專(zhuān)利名稱(chēng)：：Lefty蛋白在抑制器官纖維化病變中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域。涉及將Lefty蛋白用于抑制多種器官及組織的纖維化病變，該蛋白一方面通過(guò)抑制纖維化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子[TGF]-P、Nodal等)而下調(diào)組織膠原蛋白的產(chǎn)生，另一方面則通過(guò)上調(diào)多種蛋白水解酶的活性而促進(jìn)纖維化組織的分解。同時(shí)涉及該蛋白的制備方法，以及該蛋白作為制備治療或預(yù)防在肝、腎、肺、心肌、皮膚等器官和組織纖維化病變的機(jī)制研究和臨床藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：各種原因誘發(fā)的重要臟器的慢性纖維化，常伴有器官功能的進(jìn)行性下降，最終導(dǎo)致器官衰竭甚至患者的死亡，目前纖維化疾病還是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要難題之一。近年來(lái)，各種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用已越來(lái)越受到人們的關(guān)注，報(bào)道較多的有TGF-卩/Smad通路[見(jiàn)參考文獻(xiàn)MauvielA.Transforminggrowthfactorbeta:akeymediatoroffibrosis.MethodsMolMed,2005,11(7):69-80.]、？38絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路[見(jiàn)參考文獻(xiàn)StambeC,AtkinsRC,TeschGH，etal.Theroleofp38alphamitogen-activatedproteinkinaseactivationinrenalfibrosis.JAmSocNephrol.2004,15(2):370-379.]、Rho-ROCK通路[見(jiàn)參考文獻(xiàn)NagatoyaK,MoriyamaT,KawadaN,etal.Y-27632preventstubulointerstitialfibrosisinmousekidneywithunilateralureteralobstruction.KidneyInt,2002，61(5):1684-1695.]、PI-3K通路[見(jiàn)參考文獻(xiàn)DerynckR,ZbangYE.Smad-dependentandSmad陽(yáng)independentpathwaysinTGF-betafamilysignaling.Nature,2003,425(6958):577-584.]等等。目前，針對(duì)各信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)或?qū)ふ页龅母深A(yù)靶點(diǎn)已有數(shù)十種之多，而針對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的藥物或制劑更是數(shù)不勝數(shù)。總的說(shuō)來(lái)，這些治療方法(方案)均有其各自的不足，要么僅減少膠原基質(zhì)的生成，要么僅增加膠原基質(zhì)的降解，幾乎沒(méi)有在整體上同時(shí)從這兩個(gè)方面"雙管齊下"的治療手段。然而，盡管以上信號(hào)通路各自的作用效果及其相關(guān)關(guān)系尚未完全明了，但TGF-(3已被大多數(shù)學(xué)者公認(rèn)為是纖維化形成與發(fā)展的啟動(dòng)樞紐，是最為關(guān)鍵性細(xì)胞因子[見(jiàn)參考文獻(xiàn)MauvielA.Transforminggrowthfactorbeta:akeymediatoroffibrosis.MethodsMolMed,2005,11(7):69-80.]，可以說(shuō)，針對(duì)該信號(hào)通路找到有效的干預(yù)手段，將有助于延緩或逆轉(zhuǎn)組織、臟器的纖維化進(jìn)程，這一點(diǎn)依然是我們?cè)谘芯抗ぷ髦袘?yīng)當(dāng)重點(diǎn)考慮的。1996年，Meno等[見(jiàn)參考文獻(xiàn)MenoC,SaijohY,FujiiH,etal.Left-rightasymmetricexpressionoftheTGFbeta-familymemberleftyinmouseembryos.Nature,1996，381(6578):151-155.]首次在小鼠的胚胎中發(fā)現(xiàn)了一種呈左右不對(duì)稱(chēng)性表達(dá)的蛋白。因檢測(cè)出該蛋白僅(短暫)出現(xiàn)于小鼠原腸胚(gastrulatingmouseembryos)的左半部分組織，遂將其命名為L(zhǎng)efty蛋白，并推測(cè)這種蛋白與胚胎發(fā)育的左-右不對(duì)稱(chēng)性(left-rightasymmetry)有關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)被刊登于當(dāng)年的《Nature》雜志上。1999年，Thisse等[見(jiàn)參考文獻(xiàn)ThisseC,ThisseB.Antivin,anovelanddivergentmemberoftheTGF-betasuperfamily，negativelyregulatesmesoderminduction.Development,1999,126(2):229-240.]在研究TGF-p誘導(dǎo)斑馬魚(yú)(Ze6m力A)胚胎中胚層發(fā)生的機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)了Lefty對(duì)TGF-p信號(hào)通路具有抑制作用，從而開(kāi)創(chuàng)了利用Lefty蛋白的作用來(lái)治療纖維化疾病的新領(lǐng)域。其后，國(guó)外的幾家實(shí)驗(yàn)室對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行了更加深入的研究，所獲得成果令人振奮！Ulloa等[見(jiàn)參考文獻(xiàn)UlloaL，TabibzadehS.LeftyinhibitsR-SmadphosphorylationinducedbyactivatedTGF隱betareceptor.JBiolChem.2001,276(14):21397-21404.]的研究結(jié)果提示，經(jīng)過(guò)Lefty的干預(yù)，TGF-p受體對(duì)Smad2(受體激活型Smad,R-Smad)的磷酸化作用受到抑制；R-Smad與Smad4(通用型Smad,Co-Smad)的結(jié)合以及結(jié)合后所形成之共聚物的核轉(zhuǎn)移亦受到了抑制；同時(shí)發(fā)現(xiàn)TGF-p所誘導(dǎo)的p21、cdc25、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)以及由Smad結(jié)合元件(Smad-bindingdement,SBE)所調(diào)控的一組報(bào)告基因的表達(dá)水平顯著降低；另外Smad5的磷酸化和基因轉(zhuǎn)錄(受骨形成蛋白[bonemorphogeneticprotein,BMP]的介導(dǎo))也受到了抑制。因此，該小組得出結(jié)論:Lefty能夠影響TGF-p和BMP相關(guān)基因的表達(dá)，能夠通過(guò)抑制R-Smad的磷酸化而參與TGF-p和BMP信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)，而這些作用均不依賴(lài)于任何抑制性蛋白的合成，包括抑制型Smad(I-Smad)。Mason等[見(jiàn)參考文獻(xiàn)MasonJM,XuHP,RaoSK,etal.LeftycontributestotheremodelingofextracellularmatrixbyinhibitionofconnectivetissuegrowthfactorandcollagenmRNAexpressionandincreasedproteolyticactivityinafibrosarcomamodel.JBiolChem,2002，277(1):407-415.]將轉(zhuǎn)染了leftyA基因的小鼠纖維瘤(GP+E86)細(xì)胞接種至裸鼠皮下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染leftyA后的GP+E86細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生膠原的能力顯著降低甚至消失；胞內(nèi)CTGF和其下游的I型膠原(CollagentypeI，Col-I)的mRNA表達(dá)分別降低了4.7倍和2.8倍；蛋白水解酶活性分析提示細(xì)胞內(nèi)溶膠原、溶明膠、促組織離解等酶的活性均明顯增加；組織學(xué)圖片顯示實(shí)驗(yàn)組ECM的面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組。該結(jié)果提示Lefty蛋白能夠通過(guò)抑制CTGF、Col-I等蛋白的基因轉(zhuǎn)錄和誘導(dǎo)數(shù)種蛋白水解酶的活化，從表現(xiàn)出減少膠原蛋白沉積的作用，暗示了其在抗纖維化疾病中的誘人前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種Lefty蛋白(Locus:NM003240)作為制備拮抗TGF-卩、Nodal、BMP、p化MAPK信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用。該蛋白能夠明顯抑制TGF-P、Nodal、BMP、p38MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵因子如CTGF、goosecoid、BMPR-I和p38MAPK等的表達(dá)，從而發(fā)揮其減少纖維化膠原基質(zhì)產(chǎn)生的作用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種Lefty蛋白作為制備治療或預(yù)防在肝、腎、肺、心肌、皮膚等器官和組織纖維化病變的藥物中的應(yīng)用。該蛋白能夠有效上調(diào)肝、腎、肺、心肌、皮膚纖維瘤組織中幾種蛋白水解酶的活性，包括明膠酶、酪蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等，從而發(fā)揮其增加膠原基質(zhì)降解的作用。兩方面作用相結(jié)合，最終起到抑制以上各器官和組織纖維化病變的作用。本發(fā)明技術(shù)方案如下l.Lefty蛋白的制備方法A.lefty基因的轉(zhuǎn)染lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒[見(jiàn)參考文獻(xiàn)TabibzadehS.RoleofEBAF/Leftyinimplantationanduterinebleeding.ErnstScheringResFoundWorkshop,2005,(52):159-189.]-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染GP+E86細(xì)胞(購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC),令其強(qiáng)制表達(dá)所需Lefty蛋白。B.Lefty蛋白的親和與純化將兔源性抗LeftyA抗體(A353或A44)[見(jiàn)參考文獻(xiàn)UlloaL,CreemersJW,RoyS,etal.LeftyproteinsexhibituniqueprocessingandactivatetheMAPKpathway.JBiolChem,2001,276(24):21387-21396.]加入到氰基活化的Sepharose犯以制備AS53或A44親和柱。將lefty轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基[DMEM+0.015mg/mlhypoxanthine+0.25mg/mlxanthine+0.025mg/mlmycophenolicacid+90%calfserum5(10%)]加入到A353/A44-Seph讓e4B懸液，室溫(20-25°C)孵育1小時(shí)后將結(jié)合了Lefty蛋白的Sepharose4B倒入親和柱，反復(fù)清洗3次。洗脫的蛋白經(jīng)PBS透析于4'C下保存。鑒定所得純化Lefty蛋白的量。2.Lefty蛋白在體外作為制備抑制纖維化病變相關(guān)信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用A.Lefty蛋白作為制備拮抗TGF-卩信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用將fe/0/基因轉(zhuǎn)染至P19細(xì)胞(購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)。向條件培養(yǎng)基[90%的最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基a+核糖核苷+脫氧核糖核苷+7.5%小牛血清+2.5%胎牛血清]中分別加入不同濃度的TGF-(31,37°C,5y。C02溫箱孵育，再分別于不同時(shí)間用PBS反復(fù)洗滌5次后收獲細(xì)胞。裂解后用Westernblotting法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)產(chǎn)物中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、a-SMA的表達(dá)。B.Lefty蛋白作為制備拮抗Nodal信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用將/e/zy基因轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞(Fibroblast,FB)。分別于不同時(shí)間用PBS反復(fù)洗滌3次收獲細(xì)胞。裂解后提取總RNA,分別檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中Nodal相關(guān)基因cyclops、squint、goosecoid、no-tail和pitx2等的表達(dá)情況。C.Lefty蛋白作為制備抑制BMP信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用將/e/zy基因轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞(購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)。向條件培養(yǎng)基[DMEM+4mML-谷氨酰胺+1.5g/LNa2C03+4.5g/L葡萄糖+90%胎牛血清(10%)]中分別加入不同濃度的TGF-pl,再分別于不同時(shí)間用PBS反復(fù)洗滌3次后收獲細(xì)胞。用Westernblotting法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)Lefty對(duì)磷酸化Smad5和BMPR-II、BMPR-I、Smad6、GDF-8、BMP2、BMP7表達(dá)的影響，以及應(yīng)用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)各指標(biāo)mRNA的表達(dá)情況。D.Lefty蛋白作為制備拮抗p38MAPK信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用將/e/(y基因轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞。反復(fù)洗滌5次收獲細(xì)胞。超聲粉碎后留取上清，測(cè)定樣品的總蛋白濃度。取含總蛋白200g的相應(yīng)體積的上清液，用免疫沉淀結(jié)合特異性底物磷酸化法測(cè)定其中p38MAPK的活性。3.Lefty蛋白在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防纖維化病變的藥物中的應(yīng)用A.Lefty蛋白在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防肝纖維化病變的藥物中的應(yīng)用用改良硫代乙酸胺(TAA)法建立大鼠肝纖維化模型[見(jiàn)參考文獻(xiàn)張杰，陳積圣，王坤，等.硫代乙酰胺誘導(dǎo)肝硬化模型方法的改進(jìn).中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1999，16:567-568.]。麻醉后先取小塊肝組織標(biāo)本。再將脂質(zhì)體-lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒復(fù)合物注入肝臟并標(biāo)記注射部位用。3周后，取注射部位和非注射部位的肝組織標(biāo)本，行HE染色，釆用免疫組化、Western-blotting和RT-PCR法分別檢測(cè)肝組織中Lefty蛋白、a-SMA、基質(zhì)金屬蛋白酶、明膠酶、i型膠原、n型膠原、m型膠原、iv型膠原的蛋白表達(dá)和mRNA的表達(dá)。B.Lefty蛋白在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防腎纖維化病變的藥物中的應(yīng)用建立大鼠UUO-腎纖維化模型[見(jiàn)參考文獻(xiàn)JeremiahM,KeithH,GuoGJ,etal.Bonemorphogeneticprotein-7improvesrenalfibrosisandacceleratesthereturnofrenalfunction.JAmSocN印hrol,2002,13:S14-S21.]。2周后經(jīng)鼠尾靜脈注射脂質(zhì)體-lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒復(fù)合物，分別于術(shù)后不同時(shí)間處死動(dòng)物并摘取患腎，用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)纖維化腎臟組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(co皿ectivetissuegrowthfactor,CTGF)、I型膠原、n型膠原、III型膠原、IV型膠原基因的表達(dá)水平；應(yīng)用磷酸化Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、cx-SMA抗體，經(jīng)Westernblotting法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)產(chǎn)物中嫌酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、oc-SMA的表達(dá)；用比色測(cè)定法檢測(cè)蛋白水解酶的活性；用酪蛋白和明膠酶譜法檢測(cè)相應(yīng)的兩種蛋白酶的活性。C.Lefty蛋白在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防肺纖維化病變的藥物中的應(yīng)用先通過(guò)氣管內(nèi)滴人lefty-A/pcDNAl質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒向小鼠肺組織給藥。然后以全胸腔射線照射，以建立肺纖維化模型。建模完成后取新鮮肺組織，測(cè)I型膠原、III型膠原、CTGF和TGF-p的表達(dá)。在光學(xué)顯微鏡下觀察并評(píng)價(jià)肺泡炎及肺纖維化的程度。D.Lefty蛋白在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防心肌纖維化病變的藥物中的應(yīng)用建立大鼠高血壓-心肌纖維化模型。同時(shí)經(jīng)腹腔注射脂質(zhì)體-lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒復(fù)合物。所有動(dòng)物8周后處死并摘取心臟。用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)纖維化腎臟組織中CTGF、I型膠原、II型膠原、III型膠原、IV型膠原基因的表達(dá)水平；應(yīng)用磷酸化Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、a-SMA抗體，經(jīng)Westernblotting法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)產(chǎn)物中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、a-SMA的表達(dá)；用比色測(cè)定法檢測(cè)蛋白水解酶的活性；用明膠酶譜法檢測(cè)明膠酶的活性。E.Lefty蛋白在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防皮膚纖維瘤的藥物中的應(yīng)用取孵育之經(jīng)/e/z);J基因轉(zhuǎn)染的GP+E86細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液，注射于無(wú)胸腺裸鼠背部皮下。分別于術(shù)后不同時(shí)間處死動(dòng)物摘取腫瘤，用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)胂瘤組織中CTGF、I型膠原、II型膠原、III型膠原、IV型膠原基因的表達(dá)水平；用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)以上各指標(biāo)的蛋白表達(dá)情況；用比色測(cè)定法檢測(cè)蛋白水解酶的活性；用酪蛋白和明膠酶譜法檢測(cè)相應(yīng)的兩種蛋白酶的活性。上述制備的蛋白的生物學(xué)特性、作用和功能本發(fā)明提供了一種能抑制器官纖維化病變的蛋白及其制備方法和應(yīng)用。Lefty是一種分泌性蛋白，其前原蛋白(pro-proprotein)相對(duì)分子量為42kDa,經(jīng)過(guò)蛋白水解酶在Arg77和Arg135兩個(gè)位點(diǎn)酶切后，分別形成34kDa和28kDa兩種成熟多肽，進(jìn)而被分泌出細(xì)胞執(zhí)行各自的生理學(xué)功能。作為T(mén)GF-(3超家族成員之一，Lefty具有該家族典型的蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即含有7個(gè)保守的半胱氨酸殘基以形成特殊的半胱氨酸結(jié)(cysteineknot)結(jié)構(gòu)域(圖1)。但Lefty蛋白又有著自己獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，也是與TGF-卩等的不同之處(1)TGF-P等蛋白的羧基端常常為CXtCXi序列，而Lefty則含有更長(zhǎng)的CX^Xn序列；(2)TGF-卩等的前原蛋白常常在唯一的一個(gè)RXXR位點(diǎn)被酶切，進(jìn)而釋放出含110-140個(gè)氨基酸(aminoacid,aa)的成熟蛋白，而Lefty的前原蛋白卻含有RGKR(74-77)和RQKR(132-135)兩個(gè)酶切位點(diǎn)；(3)Lefty蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中缺少形成分子間二硫鍵的半胱氨酸殘基(見(jiàn)圖1),而該殘基是TGF-p等形成二聚體所必須的結(jié)構(gòu)，因此，Lefty是TGF-P超家族中為數(shù)不多的幾個(gè)不以二聚體結(jié)構(gòu)存在的成員之一[見(jiàn)參考文獻(xiàn)TabibzadehS，HemmatiBA.Leftyatthecrossroadsof"sternness"anddifferentiativeevents.StemCells,2006,24(9):1998-2006.]。不管是在人體還是小鼠體內(nèi)，編碼Lefty的基因均位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂的lq42.1區(qū)域。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，該蛋白在體外能夠抑制TGF-p/Smad信號(hào)通路、Nodal信號(hào)通路，能夠抑制c少c/o戸、w"/w"goo^co/丄"o-to7和/to:2的基因表達(dá)，能夠抑制Smad2、Smad3和Smad5的磷酸化，能夠抑制BMPR-II、BMPR-I、Smad6、GDF-8、BMP2、BMP7、oc-SMA、CTGF、I型膠原、II型膠原、III型膠原、IV型膠原基因和蛋白的表達(dá)(表1、表2)，能夠增強(qiáng)p38MAPK的活性；在體內(nèi)增強(qiáng)酪蛋白酶、明膠酶、MMP等水解酶的活性(表3),能夠明顯抑制肝、腎、肺、心肌和皮膚纖維瘤纖維化組織中細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，縮小組織切片中細(xì)胞間質(zhì)的寬度和面積，改善組織的微觀結(jié)構(gòu)(圖2、圖3),對(duì)器官功能具有保護(hù)作用(圖4、圖5)。發(fā)明優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明提供了一種能抑制器官纖維化病變的蛋白及其制備方法和應(yīng)用。其優(yōu)點(diǎn)包括抑制纖維化疾病相關(guān)信號(hào)通路(如TGF-p/Smad、Nodal信號(hào)通路)(表1、2)和活化具有抑制纖維化的相關(guān)蛋白水解酶類(lèi)(如MMP、明膠酶等)(表3)兩大方面。是極具潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的生物制劑，還可為進(jìn)一步探討纖維化疾病的發(fā)生機(jī)制提供幫助。表l各檢測(cè)基因條帶的相對(duì)吸光度(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>Exp--0.77±0.210.74±0.040.91±0.160.88±0.030.95±0.17Col-IVCon--2.55±0.132.25±0.172.06±0.142.31±0.192.16±0.17Exp--0.59±0.060.67±0.130.45±0.090.65±0.050.49土0.17CTGFCon--0.94±0.032.02±0.121.15±0.311.72±0.161.23±0.21表2WesternBlotting檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組各蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組的比值蛋白4僉測(cè)細(xì)胞/器官P19293T肝腎肺心肌皮膚纖維瘤pSmad2*0.66-0.53-0.49-pSmad3*0.53-一0.39—0.42-pSmad5*0.430.61-0.67-0.57-Smad40.84--0.73一0.59-a-SMA0.62-0.340.53-0.44-Smad6-0.43—----BMPR-I-0.31-----BMPR-II-0.37-—-—-GDF-8-0.72—-一--BMP2-0.66---一-BMP7-1.21-----CTGF----0.46-0.57LeftyA--3.11—-一一Col隱I-一0.31-0.37-0.49Col陽(yáng)II--0.53---0.54Col-III--0.44-0.64-0.43Col-IV_—0.28國(guó)—_0.21"p"表示磷酸化蛋白。表3部分蛋白水解酶的活性比較，實(shí)驗(yàn)組吸光度值與對(duì)照組的吸光度值(AExp/Ac。n)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>圖1Lefty蛋白的II級(jí)結(jié)構(gòu)圖(與TGF-(32比較)圖中灰色圓點(diǎn)表示兩者共有的氨基酸序列，白色圓圈表示序列中的保守性置換，虛線線條表示分子內(nèi)二硫鍵，箭頭指示的是構(gòu)成分子間二硫鍵的半胱氨酸殘基。圖2腎組織掃描電鏡照片(800x)經(jīng)鼠尾靜脈給予脂質(zhì)體-lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒后14天，UUO建模大鼠術(shù)側(cè)腎組織中可見(jiàn)腎小管結(jié)構(gòu)較為清晰，小管擴(kuò)張明顯，上皮變矮，小管間隙較窄，少量基質(zhì)纖維填充其間。圖3腎組織掃描電鏡照片(600x)經(jīng)鼠尾靜脈給予脂質(zhì)體-空載質(zhì)粒(對(duì)照)后14天，UUO建模大鼠術(shù)側(cè)腎組織中可見(jiàn)腎小管已明顯失去正常結(jié)構(gòu)，部分小管擴(kuò)張明顯，部分則塌陷而發(fā)生纖維化改變，小管間隙增寬明顯，填充以大量的細(xì)胞外基質(zhì)，表現(xiàn)為大面積的纖維化改變。圖4UUO大鼠模型術(shù)側(cè)腎臟彩色多普勒超聲顯像+血流頻譜圖經(jīng)鼠尾靜脈給予脂質(zhì)體-lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒后14天，腎臟血流阻力指數(shù)RI為0.48,提示腎臟供血尚可，由此推測(cè)腎功能未受到較大損害。圖5UUO大鼠模型術(shù)側(cè)腎臟彩色多普勒超聲顯像+血流頻譜圖經(jīng)鼠尾靜脈給予脂質(zhì)體-空載質(zhì)粒(對(duì)照)后14天，腎臟血流阻力指數(shù)RI為0.72,提示腎臟供血受到影響，推測(cè)腎功能不良。圖6肺纖維化小鼠模型術(shù)側(cè)肺葉中I型膠原mRNA的表達(dá)情況(RT-PCR)圖中N為正常對(duì)照，El和Cl分別代表建模2周時(shí)經(jīng)氣管給予脂質(zhì)體-lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn))組和給予脂質(zhì)體-空載質(zhì)粒(對(duì)照)組的情況，E2和C2分別代表建模4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的情況，M為GAPDH內(nèi)參?？梢?jiàn)在同一時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組肺組織I型膠原mRNA的表達(dá)均低于對(duì)照組，說(shuō)明Lefty具有保護(hù)和延緩肺纖維化病變的作用。具體實(shí)施方式l.Lefty蛋白的制備方法A./e/yA基因的轉(zhuǎn)染選用GP+E86細(xì)胞(購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)用含有10%胎牛血清和100U/ml青霉素、100ng/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，至于含5%<:02的37。C孵箱中培養(yǎng)，采用胰蛋白酶(Irwitrogen,Inc.)消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染釆用脂質(zhì)體Lipofectamin2000(Invitrogen,Inc.)轉(zhuǎn)染試劑。在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，接種于35mm直徑的培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)平皿的30%-60%,即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先取4嗎lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒用150ul無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋、混勻、室溫放置。取6plLipofectamin2000脂質(zhì)體，用150|il無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋、混勻、室溫孵育5分鐘。將稀釋好的脂質(zhì)體逐滴加入質(zhì)粒稀釋液中，輕輕搖句，室溫放置20分鐘。取出待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，換2ml無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基，再加入脂質(zhì)體-lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒復(fù)合物，輕搖令其均勻分布于平皿內(nèi)。細(xì)胞置于5%C02的37。C孵箱中孵育12小時(shí)后，將含有脂質(zhì)體的無(wú)雙抗培養(yǎng)基吸出，換含10%胎牛血清和1OOU/ml青霉素、100嗎/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2天。B.LeftyA蛋白的親和與純化將兔源性抗LeftyA抗體(A353或A44)加入到氰基活化的Sepharose4B以制備A353或A44親和柱。取/e/^y轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基[DMEM+0.015mg/mlhypoxanthine+0.25mg/mlxanthine+0.025mg/mlmycophenolicacid+90%calfserum(10%)]lOml,加入250jalA353/A44-Sepharose4B懸液，室溫下輕搖孵育1小時(shí)。然后將結(jié)合了Lefty蛋白的Sepharose4B倒入一0.7><15cm的柱子。用20倍于其容積的Tris-HCl(50mM,pH7.5)、NaCl(0.2M)和EDTA(5mM)混合液清洗。分別用0.5倍其容積的[2.5M的NaCl+10mM的Tris-HCl(pH8.1)+5mM的EDTA]混合液和0.25倍其容積的[50mM的Tris-HCl(pH7.5)+5mM的EDTA]混合液將結(jié)合的Lefty蛋白洗脫。洗脫的蛋白在4°C下經(jīng)10mM的PBS透析，于4°C下保存。培養(yǎng)基首先用于A353親和柱，洗脫后的蛋白再經(jīng)過(guò)A44親和柱，然后再洗脫。洗脫物用A353抗體經(jīng)Westernblotting法鑒定其親和純化的蛋白。由A353抗體制備的親和柱能夠結(jié)合所有的Lefty蛋白(包括42,34和28kDa三種成分)。A44親和柱僅結(jié)合42kDa的蛋白成分，而是其他兩種成分隨液流被帶走。大規(guī)模純化操作所得純化之蛋白(分別為L(zhǎng)efty蛋白42,34和28kDa三種成分)的量由Bio-Rad蛋白檢測(cè)試劑盒鑒定。2.Lefty蛋白在體外作為制備抑制纖維化病變相關(guān)信號(hào)通路藥物中的應(yīng)用A.Lefty蛋白作為制備拮抗TGF-p信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用將fe/^基因轉(zhuǎn)染至P19細(xì)胞(購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)。3天后傳代，待細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后，向條件培養(yǎng)基[90。/。的最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基cc+核糖核苷+脫氧核糖核苷+7.5%小牛血清+2.5%胎牛血清]中分別加入含有Ong/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml五種濃度TGF-(31的DMEM培養(yǎng)基，37°C,5%0)2溫箱孵育，再分別于1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)取出平皿，用PBS反復(fù)洗滌5次后收獲細(xì)胞。釆用超聲破碎法裂解細(xì)胞后，于4'C下1000rpm離心3分鐘，分別收集上清和沉淀。應(yīng)用磷酸化Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、a-SMA抗體，經(jīng)Westernblotting法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)產(chǎn)物中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、a-SMA的表達(dá)。B.Lefty蛋白作為制備拮抗Nodal信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用將/e/0;基因轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞中。2天后傳代，待細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后，分別于l小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)取出平皿，用PBS(137mMNaCl、22.7mMKC1、10mMNa2HP04、2mMKH2P04)反復(fù)洗滌3次收獲細(xì)胞。釆用超聲破碎法裂解細(xì)胞后，于4。C下1000rpm離心3分鐘，棄上清。用Promega的總RNA提取試劑盒(Invitrogen,Inc.)從上述制備好的細(xì)胞中提取總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(RealtimePCR)技術(shù)，分別檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中A^/a/相關(guān)基因c_yc/o/w、w/\gooyeco/丄朋-to7和/w'ftc2等的表達(dá)情況。C.Lefty蛋白作為制備拮抗BMP信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用將/e/(y基因轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞(購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)。3天后傳代，待細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后，向條件培養(yǎng)基中分別加入含有0ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml五種濃度TGF-卩1的DMEM培養(yǎng)基[DMEM+4mML-谷氨酰胺+1.5g/LNa2C03+4.5g/L葡萄糖+90%胎牛血清(10%)],37°C,5%<:02溫箱孵育，再分別于l小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)取出平皿，用PBS反復(fù)洗滌5次后收獲細(xì)胞。采用超聲破碎法裂解細(xì)胞后，于4。C下1000rpm離心3分鐘，分別收集上清和沉淀。應(yīng)用磷酸化Smad5和BMPR-II、BMPR-1、Smad6、GDF-8、BMP2、BMP7抗體，經(jīng)Westernblotting法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)Lefty對(duì)以上各指標(biāo)表達(dá)的影響，以及應(yīng)用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)各指標(biāo)mRNA的表達(dá)情況。D.Lefty蛋白作為制備拮抗p38MAPK信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用將/e/0;基因轉(zhuǎn)染至FB細(xì)胞中，經(jīng)3次傳代后細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，用PBS(137mMNaCl、22.7mMKCl、10mMNa2HP04、2mMKH2P04)反復(fù)洗滌3次收獲細(xì)胞。超聲粉碎8次，每次10s,7000r/min離心10min,留取上清，即為p38MAPK粗提液。測(cè)定樣品的總蛋白濃度。取含總蛋白200g的相應(yīng)體積的上述上清，加20|al抗磷酸化p38MAPK單克隆抗體，4'C輕搖過(guò)夜；7000r/min離心30s,棄上清，用1x細(xì)胞裂解液500^清洗2次；再用1x激酶緩沖液500血清洗2次。加1x激酶緩沖液48pl、200pmol/LATP1^和2piATF-2融合蛋白3(TC孵育30min，加3xSDS加樣緩沖液25pi終止反應(yīng)，100'C水浴5min,離心2min,取樣品20nl和溴酚藍(lán)混句后進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳(100-150V)，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜，力口1xTBS25mL洗硝纖膜室溫孵育5min,加阻斷液(5%BSA)10H1L室溫孵育60min，加磷酸化ATF-2單克隆抗體10pi至10ml抗體稀釋緩沖液中與硝酸纖維膜共同孵育(4'C)輕搖過(guò)夜，用TBST10ml洗膜3次，每次5min,力口HRP-抗兔二抗(1:2000)和HRP-抗生物素二抗(1:IOOO)至10ml阻斷緩沖液與硝酸纖維膜室溫下共同孵育60min,用TBST10pl洗膜3次，每次5min。加luminol熒光顯色液，暗房?jī)?nèi)X光片曝光顯影。上述實(shí)驗(yàn)所獲得X光片置于UVP凝膠成像系統(tǒng)(美囯)進(jìn)行圖像輸入分析(LabworkSystem軟件)，以吸光值(A)的大小為其活性的強(qiáng)弱(見(jiàn)表3)。3.Lefty蛋白在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防纖維化病變的藥物中的應(yīng)用A.Lefty蛋白在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防肝纖維化病變的藥物中的應(yīng)用取成年雄性SD大鼠(購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，釆用改良硫代乙酸胺(TAA)法建立大鼠肝纖維化模型[見(jiàn)參考文獻(xiàn)張杰，陳積圣，王坤，等.硫代乙酰胺誘導(dǎo)肝硬化模型方法的改進(jìn).中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1999，16:567-568.]。在90mg/kg氯胺酮+9mg/kg曱苯噻嗪麻醉后開(kāi)腹顯露肝臟，先取小塊肝組織標(biāo)本。按100ug質(zhì)粒DNA/動(dòng)物，使用500pl的微量注射器和4號(hào)針頭將脂質(zhì)體-lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒復(fù)合物或生理鹽水(作對(duì)照)分別多點(diǎn)緩慢地注入肝臟各葉的邊緣，間距5mm，進(jìn)針深度5mm。注射部位用絲線縫合標(biāo)記。大鼠清醒后繼續(xù)以0.01%濃度的TAA供水。3周后，同上麻醉下，下腔靜脈采血，加入肝素抗凝；取注射部位(標(biāo)記處)和非注射部位的肝組織標(biāo)本，于10%的中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋。對(duì)組織標(biāo)本行HE染色，采用免疫組化、Western-blotting和RT-PCR法分別檢測(cè)肝組織中Lefty蛋白、cc-SMA、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、明膠酶、I型膠原、II型膠原、in型膠原、IV型膠原的蛋白表達(dá)和mRNA的表達(dá)B.Lefty蛋白在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防腎纖維化病變的藥物中的應(yīng)用取成年雄性SD大鼠(購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，采用輸尿管完全結(jié)扎法建立大鼠UUO-腎纖維化模型[見(jiàn)參考文獻(xiàn)JeremiahM,Ke池H,GuoGJ,etal.Bonemorphogeneticprotein-7improvesrenalfibrosisandacceleratesthereturnofrenalfunction.JAmSocNephrol,2002,13:S14-S21.]。于建模術(shù)后2周在90mg/kg氯胺酮+9mg/kg甲苯噻嗪麻醉后，從鼠尾靜脈注射脂質(zhì)體-lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒復(fù)合物或生理鹽水(作對(duì)照)，所有動(dòng)物均于注射后分別于術(shù)后2天、14天和21天過(guò)量麻醉處死。手術(shù)摘取左惻腎臟，HE染色和掃描電鏡觀察組織微觀結(jié)構(gòu)(結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5);用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)纖維化腎臟組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF、I、II、III、IV型膠原基因的表達(dá)水平；應(yīng)用磷酸化Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、a-SMA抗體，經(jīng)Westernblotting法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)產(chǎn)物中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、a-SMA的表達(dá)；用比色測(cè)定法檢測(cè)蛋白水解酶的活性；用酪蛋白和明膠酶譜法檢測(cè)相應(yīng)的兩種蛋白酶的活性(結(jié)果見(jiàn)表3)。C.Lefty蛋白在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防肺纖維化病變的藥物中的應(yīng)用取成年雄性BALB/c小鼠(購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，以3.8。/。水合氯醛(10ml/kg)腹腔麻醉后，直立固定于鼠板，9號(hào)注射彎針頭氣管內(nèi)滴人lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒或空質(zhì)粒。給藥24h后，固定小鼠并以射線照射，源皮距(SSD)80cm,吸收劑量率137.96cGy/min,每只小鼠單次全胸腔照射，頭部及腹部以下用5個(gè)半價(jià)層鉛塊屏蔽。此后動(dòng)物每日照射2次，每次8Gy,兩次照射間隔8h，分別在放射后0、1、2、4、8及12周，頸推脫臼法處死小鼠，取出全肺，右肺中葉用10%甲醛溶液固定，余肺組織液氮冷凍，-80匸保存組織備用。取各肺葉組織70mg,加人PBS液700W句漿，13000r/min離心15min后取上清液，ELISA法檢測(cè)I型膠原、III型膠原、CTGF和TGF-p的表達(dá)。甲醛溶液固定的小鼠肺組織經(jīng)HE染色，按Szapiel方法[見(jiàn)參考文獻(xiàn)SzapielSV,ElsenNA,FulmerJD,etal.Bleomycininducedinterstitialpulmonarydiseasesinthenude,athvmicmouse.AmRevRespirDis,1979,120:893-899],在光學(xué)顯微鏡下觀察并評(píng)價(jià)肺泡炎及肺纖維化的程度。D.Lefty蛋白在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防心肌纖維化病變的藥物中的應(yīng)用取成年雄性SD大鼠(購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，釆用Guan等[見(jiàn)參考文獻(xiàn)GuanS,FoxJ,MitchellKD,etal.Angiotensinandangiotensinconvertingenzymetissuelevelsintwokidneysonecliphypertensiverat.Hypertension.1992，20(6》763-767.]介紹的方法建立大鼠高血壓-心肌纖維化模型。其中實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在給藥的同時(shí)，經(jīng)腹腔注射脂質(zhì)體-lefty-A/pcDNAl質(zhì)粒復(fù)合物(100ng質(zhì)粒DNA/動(dòng)物)或生理鹽水(作對(duì)照)。所有動(dòng)物均于給藥8周后過(guò)量麻醉處死，手術(shù)摘取心臟。用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)纖維化腎臟組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)、I型膠原、II型膠原、III型膠原、IV型膠原基因的表達(dá)水平；應(yīng)用磷酸化Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、oc-SMA抗體，經(jīng)Westernblotting法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)產(chǎn)物中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad5和Smad4、cc-SMA的表達(dá)；用比色測(cè)定法檢測(cè)蛋白水解酶的活性；用明膠酶譜法檢測(cè)溶明膠酶的活性。E.Lefty蛋白在體內(nèi)在體內(nèi)作為制備治療或預(yù)防皮膚纖維瘤的藥物中的應(yīng)用取前述方法孵育之經(jīng)/e/(M基因轉(zhuǎn)染的GP+E86細(xì)胞，待其進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，加入含有0.05%胰蛋白酶和0.2%EDTA的消化液。室溫(20~25。C)孵育5-10分鐘后，將細(xì)胞及培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液。室溫下3000rpm離心5分鐘，棄上清液，所得細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸。反復(fù)兩次后，將細(xì)胞濃度調(diào)至5x107/ml作為注射用細(xì)胞懸液。取該懸液100pl注射于無(wú)胸腺裸鼠(購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，90mg/kg氯胺酮+9mg/kg甲苯謹(jǐn)嗪麻醉)背部皮下，重復(fù)4-6次分別選取不同的部位注射。分別于術(shù)后2天、14天和21天過(guò)量麻醉處死動(dòng)物，手術(shù)摘取腫瘤，觀察相關(guān)纖維化指標(biāo)用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中CTGF、I型膠原、II型膠原、III型膠原、IV型膠原基因的表達(dá)水平；用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)以上各指標(biāo)的蛋白表達(dá)情況；用比色測(cè)定法檢測(cè)蛋白水解酶的活性；用酪蛋白和明膠酶譜法檢測(cè)相應(yīng)的兩種蛋白酶的活性。權(quán)利要求1、Lefty蛋白作為制備拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用。2、Lefty蛋白作為制備拮抗Nodal信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用。3、Lefty蛋白作為制備拮抗骨形成蛋白(BMP)信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用。4、Lefty蛋白作為制備拮抗p38絲裂原蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的藥物中的應(yīng)用。5、Lefty蛋白在制備治療或預(yù)防肝纖維化病變的藥物中的應(yīng)用。6、Lefty蛋白在制備治療或預(yù)防腎纖維化病變的藥物中的應(yīng)用。7、Lefty蛋白在制備治療或預(yù)防肺纖維化病變的藥物中的應(yīng)用。8、Lefty蛋白在制備治療或預(yù)防心肌纖維化病變的藥物中的應(yīng)用。9、Lefty蛋白在制備治療或預(yù)防皮膚纖維瘤的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種Lefty蛋白在抑制器官纖維化病變中的應(yīng)用，該Lefty蛋白作為制備拮抗TGF-β、Nodal、BMP、p³⁸MAPK信號(hào)通路的藥物在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用和將Lefty蛋白作為制備治療或預(yù)防在肝、腎、肺、心肌、皮膚等器官和組織纖維化病變的藥物中的應(yīng)用。抑制纖維化疾病相關(guān)信號(hào)通路(如TGF-β/Smad、Nodal信號(hào)通路)和活化具有抑制纖維化的相關(guān)蛋白水解酶類(lèi)(如MMP、明膠酶等)兩大方面。是極具潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的生物制劑，還可為進(jìn)一步探討纖維化疾病的發(fā)生機(jī)制提供幫助。文檔編號(hào)A61K38/17GK101152561SQ20071005314公開(kāi)日2008年4月2日申請(qǐng)日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日發(fā)明者頤姚,杰張申請(qǐng)人:武漢大學(xué)