專利名稱：：小麥麩皮黃酮類化合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及小麥麩皮黃酮類化合物，屬于天然藥物化學領域，具體說是一種利用小麥麩皮為原料制備的小麥麩皮黃酮類化合物及其制備方法，以該化合物作為活性成分的藥物在治療與預防癌癥和與自由基損傷有關的疾病的用途。二、技術背景小麥麩皮為未本科植物小麥7H"cwmae沾V"wL.的種皮。主治時疾熱瘡，湯火瘡爛，撲損傷折淤血?！侗静菥V目》"麩乃麥皮也，與浮麥同性，而止汗之功次于浮麥，蓋浮麥無肉也。"清《本草備要》記載用醋炮制后"能散血止痛，熨腰腳折傷，風濕痹痛，寒濕腳氣，互易至汗出良"，麥麩性涼而軟，還可為瘡瘍痘瘡患者作席墊。近代的《藥物圖考》說，麥皮能和緩神經，除熱，去煩，潤臟腑，安神經?！妒朝煴静荨飞线€指出麥麩可以"益顏色，滑肌膚"，具有美容功效。在中藥的炮制中有麩炒法，既將凈制或切制后的藥物用麥麩熏炒的方法，具有增強療效、緩和藥性、矯臭矯味的作用。將小麥麩炒香，研細，開水沖服，對血尿、尿淋有一定療效。與面粉按適當比例混合，加適量食油、雞蛋、蔬菜蒸熟替代飲食長期食用，可減緩糖尿病的癥狀?，F代藥理實驗證明，麥麩膳食纖維具有抗氧化、清除自由基作用和減少憩室病、膽結石和結腸癌發(fā)生的重要作用。此外小麥麩中含有多量維生素B1和蛋白質，有治療腳氣病、末梢神經炎的功效。鑒于小麥麩皮在資源上具有明顯的優(yōu)勢，因此充分開發(fā)利用麥麩中的化合物具有十分重要的現實意義。小麥化學成分方面的研究較少，更缺乏系統(tǒng)研究，目前為止有文獻報道的主要為酚酸類、黃酮類、甾體類、烷基酚類等。黃酮類化合物是存在于自然界的一大類化合物，在食品和醫(yī)藥工業(yè)上有著廣泛的應用?，F代醫(yī)學研究表明小麥黃酮具有降低心肌耗氧量，使冠脈、腦血管流量增加，抗心律失常，軟化血管、降血糖、降血脂，抗氧化，消除機體內自由基抗衰老作用，增強機體免疫力的功能。此外，還有報道對抗病蟲害也有幫助。鑒于小麥麩皮在資源上具有明顯的優(yōu)勢，因此充分開發(fā)利用麥麩中的黃酮類化合物具有十分重要的現實意義。
發(fā)明內容技術問題本發(fā)明的目的在于提供兩種小麥麩皮黃酮類化合物及其制備方法以及兩種小麥麩皮黃酮類化合物在制備治療與預防癌癥和與自由基損傷有關的疾病的藥物中的新用途。技術方案本發(fā)明提供了兩種新的小麥麩皮黃酮類化合物及其制備方法。自小麥麩皮中提取、分離、純化得到的這兩種黃酮類新化合物，命名為小麥新苷A和小麥新苷B。小麥新苷A，化學名稱為芹菜素-6-C-半乳糖苷-8-C-(2'-芥子酸?；?阿拉伯糖苷，分子式(:371138018，分子量770，化學結構式為小麥新苷B，化學名稱為芹菜素-6-C-(2，-芥子酸?；?阿拉伯糖苷-8-C-半乳糖苷,分子式C37H38018，分子量770，化學結構式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>上述小麥麩皮黃酮類化合物的制備方法，其特征在于以小麥麩皮為原料，經水或有機溶劑或混合溶劑提取，水提取液直接過大孔樹脂吸附，有機溶劑或混合溶劑提取液濃縮后加水溶解再經大孔樹脂吸附或正丁醇萃取，大孔樹脂吸附物或正丁醇萃取物經柱層析分離而得。其中，大孔樹脂包括D101、AB-5或HP-20;柱層析用擔體選自硅膠、氧化鋁、聚酰胺和ODS中的一種或幾種；有機溶劑包括甲醇、乙醇或正丁醇。本發(fā)明還提供了小麥麩皮黃酮類化合物小麥新苷A和小麥新苷B與醫(yī)學上可接受的藥用輔料組成藥物組合物及其制劑。如，片劑、丸劑、膏劑、膠囊劑、口服液、顆粒劑以及注射液粉針劑或水針液。本發(fā)明還提供了小麥麩皮黃酮類化合物作為藥物活性成分在制備預防與治療與自由基損傷有關的疾病的藥物中的應用。本發(fā)明還提供了小麥麩皮黃酮類化合物作為藥物活性成分在制備預防與治療癌癥的藥物或在食品添加劑中的應用。有益效果本發(fā)明公開了從小麥麩皮中提取分離的兩種黃酮類新化合物的化學結構，以及該化合物制備方法及在醫(yī)藥領域中的用途，尤其在制備預防與治療與自由基損傷有關的疾病的藥物和抗腫瘤藥物中的用途。鑒于小麥麩皮在資源上具有明顯的優(yōu)勢，本發(fā)明對于充分開發(fā)利用麥麩中的黃酮類化合物具有十分重要的現實意義。試驗證明，小麥新苷A和小麥新苷B均具有較強的清除羥自由基(.OH)作用，在250pg/ml濃度組清除率分別達到59.16%、56.10%。小麥新苷A和小麥新苷B均對Bel-7402、A2780、KB三種人癌細胞均具有作用，小麥新苷A的IC5Q分別為15.15ng/ml、22.03pg/ml、28.36|ag/ml，小麥新苷B的IC50分別為14.24ng/ml、21.36|_ig/ml、27.83ng/ml。四圖1小麥新苷A的HMBC光譜中觀察到的結構圖圖2小麥新苷B的HMBC光譜中觀察到的結構圖圖3小麥新苷A和B的清除羥自由基實驗結果圖4小麥新苷A和B的提取分離五具體實施例方式結合具體實施方式對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的內容并不僅僅限于所列舉的實施方式。本發(fā)明自小麥麩皮中提取、分離、純化得到的這兩種黃酮類新化合物，命名為小麥新苷A和小麥新苷B。(l)提取分離本發(fā)明利用面粉加工的廢棄物小麥麩皮，依次用95%、90%、80%乙醇各冷浸提取一次，每次3天，濃縮合并成無醇味的濃縮液。濃縮液先用石油醚萃取，取水相，達到去除脂溶性物質的目的。水相再用正丁醇萃取，取正丁醇相，達到去除水溶性雜質的目的。正丁醇相濃縮成無味的浸膏，即得到正丁醇部。正丁醇部用5倍量的水溶解，靜置，用大孔樹脂進行吸附，再以水-乙醇系統(tǒng)(9:1-1:9)分段洗脫，通過薄層層析(展開劑正丁醇:醋酸:水-4:l:5)檢測，鑒定出含有黃酮的組分，合并這些組分，得小麥麩皮總黃酮?？傸S酮用等體積乙醇溶解，與l-3倍量的聚酰胺混合，干燥，用總黃酮重量的10-20倍量的聚酰胺裝柱，水-乙醇(100:1-3:1)系統(tǒng)反復聚酰胺柱層析，聚酰胺薄層板層析檢測，合并相同組分，合并部分再進行硅膠柱層析，氯仿-甲醇(97:3-5:1)系統(tǒng)反復硅膠柱層析，得含有兩化合物的粗品。最后采用RP-C18柱純化及重結晶，得精細重結晶，經高效液相色譜檢測發(fā)現含有2個黃酮類化合物，得到小麥新苷A和B混合結晶。將混合結晶再經高效制備柱PrepaLC-C18色譜(40X200mm，粒徑6um，Waters公司)制備純化流動相為32%甲醇水溶液、流速3mL/min，分別收集得到兩個組分，經檢測均為單體化合物，分別析出結晶后即為小麥新苷A產品和小麥新苷B的產品(2)結構鑒定取上述步驟獲得的小麥新苷A和B混合結晶，為淡黃色粉末，熔點293297'C，鹽酸鎂粉反應呈陽性，Molish反應呈陽性。難溶于氯仿、水，微溶于甲醇，易溶于水-甲醇混合溶液。以上信息提示該化合物為黃酮苷類化合物。ESI+/MS顯示分子離子峰為771[M+H]+，結合氫譜和碳譜推測，分子式C37H38018，分子量770。碳譜有明顯相疊的參差兩層峰，氫譜積分比例及碳譜峰高比例約為5:3，顯示此化合物應為兩結構相似的混合物質(A和B)，且兩化合物分子量相同，結構相似，推測僅個別基團連接位置有變化。UV^nax:337nm(I帶)，274mn(II帶)(MeOH);377nrn(I帶)，275nm(II帶)(MeOH+MeONa);343nm、380nm(I帶)，275nm(H帶)(MeOH+AlCl3);338nm(I帶)，283nm(II帶)(MeOH+NaOAc)。推測苷元為芹菜素。氫譜中無A環(huán)氫，表明為6，8-C-糖苷鍵；6.92(2H，d，J=7Hz，3，，5，-H)、7.02(2H,d，J=7Hz，3，，5，-H)、8.02(2H，d，J-7Hz，2，，6，-H)、8.38(2H，d,J=7Hz，2，,6，-H)，示B環(huán)含四個氛，為對稱結構；6.86(1H,3-H)、6.71(lH，3-H)示C環(huán)含1個氫，為黃酮結構。證實兩化合物均為6，8-C-糖-芹菜素，其各自的黃酮苷元'H-NMR和。C-NMR數據見表1。與芹菜素(apigenin)iH-NMR和"C-NMR數據比較發(fā)現除6，8位的碳譜5增加外，其他數據均無明顯變化，表明黃酮骨架上再無其他基團連接。氫譜顯示化合物中存在兩個反式雙鍵5.97(lH，d,J=16Hz)，6.27(1H，d，J=16Hz)，7.11(1H，d，J=16Hz)，7.30(1H,d，J=16Hz);4個苯環(huán)氫:6.40(2H)、6.90(2H)。碳譜顯示化合物中還存在兩個羰基164.9、166.0;4個甲氧基56.0。依據以上數據推測，化合物A和B分別含有一個芥子酸基團。據氫譜4.51(d,J=9Hz)，4.66(d，J=9Hz)，5.00(d，J-9.5Hz)和5.29(d，J-9.5Hz灘測分別為兩個半乳糖和阿拉伯糖的端基氫。碳譜S59.980.8為糖信號，據DEPT譜59.9、61.2、70.1、70.5為亞甲基峰，證實化合物分別含有一個半乳糖和一個阿拉伯糖；80.0、80.8為兩個半乳糖的5位碳信號。計算上述結構的分子量，疊加后與質譜數據相吻合，證實上述結構的推測均屬實。以傘耳花草苷Corymboside和異傘耳花草苷Isocorymboside的！H-NMR和13C-NM數據與黃酮苷元比較，發(fā)現化合物B和A分別與前者一致，推測B和A分別為傘耳花草苷和異傘耳花草苷的芥子酸取代結構。HMBC譜上半乳糖和阿拉伯糖的端基氫分別與6，8位碳相關，證實推測成立。由于黃酮骨架碳譜5與傘耳花草苷和異傘耳花草苷比較無變化，所以芥子酸均連接于糖上。5.88(brt，9.5Hz)和5.56(brt，9.5Hz)為兩個阿拉伯糖2位氫信號，HMBC譜顯示兩個阿拉伯糖2位氫信號(S5.88,5.56)分別與兩個芥子酸9位碳信號(S166.0，164.9)相關，H-HCOSY譜顯示兩個阿拉伯糖2位氫信號(S5.88，5.56)分別與各自阿拉伯糖端基氫信號(S5.00，5.29)相關。據以上數據推論化合物A結構為apigenin-6-C-galactoside-8-C-(2，-sinapoyl)arabinoside，經檢索為新化合物，命名為小麥新苷A(TriticusideA);化合物B結構為apigenin-6-C-(2，-sinapoyl)arabinoside-8-C-galactoside，經檢索為新化合物，命名為小麥新苷B(TriticusideB)。小麥新苷A的'H-NMR、"C-NMR和HMBC數據見表l,主要遠程相關圖見圖1。小麥新苷B的'H-NMR^C-NMR和HMBC數據見表1，主要遠程相關圖見圖2。表1小麥新苷A和B的核磁共振數據(inDMSO8(ppm)l)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>"C-NMR125Hz,'H-NMR500Hz,TMS為內標，DEPT譜確定碳信號(q(C)，t(CH)，s(CH2),p(CH3),A為阿拉伯糖，G為半乳糖。本發(fā)明的兩種新化合物作為藥物活性成分可以制成常規(guī)的藥用劑型，如，片劑、丸劑、膏劑、膠囊劑、口服液、顆粒劑以及注射液粉針劑或水針液。(3)清除羥自由基活性實驗取7.5mmol/L鄰二氮菲水溶液1.8ml，加入pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)5,0ml,充分混勻后再加入7.5mmol/L硫酸亞鐵水溶液1.8ml,充分混勻后加入0.1%H2O22.4ml，最后用水補充體積至20ml，反應液37'C恒溫反應1小時，測536nm處吸光度A損傷，實驗組先加樣品液后再加H202，補其體積至20ml，測A加樣；空白管不加H202和樣品，測A^自。以下列方程式計算羥自由基清除率.OH清除率-(A加樣-A損傷)/(A空a-A損傷)X100%實驗結果見表2表2小麥新苷A和B清除羥自由基活性實驗結果A(吸光度測定值)A(平均).OH清除率(％)空白1.2601.2551.2511.255損傷0.4720.4730.4750.47350pg/ml0.6540.6510.6530.65322.93小麥lOO^g/ml0,6760.6750.6790.67726.00新苷150嗎/ml0.7450.7490.7470.74735.00A200ng/ml0.7990.797O細0.79941.60250|ig/ml0.9350.9370.9360.93659.1650|xg/ml0.5960.5950.5930.59515.52小麥lOOpg/ml0.6570.6580,6600.65823.66新苷150pg/ml0.7220.7210.7240.72231.84B200pg/ml0.7900.7910.7920.79140.62250ng/ml0.9110.9130.9120.91256.10結論小麥新苷A和B均具有較強的清除.0H作用，在250(ag/ml濃度組清除率分別達到59.16%、56.10%。(見附圖3)(4)對人癌細胞的體外細胞作用實驗采用7種人癌細胞株，其中包括Bel-7402(肝癌)、A2780(卵巢癌)、KB(口腔上皮細胞癌)、BGC-823(胃癌)、MCF-7(乳腺癌)、A549(肺腺癌)、Hela(宮頸癌)。用MTT法進行實驗，結果見表3。表3小麥新苷A和B在體外對人癌細胞生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結論小麥新苷A和B均對Bel-7402、A2780、KB三種人癌細胞有作用，小麥新苷A的半致死系數分別為15.15ng/ml、22.03ng/ml、28.36pg/ml，小麥新苷B的半致死系數分別為14.24|ig/ml、21.36ng/ml、27.83pg/ml。實施例1小麥麩皮lOKg，依次用95%、卯％、80%乙醇各冷浸提取一次，乙醇用量200升，每次3天，濃縮合并成無醇味的濃縮液，得總浸膏?？偨嗨芎笠来斡檬兔?、正丁醇萃取，取正丁醇相，并濃縮成浸膏。正丁醇浸膏水溶解后，經柱層析分離后分別得到小麥新苷A9.2mg，純度95e/。和小麥新苷B8.9mg，純度95%。(見附圖4)實施例2小麥麩皮1Kg，用水加熱提取三次，水用量為20升，提取時間為1小時，提取溫度為70。C，提取液經大孔樹脂(DIOI、AB-5、HP-20等)吸附，用水沖洗后用85%乙醇洗脫，洗脫液減壓回收溶劑得黃酮混合物?；旌衔镌俳浿鶎游?硅膠柱層析氯仿-甲醇系統(tǒng)，RP-C18柱層析水甲醇系統(tǒng))分離后，得到小麥新苷A和小麥新苷B的混合物15.1mg，純度90%。實施例3小麥麩皮lKg,用甲醇冷浸提取三次，甲醇用量為20升，提取時間為l天，提取液經大孔樹脂(DIOI、AB-5、HP-20等)吸附，用水沖洗后用85%乙醇洗脫，洗脫液減壓回收溶劑得黃酮混合物?；旌衔镌俳浿鶎游?硅膠柱層析氯仿-甲醇系統(tǒng)，RP-C18柱層析水甲醇系統(tǒng))分離后，分別得到小麥新苷A和小麥新苷B的混合物13.9mg，純度卯％。實施例4膠囊劑的制備取上述兩種黃酮類新化合物中的一種或它們的混合物，加藥用輔料淀粉適量，充分混勻后裝入膠囊，制成每粒含上述新化合物或衍生物100mg的膠囊劑供口服。實施例5注射劑的制備取上述兩種黃酮類新化合物及它們的衍生物中的一種或它們的混合物，加注射用純凈水及聚山梨酯80適量，制成每250ml含100mg上述新化合物或衍生物的注射液供靜脈注射點滴使用。權利要求1、一種小麥麩皮黃酮類化合物，簡稱小麥新苷A，化學名稱為芹菜素-6-C-半乳糖苷-8-C-(2’-芥子酸?；?阿拉伯糖苷，分子式C37H38O18，分子量770，化學結構式為2、一種小麥麩皮黃酮類化合物，簡稱小麥新苷B，化學名稱為芹菜素-6-C-(2'-芥子酸?；?阿拉伯糖苷-8-C-半乳糖苷，分子式C37H38018，分子量770，化學結構式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3、權利要求1或2所述小麥麩皮黃酮類化合物的制備方法，其特征在于以小麥麩皮為原料，經水或有機溶劑或混合溶劑提取，水提取液直接過大孔樹脂吸附，有機溶劑或混合溶劑提取液濃縮后加水溶解再經大孔樹脂吸附或正丁醇萃取，大孔樹脂吸附物或正丁醇萃取物經柱層析分離而得。4、權利要求3所述的制備方法，其特征在于，大孔樹脂包括D101、AB-5或HP-20;柱層析用擔體選自硅膠、氧化鋁、聚酰胺和ODS中的一種或幾種；有機溶劑包括甲醇、乙醇或正丁醇。5、權利要求1或2所述的小麥麩皮黃酮類化合物與醫(yī)學上可接受的藥用輔料組成藥物組合物及其制劑。6、權利要求5所述的制劑，包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液和注射劑。7、權利要求1或2所述的小麥麩皮黃酮類化合物在制備預防與治療與自由基損傷有關的疾病的藥物中的用途。8、權利要求1或2所述的小麥麩皮黃酮類化合物在制備預防與治療癌癥的藥物或食品添加劑中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及小麥麩皮黃酮類化合物，屬于天然藥物化學領域。小麥新苷A為芹菜素-6-C-半乳糖苷-8-C-(2’-芥子酸?；?阿拉伯糖苷；小麥新苷B為芹菜素-6-C-(2’-芥子酸?；?阿拉伯糖苷-8-C-半乳糖苷。以小麥麩皮為原料，經水或有機溶劑或混合溶劑提取，水提取液直接過大孔樹脂吸附，有機溶劑或混合溶劑提取液濃縮后加水溶解再經大孔樹脂吸附或正丁醇萃取，大孔樹脂吸附物或正丁醇萃取物經柱層析分離而得。小麥新苷A和B可作為藥物活性成分在制備預防與治療與自由基損傷有關的疾病的藥物中應用和在制備預防與治療癌癥的藥物中應用。文檔編號A61P35/00GK101104630SQ200710021030公開日2008年1月16日申請日期2007年3月23日優(yōu)先權日2007年3月23日發(fā)明者煦馮,宇單,東姜,戴廷波,曹衛(wèi)星,董云發(fā)申請人:南京農業(yè)大學