專利名稱：草珊瑚提取方法、提取物及其藥物組合物與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai中獲取能保護(hù)肝損傷的提取物，這種提取物的制備方法，含有這種提取物的藥物組合物，以及這種提取物和其藥物組合物作為藥物的用途，尤其是制備保護(hù)肝損傷藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
草珊瑚是是金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai的全草，能清熱解毒、祛風(fēng)活血、消腫止痛、抗菌消炎。主治流行性感冒、流行性乙型腦炎、肺炎、闌尾炎、盆腔炎、跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、閉經(jīng)、創(chuàng)口感染、痢疾等。近十多年，乙肝在我國蔓延甚廣，乙肝病毒攜帶率平均為10％，每年約有30萬人死于慢性肝病，占全國死亡人數(shù)的3.65％。目前肝炎仍存在很大的治療問題，因此需要尋找毒性小而有特效的新藥。中藥在抗病毒、改善和恢復(fù)肝功能、調(diào)節(jié)免疫以及抗肝纖維化等方面顯示出極大的療效。從中藥中尋找抗肝炎藥物是新藥開發(fā)研究的重要途徑之一。但目前臨床上用的中藥復(fù)方制劑有效成分不明確、作用機(jī)理不清楚，療效不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響了臨床上的使用以及中藥進(jìn)入國際主流市場(chǎng)，因此從傳統(tǒng)藥物和天然資源中尋我特效抗肝炎藥物是醫(yī)藥科研工作者今后相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的迫切任務(wù)。
在我們的研究中首次發(fā)現(xiàn)草珊瑚提取物具有保護(hù)肝損傷的作用，草珊瑚來源于天然，而且能夠大量栽培，生產(chǎn)成本低，有望開發(fā)成具有競(jìng)爭(zhēng)力的治療肝炎的中藥新藥，故申請(qǐng)草珊瑚提取物的制造方法和保肝作用專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種從草珊瑚中提取的提取物。
本發(fā)明的另一目的在于提供多種制備這種提取物的方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種藥物組合物，包括作為活性成分的本發(fā)明草珊瑚提取物及制藥領(lǐng)域中常用的載體。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種草珊瑚和/或提取物，或含有草珊瑚和/或提取物的組合物在制備保肝藥物中的應(yīng)用。
為了完成本發(fā)明目的，本發(fā)明采取如下的技術(shù)方案草珊瑚原藥材經(jīng)干燥并適當(dāng)?shù)姆鬯?，以利增大與溶劑的接觸面積提高效率。
原藥材的提取溶劑使用水、醇類、或水與醇類的混合物。優(yōu)選的醇類包括甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等，最優(yōu)選的是乙醇，乙醇濃度為體積比50～100％；優(yōu)選的濃度為體積比70～95％。提取時(shí)溶劑量為原藥重量的4～14倍。提取可以在靜態(tài)或動(dòng)態(tài)下，優(yōu)選在動(dòng)態(tài)條件下。為了提高提取的效率，可以使用超聲波等。提取的溫度是從室溫(例如20℃)到溶劑回流溫度的范圍內(nèi)，優(yōu)選在回流的溫度下。提取可連續(xù)或間歇進(jìn)行，間歇提取時(shí)可重復(fù)2～5次。提取時(shí)間是1小時(shí)到4小時(shí)，優(yōu)選為2.5到3小時(shí)。
上步結(jié)束后，合并濾液，濾去藥渣。濾液在動(dòng)態(tài)狀態(tài)下，在常壓或減壓加熱濃縮成膏狀，優(yōu)選減壓濃縮。膏狀物進(jìn)行純化，通過萃取、大孔樹脂柱層析，得到的有效部位。萃取劑為水和常用有機(jī)溶劑(如石油醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等等)；洗脫劑是水、醇類、水與醇類的混合物。
提取液也可以直接用交換柱和膜技術(shù)進(jìn)行精制濃縮后，再成浸膏或干粉?？梢允褂玫慕粨Q柱包括大孔樹脂、聚酰胺、葡聚糖凝膠等；優(yōu)選大孔樹脂、聚酰胺。
提取物可經(jīng)冷凍干燥或真空干燥成干粉，也可把濃縮液體直接噴霧干燥成干粉進(jìn)行各種制劑成型。
本發(fā)明還涉及以本發(fā)明提取物作為活性成份的藥物組合物。該藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。可通過將本發(fā)明提取物與一種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成適于人或動(dòng)物使用的任何劑型。本發(fā)明提取物在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95重量％。
本發(fā)明提取物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w型、w/o型和復(fù)乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。
為了將本發(fā)明提取物制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤(rùn)劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤(rùn)滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。
還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將本發(fā)明提取物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明提取物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆粒或微丸，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發(fā)明提取物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發(fā)明化合物的膠囊劑。
為將本發(fā)明提取物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領(lǐng)域常用的增溶劑、助溶劑、pH調(diào)劑劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β-環(huán)糊精等；pH調(diào)劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。
根據(jù)本發(fā)明的思路，草珊瑚提取物進(jìn)行了與保護(hù)肝損傷有關(guān)的藥理試驗(yàn)。D-GalN，CCl4，ConA是近年來許多國內(nèi)外學(xué)者倡導(dǎo)的肝損傷動(dòng)物模型誘導(dǎo)劑。許多研究均認(rèn)為D-GalN，CCl4，ConA復(fù)制的肝損傷可模擬病毒性肝損傷，其表現(xiàn)出來的癥狀、肝功能檢測(cè)指標(biāo)、肝臟病理改變與病毒性肝炎具有相似性。雖然病因不同，但病理解剖、病理生理諸方面改變與病毒性肝炎接近。在我國衛(wèi)生部頒布的《中藥藥理實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則》中明確指定應(yīng)用D-GalN，CCl4，ConA肝損傷動(dòng)物模型進(jìn)行保肝降酶新藥的藥理實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用D-GalN，CCl4，ConA復(fù)制肝損傷動(dòng)物模型條件要求低、技術(shù)易于掌握，可靠性強(qiáng)、重復(fù)性好，都是其它任何肝損傷動(dòng)物模型無法比擬的。基于以上原因，故目前研究抗肝損傷新藥常采用D-GalN，CCl4，ConA復(fù)制動(dòng)物模型。
我們發(fā)現(xiàn)草珊瑚提取物在四氯化碳(CCl4)，刀豆蛋白A(ConA)，D-GalN(半乳糖胺)誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型中顯示出優(yōu)良的肝保護(hù)作用。
陽性對(duì)照藥物為雙環(huán)醇(bicyclol)，雙環(huán)醇是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研究開發(fā)的新一代抗肝炎藥，對(duì)多種化學(xué)毒物和致癌物引起的肝損傷均有明顯的保護(hù)作用。
草珊瑚提取物對(duì)ConA引起小鼠肝損傷的保護(hù)作用研究中，將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組，ConA模型組，雙環(huán)醇對(duì)照組(200mg/10ml/kg)和給藥組。除正常對(duì)照組和模型組外，各給藥組和雙環(huán)醇組分別于給ConA前24小時(shí)，8小時(shí)和1小時(shí)分別口服給藥一次，對(duì)照組給予同體積賦形劑。除正常對(duì)照組外，各組均靜脈注射ConA，劑量為26mg/kg，體積20ml/kg。禁食過夜。給予ConA 16小時(shí)后將動(dòng)物斷頭處死，取血，測(cè)定血清中丙谷轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，95％乙醇提取物(草珊瑚A)及其經(jīng)萃取的氯仿部分(草珊瑚B)、水提醇沉提取物上大孔樹脂的95％乙醇洗脫部分(草珊瑚C)和70％乙醇提取物上大孔樹脂洗脫的70％乙醇洗脫部分(草珊瑚D)對(duì)肝損傷有明顯的保護(hù)作用。
草珊瑚提取物對(duì)CCl4引起小鼠肝損傷的保護(hù)作用研究中，將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組，CCl4模型組，雙環(huán)醇對(duì)照組和給藥組。給藥組在給予CCl4前24小時(shí)，8小時(shí)和1小時(shí)分別口服受試藥三次，正常對(duì)照組和CCl4模型組給予同體積賦形劑。除正常對(duì)照組外，各組動(dòng)物均于末次給藥后1小時(shí)腹腔注射0.13％CCl4花生油溶液，體積為10ml/kg，禁食過夜。給予CCl416小時(shí)后將動(dòng)物斷頭處死，取血并分離血清，測(cè)定血清中ALT的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水提醇沉提取物(草珊瑚E)對(duì)肝損傷有明顯的保護(hù)作用。
草珊瑚提取物對(duì)D-GalN引起肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究中，用含3％小牛血清，penicillin(100 units/ml)，streptomycin(100μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基配制成1×104/ml細(xì)胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)接種，每孔200ul，置37℃，5％CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后加入受試樣品(5μg/ml或1×10-4M)和雙環(huán)醇，溫孵1小時(shí)后加入40mM D-GalN或25mM APAP，設(shè)空白對(duì)照組，再溫孵24小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(0.5mg/ml)，37℃孵育3.5小時(shí)。棄上清液，每孔加入DMSO 150ul，溶解Fomazan顆粒，輕度振蕩后，在檢測(cè)波長(zhǎng)492nm下測(cè)定OD值。結(jié)果顯示70％乙醇部位保肝活性顯著。
為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發(fā)明提取物藥物組合物的給藥劑量依照所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的個(gè)體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明提取物的每天的合適劑量范圍為0.001-250mg/Kg體重，優(yōu)選為0.1-200mg/Kg體重，更優(yōu)選為1-100mg/Kg體重，最優(yōu)選為20-80mg/Kg體重。上述劑量可以一個(gè)劑量單位或分成幾個(gè)劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。
本發(fā)明的提取物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用。當(dāng)本發(fā)明的提取物與其它治療藥物存在協(xié)同作用時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整它的劑量。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例及藥物活性實(shí)驗(yàn)用來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
提取實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1 95％乙醇提取物草珊瑚1kg，粉碎后，95％乙醇回流3次(3Kg 95％乙醇/次)，每次2小時(shí)，減壓濃縮得到浸膏，提取率8％。此浸膏用水稀釋并用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到了氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分，經(jīng)藥理篩選，95％乙醇提取物(草珊瑚A)，氯仿部分(草珊瑚B)具有保肝作用。
實(shí)施例2 水提取物草珊瑚1kg，粉碎后，水回流3次(3Kg水/次)，每次2小時(shí)，減壓濃縮至小體積，隨后加95％乙醇至溶液中的乙醇濃度達(dá)到70％(草珊瑚E)，過濾，濾液減壓濃縮得到草珊瑚提取物。隨后提取物上大孔樹脂，分別用30％，50％，95％乙醇洗脫，經(jīng)藥理篩選95％乙醇洗脫部分(草珊瑚C)具有抗肝炎作用。
實(shí)施例3 70％乙醇提取物草珊瑚1kg，粉碎后，70％乙醇回流3次(3Kg 70％乙醇/次)，每次2小時(shí)，減壓濃縮得到浸膏，提取率10％。此浸膏用水稀釋，然后上大孔樹脂，分別用30％，70％，95％乙醇洗脫，經(jīng)藥理篩選70％乙醇洗脫部分(草珊瑚D)具有抗肝炎作用。
藥理實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)材料 1、受試藥本發(fā)明的各種提取物。2、陽性對(duì)照藥雙環(huán)醇，有北京協(xié)和藥廠提供，HPLC檢測(cè)純度＞98％。3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠，雄性，體重18～22克，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)SCDK(京)2002-0003。4、D-GalN，ConA美國sigma公司生產(chǎn)，CCl4購自北京化工廠。
實(shí)驗(yàn)例1 草珊瑚提取物對(duì)ConA引起小鼠肝損傷的保護(hù)作用研究將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組，ConA模型組，雙環(huán)醇對(duì)照組(200mg/10ml/kg)和給藥組。除正常對(duì)照組和模型組外，各給藥組和雙環(huán)醇組分別于給ConA前24小時(shí)，8小時(shí)和1小時(shí)分別口服給藥一次，對(duì)照組給予同體積賦形劑。除正常對(duì)照組外，各組均靜脈注射ConA，劑量為26mg/kg，體積20ml/kg。禁食過夜。給予ConA 16小時(shí)后將動(dòng)物斷頭處死，取血，測(cè)定血清中ALT的含量。

與對(duì)照組比較***P＜0.001

與對(duì)照組比較**P＜0.01，***P＜0.001

與對(duì)照組比較**P＜0.01，實(shí)驗(yàn)例2 草珊瑚提取物對(duì)CCl4引起小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究草珊瑚提取物對(duì)CCl4引起小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究中，將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組，CCl4模型組，雙環(huán)醇對(duì)照組和給藥組。給藥組在給予CCl4前24小時(shí)，8小時(shí)和1小時(shí)分別口服受試藥三次，正常對(duì)照組和CCl4模型組給予同體積賦形劑。除正常對(duì)照組外，各組動(dòng)物均于末次給藥后1小時(shí)腹腔注射0.13％CCl4花生油溶液，體積為10ml/kg，禁食過夜。給予CCl416小時(shí)后將動(dòng)物斷頭處死，取血并分離血清，測(cè)定血清中ALT和AST的含量。

與對(duì)照組比較**P＜0.01，***P＜0.001
實(shí)驗(yàn)例3 草珊瑚提取物對(duì)D-GalN引起肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究用含3％小牛血清，penicillin(100units/ml)，streptomycin(100μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基配制成1×104/ml細(xì)胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)接種，每孔200ul，置37℃，5％CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后加入受試樣品(5μg/ml或1×10-4M)和雙環(huán)醇，溫孵1小時(shí)后加入40mM D-GalN，設(shè)空白對(duì)照組，再溫孵24小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(0.5mg/ml)，37℃孵育3.5小時(shí)。棄上清液，每孔加入DMSO 150ul，溶解Fomazan顆粒，輕度振蕩后，在檢測(cè)波長(zhǎng)492nm下測(cè)定OD值。結(jié)果顯示70％乙醇(草珊瑚D)部位保肝活性顯著。

權(quán)利要求
1.草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai在制備保肝藥物中的應(yīng)用。
2.草珊瑚提取物的提取方法，其特征在于，原藥材草珊瑚用溶劑提取，合并提取液，濃縮，再進(jìn)行純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述的溶劑選自水、醇類、或水與醇類的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述的醇是甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇或其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述的提取為在溫度為從20℃到溶劑回流溫度的范圍進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于，純化是通過萃取、大孔樹脂柱層析。
7.權(quán)利要求2-6中任一提取方法制備的草珊瑚提取物。
8.一種藥物組合物，其特征在于，包括藥物有效劑量的，作為活性成分的如權(quán)利要求7的草珊瑚提取物及藥學(xué)上可接受的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括片劑、膠囊、丸劑、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
10.權(quán)利要求7的草珊瑚提取物在制備保肝藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及從草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai中獲取能保護(hù)肝損傷的提取物，這種提取物的制備方法，含有這種提取物的藥物組合物，以及這種提取物和其藥物組合物作為藥物的用途，尤其是制備保護(hù)肝損傷藥物的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K9/20GK101057877SQ20071009785
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者張東明, 李燕, 李媛, 李燁, 李建北, 陳暉 , 楊敬芝 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所