專利名稱：：一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)聚乙二醇化修飾技術(shù)，具體的說(shuō)，涉及一種高活性的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)及其制備方法和醫(yī)療用途。發(fā)明背景重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)成熟蛋白具有175個(gè)氨基酸，分子量為19KDa,可誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的增值和分化，導(dǎo)致血液中的中性粒細(xì)胞數(shù)增加；另外還能刺激成熟中性粒細(xì)胞數(shù)從骨髓中釋出并激活中性粒細(xì)胞的功能。因此自1991年起rhG-CSF已經(jīng)廣泛用于治療癌癥化療導(dǎo)致的骨髓抑制，可以顯著改善化療所引起的中性粒細(xì)胞減少癥的嚴(yán)重性和持續(xù)時(shí)間。但是，作為重組蛋白藥物，rhG-CSF血清半衰期短，只有2-4小時(shí)，每個(gè)化療周期需要每天注射1-2次，持續(xù)注射5-7天(WelteK等，ProcNatAcadSci，82:1526-1530(1985);FramptonJE等，Drugs,48(5):731-60(1994))，這不僅增加了病人的痛苦，也增加了醫(yī)療費(fèi)用。用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾的方法已經(jīng)證明是延長(zhǎng)蛋白藥物體內(nèi)半衰期的一個(gè)有效辦法，蛋白質(zhì)藥物通過(guò)和PEG結(jié)合來(lái)延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物的血藥濃度，同時(shí)還可降低免疫原性，如聚乙二醇單修飾重組人干擾素a2a(PEG-IFNa2a)(BailonP等，BioconjugateChem.，12:195-202(2001))、聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)(HarrisJM，ClinPharmacokinet，40:539-551(2001))。PEG-rhG-CSF描述的是利用活化的20KDPEG-丙醛對(duì)rhG-CSF中N端的a-氨基進(jìn)行修飾(美國(guó)專利US5824784;Kinstler0B等，PharmRes,13:996-1002(1996))。通過(guò)對(duì)其N(xiāo)端進(jìn)行PEG修飾，增大了rhG-CSF蛋白的分子量，顯著提高其在體內(nèi)的半衰期，每個(gè)化療周期只需注射給藥一次。然而，這種修飾方式對(duì)rhG-CSF來(lái)說(shuō)并非最優(yōu)，因?yàn)槌薔端的a-氨基外，rhG-CSF結(jié)構(gòu)中其余的四個(gè)Lys殘基的氨基也可能與活化的PEG結(jié)合，但是N端a-氨基和這四個(gè)Lys殘基都是和G-CSF受體結(jié)合有關(guān)，因此，用現(xiàn)有方法進(jìn)行PEG修飾以后，rhG-CSF的生物學(xué)活性都會(huì)下降，根據(jù)不同修飾位點(diǎn)和修飾數(shù)目，其體外活性可能下降幾倍到幾十倍。而且，所獲得最終產(chǎn)物可能是不同修飾位點(diǎn)的混合物，還可能有多修飾產(chǎn)物，這些對(duì)于PEG-rhG-CSF的后續(xù)純化及臨床應(yīng)用等都是不利的。因此，制備一種活性更高結(jié)構(gòu)更均一的PEG化rhG-CSF產(chǎn)物，具有很重要的臨床和經(jīng)濟(jì)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)，其活性更高且結(jié)構(gòu)更均一。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-nnhG-CSF)的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種包含上述聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)的藥物制劑及其在制備治療因放療、化療等引起的中性粒細(xì)胞減少癥藥物中的應(yīng)用。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)含有形成兩個(gè)二硫鍵的五個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基，其中rhG-CSF成熟蛋白序列的第37和43位Cys形成二硫鍵，第65和75位Cys形成二硫鍵，而rhG-CSF的18位的半胱氨酸(Cys)殘基處于蛋白三維空間結(jié)構(gòu)的疏水區(qū)域中心，因此不易與其他半胱氨酸(Cys)殘基反應(yīng)生成二硫鍵，它是游離的。己有研究發(fā)現(xiàn)，rhG-CSF蛋白與細(xì)胞受體的結(jié)合位點(diǎn)主要位于N-末端，因此在N-末端PEG修飾rhG-CSF將引起rhG-CSF蛋白生物學(xué)活性的降低。本發(fā)明的一個(gè)目的是使重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)游離的半胱氨酸(Cys)與帶有巰基反應(yīng)基團(tuán)的半胱氨酸反應(yīng)性聚乙二醇(PEG)進(jìn)行反應(yīng)，得到結(jié)構(gòu)均一的聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)。rhG-CSF在其N(xiāo)端具有一游離的半胱氨酸(Cys)殘基，由于在N-末端PEG修飾修飾將降低修飾后蛋白的生物學(xué)活性，并且第18位的半胱氨酸(Cys)殘基處于蛋白三維空間結(jié)構(gòu)的疏水區(qū)域中心，因此不易與巰基反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，因此有必要對(duì)rhG-CSF進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明人采用了如下的技術(shù)方案對(duì)rhG-CSF進(jìn)行定點(diǎn)突變，該rhG-CSF突變體(rmhG-CSF)可與帶有巰基反應(yīng)基團(tuán)的半胱氨酸反應(yīng)性聚乙二醇(PEG)進(jìn)行定點(diǎn)反應(yīng)，得到結(jié)構(gòu)均一的聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體，其結(jié)構(gòu)形式為PEG-rmhG-CSF。其中，所述的rmhG-CSF的氨基酸序列與rhG-CSF具有至少95%的同源性，其中的一個(gè)突變位點(diǎn)為將rhG-CSF第18位的游離半胱氨酸(Cys)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)或者蘇氨酸(Thr)，并在遠(yuǎn)離N端的部位引入另一個(gè)半胱氨酸(Cys)(例如在rhG-CSF第76-175位氨基酸引入一個(gè)Cys);所述的PEG為帶有巰基反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇分子，該聚乙二醇分子通過(guò)巰基與rmhG-CSF中的游離半胱氨酸(Cys)結(jié)合。優(yōu)選的，發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將rhG-CSF蛋白N端第18位的半胱氨酸(Cys)突變?yōu)榻z氨酸，同時(shí)將第2(Thr)、4(Uu)、5(Gly)、6(Pro)位氨基酸突變?yōu)锳la、Thr、Tyr和Arg，所得到的突變體G-CSF其體外生物學(xué)活性要比未突變的rhG-CSF蛋白高1.5-4倍，有關(guān)點(diǎn)突變的技術(shù)方案可參考MarkDF等人的文章(MarkDF，etal.Site-specificmutagenesisofthehumanfibroblastinterferongene.ProcNaltAcadSciUSA,1984,81:5662掘6)?？紤]到rhG-CSF中原有的另外兩對(duì)成鍵的Cys(第37和43位Cys成鍵，第65和75位Cys成鍵)，為不影響原有半胱氨酸間二硫鍵的形成，新添加的游離半胱氨酸(Cys)應(yīng)當(dāng)在高活性突變體G-CSF第75位Cys殘基之后，例如可以替換突變體G-CSF中76-175位氨基酸中任一現(xiàn)存的氨基酸為Cys，或者將Cys插入到第76-175氨基酸中兩個(gè)正常相連的氨基酸之間，或者將Cys插入到突變體G-CSF成熟蛋白C-末端之后。考慮到游離Cys的引入有可能影響rmhG-CSF的生物學(xué)活性和PEG修飾反應(yīng)的進(jìn)行，因此，Cys的引入位點(diǎn)還需要進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)HillC.P等人報(bào)道的rhG-CSF的三維結(jié)構(gòu)(HillCP等，PNAS，90:5167-5171(1993))，G-CSF具有4個(gè)a螺旋結(jié)構(gòu)，分別為A(11-39),B(71-91)，C(100-123)和D(143-172)，這4個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)和G-CSF的生物學(xué)活性密切相關(guān)。因此，為不影響蛋白活性，游離Cys的引入位點(diǎn)最好是在上述得到的高活性的G-CSF突變體a螺旋結(jié)構(gòu)外，其中引入的游離Cys優(yōu)選位于突變體G-CSF的C-D環(huán)，即在突變體G-CSF蛋白序列的第123-143位，或插入到突變體G-CSF成熟蛋白c-末端之后。表1rhG-CSF和各種rmhG-CSF修飾前后的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>rmhG-CSF-Gly'36-〉rmhG-CSF-Cys'加rmhG-CSFGly136(位于C-D環(huán))突變?yōu)镃ys1361.1291%1.0183%rmhG-CSF-Pro3->rmhG-CSF-Cys3rmhG-CSFPro3(N端)突變?yōu)镃ys31.0990%0.6755%rmhG-CSF-Ala8-〉rmhG-CSF-Cys8rmhG-CSFAla8(位于螺旋A)突變?yōu)镃ys81.0788%0.6452%rhG-CSF一0.8268%無(wú)修飾68%根據(jù)這一方案，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一系列的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，來(lái)確定合適的Cys引入位點(diǎn)，其結(jié)果列在表l中。從表中我們發(fā)現(xiàn)引入在176位、140和136位的Cys都沒(méi)有影響原來(lái)高活性的rmhG-CSF的活性，其突變體蛋白序列分別和附圖1中的SeqIDNo.2、SeqIDNo.4和SeqIDNo.6描述的序列一致。而在N-端附近引入Cys卻使rmhG-CSF的活性降低，PEG修飾后的rmhG-CSF的活性明顯下降，這也驗(yàn)證了先前的討論。rmhG-CSF可以通過(guò)原核生物或真核生物宿主基因重組技術(shù)表達(dá)外源性DNA序列而得到，合適的原核生物宿主包括各種細(xì)菌(如^c^i.);合適的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)。依據(jù)所用的宿主的不同，rmhG-CSF表達(dá)產(chǎn)物可能會(huì)被哺乳動(dòng)物或其它真核細(xì)胞中的碳水化合物所糖基化修飾。對(duì)于本發(fā)明所用的人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)突變體，優(yōu)選的采用原核表達(dá)系統(tǒng)或酵母表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物，例如E.coli或甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)。這些改構(gòu)的rmhG-CSF，由于蛋白序列中只存在一個(gè)游離的Cys，因此，帶有巰基反應(yīng)基團(tuán)的半胱氨酸反應(yīng)性聚乙二醇(PEG)如聚乙二醇馬來(lái)酞亞胺基(mPEG-Maleimide，mPEG-Mal)和聚乙二醇正吡啶二硫化物(mPEG-Ortho-pyridyldisulfide，mPEG-0PSS)等聚乙二醇巰基反應(yīng)試劑可以和rmhG-CSF的Cys基團(tuán)特異性的結(jié)合，獲得聚乙二醇定點(diǎn)單修飾的產(chǎn)物。這些活性聚乙二醇可以是分子量大于5kDa的任意大小的PEG，其形狀可以是單鏈或者分支狀，其中優(yōu)選分子量在5kDa到40kDa之間的分枝或線性PEGs，更優(yōu)選分子量為20kDa的聚乙二醇馬來(lái)酞亞胺基(mPEG-Ma1，。。)。如前所述，由于G-CSF突變體rmhG-CSF-Cys的蛋白序列中只存在一個(gè)游離的Cys，因此，帶有巰基反應(yīng)基團(tuán)的PEG只能和rmhG-CSF的Cys基團(tuán)特異性的結(jié)合，獲得聚乙二醇定點(diǎn)單修飾的產(chǎn)物，這克服了
背景技術(shù)：
中PEG修飾N端的a-氨基所帶來(lái)的反應(yīng)位點(diǎn)不一和多修飾產(chǎn)生等缺陷，簡(jiǎn)化了后續(xù)純化過(guò)程，提高了蛋白收率。此外，半胱氨酸反應(yīng)性PEGs和游離Cys的結(jié)合是在rmhG-CSF活性區(qū)以外的位置，如表l的C末端和C-D環(huán)上，因此修飾后的蛋白活性基本未受影響。由于突變體G-CSF的活性要比未突變的G-CSF的活性高1.5-4倍，加上PEG修飾后對(duì)蛋白活性的影響，總體而言，PEG修飾G-CSF蛋白游離Cys后的產(chǎn)物要比PEG修飾G-CSF蛋白游離氨基后的產(chǎn)物的活性要高1.5-4倍，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)到了14.2小時(shí)，比未修飾的G-CSF(T1/2=2.1小時(shí))提高了7倍，達(dá)到了長(zhǎng)效、減少給藥次數(shù)的目的。本發(fā)明還提供了一種半胱氨酸反應(yīng)性PEGs修飾rmhG-CSF的方法，其包括如下步驟(1)在中性或堿性的含水介質(zhì)中，帶有巰基反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇分子與人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)中的游離Cys反應(yīng)；(2)任選地從反應(yīng)混合物中分離聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)的產(chǎn)物。較合適的修飾反應(yīng)條件是rmhG-CSF濃度至少為1毫克/毫升，蛋白質(zhì):PEG分子的比例在1:1-1:20之間，pH條件為中性到堿性，優(yōu)選為pH7-9.5。經(jīng)修飾反應(yīng)后獲得的為含有PEG-rmhG-CSF的混合物，其中含有PEG-rmhG-CSF、未反應(yīng)的活性PEG分子和rmhG-CSF等。需要通過(guò)合適的分離純化方法，例如通過(guò)離子交換層析和分子篩層析的組合來(lái)純化上述混合物體系，最終獲得的制品含有至少90%以上的PEG-rmhG-CSF和至多10%的未發(fā)生聚乙二醇化的rmhG-CSF，優(yōu)選制品含有至少95%以上的PEG-rmhG-CSF和至多5%的未發(fā)生聚乙二醇化的rmhG-CSF。本發(fā)明所制備的PEG-rmhG-CSF，與以前的方法相比，生物學(xué)活性更高而且修飾性專一，純化工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，從而達(dá)到降低劑量和工藝復(fù)雜性，最終達(dá)到提高療效和降低生產(chǎn)成本的目的。本發(fā)明還提供了一種含有聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)的藥物組合物，該藥物組合物含有上述的有效量的生物制品和藥用稀釋劑、佐劑或載體等。該藥物組合物可用于治療因放療、化療等引起的中性粒細(xì)胞減少癥，由于半衰期延長(zhǎng)，因此可實(shí)現(xiàn)每周只給藥1次。優(yōu)選制劑為注射水針，每毫升含6mgmPEG-Mal細(xì)。-rmhG-CSF-Cys176，0.35mg乙酸鈉，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20和0.02mg的氯化鈉，pH為4.0。以下實(shí)例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。附圖1為各種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的DNA核苷酸序列和氨基酸序列附圖2為純化過(guò)程中的SDS-PAGE電泳圖附圖3為SourceS分離純化PEG-rmhG-CSF-Cys176的層析圖附圖4為小鼠皮下給藥后rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys176的血藥濃度-時(shí)間曲線附圖5為小鼠皮下給藥后rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF-Cys"6和空白對(duì)照組的白細(xì)胞總數(shù)變化情況具體實(shí)施方式實(shí)施例l由原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組rmhG"CSF《ys"6的制備rmhG-CSF-Cys176是把rhG-CSF第2，4，5，6，18位氨基酸分別突變?yōu)锳la、Thr、Tyr、Arg和Ser，并且在C-末端額外引入了一個(gè)半胱氨酸(Cys)，其核苷酸序列和氨基酸序列分別如附圖1中的SeqIDNo.l和SeqIDNo.2所述。rhG-CSF基因的克隆方法可參考中國(guó)專利CN96106418.8，以此為模板，為了得到預(yù)期的突變體G-CSF基因，設(shè)計(jì)引物如下上游引物5'-ACTAGCCATATGGCACCAACATACCGTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCTGCTCAAGTCCTTAGAGCAAGTGAGG-3，；下游引物5'-AAAGGATCCTTAACAGGGCTGGGCAAGG-3,;用常規(guī)PCR方法進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化，裝到pGEM-T載體(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，做藍(lán)白斑篩選，將陽(yáng)性克隆送測(cè)序檢測(cè)。將測(cè)序正確的克隆基因用ndel和BamHI(GibcoBRL公司)從pGEM-T上切割回收，然后裝到經(jīng)同樣酶切處理的pET32a(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，T4DNA連接酶(GibcoBRL公司)，12.5"連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落，用柱式質(zhì)粒小提試劑盒小提質(zhì)粒(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，然后用ndel和BamHI酶切鑒定。構(gòu)建成功的菌株參考文獻(xiàn)(WelteK等，ProcNatAcadSci，82:1526-1530(1985)進(jìn)行表達(dá)和純化，其蛋白復(fù)性條件為rmhG-CSF-Cys'76的包含體溶解于200ml增溶液中(8M尿素、1Oramol/LDTT、25mmol/L半胱氨酸，20mmol/LTris-HC1，pH8.0)，室溫?cái)嚢?0分鐘后用復(fù)性緩沖液(15%甘油，40umol/L硫酸銅，40mraol/L磷酸鈉緩沖液，pH8.0)稀釋到1000ml，4°C攪拌復(fù)性48小時(shí)。然后用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH到4.0，經(jīng)ResourceS離子交換柱層析，以0-0.5mol/LNaCl(含20mmol/LNaAc，pH4.0)梯度洗脫，目標(biāo)峰在0.3mol/LNaCl時(shí)被洗脫，經(jīng)檢測(cè)，所得的目標(biāo)縫收集液中rmhG-CSF-Cys"e蛋白純度大于95%。實(shí)施例2由原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組rmhG~CSF~CyS"Q的制備rmhG-CSF-Cys，是把rhG-CSF第2，4，5，6，18位氨基酸分別突變?yōu)锳la、Thr、Tyr、Arg和Ser,并且在140位突變了一個(gè)半胱氨酸(Cys)，其核苷酸序列和氨基酸序列分別如附圖1中的SeqIDNo.3和SeqIDNo.4所述。rhG-CSF基因的克隆方法可參考中國(guó)專利CN96106418.8,以此為模板，為了得到預(yù)期的突變體G-CSF基因，設(shè)計(jì)引物如下上游弓I物5'-ACTAGCCATATGGCACCAACATACCGTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCTGCTCAAGTCCTTAGAGCAAGTGAGG-3，；下游引物引物l:5'AAGGATCCGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAACGCGGTACGACACCTCCAGGAAGC3，；引物2:5'TCCAGGAAGCTCTGCAGATGGGAGGCAACCAGGACCCCTCCGCACCGGCGC3，；先用下游引物2和上游引物對(duì)rhG-CSF基因進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，再用下游引物1和上游引物，以第一次擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化，裝到pGEM-T載體(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，做藍(lán)白斑篩選，將陽(yáng)性克隆送測(cè)序檢測(cè)。將測(cè)序正確的克隆基因用Ndel和BamHI(GibcoBRL公司)從pGEM-T上切割回收，然后裝到經(jīng)同樣酶切處理的pET32a(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，T4DNA連接酶(GibcoBRL公司)，12.5。C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落，用柱式質(zhì)粒小提試劑盒小提質(zhì)粒(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，然后用Ndel和BamHI酶切鑒定。構(gòu)建成功的菌株參考文獻(xiàn)(WelteK等，ProcNatAcadSci,82:1526-1530(1985)進(jìn)行表達(dá)和純化，其蛋白復(fù)性條件為rmhG-CSF-Cys14"的包含體溶解于200ml增溶液中(8M尿素、10腿ol/LDTT、25咖ol/L半胱氨酸，20mmol/LTris-HC1，pH8.0)，室溫?cái)嚢?0分鐘后用復(fù)性緩沖液(15%甘油，40umol/L硫酸銅，40腿ol/L磷酸鈉緩沖液，pH8.0)稀釋到1000ml，4°C攪拌復(fù)性48小時(shí)。然后用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH到4.0，經(jīng)ResourceS離子交換柱層析，以0-0.5raol/LNaCl(含20,1/LNaAc，pH4.0)梯度洗脫，目標(biāo)峰在0.3mol/LNaCl時(shí)被洗脫，經(jīng)檢測(cè)，蛋白純度為95%以上。實(shí)施例3PEG-rmhG-CSF""Cys"6的制備rmhG-CSF-Cys176的修飾反應(yīng)和分離準(zhǔn)備50mllmg/ml的rmhG-CSF-Cys，含100mMBicine(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)(pH8.5)，然后加入5倍摩爾比的PEG-MA"),(Nektar)。在室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物用水稀釋到蛋白濃度為0.1mg/ml，稀鹽酸調(diào)pH至4.0，過(guò)離子交換柱ResourceS，在0-0.5MNaCl,20mMNaAc(pH4.0)中以階段梯度洗脫，其中單修飾的PEG-rmhG-CSF-Cys176在20%梯度洗脫下，目標(biāo)峰再經(jīng)S印hadexG25脫鹽層析。由于PEG-MAL只能特異性地與rmhG-CSF-Cys176末端的Cys反應(yīng)，因此修飾后不同于常規(guī)的PEG修飾存在多修飾情況，被修飾的rmhG-CSF-Cys176與PEG均是1:1結(jié)合，但是也存在部分未被修飾的rmhG-CSF-Cys176。由于PEG修飾后，蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)發(fā)生顯著改變，因此利用離子交換層析可以有效地把修飾蛋白，PEG-MAL2Q。。。，rmhG-CSF-Cys"e進(jìn)行有效地分離。分離產(chǎn)物的電泳圖如附圖2所示，其中1、6道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，分子量從下到上分別為14.4、21、31、43、67和96kDa;2道為純化的rmhG-CSF-Cys176;3道為PEG修飾反應(yīng)混合物；4道為ResourceS洗脫峰1，亦即PEG-rmhG-CSF-Cys176，分子量約為40kDa，與預(yù)期相符；5道為ResourceS洗脫峰2，為未參與反應(yīng)的rmhG-CSF-Cys176。經(jīng)薄層掃描分析，2，4，5道的蛋白純度均在95%以上。圖3所示為ResourceS離子交換層析分離修飾PEG-rmhG-CSF-Cys176的層析圖譜。由于PEG修飾后rmhG-CSF176等電點(diǎn)下降，因此PEG-rmhG-CSF-Cysi76先被洗脫，最后洗脫的為rmhG-CSF-Cys'76。通過(guò)離子交換層析，PEG-rmhG-CSF-Cys176可以獲得有效的分離。而且，由于PEG-MAL與rmhG-CSF-Cys"s只有一個(gè)Cys反應(yīng)位點(diǎn)，避免了一般PEG修飾中很難分離的多個(gè)單修飾異構(gòu)體的存在，因此分離純化工藝也得以簡(jiǎn)化。實(shí)施例4PEG-rmhG""CSF""Cys"6等生物學(xué)活性的分析體外生物活性的測(cè)定采用MTT方法((WelteK等，ProcNatAcadSci，82:1526-1530(1985))。具體步驟為在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種一定濃度的細(xì)胞懸液(50uL/孔)，將rhG-CSF標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)和修飾rhG-CSF樣品系列稀釋，各50uL加入培養(yǎng)板相應(yīng)孔中。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照(不含rhG-CSF)和空白對(duì)照(只含培養(yǎng)液)，37°C，5%C02培養(yǎng)36-48h,加MTT溶解液100uL/孔，次日測(cè)定各孔A,/A63。值。最終獲得產(chǎn)物的比活見(jiàn)表2，測(cè)定顯示rmhG-CSF-Cys'76的生物學(xué)活性為1.23x108IU/mg，rhG-CSF為0.82x108IU/mg，rmhG-CSF-Cys176的活性比rhG-CSF高50X，說(shuō)明我們獲得了高活性的rmhG-CSF。而且PEG修飾前后的mhG-CSF-Cy,的生物學(xué)活性分別為1.23x108IU/mg和1.25^108111/呢，可見(jiàn)經(jīng)PEG修飾后對(duì)蛋白活性沒(méi)有影響，而N端PEG修飾的陽(yáng)性對(duì)照PEG-rhG-CSF(Neulasta，A呢en公司)生物活性為0.58xl07mg，表明C末端定點(diǎn)修飾較N端優(yōu)越，它不影響生物活性。綜合以上實(shí)例，表明我們制備的PEG-rmhG-CSF-Cys"6是活性更高和結(jié)構(gòu)更均一的制品。表2.各種G-CSF體外生物學(xué)活性比較SpecificRelativebioactivitybioactivity(%)(X108IU/mg)(%)rhG-CSF0.82100PEG-rhG-CSF0.5870.7rmhG-CSF-Cys1761.23150PEG-rmhG-CSF-Cys'761.25152實(shí)施例5PEG-rmhG""CSF"Cys176體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)的分析藥代動(dòng)力學(xué)的測(cè)定采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)樣品中rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys^的血藥濃度。每組三只來(lái)自中科院上海動(dòng)物試驗(yàn)中心的1822g雄性SPF級(jí)ICR小鼠，參照表3進(jìn)行注射和采集血樣后，再將血樣離心30min后分離血清，-2(TC保存待測(cè)。用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)樣品中rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys176的血藥濃度，具體操作參見(jiàn)HumanG-CSFDuoSet試劑盒(R&DSystems)的操作手冊(cè)。得到標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)用MicroCalOrigin軟件中的四參數(shù)邏輯曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求回歸方程及相關(guān)統(tǒng)計(jì)參數(shù)；用MicrosoftExcel2003軟件將樣品數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算相關(guān)數(shù)值并作圖；最后用3P87軟件進(jìn)行曲線擬合并計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。表3皮下給藥和取樣方法<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*SOsubcutaneous;Dl=firstday結(jié)果rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys176小鼠皮下給藥(subcutaneous,SC)后的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4，PEG-rmhG-CSF-Cys176與rhG-CSF在小鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線比較見(jiàn)圖4。從表4中可看到rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys176血清中藥物的半衰期(T1/2)分別為2.lh和14.2h,后者是前者的7倍；PEG-rmhG-CSF-Cys176的AUC值為143280ng'h.mr'，是rhG-CSF的16倍；從圖4的血藥濃度-時(shí)間曲線圖可直觀看出，達(dá)峰時(shí)間PEG-rmhG-CSF-Cys176明顯大于rhG-CSF，并且在70h后在血液中可以檢測(cè)到PEG-rmhG-CSF-Cys"e的血藥濃度，血藥濃度的波動(dòng)顯著減少。從上述藥代參數(shù)對(duì)比來(lái)看，PEG修飾技術(shù)確實(shí)可以延長(zhǎng)rhG-CSF的半衰期，從而達(dá)到長(zhǎng)效的目的。表4小鼠皮下給藥后rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF-Cys'76的藥代參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>藥效動(dòng)力學(xué)的分析自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)入1923glCR小鼠245只(125只雄性，120只為雌性)，除正常對(duì)照組注射等量的生理鹽水外，其余小鼠注射環(huán)磷酰胺lmg/10g體重，連續(xù)3天，隨機(jī)取正常和造模小鼠5只，經(jīng)測(cè)試造模成功。將造模成功小鼠隨機(jī)分成3組，分組和給藥見(jiàn)下表5，給藥劑型為水針，每毫升含6mg的mPEG-Mal測(cè)廠rmhG-CSF-Cys'76，0.35mg乙酸鈉，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20，和0.02mg的氯化鈉，pH為4.0。采集各組給藥后D2、D4、D6、D8天各5只小鼠血樣進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和評(píng)價(jià)。表5分組和給藥<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>結(jié)果如下表6、圖5分別為小鼠皮下給藥后rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF-Cys176和對(duì)照的白細(xì)胞總數(shù)表和圖。從中可看出PEG-rmhG-CSF-Cys176對(duì)環(huán)磷酰胺引起的小鼠白細(xì)胞減少癥有升白作用，其5天一次注射的效果與每天注射的rhG-CSF效果相當(dāng)。表6小鼠皮下給藥后rhG-CSF、PEG-mihG-CSF-Cys"6和對(duì)照的的白細(xì)胞總數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>序列表<110〉杭州九源基因工程有限公司<120>—種聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體及其制備方法〈160>6<170>Patentlnversion3.3〈210〉1<211>528〈212〉DNA<213>智人(Homosapiens)<400〉1atggcaccaacataccgtgccagctccctgccccagagcttcctgctcaagtccttagag60caagtgaggaagatccagggcgatggcgcagcgctccaggagaagctgtgtgccacctac120aagctgtgccaccccgaggagctggtgctgctcggacactctctgggcatcccctgggct180cccctgagcagctgccccagccaggccctgcagctggcaggctgcttgagccaactccat240agcggccttttcctctaccaggggctcctgcaggccctggaagggatctcccccgagttg300ggtcccaccttggacacactgcagctggacgtcgccgactUgccaccaccatctggcag360c卿tggaagaactgggaatggcccctgccctgcagcccacccagggtgccatgccggcc420ttcgcctctgctttccagcgccgggcaggaggggtcctggttgcctcccatctgcagagc480ttcctggaggtgtcgtaccgcgttctacgccaccttgcccagccctgc528<210>2<211>176<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>2MetAlaProThrTyrArgAlaSerSerLeuProGinSerPheLeuLeul51015LysSerLeuGluGinValAryLyslieGinGlyAspGlyAlaAlaLeu202530GinGluLysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeu354045ValLeuLeuGlyHisSerLeuGlylieProTrpAlaProLeuSerSer505560CysProSerGinAlaLeuGinLeuAlaGlyCysLeuSerGinLeuHis65707580SerGlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeuLeuGinAlaLeuGluGlylie859095SerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGinLeuAspvalAla100105110AspPheAlaThrThrlieTrpGinGinMetGluGluLeuGlyMetAla115120125ProAlaLeuGinProThrGinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAla130135140PheGinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSer145150155160PheLeuGluvalSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGinProCys165170175<210>3<211>525〈212>DNA〈213>智人(Homosapiens)<400>3atggcaccaacataccgtgccagctccctgccccagagcttcctgctcaagtccttagag60caagtgaggaagatccagggcgatggcgcagcgctccaggagaagctgtgtgccacctac120aagctgtgccaccccg鄉(xiāng)agctggtgctgctcggacactctctgggcatcccctgggct副cccctgagcagctgccccagccaggccctgcagctggcaggctgcttgagccaactccat240agcggccttttcctctaccaggggctcctgcaggccctggaagggatctcccccgagttg300ggtcccaccttggacacactgcagctggacgtcgccgactttgccaccacca.tctggcag360cagatggaagaactgggaatggcccctgccctgcagcccacccagggtgccatgccgtgc420ttcgcctctgctttccagcgccgggcaggaggggtcctggttgcctcccatctgcagagc480ttcctggaggtgtcgtaccgcgttctacgccaccttgcccagccc525〈210>4〈211>175<212>PRT〈213>智人(Homosapiens)〈400>4MetAlaProThrTyrArgAlaSerSerLeuProGinSerPheLeuLeu151015LysSerLeuGluGinValAryLyslieGinGlyAspGlyAlaAlaLeu202530GinGluLysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeu354045ValLeuLeuGlyHisSerLeuGlylieProTrpAlaProLeuSerSer505560CysProSerGinAlaLeuGinLeuAlaGlyCysLeuSerGinLeuHis65707580SerGlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeuLeuGinAlaLeuGluGlylie859095SerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGinLeuAspvalAla100105110AspPheAlaThrThrlieTrpGinGinMetGluGluLeuGlyMetAla115120125ProAlaLeuGinProThrGinGlyAlaMetProCysPheAlaSerAla130135140PheGinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSer145150155160PheLeuGluvalSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGinPro165170175<210〉5〈211>525<212>DNA<213>智人(Homosapiens)〈400〉5atggcaccaacataccgtgccagctccctgccccagagcttcctgctcaagtccttagag60caagtgaggaagatccagggcgatggcgcagcgctccagg卿agctgtgtgccacctac120aagctgtgccaccccgaggagctggtgctgctcggacactctctgggcatcccctgggct180cccctgagcagctgccccagccaggccctgcagctggcaggctgcttgagccaactccat240agcggccttttcctctaccaggggctcctgcaggccctggaagggat,ctcccccgagttg300ggtcccaccttggacacactgcagctggacgtcgccgactttgccaccaccatctggcag360cagatggaagaactgggaatggcccctgccctgcagcccacccagtgcgccatgccggcc420ttcgcctctgctttccagcgccgggcaggaggggtcctggttgcctcccatctgcagagc480ttcctggaggtgtcgtaccgcgttctacgccaccttgcccagccc525<210>6<211>175〈212〉PRT〈213〉智人(Homosapiens)<400>6MetAlaProThrTyrArgAla15LysSerLeuGluGinValAry20GinGluLysLeuCysAlaThr35SerSerLeuProGinSerPheLeuLeu1015LyslieGinGlyAspGlyAlaAlaLeu2530TyrLysLeuCysHisProGluGluLeu4045<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>權(quán)利要求1.一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)，結(jié)構(gòu)形式為PEG-rmhG-CSF，其特征在于所述的rmhG-CSF的氨基酸序列與rhG-CSF具有至少95％的同源性，其中的一個(gè)突變位點(diǎn)為將rhG-CSF第18位的游離半胱氨酸(Cys)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)或者蘇氨酸(Thr)，并在rhG-CSF遠(yuǎn)離N端的部位引入另一個(gè)半胱氨酸(Cys)；所述PEG為帶有巰基反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇分子，該聚乙二醇分子通過(guò)巰基與rmhG-CSF中的游離半胱氨酸(Cys)結(jié)合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)，其特征在于所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)為將rhG-CSF蛋白的第2(丁hr)、4(Leu)、5(Gly)，6(Pro)和18(Cys)位氨基酸突變?yōu)锳la、Thr、Tyr、Arg和Ser;并將rhG-CSF中第76-175位氨基酸中任一現(xiàn)存的氨基酸突變?yōu)镃ys，或在第76-175氨基酸中兩個(gè)正常相連的氨基酸之間插入一個(gè)Cys，或?qū)ys插入到rhG-CSF蛋白C-末端之后。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落剌激因子突變體(rmhG-CSF)，其特征在于所引入的游離Cys位于rmhG-CSF蛋白序列第123-143位或插到rmhG-CSF蛋白C-末端之后。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)，其特征在于所述的重組人粒細(xì)胞集落剌激因子突變體(rmhG-CSF)的氨基酸序列和SeqIDNo.2、SeqIDNo.4或SeqIDNo.6所示序列一致。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)，其特征在于所述的聚乙二醇分子為聚乙二醇馬來(lái)酞亞胺基(mPEG-Maleimide，mPEG-Mai)或聚乙二醇正吡啶二硫化物(mPEG-Ortho-pyridyldisulfide,mPEG-OPSS)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)，其特征在于所述的聚乙二醇分子分子量在5kDa到40kDa之間。7.—種含有如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)的生物制品，其特征在于所述制品含有至少90%以上的PEG-rmhG-CSF和至多10%的未發(fā)生聚乙二醇化的rmhG-CSF。8.權(quán)利要求7所述的生物制品在制備治療因放療、化療等引起的中性粒細(xì)胞減少癥藥物中的應(yīng)用。9.一種藥用組合物，其含有有效量的權(quán)利要求7所述的生物制品，和藥用稀釋劑、佐劑或載體。10.—種制備如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落剌激因子突變體(rmhG-CSF)的方法，其包括如下步驟(1)在中性或堿性的含水介質(zhì)中，帶有巰基反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇分子與重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)中的游離Cys反應(yīng)；(2)任選地從反應(yīng)混合物中分離聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)的產(chǎn)物。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種高活性的聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)及其制備方法和醫(yī)療用途。將重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)游離的半胱氨酸(Cys)經(jīng)聚乙二醇巰基反應(yīng)試劑定點(diǎn)化學(xué)修飾，獲得活性更高結(jié)構(gòu)更均一的PEG-rmhG-CSF產(chǎn)物。該產(chǎn)物可以用來(lái)治療因放療、化療等引起的中性粒細(xì)胞減少癥。文檔編號(hào)A61K47/48GK101245109SQ200710067309公開(kāi)日2008年8月20日申請(qǐng)日期2007年2月12日優(yōu)先權(quán)日2007年2月12日發(fā)明者劉曉妮,單劍峰,徐飛虎,王昌梅,榮金,黃巖山申請(qǐng)人:杭州九源基因工程有限公司