專利名稱：苦參生物堿在制備治療人表觀遺傳失活疾病藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物學制藥領域，特別涉及苦參生物堿在制備治療人表觀遺傳失活疾 病藥物應用。 技術背景-繼人類基因組計劃圓滿完成之后，研究人員已正式啟動了 "人類基因組表觀遺傳 計劃(Human Epigenome Project)",這是一項針對控制人類基因"開"和"關"的主 要化學變化進行的圖譜繪制工作?；虮磉_的"開關"是由表觀遺傳因素(Epigenetics) 控制。表觀遺傳因素是在不影響DNA序列的情況下通過對染色體結構或DNA空間結 構進行表觀遺傳修飾來開啟或關閉，增強或抑制特定基因的表達，包括DNA甲基化和 聚梳蛋白家族表達、組蛋白乙?；?。大部分情況下，人類疾病有半數(shù)原因與基因遺 傳有關，另一半則取決于表觀遺傳變化。雖然它與腫瘤發(fā)生是否存在因果關系的爭議 持續(xù)了二十年，但愈來愈多的證據(jù)表明腫瘤的發(fā)病機制中，表觀遺傳因素的變化可先 于遺傳因素的改變，表觀遺傳因素變化引發(fā)腫瘤一說現(xiàn)已得到證實。DNA甲基化是指哺乳動物基因組DNA的胞嘧啶(C)的5'位通過DNA甲基轉移 酶(DNAmethyltransferase， DNMT)介導發(fā)生的甲基化修飾反應，此反應主要發(fā)生在 含-CG-的DNA序列中。CpG島是指基因組DNA上富含CpG的區(qū)域，主要分布在基 因的啟動子和第一外顯子。據(jù)估計人類基因組DNA上約29， 000個CpG島，多為低 甲基化，人類50%基因的5'端可出現(xiàn)CpG島。基因的轉錄調(diào)節(jié)同啟動子CpG島甲基 化密度和發(fā)生的區(qū)域有關。高表達基因(如管家基因)的CpG島趨于低甲基化，而低 表達基因常呈現(xiàn)高甲基化。細胞的正常發(fā)育和分化過程也可通過這種不同基因甲基化 調(diào)節(jié)以控制不同生理狀態(tài)下基因表達來實現(xiàn)；有研究表明隨年齡的增加，重要基因的 甲基化程度也增加；廣泛的低甲基化和CpG島的高甲基化共存是許多腫瘤細胞的表觀 遺傳學特征。 CpG島甲基化譜的系統(tǒng)性和全面性特點同中醫(yī)藥學整體觀的哲學體系完全吻合。 由此看來，CpG島甲基化譜不但與決定疾病不同中醫(yī)癥侯群的分子機制密切相關，還 可能是中醫(yī)藥辯證施治的科學依據(jù)。為此研究CpG島甲基化譜的CpG島芯片技術又將 帶給具有豐富內(nèi)涵的中醫(yī)藥研究新的契機。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供苦參生物堿作為制備治療人表觀遺傳失活疾病藥物的應用本發(fā)明所說的苦參生物堿是從苦參、山豆中提取的生物堿。包括參堿、氧化苦參 堿、羥基苦參堿及其臨床上可接受的鹽。本發(fā)明所說的人表觀遺傳失活是指人細胞內(nèi)基因在DNA表達調(diào)控區(qū)域甲基化發(fā) 生變異、聚梳蛋白家族表達發(fā)生變異、或甲基化轉移酶活性發(fā)生改變導致正常組織中 的細胞增殖、分化和凋亡等發(fā)生紊亂由此而引起的疾病。具體是指腫瘤、白血病。本發(fā)明苦參生物堿的用量為臨床上可接受的用量。本發(fā)明所述的苦參生物堿通過影響腫瘤細胞DNA水平甲基化，聚梳蛋白家族表達 調(diào)控抑癌基因表達，誘導腫瘤細胞分化、凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，達到治療和預防 腫瘤疾病，以及其它疾病。


圖1為RIZ1啟動子呈高甲基化水平，經(jīng)過0.1 mg/ml苦參堿或0.2 mg/ml苦參液 作用K562細胞6天，甲基化程度降低，處理組U出現(xiàn)條帶。圖2為不同藥物作用K562細胞不同時間后RIZ1表達的變化，J5 — actin作為內(nèi)對照。 其中圖中1、 DNAMarker; 2、 0小時；3、 24小時；4、 72小時。
具體實施方式
苦參堿、氧化苦參堿以及羥基苦參堿等生物堿是我國傳統(tǒng)中藥苦參、山豆的 多種活性成分中較為重要的一種生物堿。我們觀察到苦參煎液可誘導人白血病K562 細胞部分分化基礎上，發(fā)現(xiàn)苦參堿、氧化苦參堿等中藥苦參、山豆根中生物堿單體可 抑制K562細胞增殖，促使細胞向紅系分化，進一步觀察到細胞在信號轉導、細胞周期 以及癌基因等諸多方面發(fā)生了相應變化[1]，我們選擇含有細胞周期、受體、信號轉導、 轉錄因子、癌基因等相關的7600條人類基因的國產(chǎn)基因表達譜芯片檢測了苦參堿作用K562細胞24小時的差異表達基因，并發(fā)現(xiàn)此過程中有300多個基因的表達情況明顯 發(fā)生變化，且與增殖、分化和代謝相關的基因占多數(shù)，此研究結果同我們以往獲得的 研究數(shù)據(jù)基本吻合。隨著微觀生物學在表觀遺傳學(Epigenetic)方面研究的深入，依 據(jù)這些研究結果，進一步利用PCR技術，MSP-PCR技術，毛細管電泳等技術，發(fā)現(xiàn) 了中藥苦參、山豆根以及從中提取的苦參堿、氧化苦參堿、羥基苦參堿等化合物可改 變?nèi)祟惣毎碛^遺傳因素。從而可以應用這些物質(zhì)改變生物的表觀遺傳，以及治療或 預防由于表觀遺傳因素引起的疾病提供了新途徑。如圖一所示，通過Methylation Specific PCR (甲基化特異性PCR， MSP)技術， 研究發(fā)現(xiàn)RIZ1啟動子呈高甲基化水平，經(jīng)過0.1 mg/ml苦參堿或0.2 mg/ml苦參液作 用K562細胞6天，甲基化程度降低，處理組U出現(xiàn)條帶。如圖二所示，在對照組K562細胞中，RIZ1抑癌基因低表達，0.1mg/ml苦參堿或 0.2 mg/ml苦參液作用K562細胞24小時和72小時RIZ1的轉錄表達明顯比對照組升 高，并隨著作用時間延長而表達增加。結合圖一結果表明苦參堿和苦參液誘導RIZ1基 因表達是通過降低RIZ1啟動子甲基化實現(xiàn)。目前臨床尚沒有通過改變腫瘤細胞的表觀遺傳學性狀治療腫瘤的中藥。通過改 變RIZ1等抑癌基因表觀遺傳學性狀，由轉錄沉默狀態(tài)轉變?yōu)檗D錄表達，不但可以發(fā)揮 抗腫瘤作用，還可以用于腫瘤預防作用。特別是通過RIZ1基因表達，可影響組蛋白甲 基化，改善染色體的穩(wěn)定性，對腫瘤預防和輔助腫瘤化療有積極作用。 實施例1細胞培養(yǎng)K562細胞采用常規(guī)細胞培養(yǎng)，含10%小牛血清，青、鏈霉素各100u/ml 的RPMI1640培養(yǎng)液，在37。C，飽和濕度，5XC02孵箱中培養(yǎng)，每3 4天換液傳代。 2藥物處理細胞收集對數(shù)生長期細的苦參堿或0.2 mg/ml的苦參液分別作用K562細 胞24和72小時，其中處理72小時組為先用藥物作用細胞24小時，離心去掉上清液，加 無藥物的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后再加入同等濃度藥物處理24小時。對照組不加藥物 處理，其余條件完全一致。37'C培養(yǎng)，收集細胞。3 RNA提取采用細胞總RNA提取試劑盒(RNeasy Protect Mini Kit， QIAGEN)，具體 操作參照試劑盒說明書進行。電泳分析其完整性，用紫外法對樣品RNA進行定量與純度測定。4 RT-PCR:取1 u g總RNA， 分別用通用引物(Hexanucleotide-Mix, Roche)與RIZ基 因的特異性引物(5' -ACACCAATCCGGGTCTTGTC-3')進行逆轉錄反應。具體操作為RNA 樣品先經(jīng)7(TC預變性3分鐘,加入20 W逆轉錄反應體系中，然后經(jīng)37'C (通用引物組) 或42。C (RIZ特異性引物組)逆轉錄1小時，70°C 10min，然后置于-20。C保存?zhèn)溆?。引物由上?；瞪锛夹g有限公司合成，RIZ1基因引物序列為上游5' -GAACACTACTGAGCCTGTGG-3'，下游5' -ACACCAATCCGGGTCTTGTC-3'。擴增片斷長度為 123bp。
e-actin的引物序列上游5' -ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3'，下游5' -AGGGG5CCGGACTCGTCATACT—3'，擴增片斷為621bp。 PCR條件為94。C預變性5分鐘； 擴增35個循環(huán)，即94'C 45秒、62°C 45秒、72°C 1分鐘；最后72'C延伸10分鐘。5 PCR產(chǎn)物測定將全部PCR擴增產(chǎn)物加入2.0M瓊脂糖凝膠中，以100V電壓電泳40分 鐘，溴化乙錠染色，將電泳結果直接置于凝膠成像系統(tǒng)裝置中攝像分析。本發(fā)明用苦參堿為例進行實驗，其他的氧化苦參堿、羥基苦參堿、N-甲基金雀花 堿、安那吉堿、膺靛葉堿、脫氫苦參堿、d-異苦參堿、苦參啶、去甲苦參酮、苦參碇 醇、苦參醇、新苦參醇、去甲苦參醇等，本領域普通技術人員參照苦參堿的實驗方法， 就可以實現(xiàn)本發(fā)明的內(nèi)容。
權利要求
1、苦參生物堿在制備治療人表觀遺傳失活疾病藥物的應用。
2、 根據(jù)權利要求l所述的應用，其特征在于所說的苦參生物堿 是從苦參、山豆中提取的生物堿。
3、 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于所述的生物堿是指 苦參堿、氧化苦參堿、羥基苦參堿、N-曱基金雀花堿、安那吉堿、膺 靛葉堿、脫氫苦參堿、d-異苦參堿、苦參啶、去甲苦參酮、苦參碇醇、 苦參醇、新苦參醇、去曱苦參醇。
4、 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于其苦參生物堿包括 其臨床上可接受的鹽。
5、 根據(jù)權利要求l所述的應用，其中人表觀遺傳失活是指人細胞 內(nèi)基因在DNA表達調(diào)控區(qū)域甲基化發(fā)生變異、聚梳蛋白家族表達發(fā)生 變異、或曱基化轉移酶活性發(fā)生改變由此而引起的疾病。
6、 根據(jù)權利要求書5所述的應用，其所述的疾病是指腫瘤、白 血病。
7、 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于苦參生物堿的用 量為臨床上可接受的用量。
全文摘要
表觀遺傳失活對生物基因表達、生長、發(fā)育等生命行為產(chǎn)生重要影響，特別是對抑癌基因表達調(diào)控的作用異常，導致表觀遺傳失活疾病發(fā)生，如腫瘤、白血病等。中藥苦參、山豆根以及從中提取的苦參堿、氧化苦參堿、羥基苦參堿等化合物可抑制腫瘤表觀遺傳失活，誘導抑癌基因表達，抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞分化和凋亡，達到治療和預防腫瘤。
文檔編號A61K31/4353GK101152177SQ200710030219
公開日2008年4月2日 申請日期2007年9月13日 優(yōu)先權日2007年9月13日
發(fā)明者劉小珊, 蔣紀愷 申請人:汕頭大學醫(yī)學院