xué)損傷。在實施例7中，佐劑組和PBS處理動物之間臨床化學(xué)表現(xiàn)也沒有差異。雖然，實施例7中AN1792和弗氏佐劑處理動物相對于PBS處理動物，幾種血液學(xué)參數(shù)存在顯著增加，但是這些類型的影響是弗氏佐劑治療和伴生的腹膜炎帶來的能夠意料到的影響，它們不能說明AN1792治療帶來任何不利作用。雖然不是部分毒理學(xué)評價，但廣泛地檢查了PDAPP小鼠的腦部病理作為部分功效端點(diǎn)。在所有研究中沒有發(fā)現(xiàn)與治療有關(guān)的腦病理學(xué)不良影響的跡象。這些結(jié)果表明AN1792治療可以很好地耐受，至少基本上沒有副作用。
XI.抗Aβ抗體的治療性處理本實施例測試各種Aβ多克隆和單克隆抗體抑制異源轉(zhuǎn)基因小鼠腦部Aβ聚集的能力。
1.實驗設(shè)計60只8.5-10.5月齡的雄性和雌性雜合PADPP轉(zhuǎn)基因小鼠來自Charles River實驗室。小鼠被分成6組，分別用針對Aβ的各種抗體處理。分組使每組中動物性別、月齡、家系和來源盡可能保持一致。如表10所示，抗體包括四種鼠Aβ特異性的單克隆抗體，2H3(針對Aβ殘基1-12)，10D5(針對Aβ殘基1-16)，266(針對Aβ殘基13-28，結(jié)合單體的AN1792而非聚集態(tài)AN1792)，21F12(針對Aβ殘基33-42)。第五組用Aβ特異性的多克隆抗體組分(用聚集態(tài)AN1792免疫獲得)處理。陰性對照組僅接受稀釋劑PBS，沒有抗體。
單克隆抗體每次注射劑量約每千克體重10毫克(假設(shè)小鼠重50克)。平均每七天進(jìn)行腹膜內(nèi)給藥，使抗Aβ效價維持在1000以上。盡管因mAb 266不與本實驗中用作捕捉抗原的聚集態(tài)AN1792良好結(jié)合，從而有效價較低，但仍然使用同樣的劑量方案。由于在體內(nèi)抗體被快速清除，接受單克隆抗體2H3的組在前三周內(nèi)被終止。每次給藥前對動物取血以測定抗體效價。治療持續(xù)6個月，總計約196天。在最后一次給藥一周后，無痛處死動物。
表12

腳注a實驗結(jié)束時組內(nèi)的小鼠數(shù)目，所有的組以每組10只動物開始。
bNA不適用cmAb單克隆抗體2.材料和方法a抗體制備從兩組動物采集的血液中制備抗Aβ多克隆抗體。第一組含有6-8周齡的100只雌性瑞典Webster小鼠。在0、15和29天用100μg與CFA/IFA組合的AN1792免疫。第三十六天進(jìn)行第四次注射，給藥一半劑量的AN1792。第42天放血法處死動物，制備血清，共收集血清64ml。第二組含有24只6-9周齡的雌性小鼠，與PDAPP小鼠等基因，但非轉(zhuǎn)基因人APP基因的。在0、14、28和56天用100μg與CFA或IFA組合的AN1792免疫。第63天放血法處死動物，制備血清，共收集血清14ml?；旌线@兩種血清。使用50％飽和硫酸氨進(jìn)行兩次連續(xù)的沉淀作用，以純化抗體組分。最終的沉淀物在PBS中透析并檢測內(nèi)毒素。內(nèi)毒素的水平小于1EU/mg。
抗Aβ單克隆抗體制備于腹水液。冰冷的腹水液中加入濃縮的硫酸葡聚糖鈉鹽進(jìn)行脫水，在冰上攪動使終濃度為0.238％。攪動加入濃縮的CaCl2，使其終濃度為64mM。10,000g離心該溶液，丟棄沉淀。在冰上逐滴攪動加入等體積的飽和硫酸氨于上清液中。10,000g離心該溶液，丟棄上清液。沉淀重懸并透析于20mM Tris-HCl，0.4M NaCl中pH7.5。這一部分使用Pharmacia FPLC Sepharose Q柱，并以反向梯度從0.4M到0.275M NaCl(溶于20mM Tris-HCl pH7.5)洗脫。
抗體的峰值可以通過280納米的吸收確定，從而收集合適的部分。通過BCA方式測定蛋白濃度，以及SDS-PAGE測定純度，對純化的抗體制備物進(jìn)行定性。也檢測抗體池的內(nèi)毒素。內(nèi)毒素水平低于1EU/mg。低于100的效價被任意地給一個25的效價值。
3.腦部Aβ和APP的水平各種抗Aβ抗體制備物處理6個月后，移去動物腦部，鹽水灌注。大腦半球之一準(zhǔn)備用于免疫組織化學(xué)分析，第二個用于測定Aβ和APP水平。為了測定各種形式β淀粉樣沉積物和淀粉樣前體蛋白(APP)濃度，解剖大腦半球，在5M胍中勻漿海馬、皮層和小腦三個區(qū)。進(jìn)行一系列的稀釋，與ELISA模式中已知濃度的Aβ肽或APP的一系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)比較，從而量化淀粉樣肽或APP的水平。
ELISA測定的皮層和海馬勻漿液中總Aβ和Aβ1-42的水平，小腦中總Aβ的水平分別在表11、12和13中作了說明。接種PBS的對照組總Aβ濃度的中值在海馬中比皮層中高3.6倍(海馬組織中值63,389ng/g比皮層組織中值17,818ng/g)。對照組小腦的中值(30.6ng/g組織)比海馬中低超過2,000倍。這些水平與從前報道的同齡雜合PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠相似(Johnson-Wood等，1997)。
皮層中，一個處理組的Aβ水平中值(以Aβ1-42測定的)與對照組(p＜0.05)的顯著不同，那些動物接受了表13所示的多克隆抗Aβ抗體。與本處理組的對照組相比，Aβ1-42的中值降低了65％。與另外一個處理組(動物被給藥單克隆抗體10D5，p＝0.0433)相比，Aβ1-42的中值降低了55％。
表13

腳注a實驗結(jié)束時每組動物的數(shù)目。
b納克/克組織。
c Mann-Witney分析。
d NA不適用。
e標(biāo)準(zhǔn)偏差。
海馬中，與多克隆抗Aβ抗體處理相關(guān)的總Aβ的中值降低的百分率(50％，p＝0.0055)小于皮層中觀察到的(65％)(表14)。但海馬中降低的絕對量幾乎比皮層大三倍，海馬中凈降低為31,683納克/克組織而皮層中為11,685納克/克組織。如不以總Aβ，而以Aβ1-42這種更加致淀粉病的Aβ形式為測定基準(zhǔn)，多克隆抗體導(dǎo)致的降低是顯著的(p＝0.0025)。單克隆抗體10D5和266處理組的中值分別降低33％和21％。
表14

腳注a實驗結(jié)束時每組動物的數(shù)目。
b納克/克組織。
c Mann-Witney分析。
d NA不適用。
e標(biāo)準(zhǔn)偏差。
也測定了小腦中的總Aβ(表15)。在多克隆抗Aβ抗體和266抗體處理組中，總Aβ水平顯著降低(分別為43％和46％，p＝0.0033和p＝0.0184)，而10D5處理組有幾乎顯著的降低(29％，p＝0.0675)。
表15

腳注a實驗結(jié)束時每組動物的數(shù)目。
b納克/克組織。
c Mann-Witney分析。
d NA不適用。
e標(biāo)準(zhǔn)偏差。
ELISA測定了來自抗原處理的及對照，PBS處理的小鼠皮層和小腦APP濃度。使用兩種不同的APP分析。第一種，APP-α/FL，識別APP-α(α，剪切自Aβ序列的分泌型APP)和APP的全長型(FL)。第二種分析只識別APP-α。與Aβ在一系列處理組中的處理相關(guān)性降低相反，與對照動物相比，在所有處理組中APP水平幾乎不變。這些結(jié)果表明Aβ抗體的免疫消耗Aβ，但不消耗APP。
總之，抗AN1792的多克隆抗體處理的小鼠，其皮層、海馬和小腦中Aβ的水平顯著降低。Aβ1-42氨基末端，特別是1-16和13-28的氨基酸，的單克隆抗體也表現(xiàn)顯著的治療效果，盡管程度更小。
4.組織化學(xué)分析PBS、多克隆Aβ42、21F12、266和10D5免疫的小鼠腦部亞群中，Aβ-免疫活性斑的形態(tài)與之前研究中的形態(tài)(使用Aβ42的標(biāo)準(zhǔn)免疫程序)進(jìn)行定性比較。
淀粉樣斑的程度和外形的最大變化均產(chǎn)生在多克隆Aβ42免疫的動物中。淀粉樣侵害、侵蝕的斑形態(tài)以及細(xì)胞相關(guān)的Aβ-免疫活性，這三者的降低非常類似標(biāo)準(zhǔn)免疫程序所產(chǎn)生的效果。這些觀察支持ELISA的結(jié)果，即，給藥多克隆Aβ42抗體可以導(dǎo)致總Aβ和Aβ1-42的顯著降低。
同樣的定性估計中，10D5組的淀粉樣斑在數(shù)量和形態(tài)上也有所減少，并存在細(xì)胞相關(guān)的Aβ-免疫活性。相對于對照處理動物，抗Aβ的多克隆Ig組分和一個單克隆抗體10D5分別降低了93％和81％的斑侵害(p＜0.005)。似乎21F12對斑侵害有相對較弱的效果。相對于對照處理的動物，對pabAβ1-42處理后的腦部顯微照相顯示出彌散的沉積物，以及pab Aβ1-42處理組中許多更大緊密聚集斑的消失。
5.抗體效價的測定每次腹膜內(nèi)接種之前，對三個來自每組的，隨機(jī)選擇的小鼠亞群進(jìn)行采血，共30個血樣。夾心ELISA的方法，使用包被Aβ1-42的塑料多孔板進(jìn)行抗體效價的測定，測定的抗體為Aβ1-42結(jié)合抗體，在“一般材料和方法”中有詳細(xì)的說明。每次采血的平均效價顯示于圖16-18中(分別為多克隆抗體和單克隆抗體10D5及21F12)。在這段時期，多克隆抗體制劑的效價平均高于1000，而10D5及21F12處理的動物效價略高于這一水平。
6.淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答最后一次抗體融入8天后收集脾細(xì)胞，測定依賴Aβ的淋巴細(xì)胞增殖。新鮮收集的細(xì)胞，每孔105個，在Aβ1-40(濃度為5μM，以起刺激作用)存在下培養(yǎng)5天。作為陽性對照，另外的細(xì)胞與T細(xì)胞有絲分裂原PHA共同培養(yǎng)，作為陰性對照，細(xì)胞的培養(yǎng)無外加的肽。
各種抗Aβ抗體被動免疫的衰老PDAPP小鼠的脾細(xì)胞在體外經(jīng)AN1792刺激、增殖，測定細(xì)胞因子應(yīng)答。這些分析的目的在于確定是否被動免疫促使抗原的呈遞，并因此引發(fā)AN1792特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。在抗Aβ抗體被動免疫的小鼠中未觀察到AN1792特異性的增殖或細(xì)胞因子應(yīng)答。
XII.被動免疫的深入研究在第二項研究中，重復(fù)10D5的處理并檢測兩種另外的抗Aβ抗體，單克隆抗體3D6(Aβ1-5)及16C11(Aβ33-42)。對照組接受PBS或一種不相關(guān)的配合同種型抗體(TM2a)。小鼠較前述研究中大(11.5-12月的雜合體)，其它實驗設(shè)計都相同。再一次，在處理6個月后，與PBS或配合同種型抗體對照組(p＝0.003)相比，10D5使斑侵害降低了超過80％。另外一個抗Aβ抗體3D6同樣有效，產(chǎn)生86％的降低(p＝0.003)。相反，第三個抗該肽的抗體，16C11，對斑侵害無效。Aβ42ELISA定量也獲得相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明在缺少T細(xì)胞免疫情況下，抗Aβ肽的抗體應(yīng)答足以降低PDAPP小鼠的淀粉樣沉著，但并非所有的抗Aβ抗體都有效。針對具有Aβ氨基酸1-5或3-7的表位的抗體特別有效。
總之，我們表明了被動給藥抗Aβ抗體降低了患阿爾茨海默氏病模式小鼠的斑沉著的程度。較為平緩的血清濃度時(25-70μg/ml)，抗體以足以修飾β-淀粉樣斑的水平接觸CNS?？贵w對CNS的進(jìn)入并非因為血腦屏障的異常泄漏，因為Evans藍(lán)檢測PDAPP小鼠，未發(fā)現(xiàn)血管通透性的增加。衰老PDAPP小鼠腦主質(zhì)中的抗體濃度和非轉(zhuǎn)基因小鼠相似，即血清中抗體濃度0.1％(不考慮同種型)。
XIII.抗體結(jié)合的監(jiān)測檢測是否抗Aβ抗體可以在CNS內(nèi)直接作用，取實施例XII結(jié)束時鹽水灌注的小鼠腦部，確定外周給藥的抗體是否存在。未固定的恒冷箱腦切片暴露于抗鼠免疫球蛋白(羊抗鼠IgG-Cy3)的一種熒光藥物中。10D5和3D6處理組的腦部淀粉樣斑被抗體強(qiáng)烈地著色，而16C11組無染色。為充分展示斑沉著的程度，先用抗Aβ抗體與各個腦組織的系列切片免疫反應(yīng)，然后用第二種試劑，外周給藥后10D5和3D6接觸CNS內(nèi)的大多數(shù)淀粉樣斑。與16C11組相比，這些組中的斑侵害被極大的降低。這些數(shù)據(jù)表明，外周給藥的抗體可以進(jìn)入CNS內(nèi)，并在其中直接引發(fā)淀粉樣沉積物的清除?？赡?6C11也能接觸到淀粉樣斑，但卻不能結(jié)合。
XIV.離體篩選分析抗淀粉樣沉積物抗體的活性為了檢測抗體對斑清除的效果，我們用初級小膠質(zhì)細(xì)胞與未固定的恒冷箱腦切片(來自PDAPP鼠或人AD腦)共同培養(yǎng)建立了一種離體分析。小膠質(zhì)細(xì)胞來自新生DBA/2N小鼠(1-3天)的腦皮層。在HBSS(Hanks平衡鹽溶液，Sigma)和50μg/ml DNA酶I中機(jī)械化分散皮層。用100μm細(xì)胞濾器(Falcon)過濾分散化的細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘。沉淀重懸于生長培養(yǎng)介質(zhì)中(高葡萄糖DMEM，10％FBS，25ng/mlrmGM-CSF)，以每個T-75培養(yǎng)瓶兩個腦組織的密度鋪板細(xì)胞。7-9天后，培養(yǎng)瓶在定軌搖床以200rpm的速度37℃培養(yǎng)2小時。細(xì)胞懸浮物在1000rpm離心，重懸于分析培養(yǎng)介質(zhì)。
PDAPP鼠或人AD腦(死亡時間小于3小時)的10μm恒冷箱腦切片融化后，置于多聚賴氨酸覆蓋的園行玻璃蓋片上，并放置在24孔組織培養(yǎng)平板孔中。分析培養(yǎng)介質(zhì)沖洗蓋片二次，分析培養(yǎng)介質(zhì)含有1％FBS的H-SFM(無雜交瘤細(xì)胞血清培養(yǎng)介質(zhì)，Gibco，BRL)、谷氨酰氨、青霉素或鏈霉素，以及5ng/ml rmGM-CSF(R&D)。一小時內(nèi)加入兩倍濃度的對照或抗Aβ抗體(終濃度5μg/ml)。以0.8×106細(xì)胞/ml密度接種小膠質(zhì)細(xì)胞于分析培養(yǎng)介質(zhì)中。培養(yǎng)物在濕潤培養(yǎng)箱內(nèi)(37度5％CO2)孵育24小時或更長時間。孵育結(jié)束后，4％的甲醛固定培養(yǎng)物并浸透于0.1％的Triton-X100。切片用生物素?；?D6染色，接著鏈霉素或Cy3共軛(Jackson ImmunoResearch)。外源的小膠質(zhì)細(xì)胞通過核染色(DAPI)可見。倒置熒光顯微鏡(Nikon，TE300)觀察培養(yǎng)物，SPOT數(shù)碼相機(jī)用SPOT軟件(診斷裝置)進(jìn)行光學(xué)顯微照相。Western印記分析中，培養(yǎng)物用8M尿素抽提，在還原tricine樣品緩沖液中以1∶1稀釋，并上樣于16％tricine凝膠中(Novex)。轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移膜上后，印記暴露于5μg/ml pabAβ42和HRP偶聯(lián)的抗鼠抗體，在ECL(Amersham)中顯像。
16C11(一種抗Aβ抗體，在體內(nèi)無效)存在時，對PDAPP腦切片進(jìn)行分析，β淀粉樣斑保持其完整性，并且未觀察到吞噬現(xiàn)象。相反，鄰近的切片在10D5存在時，淀粉樣沉積物大多不存在，并且小膠質(zhì)細(xì)胞顯示許多含有Aβ的吞噬泡。AD腦切片也有同樣的結(jié)果；10D5誘導(dǎo)對AD斑的吞噬，而16C11無效。此外，該分析提供了進(jìn)行鼠或人小膠質(zhì)細(xì)胞和鼠、兔或靈長類動物抗Aβ抗體的可比性結(jié)果。
表16表示幾種不同結(jié)合特異性的抗體是否產(chǎn)生結(jié)合和/或吞噬作用。表中可見，結(jié)合氨基酸1-7內(nèi)表位的抗體結(jié)合并清除淀粉樣沉積物，而結(jié)合氨基酸4-10內(nèi)表位的抗體結(jié)合但不清除淀粉樣沉積物。結(jié)合C末端到殘基10處表位的抗體既不結(jié)合也不清除淀粉樣沉積物。
表16表位特異性分析

表17顯示的結(jié)果獲自幾種抗Aβ抗體，比較其離體分析中誘導(dǎo)吞噬的能力，以及在體內(nèi)被動轉(zhuǎn)移研究中減少斑沉積的能力。盡管16C11和21F12可以高親和地結(jié)合合成的聚集態(tài)Aβ肽，這些抗體不能與未固定的腦切片中的β淀粉樣斑反應(yīng)，因此不能引發(fā)離體分析中的吞噬，而且在體內(nèi)并不有效。在三種測定中，10D5、3D6和多克隆抗Aβ抗體都有活性。22C8抗體對Aβ天然形式的類似物有更強(qiáng)的結(jié)合，其1和7處的天冬氨酸在類似物中被同型天冬氨酸所替換。這些結(jié)果顯示體內(nèi)效果是基于CNS中直接抗體介導(dǎo)的斑清除作用，并且離體分析可以預(yù)示體內(nèi)效果。
同樣的分析被用來檢測抗一個同型核蛋白片段(稱為NAC)抗體的清除作用。已知同型核蛋白是一種淀粉樣斑相關(guān)蛋白。NAC的抗體與具有淀粉樣斑、小膠質(zhì)細(xì)胞的腦組織樣品接觸，同前。用兔血清作對照。接下來的監(jiān)測顯示斑的數(shù)目和尺度有顯著的減少，顯示了抗體的清除活性。
表17離體分析預(yù)示體內(nèi)效果

共聚焦顯微鏡被用來確定離體分析中抗體已內(nèi)化。在對照抗體存在時，使外源的小膠質(zhì)細(xì)胞維持在組織上方的一個共聚焦平面，在此區(qū)域沒有含Aβ的吞噬細(xì)胞和完好的淀粉樣斑。在10D5存在時，幾乎所有的淀粉樣斑物質(zhì)都存在于外源小膠質(zhì)細(xì)胞的小泡中。為了確定內(nèi)化肽的最終命運(yùn)，在各個時間點(diǎn)對10D5處理的培養(yǎng)物進(jìn)行8M尿素抽提，并進(jìn)行Western印記分析檢測。在第一小時時間點(diǎn)，還未產(chǎn)生吞噬作用，與多克隆抗Aβ抗體的反應(yīng)顯示一個強(qiáng)的4kD條帶(相應(yīng)于Aβ肽)。Aβ的免疫活性在第一天降低，到第三天消失。因此，抗體介導(dǎo)Aβ的吞噬作用導(dǎo)致了其降解。
為了確定是否是Fc在離體分析中介導(dǎo)了吞噬，制備抗Aβ抗體3D6的F(ab’)2片段。盡管F(ab’)2片段保持了其與淀粉樣斑反應(yīng)的全部能力，它們不能引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用。此外，整個抗體的吞噬可以被抗鼠Fc受體(抗CD16/32)的藥物阻斷。這些數(shù)據(jù)顯示Aβ的體內(nèi)清除是通過Fc受體介導(dǎo)的吞噬進(jìn)行的。
XV.抗體通過血腦屏障的途徑本實施例通過靜脈注射到正?；騊DAPP小鼠周邊組織后，確定進(jìn)入腦部的抗體的濃度。0.9％NaCl溶液灌注PDAPP或?qū)φ盏恼Ｐ∈?。剖出腦區(qū)(海馬和皮層)并快速冷凍。在0.1％Triton+蛋白酶抑制劑中勻漿腦組織。ELISA檢測抽提物中的免疫球蛋白。Fab’2羊抗鼠IgG包被RIA板作為捕捉試劑。將腦抽提物或血清孵育1小時。用抗鼠IgG1-HRP、IgG2a-HRP或IgG2b-HRP(Catlag)檢測同種型。發(fā)現(xiàn)無論何種同種型，存在于CNS中的抗體與其在血液中的濃度比為1∶1000。例如，當(dāng)血液中IgG1濃度是血液中IgG2a濃度的三倍時，在腦部的濃度也是它的三倍，二者的濃度都是血液中濃度水平的0.1％。在轉(zhuǎn)基因或未轉(zhuǎn)基因的小鼠中都觀察到這一結(jié)果，因此PDAPP沒有獨(dú)特的血腦屏障泄漏。
XVI.MAP構(gòu)象中的Aβ肽的治療效果進(jìn)行治療性佐劑或免疫原效率的研究，選擇9-10.5月齡的雄性和雌性PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠，測試含有上述四聚體MAP構(gòu)象中Aβ1-7的融合蛋白的治療效果。研究持續(xù)時間為25周，每個處理組29-40只動物；因此在結(jié)束時，動物月齡15-16.5月。本研究使用的方法與上面實施例VIII對不同佐劑的治療研究中的相同。各處理組在下表18中表示。
表18

表18縮寫MAP-多抗原性肽；TT-破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位(830-844)；SQ-皮下；IP-腹膜內(nèi)；PBS-磷酸緩沖鹽溶液；GCS-是甘氨酸/檸檬酸/蔗糖制劑。
免疫方案各處理組都相同。在0、2、4、8、12、16、20和24周注射小鼠，在3、5、9、13、17、21和25周取血。第1，2，3，4和6組注射8次。第2和第3組，即QS21/AN1792和PBS，在本實驗中分別作為陽性和陰性對照。
通過抗Aβ抗體效價分析測定各組效價。
第一組，CFA/IFAMAP(Aβ1-7TT)組，效價水平低。13周時GMT達(dá)到峰值，僅為1,200，且第25周降至600。30只小鼠中3只無任何效價升高，而另外7只實驗結(jié)束時效價低于400。
第二組，QS21/AN1792對照組。效價在17周達(dá)到峰值，GMT 16,000。然后效價在以后的8周中下降，最后以GMT8,700結(jié)束。此組中一只動物在實驗全過程中都沒有效價產(chǎn)生。
第三組，PBS獨(dú)立處理組。沒有效價產(chǎn)生。
與PBS對照組相比，兩個處理組皮層Aβ水平顯著降低(見表19)。盡管抗Aβ抗體的效價相對較低，CFA/IFAMAP(Aβ1-7)組與PBS對照組相比，仍然顯著地降低了皮層Aβ的水平。
表19皮層Aβ水平

總之，Aβ1-7MAP免疫原可以有效的誘導(dǎo)充分的免疫應(yīng)答，顯著減緩Aβ在皮層中的沉著。
XVII.猴中對Aβ的免疫應(yīng)答表位成像本例分析靈長類動物對AN1792免疫(即Aβ1-42)的應(yīng)答。結(jié)合了QS-21佐劑(50或100μg/劑)或5％無菌右旋糖水溶液(D5W，對照組)的AN1792(75或300μg/劑)免疫11組猴子(4只/性別/組)。所有的動物在表20所示的三個注射安排之一均接受IM注射，共計4、5或8次劑量。血清樣品(來自4只/性別/組)在實驗的第175天采集，CSF樣品(來自3只/性別/組)在實驗的第176天采集(第六個月尸體剖檢)，并測定其結(jié)合Aβ1-40肽和APP的能力。
表20；小組的分配及劑量水平

a設(shè)計1，1、15、29、57、85、113、141、169日給藥；設(shè)計2，1、29、57、113、169日給藥；設(shè)計3，43、85、169日給藥。
bD5W注射的對照組。
c含有甘氨酸/檸檬酸/蔗糖緩沖溶液的載體，是AN1792的賦形劑。
通過ELISA測定與覆蓋Aβ1-42全序列之重疊肽結(jié)合的抗體，確定這些AN1792免疫動物的血清樣品中的抗體所識別的線性肽的確切陣列。手性技術(shù)獲得帶有部分AN1792序列的生物素?；碾?，即，10個氨基酸肽每個有9個殘基的重疊和一個殘基突出(合成號5366，5331和5814)。前32個肽(從AN1792N末端上游第八個氨基酸往下，直到AN179第24個氨基酸)的C端連接一個GGK接頭使其生物素酰化。后10個肽(重復(fù)上一系列的32肽)的N端連接一個含有EGEG的接頭使其生物素酰化。凍干的生物素?；碾娜芙庥贒MSO中濃度為5mM。這些肽的儲存液在TTBS(0.05％ Tween20，25mM Tris-HCl，137mMNaCl，5.1mM KCL，pH＝7.5)中稀釋至5μM。5μM的溶液中取100μl以二等份加入預(yù)先覆蓋有鏈親和素的96孔板(Pierce)。平板在室溫下孵育1小時，然后用TTBS洗4次。血清樣品在不含疊氮化物的樣品稀釋劑中稀釋以歸一化效價每孔加100μl。這些平板在室溫下孵育1小時，然后用TTBS洗4次。HRP偶聯(lián)的羊抗人抗體(JacksonImmunoResearch)在不含疊氮化物的樣品稀釋劑中以1∶10,000稀釋，每孔加入100μl。平板再孵育并沖洗。在加入用于終止反應(yīng)的30μl 2N的H2SO4之前，每孔加入100μl TMB(Pierce)并孵育15分鐘以產(chǎn)生顏色反應(yīng)。在Vmax或Spectramax比色平板讀取器上測定450nm的光密度。
AN1792的免疫導(dǎo)致所有劑量組的100％的動物在175天時表達(dá)抗體。各組的平均效價范圍從14596到56084。更高的效價傾向于那些有更高的抗原和/或佐劑濃度的免疫方案，但由于個體動物對免疫的應(yīng)答有很高的波動，對此表現(xiàn)不出統(tǒng)計上的顯著差異。
AN1792抗體陽性的血清同樣也是Aβ1-40抗體陽性血清。各組的平均效價范圍從36867到165991，而抗AN1792的效價在175天各組沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異。結(jié)合AN1792與結(jié)合Aβ1-40有很高的正相關(guān)性(Spearman r＝0.8671)。
AN1792免疫的各種設(shè)計安排的48只猴中，33只產(chǎn)生了體積和質(zhì)量上足以用于分析的CSF樣品。其中32只(97％)有對AN1792的陽性效價。效價范圍從2到246，平均值為49.44±21.34?？笰N1792的CSF水平是血清中的0.18±0.11％，與血清效價表現(xiàn)出高的正相關(guān)(Spearman r＝0.7840)。組間及性別之間的CSF抗體百分率沒有差異。CSF的抗體水平與通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外周產(chǎn)生抗體的被動轉(zhuǎn)移一致。
對于抗AN1792陽性之CSF樣品的一個亞群的檢測表明，和血清樣品中的抗體相似，CSF的抗體對Aβ1-40有交叉反應(yīng)。Aβ1-40效價和相應(yīng)的AN1792效價有很高的相關(guān)性(Spearman r＝0.9634)。檢測CSF樣品中最高AN1792效價的亞群，顯示對APP沒有結(jié)合，正如血清抗體一樣。
檢測第175天的血清對一系列10體重疊肽的抗性，所有猴的抗體都結(jié)合其序列覆蓋AN1792肽1-10氨基酸的肽(APP的氨基酸653-672)。一些動物中，這是能被檢測到結(jié)合的唯一肽鏈(見圖19)。
其它動物中還可以檢測到其它反應(yīng)活性，但所有的情況下，對肽鏈N末端的反應(yīng)活性都是主導(dǎo)的。其它反應(yīng)活性可以歸結(jié)為兩組。第一，也最普遍，是對以AN1792肽N末端1-10為中心的肽鏈的結(jié)合(圖20)。這種類型的結(jié)合針對那些覆蓋AN1792肽氨基酸1-8，1-9和2-11的肽。這些反應(yīng)活性，和1-10肽的反應(yīng)活性一起，代表了所有動物中的主要反應(yīng)活性。個體動物在一段時間內(nèi)的表位成像顯示對1-10肽的抗體反應(yīng)活性超過鄰近的肽。這表明免疫應(yīng)答強(qiáng)烈地傾向于具有自由天冬氨酸殘基的AN1792肽N末端。在一些動物中，第二種次要的可檢出的活性是對位于主要區(qū)域C端，以及覆蓋AN1792肽氨基酸7-16，11-20和16-25為中心的肽的結(jié)合。這些反應(yīng)活性僅在10％到30％的猴中可見。
不同動物的應(yīng)答變化(如，是否氨基酸1-10是專有的或主導(dǎo)性的活性表位)與抗原或佐劑劑量、給藥安排，或抗體效價不相關(guān)，而且可能是各動物遺傳組成的一個表現(xiàn)。
XVIII.對人受試者的預(yù)防和治療進(jìn)行單劑量I期試驗確定人體安全性。以逐步增加的劑量對不同患者給藥治療藥物，從約0.01(推測功效的水平)開始，以3為系數(shù)增長，直到達(dá)到10倍有效小鼠劑量的水平。
進(jìn)行II期試驗確定治療功效。挑選利用阿爾茨海默氏病和相關(guān)病癥協(xié)會(ADRDA)為可能發(fā)生的AD制定的標(biāo)準(zhǔn)確定的患早期到中度阿爾茨海默氏病的患者。按照微小精神狀況檢查(Mini-Mental State Exam，MMSE)，合適的患者積分在12-26范圍內(nèi)。其它選擇標(biāo)準(zhǔn)是，患者在研究期間容易存活，以及不會出現(xiàn)復(fù)雜問題，例如可能帶來干擾的伴隨藥物的使用。利用典型心理測量法(例如MMSE、ADAS，它們對于評價阿爾茨海默氏病的狀況和功能是一種內(nèi)容詳盡的標(biāo)尺)對患者功能作基線評價。這些心理測量標(biāo)準(zhǔn)能夠測量阿爾茨海默氏病的發(fā)展。合適的定性生命標(biāo)準(zhǔn)也可以用來監(jiān)測治療。還可以通過MRI監(jiān)測疾病發(fā)展。也可以監(jiān)測患者的血液數(shù)據(jù)，包括分析免疫原特異性抗體和T細(xì)胞應(yīng)答。
測定基線后，患者開始接受治療。將它們完全打亂，以雙盲方式用治療藥物或安慰劑治療。至少每六個月監(jiān)測患者一次。通過進(jìn)展中治療組相對于安慰劑組有效降低確定效果。
進(jìn)行第二次II期試驗，評價患者從非阿爾茨海默氏病的早期記憶丟失(有時被稱為年齡有關(guān)的記憶損傷(AAMI)或輕度認(rèn)知損傷(MCI))到經(jīng)ADRDA標(biāo)準(zhǔn)確定為可能的阿爾茨海默氏病的改變。通過篩選參照群體的記憶丟失早期跡象或其它與前阿爾茨海默氏病癥候?qū)W、阿爾茨海默氏病的家族史、遺傳危險因素、年齡、性別和已發(fā)現(xiàn)的其它預(yù)示阿爾茨海默氏病高危特征有關(guān)的不利，從非臨床群體選擇具有轉(zhuǎn)化成阿爾茨海默氏病高風(fēng)險的患者。收集基于包括MMSE和ADAS的合適法則和其它設(shè)計用來評價較為正常群體法則的基線積分。將這些患者群體分成合適的安慰劑對交替劑量藥物組。間隔六個月后，對這些患者群體進(jìn)行跟蹤，每個患者的端點(diǎn)是到觀察結(jié)束時他或她是否轉(zhuǎn)化成可能的阿爾茨海默氏病(按照ADRDA標(biāo)準(zhǔn)判斷)。
XIX.一般材料和方法1.抗體效價的測定在小鼠尾靜脈切開小口取血，采集約200μl血置于微量離心管(microfuge tube)。豚鼠如下取血，首先剃去后腿背面的毛，然后用18號針頭劃破跖骨靜脈，采血于微量離心管。室溫下(RT)靜置1小時使血液凝結(jié)成塊，旋渦振蕩，然后在14000×g離心10分鐘，將血塊從血清中分離出來。然后將血清轉(zhuǎn)移到干凈的微量離心管中，4℃儲存直到測定效價。
用ELISA測定抗體效價。在Well包被緩沖液(Well CoatingBuffer)(0.1M磷酸鈉，pH8.5，0.1％疊氮化鈉)中含有10μg/ml Aβ42或SAPP或其它抗原(如各單獨(dú)報道記錄)，用100μl溶液包被96孔微滴定平板(Costar EIA平板)，室溫過夜。吸干各孔，從1/100稀釋度的樣品稀釋液(0.014M磷酸鈉、pH7.4、0.15M NaCl、0.6％牛血清白蛋白、0.05％硫柳汞)開始向孔中加入血清。以三倍的跨度制備七個連續(xù)稀釋度的樣品，置于平板中，終稀釋度為1/218700。稀釋液在經(jīng)包被的平板的孔中室溫保溫1小時。然后用含0.05％吐溫20的PBS沖洗四次。將第二種抗體，結(jié)合辣根過氧化物酶的羊抗小鼠Ig(從BoehringerMannheim得到)，作為100μl 1/3000稀釋度的樣品稀釋液加到孔中，室溫保溫1小時。再次用PBS、吐溫20沖洗平板四次。為了形成色原體，將100μl慢TMB(Slow TMB，3，3’，5，5’-四甲基對二氨基聯(lián)苯，從Pierce Chemicals得到)加入各孔，室溫保溫15分鐘。加入25μl 2M硫酸終止反應(yīng)。然后在分子裝置Vmax(Molecular Devices Vmax)上記錄450nm-650nm處的光密度。
效價表示為得到最大光密度一半時血清稀釋度的倒數(shù)。最大OD通常取自起始的1/100稀釋液，除非該條件下具有非常高的效價，在這種情況下，需要建立較高起始稀釋度的最大OD。如果兩種稀釋液之間下降了50％點(diǎn)位，則利用線性外推法計算最終效價。為了計算幾何平均抗體效價，低于100的效價被任意地指定效價值為25。
2.淋巴細(xì)胞增殖分析用異氟烷麻醉小鼠。取出脾，用5ml含10％熱滅活胎牛血清的PBS(PBS-FBS)漂洗兩次，然后置于Medimachine(Dako)的50°Centricon室(Dako A/S，Denmark)，在1.5ml PBS-FBS中以100rpm勻漿10秒，然后經(jīng)100μ孔徑的尼龍篩過濾。用15ml PBS-FBS沖洗脾細(xì)胞一次，然后在200×g離心5分鐘沉淀。將沉淀重懸浮于5ml含0.15MNH4Cl、1M KHCO3、0.1M NaEDTA、pH7.4的緩沖液中室溫保持5分鐘，使紅細(xì)胞溶解。然后同上述沖洗白細(xì)胞。將新鮮分離的脾細(xì)胞(每孔105個細(xì)胞，每個樣品重復(fù)三次)置于96孔U-型底處理培養(yǎng)物微滴定平板(Corning，Cambridge，MA)中，在添加2.05mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素、和10％熱滅活FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中(JRHBiosciences，Lenexa，KS)于37℃培養(yǎng)96小時。再加入5μM到0.18μM劑量范圍內(nèi)4個梯度的各種Aβ肽，Aβ1-16、Aβ1-40、Aβ1-42或Aβ40-1反向序列蛋白質(zhì)。對照孔中的細(xì)胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)(Sigma，cat.#C-5275，濃度為1μg/ml)存在下不添加蛋白質(zhì)培養(yǎng)。向細(xì)胞中加入3H-胸苷(1μCi/孔，從Amersham Corp.，Arlington Heights IL得到)培養(yǎng)最后24小時。然后收獲細(xì)胞置于UniFilter平板，在Top Count微平板發(fā)光計數(shù)儀(Top Count Microplate Scintillation Counter(Packard Instruments，Downers Grove，IL))中計數(shù)。結(jié)果表示為插入不溶性大分子的放射性的每分鐘計數(shù)(cpm)。
4.腦組織制備無痛處死后，取腦，一個大腦半球準(zhǔn)備進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，解剖另一個大腦半球的三個腦區(qū)(海馬、皮層和小腦)，用于利用特異性ELISA(Johnson-Wood等，同上)測定各種Aβ蛋白質(zhì)和APP型的濃度。
將用于ELISA的組織在10體積的冰冷胍緩沖液(5.0M胍-鹽酸，50mM Tris-HCl，pH 8.0)中勻漿。勻漿液利用Adams振動器(Fisher)溫和振搖，室溫下混合三到四小時，然后于-20℃儲藏，留待定量Aβ和APP時使用。前面的試驗已經(jīng)表明，在該儲藏條件下，分析物是穩(wěn)定的，當(dāng)合成的Aβ蛋白(Bachem)混入同窩生小鼠的對照腦組織勻漿中時，可以定量提取(Johnson-Wood等，同上)。
5.Aβ水平的測定用冰冷卻的酪蛋白稀釋液(0.25％酪蛋白、PBS、0.05％疊氮化鈉、20μg/ml抑肽酶、5mM EDTA pH8.0，10μg/ml亮肽素)以1∶10稀釋腦勻漿，然后在4℃，16000×g離心20分鐘。制備合成的Aβ蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(1-42氨基酸)和APP標(biāo)準(zhǔn)品，使終組合物中包括0.5M胍和0.1％牛血清白蛋白(BSA)?！翱偂盇β夾心ELISA利用單克隆抗體266，特異于Aβ的氨基酸13-28(Seubert，等)作為捕捉抗體，生物素?；膯慰寺】贵w3D6，特異于Aβ的氨基酸1-5(Johnson-Wood等)作為報道抗體。3D6單克隆抗體不能識別分泌型APP或全長APP，僅可檢測氨基末端為天冬氨酸的Aβ類型。該分析法靈敏度下限約為50ng/ml(11nM)，不與濃度高達(dá)1ng/ml內(nèi)源性鼠Aβ蛋白質(zhì)表現(xiàn)交叉反應(yīng)性(Johnson-Wood等，同上)。
Aβ1-42特異性夾心ELISA應(yīng)用mAβ21F12，特異于Aβ的氨基酸33-42(Johnson-Wood等)作為捕捉抗體。該分析同樣用生物素?；膍Aβ3D6作為報道抗體，其靈敏度下限約為125μg/ml(28μM，Johnson-Wood等)。當(dāng)進(jìn)行AβELISA時，用100μl mAβ266(10μg/ml)或mAβ21F12(5μg/ml)包被96孔的免疫測試平板(Costar)，室溫下保溫過夜。通過吸氣除去溶液，向各孔中加入200μl 0.25％的人血清蛋白PBS溶液，于室溫將各孔封閉至少1小時。除去封閉液，在4℃下儲藏干燥的平板直到使用。用沖洗緩沖液(Tris-緩沖鹽水(0.15M NaCl，0.01MTris-HCl，pH7.5)加0.05％吐溫20)在使用前使平板再水化。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入每孔100μl的三等份，然后于4℃保溫過夜。分析的每個步驟之間用沖洗緩沖液至少沖洗平板三次。加入生物素酰化的mAβ3D6(用酪蛋白分析緩沖液(0.25％酪蛋白，PBS，0.05％吐溫20，pH7.4)稀釋到0.5μg/ml，室溫下保溫1小時。將親合素-辣根過氧化物酶結(jié)合物((親合素-HRP得自Vector，Burlingame，CA)用酪蛋白分析緩沖液以1∶4000的比例稀釋，)加到孔中，室溫保持1小時。加入比色物質(zhì)，慢TMB-ELISA(Pierce)，使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行15分鐘，之后，加入25μl 2N H2SO4終止反應(yīng)。利用分子裝置Vmax，測定450nm和650nm的吸收度差值，定量反應(yīng)產(chǎn)物。
6.APP水平的測定應(yīng)用了兩種不同APP測定法。其一，特指的APP-α/FL，識別APP-α和APP的全長型(FL)。第二種分析特異于APP-α。APP-α/FL分析法識別包括Aβ的前12個氨基酸的分泌型APP。因為報道抗體(2H3)與α-發(fā)夾-位點(diǎn)(存在于APP695的氨基酸612-613之間，Esch等，科學(xué)，248，1122-1124(1990))不具有特異性；因此該分析也可以識別全長APP(APP-FL)。利用固定于APP-FL細(xì)胞質(zhì)末端的APP抗體消耗腦勻漿的APP-FL的初步試驗表明，約30-40％的APP-α/FL APP是FL(數(shù)據(jù)未顯示)。APP-α/FL和APP-α分析的捕捉抗體均為mAb 8E5，對APP695型的氨基酸444-592升高(Games等，同上)。APP-α/FL分析的報道m(xù)Ab是mAb 2H3，其特異于APP695的氨基酸597-608(Johnson-Wood等，同上)，APP-α分析的報道抗體是mAb 16H9的生物素?；苌铮瑢PP的氨基酸605-611升高。APP-α/FL分析的靈敏度下限約為11ng/ml(150ρM)(Johnson-Wood等)，APP-α特異性分析的靈敏度下限約為22ng/ml(0.3nM)。對于這兩種APP檢測，如前面mAb 266所述，將mAb 8E5包被到96孔EIA平板上。純化的重組分泌型APP-α用作APP-α分析和APP-α/FL分析的參照標(biāo)準(zhǔn)品(Esch等，同上)。5M胍中的腦勻漿樣品用ELISA樣品稀釋液(0.014M磷酸鹽緩沖液，pH7.4，0.6％牛血清白蛋白，0.05％硫柳汞，0.5M NaCl，0.1％NP40)以1∶10的比例稀釋。然后用含0.5M胍的樣品稀釋液以1∶4的比例稀釋它們。然后在室溫下，16000×g離心稀釋的勻漿15秒。將APP標(biāo)準(zhǔn)品和樣品以兩等份加入平板，室溫下保溫1.5小時。將生物素?；膱蟮揽贵w2H3或16H9與樣品一起在室溫下保溫1小時。鏈霉親和素堿性磷酸酶(Boehringer Manneim)，在樣品稀釋液中稀釋1000倍，加入孔中室溫下保溫1小時。加入熒光物質(zhì)4-甲基-umbellipheryl-磷酸酯，室溫下保溫30分鐘，在Cytofluor tm 2350熒光讀數(shù)儀(Millipore)上在激發(fā)光365nm和發(fā)射光450nm下對平板讀數(shù)。
7.免疫組織化學(xué)在4％多聚甲醛的PBS液中于4℃固定腦三天，然后在1％多聚甲醛PBS液中于4℃儲存1到7天，直到被切片。在vibratome上室溫下將其切成40微米厚的冠狀切片，在防凍劑(30％甘油，30％乙二醇，在磷酸緩沖液中)中于-20℃儲存直到進(jìn)行免疫組織化學(xué)處理。對于每個腦，在海馬背水平上的六個切片，連續(xù)間隔240μm使彼此分離，在下列之一的抗體中保溫過夜(1)生物素?；目?Aβ(mAb，3D6，特異于人Aβ)在PBS和1％馬血清中稀釋到濃度為2μg/ml；或(2)特異于人APP，8E5的生物素?；膍Ab，在PBS和1.0％馬血清中稀釋到濃度為3μg/ml；或(3)特異于神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白質(zhì)(GFAP；SigmaChemical Co.)的mAb，用含0.25％Triton X-100和1％馬血清的Tris-緩沖鹽水(pH 7.4)(TBS)以1∶500的比例稀釋；或(4)特異于CD11b(MHC-1抗原)(Chemicon International)的mAb，用0.25％ TritonX-100和1％兔血清的TBS液以1∶100的比例稀釋；或(5)特異于MHC II抗原的mAb(Pharmingen)，用含0.25％Triton X-100和1％兔血清的TBS液以1∶100的比例稀釋；或(6)特異于CD 43的大鼠mAb(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀釋；或(7)特異于CD 45RA的大鼠mAb(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀釋；或(8)特異于CD 45RB的大鼠單克隆Aβ(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀釋；或(9)特異于CD 45的大鼠單克隆Aβ(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀釋；或(10)特異于CD3e的生物素酰化多克隆倉鼠Aβ(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀釋；或(11)特異于CD3的大鼠mAb(Serotec)，用含1％兔血清的PBS液以1∶200的比例稀釋；或(12)含1％正常馬血清的無一級抗體的PBS溶液。
與上面所列的1、2和6-12號抗體溶液反應(yīng)的切片首先用含1.0％Triton X-100，0.4％過氧化氫的PBS液在室溫下預(yù)處理20分鐘，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。接著將它們與一級抗體在4℃下保溫過夜。然后使與3D6或8E5或CD3e mAb反應(yīng)的切片在室溫下與辣根過氧化物酶-親和素-生物素-復(fù)合物與用PBS稀釋75倍的試劑盒成分“A”和“B”(載體精英標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(Vector Elite Standard Kit)，Vector Labs，Burlingame，CA)一起反應(yīng)1小時。與特異于CD 45RA、CD 45RB、CD45、CD3的抗體和無一級抗體的PBS溶液反應(yīng)的切片分別與生物素?；目?大鼠IgG(Vector)(用PBS稀釋75倍)或者生物素?；目?小鼠IgG(Vector)(用PBS稀釋75倍)一起在室溫下保溫1小時。然后將切片與辣根過氧化物酶-親和素-生物素-復(fù)合物與試劑盒成分“A”和“B”(用PBS稀釋75倍)(載體精英標(biāo)準(zhǔn)試劑盒，Vector Labs，Burlingame，CA)在室溫下反應(yīng)一小時。
將切片置于0.01％過氧化氫、0.05％3，3′-對二氨基聯(lián)苯(DAB)中室溫下。用于與GFAP-、MAC-1-、和MHC II-特異性抗體一起保溫的切片首先用0.6％過氧化氫在室溫下預(yù)處理，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，然后與一級抗體在4℃下保溫過夜。與GFAP抗體反應(yīng)的切片與生物素酰化的馬體內(nèi)制備的抗-小鼠IgG(載體實驗室(Vector Laboratories)；Vectastain Elite ABC試劑盒)(用TBS稀釋200倍)在室溫下保溫1小時。接著將切片與親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(載體實驗室；Vectastain Elite ABC試劑盒)(用TBS稀釋1000倍)反應(yīng)1小時。接著將與MAC-1-或MHC II-特異性單克隆抗體作為一級抗體一同保溫的切片與生物素酰化的來自兔的抗-大鼠IgG(用TBS稀釋200倍)在室溫下反應(yīng)1小時，隨后與親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(用TBS稀釋1000倍)保溫1小時。然后將與GFAP-、MAC-1-和MHC II-特異性抗體一同保溫的切片用0.05％DAB、0.01％過氧化氫、0.04％氯化鎳、TBS液分別處理4和11分鐘，使它們顯色。
將免疫標(biāo)記的切片在載玻片(VMR，Superfrost玻片)上制作成標(biāo)本，空氣干燥過夜，在Propar(Anatech)中浸漬，然后用Permount(Fisher)作為標(biāo)本介質(zhì)用蓋玻片覆蓋。
為了復(fù)染色Aβ斑，將一系列GFAP-陽性切片在免疫組織化學(xué)處理后置于Superfrost載玻片上制作成標(biāo)本，在1％硫黃素S(Sigma)水溶液中保持7分鐘。然后使切片脫水，在Propar中使其清晰，然后用Permount制作標(biāo)本加蓋玻片覆蓋。
8.圖像分析通過CCD攝像機(jī)和Sony Trinitron監(jiān)測儀連接于NikonMicrophot-FX顯微鏡的圖像計150型圖像分析系統(tǒng)(Oncor，Inc.，Gaithersburg，MD)被用來定量免疫反應(yīng)切片。切片的圖像儲存于影象緩沖區(qū)中，確定基于顏色和飽和度的閾值以選擇和計算免疫標(biāo)記結(jié)構(gòu)物所占據(jù)的總像素面積。對于每個切片，人工描繪出海馬輪廓，計算海馬占據(jù)的總像素面積。如下測定淀粉樣侵害百分率(含與mAb 3D6發(fā)生免疫反應(yīng)的Aβ沉積物的海馬趾面積的分?jǐn)?shù))×100。同樣，神經(jīng)炎侵害的百分率如下測定(含與單克隆抗體8E5發(fā)生反應(yīng)的營養(yǎng)不良性神經(jīng)突的海馬趾面積的分?jǐn)?shù))×100。運(yùn)行簡單32軟件應(yīng)用程序的C-成像系統(tǒng)(Compix，Inc.，Cranberry Township，PA)通過光電子學(xué)照相機(jī)連接于Nikon Microphot-FX顯微鏡，用于定量GFAP-陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞和MAC-1-和MHC II-陽性小膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)的夾肌后皮層的百分率。免疫反應(yīng)切片的圖像儲存于顯影緩沖區(qū)中，確定單色閾值，以選擇和計算免疫標(biāo)記細(xì)胞占據(jù)的總像素面積。對于每個切片，手工繪制除夾肌后皮層(RSC)的輪廓，然后計算RSC占據(jù)的總像素面積。星形膠質(zhì)細(xì)胞增多百分率如下確定(GFAP-反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)的RSC的分?jǐn)?shù))×100。同樣，小膠質(zhì)細(xì)胞增多百分率如下確定(MAC-1-或MHC II-反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)的RSC的分?jǐn)?shù))×100。對于所有的圖像分析，定量每個動物的海馬背水平上的六個切片(彼此以連續(xù)240μm的間隔分隔)。在所有條件下，動物的治療狀況對于觀察者都是未知的。
雖然為了便于清楚理解，如上述詳細(xì)描述了本發(fā)明，但顯然可以在附加權(quán)利要求范圍內(nèi)進(jìn)行某些改動。本文為各種目的引證的所有出版物和專利文獻(xiàn)以其全文內(nèi)容引入，好象各自單獨(dú)全文列入本文那樣。
顯然本發(fā)明提供了多種用途。例如，本發(fā)明提供了以上說明的任何Aβ抗體在致淀粉樣病的治療、預(yù)防或診斷中的應(yīng)用，以及其使用的醫(yī)學(xué)或診斷組合物的制備。同樣的，本發(fā)明提供了以上說明的任何Aβ表位片段在致淀粉樣病的治療、預(yù)防或診斷中的應(yīng)用，以及其使用的醫(yī)學(xué)制備。

權(quán)利要求
1.一種多肽在制備預(yù)防或治療患者腦中與Aβ淀粉樣沉積物相關(guān)之疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述多肽帶有AβN末端區(qū)域的至少1-5個殘基的節(jié)段，Aβ的第一個殘基作為該多肽的N端殘基，且該多肽不含有Aβ的C末端節(jié)段。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述疾病的特征在于認(rèn)知損傷。
3.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述疾病是阿爾茨海默氏病。
4.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述疾病是唐氏先天愚癥。
5.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述疾病是輕度認(rèn)知損傷。
6.一種多肽在制備預(yù)防或治療患者腦中與Aβ淀粉樣沉積物相關(guān)之疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述多肽含有Aβ的N末端節(jié)段，該節(jié)段始于Aβ的1-3殘基，止于Aβ的7-11殘基處。
7.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述疾病的特征在于認(rèn)知損傷。
8.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述疾病是阿爾茨海默氏病。
9.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述疾病是唐氏先天愚癥。
10.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述疾病是輕度認(rèn)知損傷。
11.權(quán)利要求1-10中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述Aβ的N末端節(jié)段的C端與一種異源多肽連接。
12.權(quán)利要求11的應(yīng)用，其中所述N末端節(jié)段由DAEFRHD這一氨基酸序列組成。
13.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述多肽含有DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL這一氨基酸序列。
14.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述Aβ的N末端節(jié)段的N端與一種異源多肽連接。
15.權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中所述多肽含有AKXVAAWTLKAAADAEFRHD這一氨基酸序列。
16.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述Aβ的N末端節(jié)段在其N端和C端連有第一和第二異源多肽。
17.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述Aβ的N末端節(jié)段在其N端連有一個異源多肽，在其C端連有至少一個N末端節(jié)段的附加拷貝。
18.權(quán)利要求11-15和17中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述異源多肽誘導(dǎo)針對該異源多肽的T細(xì)胞應(yīng)答及抗N端節(jié)段的B細(xì)胞應(yīng)答。
19.權(quán)利要求1-15和18中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述多肽進(jìn)一步含有至少一個N末端節(jié)段的附加拷貝。
20.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述多肽從N末端到C末端含有Aβ的N末端節(jié)段，該N末端節(jié)段的多個附加拷貝及異源的氨基酸節(jié)段。
21.權(quán)利要求1-20中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述N末端節(jié)段由Aβ1-7組成。
22.權(quán)利要求1-11、14和16中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述N末端節(jié)段由Aβ3-7組成。
23.權(quán)利要求1-10中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述多肽由Aβ1-7組成。
24.權(quán)利要求1-10中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述多肽由Aβ3-7組成。
25.權(quán)利要求1-20中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述多肽不含有Aβ43C端的至少5個氨基酸。
26.權(quán)利要求1-24中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述藥物進(jìn)一步包括增強(qiáng)對N末端節(jié)段的免疫應(yīng)答的佐劑。
27.權(quán)利要求1-24中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中在施用所述藥物前施用增強(qiáng)對N末端節(jié)段的免疫應(yīng)答的佐劑。
28.權(quán)利要求1-24中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中在施用所述藥物后施用增強(qiáng)對N末端節(jié)段的免疫應(yīng)答的佐劑。
29.權(quán)利要求25和27-28中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述佐劑是明礬。
30.權(quán)利要求25和27-28中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述佐劑是MPL。
31.權(quán)利要求25和27-28中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述佐劑是QS-21。
32.權(quán)利要求25和27-28中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述佐劑是不完全弗氏佐劑。
33.權(quán)利要求1-25和27-32中的任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述藥物劑量包括大于10微克量的多肽。
34.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1-24中的任一權(quán)利要求所定義的多肽和一種佐劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療與患者腦部Aβ淀粉樣沉積物相關(guān)之疾病的改進(jìn)的治療藥物和方法。該方法包括給患者施用一種誘導(dǎo)對淀粉樣沉積物產(chǎn)生有益免疫應(yīng)答的藥物。該方法在預(yù)防和治療阿耳茨海默氏病中尤其有用。優(yōu)選的治療藥物包括Aβ的N末端片段及與其結(jié)合的抗體。
文檔編號A61K39/00GK1814287SQ20051012694
公開日2006年8月9日 申請日期2000年5月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月28日
發(fā)明者戴爾·B·申克, 弗雷德里克·巴德, 尼克·J·瓦斯克斯, 特德·耶德諾克 申請人:神經(jīng)實驗室有限公司