專利名稱：一種新的白樺脂酸型三萜化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物化學(xué)及天然抗HIV藥物開發(fā)領(lǐng)域，涉及一種化合物，特別是一種新的白樺脂酸型三萜化合物。
背景技術(shù)：
目前應(yīng)用于臨床的抗HIV藥物作用靶點(diǎn)主要針對HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和蛋白酶(PR)，這些藥物抗HIV的作用效果是明顯的，但較長時(shí)間使用會(huì)導(dǎo)致HIV對藥物產(chǎn)生耐藥性而使藥物失效(Christopher Aiken等，2005，Trends in Molecular Medicine，1131-36)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種新的白樺脂酸型三萜化合物。近年的研究表明，白樺脂酸型三萜類化合物抗HIV作用機(jī)理不同于目前臨床抗HIV藥物，白樺脂酸型三萜類化合物抗HIV的作用機(jī)理是阻止HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞和阻止HIV在宿主細(xì)胞中成熟，這對解決病毒耐藥性這一關(guān)鍵問題帶來新的希望(Christopher Aiken等，2005，Trends in Molecular Medicine，1131-36)。


圖1是本發(fā)明的新化合物的1H NMR圖；圖2是本發(fā)明的新化合物的13C NMR圖；圖3是本發(fā)明的新化合物的HSQC圖；圖4是本發(fā)明的新化合物的HMBC圖；圖5是本發(fā)明的新化合物的1H-1H COSY圖；圖6是本發(fā)明的新化合物的ROESY圖；
圖7是本發(fā)明的新化合物的EI-MS圖；圖8是本發(fā)明的新化合物的HR-ESI-MS圖；圖9是本發(fā)明的新化合物的IR圖；以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中的化合物是從中藥材皂角刺(Gleditsia sinensis Lam.的棘刺)中分離到的一個(gè)新化合物，通過NMR、MS、IR等波譜技術(shù)確定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，該化合物屬于白樺脂酸型三萜類化合物。體外抗HIV活性試驗(yàn)(C8166細(xì)胞系)發(fā)現(xiàn)該化合物具有強(qiáng)烈的抗HIV-1活性(EC50＜0.064μg/ml，CC50＝98.43μg/ml，Ti＝1538)。
該化合物為一白樺脂酸型三萜類新化合物，具有強(qiáng)烈的抗HIV活性，且其抗HIV作用機(jī)理不同于目前應(yīng)臨床抗HIV藥物，為克服目前臨床抗HIV藥物導(dǎo)致病毒產(chǎn)生耐藥性這一關(guān)鍵問題帶來新的希望。
1.化合物的提取分離過程粉碎、風(fēng)干的皂角刺15kg，用工業(yè)乙醇(70％)回流提取，得浸膏410g，將其分散浮于1500ml水中，以3×1000ml石油醚，3×1000ml乙酸乙酯，3×1000ml正丁醇依次萃取，減壓回收溶劑，得乙酸乙酯萃取物140g，該萃取物進(jìn)行硅膠柱層析以氯仿∶甲醇10∶0～7∶3洗脫，薄層層析檢測合并相似流分(5％ H2SO4120℃顯色)，得4段流分，其中第3段流分(氯仿∶甲醇8∶2洗出部分)28g進(jìn)行大孔吸附樹脂(D101)柱層析，水、甲醇洗脫，得甲醇洗出部分21g，進(jìn)行反相硅膠(RP-18)柱層析，70％甲醇洗脫，薄層層析檢測合并相似流分(5％ H2SO4120℃顯色)，第2段流分2.3g進(jìn)行同樣反相硅膠柱層析，得到目標(biāo)化合物10mg。
2.化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)確定通過1D NMR(1H NMR和13C NMR)、2D NMR(HSQC、HMBC、1H-1H COSY和ROESY)、EI-MS、HR-ESI-MS和IR等波譜技術(shù)(圖譜見附圖1～9)確定了化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為
中文名稱皂刺素I；英文名稱2β-carboxyl，3β-hydroxyl-norlupA(1)-20(29)-en-28-oic acid。
3.細(xì)胞毒性和抗HIV活性測試化合物對C8166細(xì)胞系的細(xì)胞毒性采用MTT比色法測定。將100μlC8166細(xì)胞(細(xì)胞密度為4×105/ml)接種于96孔微孔培養(yǎng)板中，加入100μl本發(fā)明的受試化合物，設(shè)不含化合物的空白對照。5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)72小時(shí)，棄去100μl上清液，加入25μl MTT試劑(5mg/ml，pH7.4 PBS溶解液)培養(yǎng)4小時(shí)，再加入100μl 50％ DMF-10％ SDS，完全溶解后，經(jīng)酶標(biāo)測定儀(Bio-Tek Elx800)在595nm和630nm波長下測定A595/A630并計(jì)算CC50值(對半數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性時(shí)的化合物濃度)，得CC50＝98.43μg/ml。
抗HIV活性測試將50μl C8166(細(xì)胞密度為4×105/ml)細(xì)胞接種于96孔微孔培養(yǎng)板中，加入100μl不同濃度的受試化合物(受試化合物先用DMSO溶解，配成10mg/ml工作液，再以培養(yǎng)基稀釋至100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml和0.8μg/ml四個(gè)不同濃度)，再加入50μl HIV-1稀釋液(200TCID50)，混合均勻，5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)72小時(shí)，倒置顯微鏡(100×)下檢測合胞體細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)濃度三個(gè)重復(fù)，設(shè)不含化合物的空白對照，AZT為陽性藥物對照。合胞體細(xì)胞形成的抑制率以受試化合物處理的培養(yǎng)基合胞體細(xì)胞數(shù)目與感染對照組合胞體細(xì)胞數(shù)目的比值表示，計(jì)算EC50值(合胞體細(xì)胞形成半數(shù)抑制時(shí)的化合物濃度)，得EC50＜0.064μg/ml。
治療指數(shù)Ti＝CC50/EC50＝1538。
綜上所述，本發(fā)明中的白樺脂酸型三萜化合物具有強(qiáng)烈的抗HIV活性(EC50＜0.064μg/ml，Ti＝1538)，抗HIV作用機(jī)理不同于現(xiàn)有抗HIV藥物，有望克服現(xiàn)有藥物無法解決的病毒易產(chǎn)生耐藥性的問題。申請人目前在著手準(zhǔn)備臨床試驗(yàn)，若最終通過臨床試驗(yàn)，對開發(fā)成用于艾滋病的治療的藥物將具有重要意義。
權(quán)利要求
1.一種白樺脂酸型三萜化合物，其特征在于，該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 該化合物具有強(qiáng)烈的抗HIV活性，即EC50＜0.064μg/ml，CC50＝98.43μg/ml，Ti＝1538。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白樺脂酸型三萜化合物，該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖，該化合物具有強(qiáng)烈的抗HIV活性，即EC
文檔編號A61P31/00GK101062936SQ20071001765
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月10日
發(fā)明者李萬華, 趙文明 申請人:西安交通大學(xué)