專利名稱：：流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及流感疫苗制劑和用于免疫對抗流感疾病的接種方案、其在藥物中的用途，尤其是其在增大對各種抗原的免疫應(yīng)答方面的用途，并涉及制備方法。具體地i兌，本發(fā)明涉及單價流感免疫原性組合物，該組合物包含與水包油乳液佐劑組合的、低量的流感病毒抗原或其抗原性制品，所述流感病毒抗原或其抗原性制品得自流感病毒抹，毒抹與大流行爆發(fā)相關(guān)或具有與大流行爆發(fā)相關(guān)的潛力。
背景技術(shù)：
：流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，既可感染人類，也可感染家畜。流感引起顯著的經(jīng)濟負擔、發(fā)病率乃至死亡率。流感病毒是RNA包膜病毒，顆粒的直徑大小約為125nm。流感病毒的基本組成為內(nèi)部為與核蛋白結(jié)合的核糖核酸(RNA)的核衣殼(nucleocapsid)或核心，外部包繞著脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)和外層糖蛋白的病毒被膜。病毒被膜內(nèi)層主要由基質(zhì)蛋白組成，而外層主要是宿主來源的脂類物質(zhì)。流感病毒包含兩種表面抗原糖蛋白神經(jīng)氨酸酶(NA)和血細胞凝集素(HA)，它們作為10-12nm長的刺突顯露在顆粒表面上。就是這些表面蛋白、尤其是血細胞凝集素，決定了流感亞型的抗原特異性。病毒抹是依據(jù)以下分類的宿主物種的起源、地理位置和分離的年代，序列號和對于流感A,依據(jù)亞'型HA和NA的血清學性質(zhì)。對于甲型流感病毒，已經(jīng)確定了16個HA亞型(H1-H16)和9個NA亞型(N1-N9)[WebsterRG等人,EvolutionandecologyofinfluenzaAviruses.Microbiol.Rev.1992;56:152-179;FouchierRA等人，CharacterizationofaNovelInfluenzaAVirusHemagglutininSubtype(HI6)ObtainedfromBlack-HeadedGulls.J.Virol.2005;79:2814-2822)。從1918年以來，已經(jīng)從水禽中取得了所有HA和NA亞型的病毒，但只有三個HA亞型(Hl、H2和H3)和兩個NA亞型(N1和N2)在人類種群中形成了穩(wěn)定的族系。對于乙型流感病毒(B)，只識別了一個HA的亞型和一個NA的亞型。甲型流感病毒(A)連續(xù)地進行演變和經(jīng)受了抗原性的變化[WileyD:6SkehelJ.Thestructureandthefunctionofthehemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavirus.Ann.Rev.Biochem.1987;56:365-394]。由于缺乏病毒RNA聚合酶的有效校正，導(dǎo)致高比例(rate)轉(zhuǎn)錄錯誤，這可以在表面糖蛋白上產(chǎn)生氨基酸取代基。這稱為"抗原性漂移"。鏈段化的病毒基因組可提供第二類抗原變異。如果兩個流感病毒同時感染宿主細胞，稱為"抗原性轉(zhuǎn)變，，的遺傳重組可以產(chǎn)生具有新表面或內(nèi)部蛋白的新病毒。這些抗原性改變叫做'漂移，和'轉(zhuǎn)變，，是不可預(yù)見的，由免疫學觀點看可能具有顯著的影響，因為它們最終導(dǎo)致出現(xiàn)新流感抹，能使病毒逃逸免疫系統(tǒng)，幾乎每年都引起眾所周知的流行病。這兩種遺傳修飾？1起對人類流行病具有責任的新病毒變體。HA是確定不同流感抹的血清學特異性的最重要抗原。此75-80kD的蛋白包含眾多的抗原決定簇，其中幾個位于在不同毒林中經(jīng)歷序列改變的區(qū)域中(毒抹特異性決定簇)，其余的位于許多HA分子共有的區(qū)域中(共同決定簇)。流感病毒幾乎每年冬天都引起大流行，曱(A)型或乙(B)型病毒的感染率在6周的時間_度內(nèi)高達40%。流感感染產(chǎn)生各種病癥，由無癥^l犬的感染至輕微的上呼吸道感染到嚴重的病毒性肺炎。典型的流感大流行S1起肺炎和下呼吸道疾病的發(fā)病率增加，證據(jù)是住院率或死亡率增加。疾病的嚴重性主要由宿主的年齡、其免疫狀況和感染部位決定。65歲和以上的老年人尤其易受攻擊，占發(fā)達國家所有流感相關(guān)死亡的80-90%?；加谢A(chǔ)性慢性疾病的個體也非常有可能經(jīng)歷這種并發(fā)癥。幼兒也可能患嚴重疾病。因此，這些群體尤其需要受保護。除了這些'風險，群體以外，衛(wèi)生當局還推薦對衛(wèi)生保健者進行預(yù)防接種。接種對控制每年的流感大流4亍起關(guān)4建作用。目前可用的流感疫苗是失活流感疫苗或減毒活流感疫苗。失活流感疫苗由三種可能形式的抗原制備物組成失活全病毒、其中純化的病毒顆粒;波溶解脂質(zhì)包膜的去污劑或其它試劑破壞的亞病毒體(所謂的"裂解疫苗，，)或純化的HA或NA(亞單位疫苗)。這些失活疫苗是肌內(nèi)(i.m.)或鼻內(nèi)(i.n.)給予的。所有種類的流行病使用的流感疫苗通常都是三價疫苗。一般來說，它們含有的抗原得自兩種曱型流感病毒抹和一種乙型流感病毒抹。據(jù)單向放射免疫擴散法(SRD)的檢測(J.M.Wood等Animprovedsingleradialimmunodiffusiontechniquefortheassayofinfluenzahaemaggiutininantigen:adaptationforpotencydeterminationofinactivatedwholevirusandsubumtvaccines.J.Biol.Stand.5(1977)237-247;J.M.Wood等，InternationalcollaborativestudyofsingleradialdiffusionandImmunoelectrophoresistechniquesfortheassayofhaemaggiutininantigenofinfluenzavirus.J.Biol.Stand.9(1981)317-330),在大多數(shù)情況下，標準0.5ml注射劑量含有每種毒株的15pg血細胞凝集素抗原組分。每個季節(jié)加入到流感疫苗中的流感病毒林由WHO協(xié)同國家衛(wèi)生管理局以及疫苗生產(chǎn)商共同確定。目前可用的流感疫苗纟皮認為在所有年齡組都是安全的(DeDonato等，1999,Vaccine,17,3094-3101)。但是，很少有證據(jù)表明當前的流感疫苗在2歲以下的小孩中有作用。而且，預(yù)防典型的已確認流感疾病的疫苗效力其々艮告比率對老年人為23-72%,這顯著低于對較年輕成年人所報告的60-90%有效率(Govaert,1994,J.Am.Med.Assoc,21,166-1665;Gross，1995,AnnIntern.Med.123,523-527)。業(yè)已表明，流感疫苗的有效性與針對病毒林的血凝反應(yīng)抑制(HI)抗體的血清滴度相關(guān)，幾個研究已發(fā)現(xiàn)較年長的成年人在流感免疫后表現(xiàn)出的HI滴度低于較年輕成年人(M腦sko,2002,Experimentalgerontology,37,427-439)。對于老年人和處于危險之中的人群，用水包油乳液形式的佐劑MF59作佐劑的亞單位流感疫苗已商品化，已表現(xiàn)出其誘導(dǎo)高于無佐劑亞單位疫苗所獲抗體滴度的抗體滴度的能力(DeDonato等，1999,Vaccine,17,3094-3101)。但是，在后來的出版物中，相同疫苗沒有表現(xiàn)出其比無佐劑裂解疫苗改善的模式(Puig-Barbera等，2004,Vaccme23,283-289)。作為背景，在大流4亍之間的時間段內(nèi)，與之前大流行的流感病毒相關(guān)的流感病毒傳播。病毒以和生命早期感染不同的免疫性水平在人之間傳播。在通常2-3年的時間段內(nèi)，這種傳播促進對已改變得足以在一般群體中再引起流行病的新毒抹的選擇；此過程稱為'抗原漂移，。'漂移變體，在任一年中在不同的社區(qū)、地區(qū)、國家或洲都具有不同影響，盡管在幾年內(nèi)其總體影響經(jīng)常是相似的。換句話說，當出現(xiàn)人群對其沒有免疫性的新流感病毒時，發(fā)生流感大流行。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的發(fā)病率增加，證據(jù)是住院率或死亡率增加。老年人或患有基礎(chǔ)性慢性疾病的人最有可能經(jīng)歷此并發(fā)癥，而幼兒也可能患嚴8重疾病。新流感病毒以不可預(yù)見的間隔出現(xiàn)，其具有與之前季節(jié)流行的毒柹、完全不同亞型的關(guān)鍵表面抗原血細胞凝集素。此時，產(chǎn)生的抗原可以先前于人中循環(huán)的毒抹的對應(yīng)蛋白的20%至50%變化。這可導(dǎo)致病毒逃逸'群體免疫'，并形成大流行。此現(xiàn)象叫做'抗原轉(zhuǎn)變，。一般認為，至少在過去已發(fā)生了大流行，當時不同物種的流感病毒例如禽或豬流感病毒已穿過種間屏障。如果這種病毒具有人與人之間傳播的潛力，它們可在數(shù)月至一年內(nèi)全球擴散，導(dǎo)致大流行。例如，在1957年(亞洲流感大流行)，H2N2亞型病毒取代了H1N1病毒，H1N1病毒至少從首先分離到該病毒的1918年開始就在人群中循環(huán)。H2HA和N2NA在1957年至1968年之間經(jīng)歷了抗原漂移，直至HA在1968年(香港流感大流4t)被出現(xiàn)的H3N2流感病毒亞型替代，此后N2NA連同H3HA繼續(xù)漂移(Nakajima等,1991,Epidemiol.Infect.106,383-395)。給予流感病毒抹引起大流行爆發(fā)潛力的流感病毒抹特4正是與當前循環(huán)株中的血細胞凝集素相比其包含新血細胞凝集素，其可伴有或不伴有神經(jīng)氨酸酶亞型的改變；其能夠在人群中水平傳播；其對人是致病的。新血細胞凝集素可為長時間段內(nèi)(可能數(shù)十年)在人群中還不明顯的血細胞凝集素，例如H2?；蛘咂淇蔀橹斑€沒有在人群中循環(huán)的血細胞凝集素，例如存在于鳥中的H5、H9、H7或H6。在^f壬一種情況下，大部分或至少大比例的或乃至整個群體以前都沒有遇到該抗原，在免疫學上對該抗原是原初態(tài)的。在未接觸抗原的人群中，已經(jīng)對單價候選疫苗(含有大流行菌抹例如非循環(huán)H2N2或H9N2菌抹)進行了一些臨床研究，用于評價安全和免疫原性。在有或者沒有明礬佐劑的條件下，這些研究已經(jīng)探究了各種HA濃度(每劑量1.9、3.8、3.8、7.5或15微克HA)的分裂或全病毒制劑。在'香港大流行期間'，當H2N2亞型的流感病毒被H3N2菌抹替代時，其乂人1957年流行到1968年。當今，1968之后出生的個體對于H2N2菌抹是免疫原初態(tài)的。已經(jīng)證明這些候選疫苗是免疫原性的并且具有較好的耐受性。結(jié)果報道在下列中Hehme,N等人2002,Med.Microbiol.Immunol.191，203-208;inHehmeN.等人2004,VirusResearch103,163-171;兩個研究對于H5N1進行了報道(BressonJL等人TheLancet.2006:367(9523):1657-1664;TreanorJJ等人NEnglJMed.2006;354:1343-1351)。其它研究已經(jīng)報道了MF59作為佐劑的流感疫苗的結(jié)果。一個研究報道說，用MF59作為佐劑的兩個劑量的H5N3流感疫苗，在主要人群中可促進對于流感H5N1的免疫性(Stephenson等人，Vaccine2003,21,1687-1693),另一個研究已經(jīng)4艮道了對于所獲得的H5N1病毒的交叉反應(yīng)的抗體應(yīng)答(三劑量的MF59-佐劑的流感H5N3疫苗之后)(Stephenson等人，J.Infect.Diseases2005,191,1210-1215)。處于流感大流行的危險情況下的人員可能不同于季節(jié)性流感的并發(fā)癥所定義的危險群體。按照WHO，由禽流行性感冒菌抹H5N1所引起的50%的人類病例發(fā)生在低于20歲的人群中，90%出現(xiàn)在年齡<40歲的人群之中。(WHO,每周疫情管理，2006年6月30曰)。在大流4亍期間，抗病毒藥物不足以滿足要求，并且處于流感危險之中的個體數(shù)目大于流行病周期中間的數(shù)目，因此，開發(fā)具有大量制備潛力和有效分配與給予潛力的合適疫苗是必要的。為此，針對大流行，需要開發(fā)單價疫苗來代替三價疫苗，以便減少疫苗用量，為了在免疫原初態(tài)接受者中實現(xiàn)保護性抗體水平，基本上需要兩個劑量的疫苗(WoodJM等人MedMircobiolImmunol.2002;191:197-201.WoodJM等人PhilosTransRSocLondBBiolSci,2001;356:1953-1960)。這些問題可以用佐劑解決，其目標是提高疫苗的免疫原性，以便能夠降低抗原含量(抗原減量)，由此提高可利用疫苗劑量的數(shù)目。使用佐劑也可以解決抗原在原初態(tài)人群中的潛在弱免疫原性。已經(jīng)證明上述的例子可使用鋁鹽作為佐劑的完全失活的H2N2或H9N2病毒(N.Hehme等人VimsResearch2004,103,163-171)。對于普通的亞病毒體H5N1疫苗或氫氧化鋁佐劑的分裂病毒H5N1疫苗，已經(jīng)進行了臨床試驗。這些試驗的結(jié)果表明，普通的和帶有佐劑的H5N1病毒疫苗對于高達卯微克的抗原劑量是安全的(只以普通亞病毒粒子疫苗的方式試驗)(BressonJL等人TheLancet.2006:367(9523):1657誦1664;TreanorJJ等人NEnglJMed.2006;354:1343-1351)。因此，還需要增加了免疫原性的新疫苗，尤其是對抗弱的或非免疫原性的大流行菌抹、或針對免疫低下的個體例如老年人。也需要具有交互保護潛力的新疫苗，在大流行之前或發(fā)生大流行時，其可以用作引發(fā)免疫原初態(tài)人群對抗大流行菌抹的大流行前的或貯存疫苗。帶有有效佐10劑的疫苗抗原制劑是提高對于亞病毒粒子抗原的免疫應(yīng)答的合適方法。在此，提供了新的佐劑制劑，其可以使抗原減量制劑對于所有年齡群體提供充分的保護(使血清陰性的受試者進行血清轉(zhuǎn)化至被認為是保護性的ffl滴度，1:40或滴度增加四倍)。本發(fā)明陳述在本發(fā)明的第一個方面，提供了一種流感免疫原性組合物，尤其是疫苗，其包含與佐劑組合的低量流感病毒抗原或其抗原性制品，所述流感病毒或其抗原性制品得自流感病毒菌林，流感病毒菌抹與大流行爆發(fā)相關(guān)或具有與大流行爆發(fā)相關(guān)的潛力，其中低抗原數(shù)量每劑量不超過15嗎的血細胞凝集素(HA),其中所述佐劑是水包油乳液，其包括可代謝油、甾醇或生育酚例如a生育酚、和乳化劑。合適的疫苗組合物是單價組合物。貫穿該文件，大流行菌抹是指與流感疾病的突發(fā)有關(guān)或?qū)ο嚓P(guān)的流感疾病突發(fā)敏感的流感菌材、形式，例如大流-f亍性流感A菌抹。合適的大流行菌林是但不局限于H5N1,H9N2,H7N7，H2N2，H7N1和H1N1。在人類中，其它合適的大流行菌抹是H7N3(在加拿大報道了2個病例)、H10N"在埃及報道了2個病例)和H5N2(在日本報道了1個病1在另一個方面，本發(fā)明提供了制備用于大流行情況或大流行前的情況的流感免疫原性組合物的方法，尤其是制備疫苗的方法，該方法包括將流感病毒抗原或其抗原性制品與如上文定義的水包油乳液佐劑混合，提供每劑量包含不超過15jag流感血細胞凝集素抗原的疫苗單元，所述流感病毒抗原或其抗原性制品得自單一流感病毒菌抹，其與大流4亍爆發(fā)相關(guān)或具有與大流行爆發(fā)相關(guān)的潛力。流感病毒可以是卵(egg-derived)衍生的、植物衍生的、細胞培養(yǎng)物衍生的或可以是重組產(chǎn)生的。合適的是，流感病毒抗原是卵衍生的或細胞培養(yǎng)物衍生的。在第三個方面，本發(fā)明提供了一種本文定義的用于藥物的免疫原性組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了(a)本文所定義的低量流感病毒抗原或其抗原性制品和(b)水包油乳液佐劑在制備免疫原性組合物或試劑盒中的用途，所述免疫原性組合物用于在人中誘導(dǎo)對抗所述病毒抗原或抗原性組合物的以下至少一種i)改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答，ii)改善的B-細月包記憶應(yīng)答，(iii)改善的體液應(yīng)答，所述流感病毒抗原或其抗原性制品得自于單一流感菌抹，流感菌株與大流行相關(guān)或具有與大流行有關(guān)的潛力。特別是，在免疫低下的個體或人群例如高風險的成年人或老年人中引起所述免疫應(yīng)答。合適的免疫原性組合物如本文所定義。本發(fā)明還提供了流感病毒或其抗原性制品和水包油乳液佐劑在制備本文定義的免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于對老年人進行抗流感接種。在一個具體實施方案中，相比于用無佐劑抗原或抗原性組合物獲得的應(yīng)答，所述免疫原性組合物能夠誘導(dǎo)改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答和改善的B-記憶細胞應(yīng)答。在另一個具體實施方案中，相比于用無佐劑抗原或抗原性組合物獲得的應(yīng)答，所述免疫原性組合物能夠誘導(dǎo)改善的CD4T-細l包免疫應(yīng)答和改善的體液應(yīng)答。優(yōu)選，所述體液免疫應(yīng)答或i呆護滿足至少一個、合適地兩個、典型地所有三個用于流感疫苗效果的EU或FDA管理標準。合適地，所述免疫應(yīng)答或保護是在一個、合適地兩個劑量疫苗之后獲得的。具體地說，在一個劑量的佐劑疫苗之后，所述免疫應(yīng)答或保護滿足至少一個、合適地兩個、或所有三個用于流感疫苗效果的EU或FDA管理標準。具體地說，在4又僅一個劑量的疫苗之后，滿足至少一個、合適地兩個FDA或EU標準。下面進一步詳述3姿照本發(fā)明組合物的效果標準(參見表1和下面的"效果標準")。合適地，胃腸外給予所述組合物，優(yōu)選通過"/L注或皮下途徑。在進一步的實施方案中，提供了低量流感病毒或其抗原性制品在制備免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于再接種先前用單價流感免疫原性組合物接種的人，所述單價流感免疫原性組合物包含與本文定義的水包油乳液佐劑組合的流感抗原或其抗原性制品，所述流感抗原或其抗原性制品得自單一流感病毒菌林，流感病毒菌抹與大流行爆發(fā)相關(guān)或具有與大流行爆發(fā)相關(guān)的潛力。在一個具體實施方案中，用于再接種的組合物可無佐劑，或者可含有佐劑，具體是水包油乳液佐劑。在另一個具體實施方案中，用于再接種的免疫原性組合物包含流感病毒或其抗原性制品，它們與用于第一次接種的流感病毒或其病毒抗原性制品共有共同的CD4T-細月包表位。用于再才妄種的免疫原性組合物可以包含典型數(shù)量(即大約15pgHA)的所述變12體大流行菌林。合適地，再接種在已于前一季進行抗流感接種的個體中進行。合適地，用包含與第一次接種所用的相同亞型(例如H5N1越南)的流感菌抹(例如H5N1越南)的疫苗進行再接種。在一個具體實施方案中，用同樣亞型的漂移菌抹例如H5N1印度尼西亞進行再接種。在另一個實施方案中，用于再接種的所述流感菌抹是轉(zhuǎn)變(shift)菌抹，即其不同于第一次接種所用的菌抹，例如它具有不同的HA或NA亞型，例如H5N2(與H5N1相同的HA亞型，但不同的NA亞型)或H7N1(與H5N1不同的HA亞型，^旦相同的NA亞型)。合適地，在大流行開始時進行第一次接種，隨后進行再接種?；蛘?，作為引發(fā)策略，第一次接種是大流行前策略的一部分，并且在宣告大流行開始之前進行，由此，使免疫系統(tǒng)被引發(fā)，隨后進行再接種。通常，再接種在第一次接種后至少4個月進行，優(yōu)選在第一次接種后6或8-14個月進行，更優(yōu)選在第一次接種后約10-12個月后或更長時間進行。合適地，一年以后或比一年以后更長的時間進行再接種，能夠促進抗體和/或細胞免疫應(yīng)答。這是特別重要的，因為進一步的感染高潮可能在第一大流行突發(fā)之后幾個月發(fā)生。按照需要，再接種可以進行不止一次。優(yōu)選地，所述水包油乳液包含可代j射(metabolisable)油、甾醇或生育酚例如oc生育酚和乳化劑。在另一個具體實施方案中，所述水包油乳液佐劑包含至少一種可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%,并具有油滴，油滴的至少70%(以強度計)具有小于1(im的直徑。合適地，所述生育酚(例如a生育盼)是以所述免疫原性組合物的總體積的1.0%至20%的量存在的，優(yōu)選1.0%至5%的量。在本發(fā)明的另一個方面，提供了得自于第一種大流行性流感菌抹的抗原或抗原性制品在制備本文定義的免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于抗變體流感菌株引起的流感感染的保護作用。在具體方面，本發(fā)明提供了接種例如高風險成人或老年人的免疫低下人類個體或群體的方法，所述方法包括給予所述個體或人群流感免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含與本文所定義的水包油型乳狀液佐劑組合的、得自于單一大流行性流感病毒抹的^氐數(shù)量流感抗原或其抗原性制品。在再另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種再接種先前用單價流感13免疫原性組合物接種的人的方法，所述單價流感免疫原性組合物包含與水包油乳液佐劑組合的流感抗原或其抗原性制品，所述流感抗原或其抗原性制品得自單一大流行性流感病毒抹，所述方法包括給予所述人有佐劑或無佐劑的、含流感病毒的免疫原性組合物。在另一個實施方案中，提供了一種方法接種人類群體或個體對抗一種大流行性流感病毒抹，接著再接種所述人或群體對抗變體流感病毒抹，所述方法包括給予所述人(i)第一組合物，其包含得自于第一種大流4亍性流感病毒纟朱的流感病毒或其抗原性制品和水包油乳液佐劑，和(ii)第二免疫原性組合物，其包含所述第一種流感病毒菌抹的流感病毒菌抹變體。在一個具體實施方案中，所述變異菌林與大流行爆發(fā)相關(guān)或具有與大流行爆發(fā)相關(guān)的潛力。在另一個具體實施方案中，所述變異菌抹是多價組合物的一部分，除了所述大流行性流感病毒變體之外，其包含至少一種循環(huán)(季節(jié)性)流感病毒菌抹。優(yōu)選，所述大流行性流感病毒材、分別是另外包含一種、兩或三種季節(jié)性菌抹的二價、或三價或四價組合物的一部分。貫穿該文件，可互換使用低數(shù)量大流行性流感病毒抗原在制備用于物來治療人的方法。在下面優(yōu)選實施方案的詳細說明中，進一步描述了本發(fā)明的其它方面和益處。圖1:依據(jù)PCS檢測的SB62水包油乳液的油滴粒度分布。圖1A顯示了用MalvernZetasizer3000HS片全測的SB62批號1023的粒度測量結(jié)果A=稀釋度1/10000(Rec22至Rec24)(用Contin和適合的光學對莫型1.5/0.01分析)；B=稀釋度1/20000(Rec28至Rec30)(用Contin和適合的光學模型1.5/0.01分析)。圖1B顯示了依據(jù)強度的記錄22(上部)和記錄23(下部)的示意圖。圖2:雪貂實驗。圖2A:在用不同劑量H5N1A/Vietnam免疫的雪貂中的血球凝集抑制試馬全(GMT)。圖2B:死亡或安樂死的當天雪貂肺組織的平均H5N1PCR數(shù)據(jù)(左曲線)和平均病毒滴定數(shù)據(jù)(右曲線)(PCR數(shù)據(jù)可以表示為對照稀釋單元(CDU),其是用標準曲線測定的，標準曲線是由連續(xù)稀釋的病毒原料產(chǎn)生的，用和試驗樣品同樣的方法，即每個稀釋物經(jīng)受核苷酸提取和TaqmanPCR擴增。病毒滴定數(shù)據(jù)可以表示為TCID5o/g組織)。圖3:在用不同劑量H5N1A/越南免疫的雪貂中的抗A/印度尼西亞中和抗體應(yīng)答。圖4:流感單價原液的制備綜述。圖5:最終抗原原液的制劑流程圖。圖6:采用劑量范圍的H5N1分裂病毒抗原(帶有或不帶有佐劑AS03)的人臨床試驗。在第0、21和42天的時間點的抗HA抗體的GMT's(具有95%CI)。圖7:采用劑量范圍的H5N1分裂病毒抗原(帶有或不帶有佐劑AS03)的人臨床試驗。接種后21天和42天的抗HA抗體的血清轉(zhuǎn)化率(具有95%CI)。圖8:采用劑量范圍的H5N1分裂病毒抗原(帶有或不帶有佐劑AS03)的人臨床試驗。在每個時間點(O天、21天和42天)的抗HA抗體的血清保護率(具有95%CI)。圖9:采用劑量范圍的H5N1分裂病毒抗原(帶有或不帶有佐劑AS03)的人臨床試驗。接種后21天和42天的抗HA抗體的血清轉(zhuǎn)化因子(具有95%CI)。圖10:對于H5N1Vietnam菌林的中和滴度(GMT:圖10A;血清轉(zhuǎn)化率圖IOB)。HN4=無佐劑的3.8pgHA;HN8=無佐劑的7.5figHA;HN4AD=AS03佐劑的3.8嗎HA;HN8AD=AS03佐劑的7.5pgHA.圖11:對于H5N1Vietnam菌抹的CD4特異性應(yīng)答。HN4=無佐劑的3.8pgHA;HN8=無佐劑的7.5嗎HA;HN4AD=AS03佐劑的3.8figHA;HN8AD=AS03佐劑的7.5pgHA.i羊細i兌明本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，相比于用無佐劑病毒或其抗原性制品獲得的應(yīng)答，含低數(shù)量流感病毒或其抗原性制品連同水包油乳液佐劑的流感制劑能夠在人或人群體中改善抗所述抗原或抗原性組合物的體液免疫應(yīng)答、和/或CD4T-細胞免疫應(yīng)答和/或B細胞記憶應(yīng)答，其中流感病毒或其抗原性制品與大流行相關(guān)或?qū)Υ罅餍忻舾?，所述水包油乳液佐劑含可Aj射油、甾醇或生育酚例如OC生育酚和乳化劑。它們可以防止同源流感菌抹所引起的發(fā)病/致死。用本文定義的水包油乳液佐劑佐劑化的制劑有利地用于誘導(dǎo)抗流感的CD4-T細胞應(yīng)答，該應(yīng)答能夠檢測由MHCII類分子提呈的流感表位。用本文定義的水包油乳液佐劑進行佐或?qū)勾蠓秶嚓P(guān)菌林的可檢測的免疫性(體液和/或細胞)。佐劑化的制劑可有效地耙向體液和/或細胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)，以便提高針對同源和漂移流感菌抹的響應(yīng)性(當接種和感染時)。它們也有利地用于誘導(dǎo)交叉-引發(fā)策略，即誘導(dǎo)"已引發(fā)的，，免疫記憶，便于在用變異菌抹進行再接種(一個劑量)時的應(yīng)答。按照本發(fā)明的佐劑化的大流行性流感組合物具有幾個優(yōu)勢1)改善的免疫原性它們將對較少的免疫原性流感菌抹的弱免疫應(yīng)答提高至高于非佐劑化制劑所獲得的免疫應(yīng)答的水平；2)使用佐劑可以在原初態(tài)人群中克服抗原的潛在的弱免疫原性；3)它們可以在特定人群例如老年人(典型地超過60歲)中引起改善的免疫原性，達到在18至60歲的較年輕的人中所看到的水平(抗體和/或T細力包應(yīng)答)；4)它們可以引起改善的交互保護特性改善的交叉反應(yīng)性、對變異的(漂移的)流感菌抹的交互保護提供了交叉引發(fā)策略的建立，其中，它們可以用作大流行前的疫苗，進一步允許，為了增強對(循環(huán))大流行菌抹，僅僅需要單劑量的大流行疫苗；5)通過用減低的抗原劑量達到任何或所有這些進一步的益處，它們可以在緊急狀況下或有準備的大流行情況下(在大流行情況下的抗原減量)確保增加的能力。從下面說明書和實施例部分可明顯地看出其它益處。根據(jù)滿足流感相關(guān)性保護作用的人受試者數(shù)目的評價，本發(fā)明使用的組合物已能夠在再免疫后提供更好的抗流感的血清保護作用。而且，相比于無佐劑組合物，本發(fā)明使用的組合物還能夠誘導(dǎo)受試驗人的第一次接種后的高體液應(yīng)答或B細I包記憶應(yīng)答，和再接種后的高應(yīng)答。組合物，在更多個體中不但能夠誘導(dǎo)而且能夠保持抗疫苗中^在的流感菌抹的抗體保護性水平。案中，要求保護的組合物能夠確保針對流感相關(guān)疾病的持續(xù)性免疫應(yīng)答。具體地說，所述持續(xù)性是指HI抗體免疫應(yīng)答能夠在接種后至少3個月后、優(yōu)選至少6個月后滿足管理標準。具體地說，要求保護的組合物能夠在至少3個月后，在>50%的個體中、合適地在>60%的個體中、在〉70%的個體中、適宜地在>80%的個體中或適宜地在>90%的個體中誘導(dǎo)針對疫苗中存在的大流行性流感菌株的抗體保護性水平(用保護率(參見表l)測定)。在一個具體方面，在接種后至少6個月獲得針對疫苗組合物中流感菌林的〉90%的抗體保護性水平。按照本發(fā)明的進一步方面，與所提供的疫苗流感菌抹的EU要求相比，要求保護的組合物能夠誘導(dǎo)血清保護和血清陽轉(zhuǎn)至更高程度。下面將其進一步詳述(參見表1和下面的"效果標準，，)。流感病毒纟朱和抗原在一個實施方案中，按照本發(fā)明使用的流感病毒或其抗原性制品可以是裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制品。在一個替代性實施方案中，流感病毒制品可包含另一類型的失活流感抗原，例如失活全病毒或重組體和/或純化的HA和NA(亞單位疫苗)，或流感病毒顆粒。在更進一步實施方案中，流感病毒可為減毒活流感病毒制品。適宜地，按照本發(fā)明使用的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制品為失活病毒制品，其中病毒顆粒用去污劑或其它試劑破壞以溶解脂質(zhì)包膜。適宜地，裂解病毒或其裂解病毒抗原性制品如下制備用溶解濃度的有機溶劑或去污劑將感染性或失活的全流感病毒片段化，隨后去除全部或大部分溶解劑和某些或大部分病毒脂質(zhì)物質(zhì)。所述其裂解病毒抗原性制品是指相比于裂解病毒可能已經(jīng)受了一定程度的純化而保留了裂解病毒組分的大部分抗原特性的裂解病毒制品。例如，當在卵中產(chǎn)生時，裂解病毒可從卵污染蛋白中去除，或者在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生時，裂解病毒可從宿主細胞雜質(zhì)中去除。裂解病毒抗原性制品可包含一種以上病毒株的裂解病毒抗原性組分。含裂解病毒的疫苗(叫做'流感裂解疫苗，)或含裂解病毒抗原性制品的疫苗一般包含殘余的基質(zhì)蛋白和核蛋白，有時包含脂質(zhì)以及膜包膜蛋白。這種裂解病毒疫苗通常包含大部分或全部病毒結(jié)構(gòu)蛋白，但不一定和它們在全病毒中存在的比例相同?；蛘撸鞲胁《究蔀槿《疽呙缧问?。對于大流行情況來說，其可表現(xiàn)出超越裂解病毒疫苗的優(yōu)勢，因為其避免了有關(guān)針對新流感病毒株17是否可成功地產(chǎn)生裂解病毒疫苗的不確定性。對于某些毒抹來說，用于產(chǎn)生裂解病毒的常規(guī)去污劑可損傷病毒，并使其無用。盡管經(jīng)常有可能使用不同的去污劑和/或開發(fā)不同的裂解疫苗產(chǎn)生方法，但這會耗時，在大流行情況下可能不可用。全病毒法除了較大程度的確定性以外，還有比裂解病毒大的疫苗生產(chǎn)能力，因為在制備適宜的裂解疫苗時所必需的額外純化步驟中有相當大量的抗原損失。在另一個實施方案中，流感病毒制品為純化的亞單位流感疫苗形式。亞單位流感疫苗一般包含兩種主要的包膜蛋白HA和NA,可能具有超越全病毒體疫苗的額外優(yōu)勢，因為它們一般無反應(yīng)原性，尤其是在年輕的接種者中。亞單位疫苗可重組產(chǎn)生，或者可由石皮裂的病毒顆粒純化。在另一個實施方案中，流感病毒制品為病毒體形式。病毒體是球形的單層嚢泡，其保留了真實構(gòu)象中的功能性病毒包膜糖蛋白HA和NA,插入病毒體的磷脂雙層膜中。所述流感病毒或其抗原性制品可為卵源的或組織培養(yǎng)源的。它們也可以在其它系統(tǒng)中產(chǎn)生，例如在昆蟲細胞、植物、酵母菌或細菌中產(chǎn)生，或重組產(chǎn)生。例如，按照本發(fā)明的流感病毒抗原或其抗原性制品可來源于常規(guī)的含胚卵法，該方法在卯中培養(yǎng)流感病毒，并純化收集的尿嚢液。卵可在短時間內(nèi)大量累積?；蛘?，它們可來源于任一種^f吏用組織培養(yǎng)物的新生產(chǎn)方法，以培養(yǎng)病毒或表達重組流感病毒表面抗原。適于培養(yǎng)病毒的細胞基質(zhì)包括例如狗腎細胞，例如MDCK或由MDCK克隆的細胞、MDCK樣細胞，猴腎細胞，例如AGMK細胞，包括Vero細胞，合適的豬細胞系，或適于生產(chǎn)疫苗用途的流感病毒的任何其它哺乳動物細胞類型。合適的細胞基質(zhì)還包括人細胞，例如MRC-5或Per-C6細胞。合適的細胞基質(zhì)不限于細力包系；例如原初細胞，如小雞胚成纖維細胞，還包括禽細胞系。流感病毒抗原或其抗原性制品可通過眾多工業(yè)用方法中的任一種生產(chǎn)，例如在專利號DD300833和DD211444(通過引用結(jié)合到本文中)中描述的裂解流感病毒法。裂解流感病毒傳統(tǒng)上^f吏用溶劑/去污劑處理產(chǎn)生，例如磷酸三正丁酯，或者二乙醚組合Tween頂(稱作"Tween-醚"裂解)，該方法仍在某些生產(chǎn)廠家中使用。目前使用的其它裂解劑包括去污劑或蛋白水解酶或膽汁鹽，例如在專利號DD155875(通過引18用結(jié)合到本文中)中描述的脫氧膽酸鈉?？捎米髁呀鈩┑娜ノ蹌┌栯x子去污劑，例如溴化鯨蠟基三甲銨(CTAB);其它離子去污劑，例如十二烷基硫酸鹽、?；敲撗跄懰猁}；或非離子去污劑，如上述的一種，包括TritonX-100(例如在Lma等，2000,Biologicals28，95-103描述的方法中)和TritonN-101;或者任何兩種或多種去污劑的組合。裂解疫苗的制備方法可包括眾多不同的過濾和/或其它分離步驟，如各種組合的超離心、超濾、區(qū)帶離心和層析(例如離子交換)步驟，以及任選的例如采用熱、甲醛或(3-丙酸內(nèi)酯或紫外線的失活步驟，其可在裂解前或后進行。裂解過程可以分批、連續(xù)或半連續(xù)過程進行。用于裂解免疫原性組合物的優(yōu)選裂解和純化方法描述于WO02/097072中。按照本發(fā)明的合適裂解流感疫苗抗原制品包含生產(chǎn)過程剩余的殘余量的Tween80和/或TritonX-100,雖然這些物質(zhì)可在裂解抗原制備后加入或調(diào)整其濃度。優(yōu)選地，Tween80和TritonX-100都存在。疫苗劑量中這些非離子型表面活性劑的終濃度的優(yōu)選范圍為Tween80:0.01-1%,優(yōu)選大約0.1%(v/v)TritonX畫100:0.001-0.1(%w/v),優(yōu)選為0.005-0.02%(w/v)。在一個具體實施方案中，Tween80的終濃度在0.045%-0.09%(w/v)的范圍內(nèi)。在另一個具體實施方案中，抗原作為2倍濃縮的混合物提供，其具有的Tween80濃度在0.045%-0.2%(w/v>々范圍內(nèi)，在最終配制時必須用佐劑(或在對照制劑中用緩沖液)稀釋2倍。在另一個具體實施方案中，TritonX-100的終濃度在0.005%-0.017%(")的范圍內(nèi)。在另一個具體實施方案中，抗原作為2倍濃縮的混合物提供，其具有的TritonX-100濃度在0.005%-0.034%(w/v)的范圍內(nèi)，在最終配制時必須用佐劑(或在對照制劑中用緩沖液)稀釋2倍。優(yōu)選地，流感病毒制品在低水平防腐劑、尤其是硫柳汞存在下制備，或優(yōu)選地在沒有硫柳汞的情況下制備。優(yōu)選地，獲得的流感制品在沒有有機汞防腐劑的情況下是穩(wěn)定的，具體地說，所述制品不含殘余硫柳汞。具體地說，流感病毒制品包含在沒有石克柳汞的情況下或在^氐水平石克柳汞(一般來說為5pg/ml或以下)的情況下穩(wěn)定的血細胞凝集素抗原。具體地說，乙型流感毒林的穩(wěn)定利用cx生育酚的衍生物如cx生育酚琥珀酸酯(也稱為維生素E琥珀酸酯，即VES)來實施。這種制品及其制備方法公開于WO02/097072中。或者，尤其是多劑量容器，為了降低污染危險，應(yīng)該存在硫柳汞或任何其它合適的防腐劑。這尤其與大流行疫苗相關(guān)，這種大流行疫苗是為了在最短的合適時間內(nèi)接種盡可能多的人而設(shè)計的。除了大流行性流感菌抹之外，用于再接種的合適組合物還包含三種失活裂解病毒體抗原(由WHO建議的合適流感季病毒的菌林制備)在一個實施方案中，流感病毒或其抗原性制品和水包油型乳狀液佐劑包含在相同器皿中。這被稱為'單瓶法，。優(yōu)選地，所述瓶為預(yù)填充注射器。在一個替代實施方案中，流感病毒或其抗原性制品和水包油乳液佐劑包含在單獨的容器或瓶或單元中，并在給予個體之前不久或給予個體時混合。這被稱為'雙瓶法，。作為實例，當疫苗為0.5ml總注入劑量體積的2組分疫苗時，濃縮抗原(例如濃縮失活裂解病毒體抗原)可以存在于1個瓶(330(il)(抗原容器，例如管瓶)中，預(yù)填充注射器含佐劑(400(il)(佐劑容器，例如針筒)。典型地，大流行疫苗是0.5ml注射劑量，并且多次劑量瓶包含1:1管瓶管瓶混合物，而后第一次給個體注入。或者，大流行疫苗是l.Oml管瓶針筒注射劑量。在注射時，使用含佐劑的注射器將含濃縮的失活裂解病毒體抗原的瓶中的內(nèi)容物由瓶中取出，接著輕微混合注射器。在注射前，使用的針用肌內(nèi)針替換，體積調(diào)整到530ial。一劑重配的佐劑化流感疫苗候選物相當于530pl。優(yōu)選，佐劑化大流行性流感候選疫苗是由0.5ml濃縮失活裂解病毒體抗原(存在于I型玻璃管中)和包含0.5ml佐劑的預(yù)先填充的I型玻璃注射器組成的2組份疫苗?；蛘撸呙缡谴嬖谟?個管瓶(一個用于抗原，一個用于佐劑，每個IO劑量)中的2組分疫苗，在給予第一個患者之前進行混合，隨后在4。C貯存短時期(例如至多一周)，用于隨后的給予。在注射時，將包含佐劑的預(yù)裝填針筒的內(nèi)含物注入到管瓶中，該管瓶包含濃縮三價體失活裂解病毒抗原?；旌现?，將內(nèi)含物排出到針筒中，用肌注針替代上述針。一劑重配的佐劑化流感病毒候選疫苗相當于0.5ml。0.5ml的每個疫苗劑量包含1.9iug、3雄g、7.5嗎、15|ug或30fig血細胞凝集素(HA)或任何合適數(shù)量的HA,其是根據(jù)疫苗組合物滿足本文所定義的效果標準來確定的。1ml的疫苗劑量(0.5ml佐劑加上0.5ml抗原制劑)也是合適的。根據(jù)本發(fā)明，在本文定義的單價免疫原性組合物中的流感病毒菌株20與大流行爆發(fā)相關(guān)或具有與大流行爆發(fā)相關(guān)的潛力。這種毒抹在下文還可稱為'大流行林'。具體地說，當疫苗為用于再接種的多價疫苗如二價或三價或四價疫苗時，至少一種毒林與大流行爆發(fā)相關(guān)或具有與大流行爆發(fā)相關(guān)的潛力。適宜的毒株是、但不限于H5N1、H9N2、H7N7、H2N2、H7N1和H1N1。在人類中，其它大流行菌株H7N3(在加拿大報道了2個病例)、H10N7(在埃及報道了2個病例)和H5N2(在日本報道了1個病例)。用于再接種的所述流感病毒或其抗原性制品適宜地為多<介的，例如二價或三價或四價，或包含甚至更多流感病毒菌抹。優(yōu)選地，用于再接種的流感病毒或其抗原性制品為三價的或四價的，其具有得自三種不同流感抹的抗原，至少一種菌抹與大流行爆發(fā)相關(guān)或具有與大流行爆發(fā)相關(guān)的潛力。優(yōu)選，該再接種組合物包含大流行菌抹(其可以是存在于用于第一次接種的組合物中的大流行菌抹的變體)和三種其它的菌抹，典型地是傳統(tǒng)流行的菌抹?；蛘?，合適的大流行前疫苗策略需要用不同的潛在大流行菌抹來定期(例如每1-2年)免疫，隨著時間的推移，可以保持和擴大對這些病毒的應(yīng)答的目標。例如，在一個實施方案中，在一年中用要求保護的佐劑化單價疫苗(包含一種大流行菌抹例如H5N1)進行第一次接種，而后在下一個時點(例如六個月、一年或兩年之后)接種包含不同大流行性流感菌株例如H9N2的佐劑化組合物，然后用包含另一種大流行性流感菌抹例如H7N7的佐劑化組合物接種，等等。由于不可能預(yù)計a)潛在大流行的時間和b)具體大流行菌抹，在適當時候，依賴要求保護的佐劑化組合物的這種策略將增加保護性免疫應(yīng)答的最大幅度和寬度的保險性。在這些策略中，優(yōu)選本文所定義的佐劑。引起大流感疾病流行或與大流4亍性流感菌材、相關(guān)的流感疾病爆發(fā)潛在性的流感病毒抹的特征是與當前循環(huán)菌抹中的血細胞凝集素相比，其包含新血細胞凝集素，因此幾乎所有的人是免疫原初態(tài)的；其能夠在人群中水平傳播；其對人是致病的。新血細胞凝集素可為長時間段內(nèi)(可能數(shù)十年)在人群中還不明顯的血細胞凝集素，例如H2。或者其可為之前還沒有在人群中循環(huán)的血細月包凝集素，例如存在于鳥中的H5、H9、H7或H6。在任一種情況下，大部分或至少大比例的或乃至整個群體以前都沒有遇到該抗原，在免疫學上對該抗原是原初態(tài)的。目前，作21為一種WHO確定的可在人類中潛在地引起大流行的甲型流感病毒，是高度致病的H5N1禽流感病毒。因此，按照本發(fā)明的大流行疫苗優(yōu)選包含H5N1病毒。一般來說，在大流行環(huán)境下，某些群體被流感感染的風險增加。老年人、慢性疾病患者和小孩尤其易感，但許多年輕人和表面上健康的人也有風險。對于H2流感，1968年后出生的部分群體承受的風險增加。對這些群體重要的是盡快地和以簡單的方式有效地進行保護。承受增加的風險的另一個人群是旅行者。今天，人們比以往任何時候都更常旅行，到達出現(xiàn)最多新病毒的地區(qū)；中國和東南亞在近些年已成為受歡迎的旅行目的地。傳播模式的這種改變能使新病毒在約數(shù)周內(nèi)而不是數(shù)月或數(shù)年內(nèi)到達全球。因此，對于這些人群來說，在大流行情況下或潛在大流行的情況下特別需要接種保護來防止流感。適宜的大流行毒抹是、但不限于H5N1、H9N2、H7N7、H7N1、H2N2和H1N1。在人類中，其它的大流行菌抹H7N3(在加拿大報道了2個病例)、H10N7(在埃及報道了2個病例)和H5N2(在日本寺艮道了l個病例)。水包油乳液佐劑本發(fā)明的佐劑組合物包含水包油乳液佐劑，優(yōu)選，所述乳液包含可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%,并具有油滴，該油滴的至少70%(以強度計)具有低于1pm的直徑。為了使任意水包油組合物適于給予人，乳液系統(tǒng)的油相必須包含可代謝油。術(shù)語可代謝油的含義在本領(lǐng)域眾所周知?？纱x可定義為'能夠通過代謝神皮轉(zhuǎn)化，(Dorland，sIllustratedMedicalDictionary,W.B.SandersCompany,25thedition(1974))。所述油可為任意才直物油、魚油、動物油或合成油，它們對接受者是無毒的，能夠通過代謝被轉(zhuǎn)化。堅果、種子和谷物是常用的植物油來源。合成油也是本發(fā)明的一部分，可包括商品化油，例如NEOBEE⑧等。特別合適的可代謝油是鯊烯。鯊烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6，10,14,18,22-二十四碳六烯)是一種不飽和油，大量存在于鯊魚肝油中，少量存在于橄欖油、麥胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的油。鯊烯是可代謝油緣于以下事實其是膽固醇生物合成的中間體(Merckindex，第10版，編目流水號8619)。水包油乳液自身在本領(lǐng)域眾所周知，已表明可用作佐劑組合物(EP399843;WO95/17210)。適宜地，可代謝油以免疫原性組合物總體積的0.5%至20%(終濃度)的量存在，優(yōu)選以總體積的1.0%至10%的量存在，優(yōu)選以總體積的2.0%至6.0%的量存在。在一個具體實施方案中，可代謝油以免疫原性組合物總體積的約0.5%、1%、3.5%或5%的最終量存在。在另一個具體實施方案中，可代謝油以免疫原性組合物總體積的0.5%、1%、3.57%或5%的最終量存在。鯊烯的合適數(shù)量為每疫苗劑量大約10.7mg,優(yōu)選每疫苗劑量10.4至11.0mg。優(yōu)選，本發(fā)明的水包油乳化系統(tǒng)具有亞微米范圍的小油滴粒度。適宜地，油滴的直徑大小在120-750nm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選直徑大小在120-600nm的范圍內(nèi)。典型地，水包油乳液包含油滴，其至少70%(以強度(intensity)計)的直徑低于500nm,優(yōu)選至少80%(以強度計)的直徑低于300nm,更優(yōu)選至少90%(以強度計)的直徑在120-200nm的范圍內(nèi)。按照本發(fā)明的油滴粒度，即直徑，以強度給出。有幾種方法測定以強度計的油滴直徑大小。強度使用粒度測量儀檢測，適宜地通過諸如測。詳細的方法在實施例II.2中給出。第一個可能性是通過動態(tài)光散射(PCS-光子相關(guān)光譜法)測定z均值直徑ZAD;該方法額外給出了多分散指數(shù)(PDI),ZAD和PDI這二者均用累積量算法計算。這些值不需要粒子折射率的信息。第二個方法是通過Contin或NNLS的另一種算法或自動化"Malvern"法(由粒度測量儀提供的默認算法)測定整體粒度分布來計算油滴直徑。多半情況下，由于復(fù)雜組合物的粒子折射率是未知的，所以只能考慮強度分布，如果有需要，考慮由該分布獲得的強度平均值。按照本發(fā)明的水包油乳液包含甾醇或生育酚，例如a生育酚。甾醇在本領(lǐng)域眾所周知，例如膽固醇是周知的，例如公開于MerckIndex,第11版，341頁，為動物脂肪中天然存在的甾醇。其它適宜的甾醇包括卩-谷甾醇、豆甾醇、麥角甾醇和麥角鈣化甾醇。所述甾醇適宜地以免疫原性組合物總體積的0.01%至200/。(w/v)的量存在，優(yōu)選以0.1%至5。/c)(w/v)的量存在。優(yōu)選，當甾醇為膽固醇時，其以免疫原性組合物總23體積的0.02%至0.2。/。(w/v)的量存在，典型地以0.5ml疫苗劑量體積的0.02。/。(w/v)的量存在，或者以0.5ml疫苗劑量體積的0.07。/。(w/v)的量存在，或者以0.7ml疫苗劑量體積的0.1。/()(w/v)的量存在。適宜地，存在a-生育酚或其衍生物例如oc-生育酚琥珀酸酯。優(yōu)選，a-生育酚以免疫原性組合物總體積的0.2%至5.0%(>")的量存在，更優(yōu)選以0.5ml疫苗劑量體積的2.5Q/。(v/v)的量存在，或者以0.5ml疫苗劑量體積的0.5。/。(v/v)的量存在，或者以0.7ml疫苗劑量體積的1.7-1.9%(v/v)、優(yōu)選以1.8%的量存在。為明晰起見，以v/v給出的濃度可通過應(yīng)用以下轉(zhuǎn)換系數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)橐詗/v表示的濃度5。/。(v/v)a-生育酚濃度等于4.8。/。(wZv)a-生育酚濃度。c^生育酚的合適數(shù)量為每疫苗劑量大約11.9mg，優(yōu)選每疫苗劑量11.6至12.2mg。水包油乳液含有乳化劑。以免疫原性組合物重量計(w/w),乳化劑.可以以0.01-5.0%的量存在，優(yōu)選以重量計(w/w)以0.1-2.0%的量存在。以總組合物的重量計(w/w)的合適濃度為0.5-1.5%。乳化劑可適宜地為聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(Tween80)。在一個具體實施方案中，0.5ml疫苗劑量體積含l%(w/w)Tween80,和0.7ml疫苗劑量體積含0.7。/o(w/w)Tween80。在另一個具體實施方案中，Tween80的濃度是0.2%(w/w)。聚山梨酸酯80的合適數(shù)量為每疫苗劑量大約4.9mg，優(yōu)選每疫苗劑量4.6至5.2mg。合適地，疫苗劑量包含大約11.9mg(每疫苗劑量)量的oc-生育酚、10.7mg(每疫苗劑量)量的鯊烯和大約4.9mg(每疫苗劑量)量的聚山梨酸酯SO。水包油乳液佐劑可與其它佐劑或免疫刺激劑一起使用，因此本發(fā)明的一個重要實施方案是一種含鯊烯或另一種可代謝油、生育酚例如a-生育酚和tween80的水包油制劑。水包油乳液還可包含span85和/或卵磷脂。典型地，水包油包含免疫原性組合物總體積的2-10%的藍烯、2-10%的a-生育酚和0.3-3%的Tween80，并可按照WO95/17210中描述的方法生產(chǎn)。優(yōu)選，鯊烯:a-生育酚的比率等于或小于1,因為其提供更穩(wěn)定的乳液。Span85(聚氧乙烯山梨^唐醇酐三油酸酯)也可例如以1%的水平存在。用于本發(fā)明的第一次接種的免疫原性組合物的免疫原性特性(本文稱為'普通組合物')獲得的CD4T-細胞免疫應(yīng)答，單i"介流感組合物能夠針對至少一種組成抗原或抗原性組合物誘導(dǎo)改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答。在一個具體的實施方案中，所述改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答是針對大流4于流感沖朱。所述'改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答，指在給予佐劑化的免疫原性組合物之后在人類受試者中獲得的CD4應(yīng)答高于在給予無佐劑的相同組合物后獲得的免疫應(yīng)答。例如，與給予含流感病毒或其抗原性制品的無佐劑免疫原性組合物之后誘導(dǎo)的應(yīng)答相比，在給予含流感病毒或其抗原性制品連同水包油乳液佐劑的免疫原性組合物時于人類患者中獲得凈支高的CD4T-細胞應(yīng)答，所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、生育酚例如cx生育酚和乳化劑。這種制劑將有利地用于誘導(dǎo)抗流感的CD4-T細月包應(yīng)答，該應(yīng)答能夠檢測由MHCII類分子提呈的流感表位。優(yōu)選，由本發(fā)明使用的佐劑化裂解流感病毒組合物誘導(dǎo)的所述免疫應(yīng)答，高于用任意其它無佐劑常M^流感疫苗(例如亞單位流感疫苗或全流感病毒疫苗)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。具體地但非排它性地，所述'改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答，是在免疫學未初免的受試者(即對所述流感病毒或抗原為血清陰性的受試者)中獲得的。此血清陰性可能是由于從未面對此病毒或抗原的所述受試者(所謂的'原初，受試者)的結(jié)果，或者是在曾經(jīng)遭遇時未能對所述抗原應(yīng)答的所述受試者的結(jié)果。優(yōu)選，所述改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答在免疫應(yīng)答受損受試者中獲得，所述免疫應(yīng)答受損受試者例如為老年人，通常至少50歲，典型地為65歲或以上，或者是具有高風險醫(yī)療狀況的小于65歲的成人('高風險成人')，或者是2歲以下的兒童。改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答可通過檢測產(chǎn)生以下任一種細胞因子的細胞數(shù)目來評價產(chǎn)生至少兩種不同細胞因子(CD40L,IL-2,IFNy,TNFa)的細胞產(chǎn)生至少CD40L和另一種細胞因子(IL-2，TNFot,IFN力的細胞產(chǎn)生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L,TNFoc,IFNy)的細胞產(chǎn)生至少IFNy和另一種細胞因子(IL-2，TNFa，CD40L)的細胞產(chǎn)生至少TNFcx和另一種細胞因子(IL-2，CD40L,IFN力的細胞當和給予無佐劑組合物相比在給予有佐劑組合物后產(chǎn)生任一種以上細胞因子的細胞的量較高時，將存在改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答。通常，上文提及的5種狀況中的至少一種、優(yōu)選兩種將被實現(xiàn)。在一個具體實施方案中，與無佐劑組相比，有佐劑組中產(chǎn)生全部四種細胞因子的細胞將以更高量存在。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的有佐劑流感組合物可以賦予改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答，并且所述應(yīng)答可在單次給藥后理想地獲得。例如在快速發(fā)展的爆發(fā)情況下，單劑方法將有極為重大的意義。在某些情況下，尤其是對于老年人群，或者對于首次接種流感病毒的小孩(9歲以下)，或在大流行情況下，給予兩劑相同的該季組合物可能是有益的。幕二劑所述相同組合物(仍被看作是'用于首次接種的組合物，)可在初始免疫應(yīng)答正在進行的過程中給予，并有足夠的時間間隔。通常，第二劑組合物在首劑后數(shù)周或約1個月(例如2周、3周、4周、5周或6周)給予，以幫助觸發(fā)無應(yīng)答或低應(yīng)答個體的免疫系統(tǒng)。在一個具體方面，首次接種后，隨后進行包含異源流感病毒菌抹的佐劑化疫苗產(chǎn)品的接種過程。在一個具體實施方案中，與在無佐劑組合物免疫的個體中誘導(dǎo)的B記憶細胞應(yīng)答相比，交替地或額外地給予所述免疫原性組合物，在給予有佐劑免疫原性組合物的受試者中誘導(dǎo)改善的B-記憶細胞應(yīng)答。改善的B-記憶細胞應(yīng)答意指在遭遇抗原時能夠分化為分泌抗體的漿細胞的外周血B淋巴細胞的頻率增加，這通過體外分化刺激進行檢測(參見實施例部分，例如ElispotB細胞記憶的方法)。在另一個具體實施方案中，用有佐劑的首次接種用組合物接種，對CD8應(yīng)答沒有可檢測的影響。合適地，與水包油型乳狀液佐劑一起配制的包含流感病毒或其抗原性制品的要求保護的組合物，可在免疫低下的人群中有效地促進T細胞應(yīng)答，優(yōu)選，水包油型乳狀液佐劑包含可代謝的油、甾醇或生育酚例如cx生育酚和乳化劑。合適地，根據(jù)流感疫苗保護作用的關(guān)聯(lián)性評價，與用無佐劑流感疫苗接種提供的血清保護作用相比，給予單劑本發(fā)明所述的首次接種用免疫原性組合物，接著針對流感病毒再接種，能夠提供更好的血清保護作用。相比于用無佐劑制劑獲得的免疫應(yīng)答，要求保護的佐劑化制劑還將針對流感病毒誘導(dǎo)改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答。這種性能可能與接種或面對流感抗原性接觸的感染時增加的應(yīng)答性相關(guān)。而且，其還可能與交叉反應(yīng)性相關(guān)，即對變體流感抹應(yīng)答的能力較高。這種定性和/或定量改善的應(yīng)答可能在大流行情況下的所有人群中是有利的，特別是在免疫缺失人群如老年人群(65歲和以上)中，尤其是高風險老年人中是如此。這對于嬰兒人群(5歲以下，優(yōu)選2歲以下)也是有益的。在大流4亍突發(fā)之前或在大流行突發(fā)開始時，這種改善的應(yīng)答對于例如用包含漂移變體的貯存疫苗進行引發(fā)的用途是有益的。這可導(dǎo)致降低整體的發(fā)病率和死亡率，并防止肺炎和其它流感樣疾病的緊急入院。而且，與用無佐劑制劑誘導(dǎo)的應(yīng)答相比，其允許誘導(dǎo)時間更持久的CD4T細^^應(yīng)答，例如在首次接種后仍存在1年。優(yōu)選，CD4T-細胞免疫應(yīng)答，例如在未接觸抗原的個體中獲得的改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答，包括誘導(dǎo)交叉反應(yīng)性CD4T輔助應(yīng)答。具體地說，增加了交叉反應(yīng)性CD4T細胞的量。所述'交叉反應(yīng)性，CD4應(yīng)答是指CD4T-細l包革巴向流感抹之間的共有表位。通常，可用的流感疫苗僅有效對抗具有相似抗原性特征的血細月包凝集素的流感病毒感染林。當感染(循環(huán))性流感病毒已經(jīng)歷了表面糖蛋白(具體地說是血細胞凝集素)的微小變化(例如點突變或?qū)е掳被岣淖兊狞c突變累積)時(抗原漂移變體病毒抹)，疫苗仍可提供一些保護作用，雖然其可能僅提供有限的保護作用，因為新產(chǎn)生的變體可能逃脫先前流感感染或接種誘導(dǎo)的免疫性?？乖剖橇餍虚g隔期間發(fā)生的年度大流行的原因(Wiley&Skehel,1987,Ann.Rev.Biochem.56,365-394)。交叉反應(yīng)性CD4T細胞的誘導(dǎo)為本發(fā)明組合物提供了額外的優(yōu)勢，因為其還可提供交叉保護作用，換句話說是抗異源感染的保護體(例如漂移變體)的循環(huán)流感病毒抹引起的感染。這在循環(huán)菌抹難以在卯中繁殖或難以在組織培養(yǎng)物中產(chǎn)生時可能是有利的，使漂移株用作備選工作抹。這在受試者以幾個月或一年間隔接受第一次和第二次接種時也可能有利，用于第二次免疫的免疫原性組合物中的流感抹是用于首次接種的組合物中使用的菌抹的漂移變體抹。因此，本文定義的佐劑化流感免疫原性組合物在接種的老年受試者中具有較高的誘導(dǎo)血清保護作用和交叉反應(yīng)性CD4T細胞的能力。該特征可能與對免疫原性組合物中存在的菌抹的變體抹應(yīng)答的能力較高有關(guān)。這在大流行情況下可證明是重要的優(yōu)勢。例如，在隨后用所述漂移抹接種時或由所述漂移抹感染時，含H5、H2、H9、H7或H6菌抹中的27任一種的單價流感免疫原性組合物可提供較高的對大流行變體(即所述大流行抹的漂移抹)應(yīng)答的能力。用流感疫苗接種后的交叉反應(yīng)性CD4T-細胞的檢測在給予傳統(tǒng)的三價流感疫苗后(3周)，外周血CD4T-細胞對抗原性菌抹制品(全病毒或裂解抗原)應(yīng)答的頻率顯著增加，所述抗原性菌抹制品與疫苗中存在的一種抗原(H3N2:A/Panama/2007/99,H1N1:A/NewCaledoma/20/99,B:B/Shangdong/7/97)(參見實施例III)是同源的。如果用分類為漂移抹(H3N2:A/悉尼/5/97,H1N1:A/北京/262/95，B:B/Yamanashi/166/98)的流感抹再刺激外周血CD4T-細胞，則可以見到相當大的頻率增加。相反，如果由本領(lǐng)域的專家用分類為轉(zhuǎn)變抹(H2N2:A/新加坡/l/57;H9N2:A/香港/1073/99)的流感林再刺激外周血CD4T-細胞，則在接種后沒有可觀測的增加。能夠識別同源和漂移的流感柹、兩者的CD4T-細胞在本文件中已命名為"交叉反應(yīng)性"。如本文所述的有佐劑流感組合物已能夠顯示出異亞型的交叉反應(yīng)性，因為存在可觀測的抗漂移流感纟朱的交叉反應(yīng)性。如上所述，大流行疫苗制劑有效對抗漂移大流行菌抹的能力在大流行情況下可證明是重要的特征。與以上觀測結(jié)果相一致，已在人中鑒別出不同流感抹共有的CD4T-細胞表位(GelderC等，1998,IntImmunol.10(2):21l畫22;GelderCM等，1996JVirol.70(7):4787-90;GelderCM等，1995JVirol.199569(12):7497-506)。由于其免疫原性的性能，要求保護的組合物能針對人類流感病毒大流行的威脅來建立預(yù)防性接種策略，包括貯存大流4亍前疫苗，以侵j交好地預(yù)防大流^ft的開始。具體地說，大流行前疫苗是已經(jīng)生產(chǎn)的疫苗，例如通過使用反向遺傳學、使用與目前在鳥群中流行的菌林相似的H5N1的菌抹(禽流感病毒)。在對大流行前疫苗應(yīng)答中形成的免疫性使免疫系統(tǒng)得到'引發(fā)，或'訓練，而做好準備，并因此在遇到真實的大流行病毒抹(引起對流感病毒的相關(guān)大流行菌株的低敏感性)之后，更快速形成保護性的免疫應(yīng)答。一旦WHO已經(jīng)宣布大流4亍、并且確定最終大流4亍菌抹是漂移菌才朱時，也可以使大流行前疫苗對大流行疫苗更快速的產(chǎn)生免疫應(yīng)答(當后28者可得到時)。在一個具體實施方案中，有佐劑組合物可提供額外利益，該利益提供了針對循環(huán)菌抹的更好的保護作用，所述循環(huán)菌抹經(jīng)歷了血細胞凝集素的大改變(例如基因重組，例如兩個不同物種之間的基因重組)(抗原轉(zhuǎn)變)，現(xiàn)行疫苗對其無效。其它佐劑組合物可包含另外的佐劑，具體地說為TRL-4配體佐劑，適宜地為脂質(zhì)A的無毒衍生物。適宜的TRL-4配體為3脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)。其它適宜的TLR-4配體為脂多糖(LPS)和衍生物、MDP(胞壁酰二肽)和RSV的F蛋白。在一個實施方案中，所述組合物可另外包括Toll樣受體(TLR)4配體，例如脂質(zhì)A的無毒衍生物，具體地說是單磷酰脂質(zhì)A,或者更具體地說是3-脫酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)。3D-MPL由Corixa公司(現(xiàn)在的GSK)以商標MPL⑧銷售(本文稱為MPL),主要促進具有IFN-y(Thl)表型的CD4+T細胞應(yīng)答。其可4要照GB2220211A中公開的方法制備。在化學上，其是具有3、4、5或6條酰化鏈的3-脫酰單磷酰脂質(zhì)A的混合物。優(yōu)選，在本發(fā)明組合物中^使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有的粒度4吏得其可通過0.22ILim濾器除菌過濾。此制備描述于W094/21292和實施例II中。3D-MPL可以例如每個組合物劑量1-100貼(w/v)的量使用，優(yōu)選以每個組合物劑量10-50ng(w/v)的量使用。合適量的3D-MPL例如為每個組合物劑量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50嗎(w/v)中的任一個。更優(yōu)選，每個組合物劑量的3D-MPL的量在25-75pg(w/v)的范圍內(nèi)。通常，組合物劑量將在約0.5ml至約lml的范圍內(nèi)。典型的疫苗劑量為0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml或lml。在一個合適實施方案中，每ml疫苗組合物包含50Hg3D畫MPL的鄉(xiāng)冬濃度，或每0.5ml疫苗劑量包含25pg3D-MPL的鄉(xiāng)冬〉農(nóng)度。在其它合適實施方案中，每ml疫苗組合物包含35.7pg或71.4pg3D-MPL的終濃度。具體;也-說，0.5ml疫苗劑量體積每劑含25(ig或50pg3D-MPL。29MPL的劑量適宜地能夠在人中增強針對抗原的免疫應(yīng)答。具體地說，相比于無佐劑組合物，或相比于用另一種MPL量作佐劑的組合物，適宜的MPL量是能改善所述組合物的免疫效力的量，同時反應(yīng)原性模式可接受。合成的脂質(zhì)A的衍生物是已知的，其中一些被描述為TLR-4激動劑，其包括但不限于OM174(2-脫氧-6-o-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基十四酰基氨基]-4-o-膦?；猵-D-p比喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-a-D-吡喃葡糖基二氬磷酸酯)，(WO95/14026)OM294DP(3S,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四?；被鵠癸-l,10-二醇，1,10-雙(二氫磷酸酯)(W099/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠癸-l,10-二醇，1-二氪磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO01/46127)其它合適的TLR-4配體例如為脂多糖及其衍生物、胞壁酰二肽(MDP)或呼吸道合月包體病毒的F蛋白。用于本發(fā)明的另一種合適的免疫刺激劑是QuilA及其衍生物。QuilA是分離自南美奎拉雅屬皂樹(QuilajaSaponariaMolina)的皂苷制品，首先由Dalsgaard等在1974年4笛述("Saponinadjuvants",Archiv.fiirdiegesamteVimsforschung,44巻，SpringerVerlag，Berlin,243-254頁)具有佐劑活性。已通過HPLC分離了QmlA的純化片段，其保留了佐劑活性，沒有與QuilA相關(guān)的毒性(EP0362278),例如QS7和QS21(也稱為QA7和QA21)。QS-21是一種來源于查拉雅屬急樹(QmlajaSaponariaMolina)樹皮的天然皂苷，其誘導(dǎo)CD8+細胞毒性T細胞(CTL)、Thl細胞和主要的lgG2a抗體應(yīng)答，在本發(fā)明范圍內(nèi)是優(yōu)選的皂苷。業(yè)已描述了QS21的具體制劑，它們是特別優(yōu)選的，這些制劑還包含甾醇(W096/33739)。構(gòu)成本發(fā)明一部分的皂苷可為水包油乳液形式(WO95/17210)。再接種和用于再接種的組合物(加強組合物)本發(fā)明的一個方面提供了流感抗原在制備流感免疫原性組合物中的用途，所述流感免疫原性組合物用于再接種先前用本文要求保護的單價流感組合物或含變體流感林的所述單價流感組合物接種的人，所述單價流感組合物與本文定義的水包油乳液佐劑一起配制。通常，再接種于首次接種后至少6個月進行，優(yōu)選于首次接種后8-14個月進行，更優(yōu)選于首次接種后約10-12個月進行。用于再接種的免疫原性組合物(加強組合物)可包含任意類型的抗原制品，其是失活的、重組的或者是活減毒的。其可包含相同類型的抗原制品，即裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原性制品、全病毒體、純化的HA和NA(亞單位)疫苗或病毒顆粒，作為首次接種用的免疫原性組合物。或者，加強組合物可包含首次接種所使用流感抗原類型之外的另一種類型的流感病毒抗原，即裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原性制品、全病毒體、純化的HA和NA(亞單位)疫苗或病毒顆粒。優(yōu)選，使用裂解病毒或全病毒體疫苗。相應(yīng)地，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了流感病毒或其抗原性制品在制備免疫原性組合物中的用途，該免疫原性組合物用于再接種先前用本文要求保護的單價大流行免疫原性組合物接種的人。加強組合物可有佐劑或無佐劑。在一個實施方案中，用于再接種的組合物是無佐劑的，并且是傳統(tǒng)的流感疫苗，其包含3種由WHO推薦的適宜流感季毒抹制備的失活裂解病毒體抗原，例如肌肉內(nèi)給予的FluarixTM/a-Rix/Influsplit。在另一個實施方案中，用于再接種的組合物是有佐劑的。優(yōu)選，加強組合物包含水包油型乳狀液佐劑，尤其是包含可代謝的油、甾醇或生育酚例如cx生育酚和乳化劑的水包油型乳狀液佐劑。具體地說，所述水包油乳液佐劑包含至少一種可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%,并具有油滴，該油滴的至少70%(以強度計)具有小于1pm的直徑?；蛘撸訌娊M合物包含明鞏佐劑，既可以是氫氧化鋁、也可以是磷酸鋁或兩者的混合物。在一個實施方案中，用本文所定義的大流行性流感組合物進行第一次接種，優(yōu)選用裂解流感病毒組合物，并且如下進行再接種。在另一個具體實施方案中，用于再接種的免疫原性組合物包含流感病毒或其抗原性制品，它們與用于第一次接種的流感病毒或其病毒抗原性制品共有共同的CD4T-細胞表位。共同的CD4T-細胞表位意指可由相同CD4細胞識別的不同抗原的肽/序列/表位(參見例如以下描述的表31位GdderC等，1998,IntImmunol.10(2):211-22;GelderCM等，1996JVirol.70(7):4787-90;GelderCM等，1995JVirol.199569(12):7497-506)。在按照本發(fā)明的一個實施方案中，加強組合物為一種單^介流感組合物，其包含與大流行相關(guān)或具有與大流行相關(guān)的潛力的流感菌抹。適宜的毒株是、但不限于H5N1、H9N2、H7N7、H2N2、H7N1和H1N1。所述菌抹可與存在于首次接種用組合物中的菌林相同，或與其中一種菌抹相同。在一個替代實施方案中，所述菌抹可為首次接種用組合物中存在的菌抹的變體菌林，即漂移菌抹。在另一個具體實施方案中，用于再接種的組合物是多價流感疫苗。具體地說，當加強組合物為多價疫苗如二價、三價或四價疫苗時，至少一種毒抹與大流行相關(guān)或具有與大流行相關(guān)的潛力。在一個具體實施方案中，加強組合物中的兩種或多種毒林是大流行菌林。在另一個具體實施方案中，加強組合物中的至少一種大流行菌抹與首次接種用組合物中存在的菌株同型，或與其中一種菌林同型。在一個備選實施方案中，至少一種菌林可為首次接種用組合物中存在的至少一種大流行菌抹的變體抹，即漂移抹。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供得自第一種大流行流感菌抹的流感病毒或其抗原性制品在制備本文定義的免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于對抗由流感菌抹(為所述第一種流感菌株的變體)引起的流感感染而起保護作用。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了(a)得自第一種流感菌株的流感病毒或其抗原性制品和(b)本文定義的水包油乳液佐劑在制備本文所定義的免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于針對流感菌抹(為所述第一種流感抹的變體)引起的流感感染而起保護作用。再接種用組合物可有佐劑或無佐劑。通常在使用時，加強組合物于下一個流感季給予，例如在第一個免疫原性組合物之后約1年給予。加強組合物還可每個隨后年給予(第三次、第四次、第五次接種等)。加強組合物可與首次接種所使用的組合物相同。適宜地，加強組合物包含流感病毒或其抗原性制品，其為首次接種所使用的流感病毒的變體株。具體地說，流感病毒林或其抗原性制品是按照世界衛(wèi)生組織發(fā)布的參考材料選擇的，使得它們適合于在再接種年循環(huán)的流感菌抹。合適地，在大流行開始時進行第一次接種，隨后進行再接種。合適地，用包含與第一次接種相同亞型(例如H5N1Vietnam)的流感菌抹(例如H5N1Vietnam)的疫苗進行再接種。在一個具體實施方案中，用同樣亞型的漂移菌抹例如H5N1印度尼西亞進行再接種。在另一個實施方案中，用于再接種的所述流感菌林是轉(zhuǎn)變(shift)菌抹，即其不同于第一次接種所用的菌株，例如它具有不同的HA或NA亞型，例如H5N2(與H5N1相同的HA亞型，一f旦不同的NA亞型)或H7N1(與H5N1不同的HA亞型，一f旦相同的NA亞型)。用于再接種的流感抗原或抗原性組合物優(yōu)選包含適宜的上述佐劑或水包油乳液。所述佐劑可為如上文所述的水包油乳液佐劑，其是優(yōu)選的，任選地包含額外的佐劑，例如TLR-4配體，如3D-MPL或皂普，或者可為另一種合適的佐劑，例如明礬或明礬替代物，例如聚磷腈。優(yōu)選，相比于用無佐劑流感病毒或其抗原性制品第一次接種后誘導(dǎo)的對等應(yīng)答，再接種誘導(dǎo)以下的任一種、優(yōu)選兩種或全部(i)針對流感病毒或其抗原性制品的改善的CD4應(yīng)答，或(ii)改善的B細胞記憶應(yīng)答或(iii)改善的體液應(yīng)答。優(yōu)選，用本文定義的有佐劑流感病毒或其抗原性制品再接種后i秀導(dǎo)的免疫應(yīng)答高于用無佐劑組合物再接種后誘導(dǎo)的相應(yīng)的應(yīng)答。優(yōu)選，在用有佐劑的、優(yōu)選裂解的流感病毒組合物首次接種的人群中，用無佐劑的、優(yōu)選裂解的流感病毒再接種后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答高于在用無佐劑的、優(yōu)選裂解的流感病毒組合物首次接種的人群中的對應(yīng)應(yīng)答。3要照本發(fā)明的一方面，用含流感病毒和本文定義的水包油乳液佐劑的加強組合物再接種受試者，顯示出的抗體滴度高于用無佐劑組合物首次接種并用無佐劑組合物加強的人群中的對應(yīng)值，其中所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇或生育酚例如oc生育酚和乳化劑。佐劑增強針對再接種的抗體應(yīng)答的效力，在已知對流感病毒接種或感染具有低應(yīng)答的老年人中尤其重要。尤其是，就改善再接種后的CD4T-細胞應(yīng)答而言，與有佐劑組合物相關(guān)的利益也是顯著的。相比于對照疫苗賦予的保護作用，本發(fā)明的有佐劑組合物能夠誘導(dǎo)抗漂移菌抹(下一流感季的流感菌抹)的更好的交叉響應(yīng)性。所述交叉響應(yīng)性表現(xiàn)出的持久性比用無佐劑制劑獲得的持久性高。所述佐劑增強抗漂移菌林的交叉響應(yīng)性的作用對于大流行情況很重要。在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及一種接種方案，其中首次接種用含流感菌抹的流感組合物、優(yōu)選裂解流感組合物進行，其中所述流感菌抹可潛在地引起大流行爆發(fā)，再接種用包含至少一種流行菌林(既可以是大流行菌林、也可以是傳統(tǒng)菌抹)的單價或多價組合物進行。HA中的CD4表位此抗原漂移主要存在于病毒表面蛋白血細胞凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的表位區(qū)。已知被病毒用于逃避宿主免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性應(yīng)答的不同流感4朱之間CD4和B細胞表位的i^壬何差異都將在流感接種中起重要作用。由不同的流感菌抹共享的CD4T細胞表位已經(jīng)在人類中鑒別出(見例如GelderC等人，1998，Intlmmunol.10(2):21l畫22;GelderCMetal.1996JVirol.70(7):4787-90;andGelderCM等人，1995JVirol.199569(12):7497-506)。在一個具體的實施方案中，再接種使用含流感病毒或其抗原性制品的加強組合物進行，所述流感病毒或其抗原性制品與第一次接種所使用的流感病毒抗原或其抗原性制品共有共同的CD4T-細胞表位。因此，本發(fā)明涉及含大流行流感病毒或其抗原性制品和水包油乳液佐劑(具體地說為含可代謝油、甾醇或生育酚例如a生育酚和乳化劑的水包油乳液佐劑)的免疫原性組合物在制備多劑量疫苗的首次接種組份中的用途，所述多劑量疫苗還包含作為加強劑量的流感病毒或其抗原性制品，它們與第一次接種時所給予劑量的大流行流感病毒抗原或其病毒抗原性制品共有共同的CD4T-細胞表位。接種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的組合物可通過任意合適的遞送途徑給予，例如皮內(nèi)、粘膜如鼻內(nèi)、口服、肌內(nèi)或皮下。其它傳遞途徑在本領(lǐng)域眾所周知。肌內(nèi)遞送途徑對有佐劑流感組合物是特別優(yōu)選的。按照本發(fā)明的組合物可以存在于單劑量器皿中，或者存在于多劑量器皿中，尤其適于大流4于疫苗。在這種情況下，典型地存在抗菌防腐劑例如石克柳7泉，以防止在使用期間污染。優(yōu)選存在5pg/0.5ml劑量(即10jig/ml)或10pg/0.5ml劑量(即20pg/ml)的硫柳汞濃度?？梢允褂煤线m的IM遞送裝置，例如無針液體噴射注入裝置，例如Biojector2000(Biqject，Portland,OR)?；蛘吖P式噴射器，例如，用于家庭遞送腎上腺素，可用于自我給予疫苗。使用這種遞送裝置尤其可以用于大規(guī)模免疫活動，例如在大流^t期間所要求的免疫。皮內(nèi)遞送是另一個適宜的途徑。任意合適的裝置都可用于皮內(nèi)遞送，例如在US4,886,499、US5,190,521、US5，328,483、US5,527,288、US4,270,537、US5,015,235、US5,141,496、US5,417,662中描述的短針裝置。皮內(nèi)疫苗還可通過限制針進入皮膚的有效穿透長度的裝置給予，例如描述于WO99/34850和EP1092444的裝置及其功能等同物，這兩個文獻通過引用結(jié)合到本文中。快速注射裝置也是適宜的，其經(jīng)液體快速注射器或經(jīng)刺穿角質(zhì)層并產(chǎn)生到達真皮的射流的針輸送液體疫苗至真皮?？焖僮⑸溲b置描述于例如US5,480,381,US5,599,302,US5,334,144,US5,993,412,US5,649,912，US5,569,189,US5,704,911'US5,383,851，US5,893,397，US5,466,220,US5,339,163,US5,312,335,US5,503,627,US5,064,413,US5,520,639,US4,596,556US4,790,824，US4,941,880，US4,940,460，WO97/37705和WO97/13537中。噴射粉末/顆粒遞送裝置也是適宜的，其使用壓縮氣體加速粉末形式的疫苗通過皮膚外層至真皮。另外，常規(guī)注射器可用于皮內(nèi)給予的傳統(tǒng)結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗法。另一個合適的給予途徑是皮下途徑。任意合適的裝置都可用于皮下遞送，例如傳統(tǒng)的針。優(yōu)選，使用例如在WO01/05453,WO01/05452,WO01/05451,WO01/32243,WO01/41840,WO01/41839,WO01/47585,WO01/56637,WO01/58512,WO01/64269,WO01/78810'WO01/91835,WO01/97884，WO02/09796,WO02/34317中公開的無針快速注射器裝置。優(yōu)選，所述裝置用液體疫苗制劑預(yù)填充?；蛘?，疫苗鼻內(nèi)給予。典型地，疫苗局部給予于鼻咽部，優(yōu)選沒有吸入到肺中。理想的是，使用將疫苗制劑傳遞入鼻咽部而沒有或基本沒有使其進入肺中的鼻內(nèi)傳遞裝置。按照本發(fā)明的疫苗的合適鼻內(nèi)給予裝置是噴霧裝置。適宜的商用鼻噴霧裝置包括AccuspmyTM(BectonDickmson)。霧化器產(chǎn)生非常細小的霧滴，其可被輕易地吸入到肺中，因此不能有效到達鼻粘膜。因此不優(yōu)選霧化器。用于鼻內(nèi)使用的合適噴霧裝置的性能與使用者提供的壓力無關(guān)。這35些裝置稱為壓力域裝置。只有在提供臨界壓力時才由噴嘴釋放液體。這些裝置更容易獲得液滴大小規(guī)則的霧滴。適用于本發(fā)明的壓力域裝置在本領(lǐng)域是已知的，描述于例如WO91/13281和EP311863B和EP516636,這些文獻通過引用結(jié)合到本文中。這種裝置可從PfeifferGmbH購買，還描述于Bommer,R.PharmaceuticalTechnologyEurope,1999年9月。優(yōu)選的鼻內(nèi)裝置產(chǎn)生的液滴(使用水作為液體進行檢測)范圍為1-200|um，優(yōu)選10-120|um。小于10存在吸入風險，因此理想的是10以下的液滴不超過約5%。120|im以上的液滴擴散得不如較小的液滴好，所以理想的是120以上的液滴不超過約5%。雙劑量遞送是用于按照本發(fā)明疫苗的鼻內(nèi)傳遞系統(tǒng)的更合適特征。雙劑量裝置包含單劑疫苗的兩個亞劑量，每個鼻孔給予一個亞劑量。一般來說，兩個亞劑量存在于一個室中，裝置的構(gòu)造允許每次有效遞送單個亞劑量?；蛘?，可使用單劑量裝置給予按照本發(fā)明的疫苗?；蛘?，本發(fā)明還設(shè)想了表皮或透皮接種途徑。在本發(fā)明的一方面，首次給予的佐劑化免疫原性組合物可肌內(nèi)給予，有佐劑或無佐劑的加強組合物可通過不同途徑給予，例如皮內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)。在一個具體實施方案中，首次給予的組合物可包含用于大流行性流感菌林的小于15pg的HA數(shù)量，加強組合物可包含15嗎的標準數(shù)量，或優(yōu)選低數(shù)量的HA,即低于15嗎，根據(jù)給藥途徑，可以以較小體積給予。接種群體接種的目標群體是全部人群，例如健康的年輕成人(例如18-60歲)，老年(典型地60歲以上)或幼兒/兒童。目標人群可以優(yōu)選免疫低下的人群。與健康的成人相比，免疫低下人一般不能對抗原作出反應(yīng)，尤其是對流感病毒抗原。在按照本發(fā)明的一方面，目標群體是未對流感初免的群體，他們或者是原初態(tài)的(例如相對于大流行毒4朱)，或者先前不能對流感感染或接種應(yīng)答。優(yōu)選，目標群體是老年人，適宜地為至少60歲或65歲和65歲以上，較年輕的高風險成人(即18-64歲)，例如在保健機構(gòu)工作的人，或者具有高風險因素例如心血管病和肺病或糖尿病的年輕成人。另一個目標群體是所有6個月和以上的兒童，尤其是6-23個月齡的兒36童，他們經(jīng)歷了相對高的流感相關(guān)住院率。才妻種方案、給藥和效力標準適宜地，按照本發(fā)明的免疫原性組合物在大部分情況下為標準0.5ml注射劑量，并且包含小于15貼的血細胞凝集素抗原組份(得自于大流行性流感菌抹)，根據(jù)單輻射免疫擴散(SRD)檢測(J.M.Wood等人J.Biol.Stand.5(1977)237-247;J.M.Wood等人J.Biol.Stand.9(1981)317-330)。適宜地，疫苗劑量體積在0.5ml至1ml之間，具體地說是標準0.5ml或0.7ml疫苗劑量體積。根據(jù)原液樣品中的HA濃度，可常規(guī)地輕微調(diào)整劑量體積，并且也根據(jù)遞送途徑，通過鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑給予較小劑量。適宜i也，所述免疫原性組合物含低劑量的HA抗原-例如每流感菌抹l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14ngHA中的4壬一個，或每菌株不超過15pgHA。所述低量的HA數(shù)量可以低到實際上的可行數(shù)量，條件是允許配制可滿足國際例如EU或FDA效果標準的疫苗，如下面所詳述(參見表1和列出的具體參數(shù))。合適的低量HA是每流感病毒菌抹1至7.5HA之間，優(yōu)選每流感病毒菌抹在3.5至5|ugHA之間，例如每流感病毒菌抹3.75或3.8HA,典型地，每流感病毒菌抹大約5)iigHA。另一種合適的HA量是每流感病毒菌株在0.1和5jagHA之間，優(yōu)選每流感病毒菌株在1.0和2|ugHA之間，例如每流感病毒菌林1.9)iigHA。有利地，按照本發(fā)明的疫苗劑量，尤其是低HA數(shù)量疫苗，可以以比一般為每劑約0.5、0.7或1ml的常規(guī)注射裂解流感疫苗小的體積提供。按照本發(fā)明的小體積劑量優(yōu)選每劑低于500pi,典型地每劑低于300|ul,優(yōu)選每劑不超過約200pi或以下。因此，按照本發(fā)明的一個方面，合適小體積疫苗劑量是在小體積中具有低抗原劑量的劑量，例如在約200pl體積中有約15pg或約7.5貼HA或約3.0pgHA(每菌抹)。本發(fā)明的流感藥物優(yōu)選滿足疫苗的某些國際標準。國際上提出了檢測流感疫苗效力的標準。對于與流感疫苗的每年特許程序有關(guān)的臨床試驗，按照EuropeanAgency的人用醫(yī)學產(chǎn)品的評價標準(CHMP/BWP/214/96,CommitteeforProprietaryMedicinalProducts(CPMP).Noteforharmonizationofrequirementsforinfluenzavaccines,1997.CHMP/BWP/214/96circularN°96-0666:l畫22)評價血清變量(表1)。對于成年種群(18-60歲)和老年人群(>60歲)的要求是不同的(表1)。對于流行性流感疫苗，針對包含在疫苗中的所有流感病毒菌抹，至少一種評價(血清轉(zhuǎn)化因子、血清陽轉(zhuǎn)率、血清保護率)應(yīng)該滿足歐洲要求。認為滴定度的比例等于或大于l:40是最相關(guān)的，因為期望這些滴定度與保護作用有最好的相關(guān)性[BeyerW等人1998.ClmDrugInvest.;15:l隱12]。按照，，Guidelineondossierstructureandcontentforpandemicinfluenzavaccinemarketingauthorisationapplication.(CHMP/VEG/4717/03,2004年4月5日)所具體說明的那樣，在沒有針對衍生自非流行菌抹的流感疫苗的特定標準的情況下，可以預(yù)料在兩劑疫苗之后大流行候選物疫苗應(yīng)該(至少)能夠引起充分的免疫學的應(yīng)答，以合適地滿足所有三個為在未初免的成人或老年受試者中存在的疫苗確定的現(xiàn)行標準。對于包含在組合物中的大流行菌抹，本發(fā)明的組合物合適地滿足表1所列保護作用的至少一個這種標準(一個標準足以獲準)，合適地至少兩個，或典型i也至少所有三個標準。表l(CHMP標準)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>*血清陽轉(zhuǎn)率定義為具有保護性的接種后滴度(titre)>1:40的各個組中受試者的比例。簡而言之，血清陽轉(zhuǎn)率是具有接種之前為<1:10和接種之后為>1:40的HI滴度的受試者的百分數(shù)。然而，如果初始滴度>1:10,那么在接種之后，則需要至少四倍的抗體增加量。**轉(zhuǎn)變因子定義為接種后針對每種疫苗抹的血清HI幾何平均滴度(GMT)的增加倍數(shù)。***保護率定義為在接種之前血清陰性受試者和具有接種后(保護性)HI滴度>1:40的受試者的比率，或在接種之前血清反應(yīng)陽性的受試者和接種后滴度顯著增加4倍的受試者的比率；通常將其視作表明的保護作用。歐洲衛(wèi)生制定規(guī)章的當局(CHMP-CommitteeforMedicinalProductsforHumanUse)定義的70%血清保護率，是三個標準之一，通常要求每年的季節(jié)性流感疫苗滿足該標準，并且CHMP也期望大流行候選疫苗也滿足該標準。然而，數(shù)學模擬表明，針對某些漂移菌抹僅僅30%有效率的疫苗，在幫助降低大流行幅度方面也是有益的(Ferguson等人，Nature2006)。FDA已經(jīng)在ClinicalDataNeededtoSupporttheLicensureofPandemicInfluenzaVaccines上公開了指導(dǎo)草案(來源OfficeofCommunication,TrainingandManufacturersAssistance(HFM-40),1401RockvillePike,Suite200N,Rockville,MD20852-1448,或呼叫1-800-835-4709或301-827-1800,或得自于國際互耳關(guān)網(wǎng)http:〃www.fda.gov/cber/guiddmes.htm),并且推薦的標準也基于CHMP標準。合適的終點類似地包括l)達到HI抗體滴度>1:40的受試者的百分比，和2)血清陽轉(zhuǎn)率，定義為接種后HI抗體滴度升高四倍。在結(jié)果中，應(yīng)該包括幾何平均滴度(GMT)。應(yīng)該提供這些評價的點估計的這些數(shù)據(jù)和95%置信區(qū)間(CI)。相應(yīng)地，在本發(fā)明的一方面，提供了本文要求保護的組合物、方或保護作用可以滿足流感疫苗效果的所有三個EU管理標準。合適地，對于組合物的大流行菌抹，可以滿足下列標準的至少一個、優(yōu)選兩個或三個-在成年人口(18-60歲)中，和/或也合適地在老年人群(>60歲)中，血清陽轉(zhuǎn)率>50%、〉60%、>70%、優(yōu)選〉80%或>90%;-在成年人口(18-60歲)中，和/或也合適地在老年人群(>60歲)中，保護率〉75%、〉80%、〉85%、優(yōu)選〉90%;-在成年人口(18-60歲)中，和/或也合適地在老年人群(〉60歲)中，轉(zhuǎn)化因子>4.0、〉5.0、〉6.0、>7.0、〉8.0、〉9.0或10或10以上；在一個具體實施方案中，在成年人口中，按照本發(fā)明的組合物可同時滿足血清陽轉(zhuǎn)率〉60°/。或>70%或合適地〉80%,和保護率〉75%、優(yōu)選〉80%。在另一個具體實施方案中，在成年人口中，按照本發(fā)明的組合物可同時滿足轉(zhuǎn)化因子>5.0或>7.0或優(yōu)選>10.0，和血清陽轉(zhuǎn)率〉60%或>70%或優(yōu)選〉80%。在另一個具體實施方案中，在成年人口中，按照本發(fā)明的組合物可同時滿足轉(zhuǎn)化因子>5.0或>7.0或優(yōu)選〉10.0,和保護率>75%、優(yōu)選〉80%。在另一個具體實施方案中，給照本發(fā)明的組合物可同時滿足轉(zhuǎn)化因子為10.0或10.0以上，血清陽轉(zhuǎn)率為80%或80%以上，和^床護率80%或80%以上。在另一個實施方案中，針對漂移菌抹，要求保護的疫苗可以滿足至少30%的血清保護率，針對漂移菌抹，優(yōu)選至少40%,或〉50%或>60%。針對漂移菌4朱，優(yōu)選，血清保護率〉70%,或優(yōu)選〉80%。合適地，對于其它人群，任何或所有這種標準也都能滿足，例如兒童和任何免疫受損人群。合適地，上述應(yīng)答是在一個劑量、典型地兩個劑量之后獲得的。正是由于要求保護的組合物的具體優(yōu)勢，使得僅僅一個劑量的佐劑化疫苗之后就可獲得免疫應(yīng)答。相應(yīng)地，在本發(fā)明的一方面，提供了失活的大流行性流感病毒抗原制品、尤其是裂解流感病毒制品在制備疫苗組合物中的用途，該疫苗組合物用于針對流感病毒的單劑量接種，其中單劑量接種產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其滿足針對流感疫苗的國際管理要求的至少一個、合適地兩個或三個要求。在另一個具體實施方案中，所述單劑量接種也或另外產(chǎn)生CD4T細胞免疫應(yīng)答和/或B細胞記憶應(yīng)答，其比用非佐劑化疫苗獲得的應(yīng)答高。在具體實施方案中，所述免疫應(yīng)答是交叉反應(yīng)的抗體應(yīng)答或交叉反應(yīng)的CD4T細胞應(yīng)答或兩者。在具體實施方案中，人類受試者對接種菌抹是免疫原初態(tài)的(即不預(yù)先存在免疫性)。具體地說，疫苗組合物包含低數(shù)量的HA抗原。具體地說，疫苗組合物如本文所定義。尤其是，疫苗組合物的免疫性能如本文所定義。合適地，肌肉內(nèi)給予疫苗。就再接種組合物而論，當它是多價組合物時，對于所有的菌抹，尤其對于新疫苗，例如通過不同途徑的新疫苗，需要滿足至少兩個或所有三個標準。在一些情況下，兩個標準就足夠了。例如，可以接受所有菌林滿足三項標準中的兩項，同時部分的但不是全部的菌抹滿足第三項標準(例如三種菌才朱中的兩種)。在進一步的方面，本發(fā)明提供了針對已知要通過004+T細胞活化治愈或治療的疾病設(shè)計疫苗的方法，其包括1)選4,含CD4+表位的抗原，和2)組合所述抗原和上文定義的水包油乳液佐劑，其中所述疫苗在所40述哺乳動物中給予時能夠在所述哺乳動物中誘導(dǎo)增強的CD4T細胞應(yīng)本申請的所有參考文獻(包括專利申請和已授予專利)的講述都完整地通過引用結(jié)合到本文中。對于本申請要求優(yōu)先權(quán)的任何專利申請，按照本文描述的出版物和參考文獻的方式，以其全部結(jié)合到本文中作為參考。為避免疑惑，本發(fā)明人的意圖為本文的術(shù)語'包含，在每種情況下都任選地可被術(shù)語"由……組成"替代。本發(fā)明將參考以下的非限制性實施例進一步描述實施例I描述了雪貂和人研究中使用的免疫解讀方法。實施例II描述了用于示例性研究的水包油乳液和佐劑制劑的制備和特征。實施例III說明了在雪貂中的佐劑化和無佐劑流感疫苗的臨床前評價。實施例IV描述了在18-60歲的成年人群中用包含裂解流感病毒抗原制品的疫苗進4亍的臨床試-險，所述制品得自于大流4亍H5N1菌4朱和AS03佐劑。實施例I-免疫解讀方法1.1.雪貂法合適方法如下，用季節(jié)性菌抹進行的實驗通常使用該方法。技術(shù)熟練的讀者可以理解，根據(jù)所使用的流感病毒菌株，可以將其進行一些修改或優(yōu)化。1.1丄血凝反應(yīng)抑制測試(HI)測試禾呈序使用血凝反應(yīng)抑制測試(HI)測定針對流感病毒菌抹的抗血細胞凝集素抗體滴度。HI測試的原理基于特異性抗流感抗體通過流感病毒血細月包凝集素(HA)抑制馬紅血細胞(RBC)血凝反應(yīng)的能力。預(yù)處理血清(cholera，RDE,熱失活)之后，將血清的兩倍稀釋物用4個血凝反應(yīng)單位的流感病毒菌抹進行培養(yǎng)。然后加入馬(適應(yīng)火雞或馬)紅細力包，記錄凝集抑制。滴度表示為完全抑制血凝反應(yīng)的血清最高稀釋度的倒數(shù)。由于血清的第一個稀釋度是1:10,所以不可檢測水平記錄為等于5的滴度?？梢栽谙旅娴?.2.1.部分中看到更詳細的描述。1.1.2.體溫監(jiān)測在用氯胺酮-隆朋(rompun)-阿托品混合物(2,5%-0，25%-0，025%)麻醉的第14天，利用植入到腹膜腔中(通過腹白線處的小切口)的溫度傳感器(StarOddi，Iceland)探測體溫。用縫線封閉傷口，每天檢查。1.2.3.病毒滴定從所有的動物中收集咽部、鼻和直腸拭子。將單一體拭子放在3ml病毒傳播介質(zhì)(VTM;無菌的PBS或合適的等滲溶液，例如Hank'sBSS,包含抗生素(100單位/ml青霉素，100^g/ml鏈霉素)和2%胎兒牛血清或0.5%凝膠)中，并在-80。C儲藏，直到分析為止。尸體解剖之后，將每個動物右肺的腹側(cè)頭向、脊背頭向、腹側(cè)尾向和脊背尾向部分稱重，并在-S(TC儲藏，直到分析為止。將肺部分在3mlVTM中均化。利用H5N1特異性TaqManPCR和MadineDarby犬腎臟(MDCK)細胞上的病毒滴定培養(yǎng)物來測定病毒滴度。對于TaqManPCR,病毒H5N1FluRNAs是從雪貂樣品中提取的，而后通過使用引物和探針的(在流感病毒基因組的保守區(qū)域設(shè)計的)定量RT-PCR試驗進行擴增。數(shù)據(jù)可以分別用控制稀釋單元(CDU)和每克肺組織或每ml拭子的TCID5Q來表示?？刂葡♂寙卧?CDU)-CDUs是用標準曲線測定的，標準曲線由連續(xù)稀釋的病毒原料產(chǎn)生，對各個稀#物進行核苷酸提取，和用和試-驗樣品同樣的方法進行TaqmanPCR擴增。對于病毒培養(yǎng)物，將所有樣品的系列稀釋物轉(zhuǎn)入包含介質(zhì)和MDCK細胞的微孔板中，而后在35。C培養(yǎng)5-7天。培養(yǎng)之后，通過"ReedandMuench"測定病毒釋出滴度，并且以每克肺組織或每ml拭子的LogTCID50的形式表示。1.1.4.中和抗體試-驗對融化的冷凍血清樣品進行中和抗體檢測。在微量中和實驗中，測定包含在血清中的抗體的病毒中和。血清在實驗中無需進一步處理即可使用。各個血清以三重測定進行測試。將標準化量的病毒與連續(xù)稀釋的血清混合并培養(yǎng)，以使抗體結(jié)合病毒。然后將含限定量的MDCK細胞的細力包懸浮液加入到病毒和抗血清的混合物中，于33。C培養(yǎng)。培養(yǎng)期后，通過小雞紅細胞的凝集反應(yīng)顯現(xiàn)病毒復(fù)制。利用ReedandMuench的方法計算血清的50。/。中和滴度(Am.J;Hyg.1938,27:493-497)。1.2.評價人免疫應(yīng)答的試驗1.2.1.血凝反應(yīng)抑制試-瞼使用WHO流感合作中心，疾病控制中心，Atlanta,USA(1991)描述的方法，通過測定HI抗體來測定免疫應(yīng)答。使用4個血凝反應(yīng)抑制單位(4HIU)的適宜抗原和0.5%禽紅細胞懸浮液(或?qū)τ贖5N1，使用0.5%禽和馬)，用標準的和綜合驗證過的微量法對融化的冷凍血清樣品進4亍抗體滴度片企測。通過熱處理和受體破壞酶去除非特異性血清抑制劑。評價所獲血清的HI抗體水平。以1:10起始稀釋度開始，制備稀釋度系列(倍數(shù)為2),直至最終稀釋度1:20480。把顯示完全抑制(100%)血凝反應(yīng)的最高稀釋度步驟4i^L為滴定終點。所有實-驗都以雙份進行。H5N1的修改〃使用馬紅細胞具體說明HI:將糖蛋白(凝血素)定位在病毒被膜中，并且能夠凝聚許多物種例如大仔雞的紅血球(紅細胞)。血細胞凝集抑制試驗分為兩步驟進行抗原抗體反應(yīng)使流感抗原(DTA,滲析試-驗抗原)與受試者血清的抗體反應(yīng)。過量抗原的凝集使過量抗原與加入的紅細胞反應(yīng)將馬的紅血球用于H5N1大流4亍菌才朱。在包含0.5%BSA(牛血清白蛋白，終濃度)的磷酸鹽緩沖液中的0.5%(終濃度)馬紅細胞懸浮液。每天通過用相同磷酸鹽緩沖液洗滌紅細胞來制備該懸浮液，并且隨后進行離心步驟(10分鐘，2000每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))。這種洗滌步驟必須重復(fù)一次。將馬紅細胞加入到反應(yīng)混合物(受試者血清和病毒懸浮液)中之后，必須在室溫下(RT,20"€+/-2°(3)培養(yǎng)平皿兩個小時，因為馬紅細^^的沉降速率^氐。1.2.2.神經(jīng)氨酸酶抑制試-瞼在涂漬胎球蛋白的微量滴定板中進行試驗。制備2倍連續(xù)稀釋的抗血清，與標準化量的曱型流感H3N2、H1N1或乙型流感病毒混合。試馬全基于由胎球蛋白酶的酶作用釋放神經(jīng)氨酸的神經(jīng)氨酸酶生物活性。43在裂解末端神經(jīng)氨酸后，fi-D-半乳糖-N-乙酰基-氨基半乳糖暴露出來。向各孔加入來自落花生的辣根過氧化物酶(HRP)標記的花生凝集素，其特異性結(jié)合半乳糖結(jié)構(gòu)?？稍诤募谆?lián)苯胺(TMB)的底物反應(yīng)中檢測和定量結(jié)合凝集素的量。表明仍抑制病毒神經(jīng)氨酸酶活性達至少50%的最高抗體稀釋度為NI滴度。L2.3.中和抗體試-驗對融化的冷凍血清樣品進行中和抗體才企測。在微量中和實^驗中，測定包含在血清中的抗體的病毒中和。血清在實-驗中無需進一步處理即可使用。各個血清以三重測定進行測試。將標準化量的病毒與連續(xù)稀釋的血清混合并培養(yǎng)，以使抗體結(jié)合病毒。然后將含限定量的MDCK細胞的細胞懸浮液加入到病毒和抗血清的混合物中，并于33。C培養(yǎng)。培養(yǎng)期后，通過小雞紅細胞的凝集反應(yīng)顯現(xiàn)病毒復(fù)制。利用ReedandMuench的方法計算血清的50。/。中和滴度(Am.J;Hyg.1938,27:493-497)。1.2.4.通過細胞因子流式細胞儀(CFC)評價細胞介導(dǎo)的免疫性如果用其對應(yīng)抗原培養(yǎng)，可將外周血抗原特異性CD4和CD8T細胞進行體外再刺激，以產(chǎn)生IL-2、CD40L、TNF-oc和IFN。因此，抗原特異性CD4和CD8T細力包可在常規(guī)免疫熒光標記的細胞表型以及胞內(nèi)細胞因子產(chǎn)生后通過流式細胞儀計數(shù)。在本研究中，流感疫苗抗原用作再刺激流感特異性T細胞的抗原。結(jié)果表示為CD4或CD8T細胞亞群中細胞因子陽性CD4或CD8T細J包的頻率。1.2.5.利用ELISPOT的記憶B細胞ELISPOT技術(shù)可以定量分析記憶B細胞對于所給定抗原的特異性。用CpG培養(yǎng)5天之后，可以誘導(dǎo)記憶B細胞體外分化為漿細胞。因此，可以使用ELISPOT試驗，計數(shù)體外產(chǎn)生的抗原特異性漿細胞。筒要地說，在涂有抗原的培養(yǎng)i中培養(yǎng)體外產(chǎn)生的漿細胞。抗原特異性漿細胞形成抗體/抗原斑點，其可以通過常規(guī)免疫酶催過程檢測。在目前研究中，使用流感疫苗菌抹或抗人免疫球蛋白來涂漬培養(yǎng)i,以便分別計數(shù)流感特異性抗體或IgG屏蔽(secreting)漿細胞。結(jié)果可以表示為在產(chǎn)生IgG的漿細胞內(nèi)的流感特異性抗體屏蔽漿細胞的頻率。1.2.6.纟克-計方法1.2.6.1.主要終點44在接種后的7天隨訪期(即接種日和隨后6天)以及整個過程中訴求的局部和全身征兆和癥狀的百分率、強度以及同接種的關(guān)聯(lián)。.在接種后的21天隨訪期(即接種日和隨后20天)以及整個過程中主動提供的局部和全身征兆和癥狀的百分率、強度以及同與接種的關(guān)聯(lián)。整個研究過程中嚴重不良事件的發(fā)生。1.2.6.2.次要終點對于體液免疫應(yīng)答，見察的變量在0天和21天血清血凝反應(yīng)抑制(HI)和NI抗體滴度，分別對疫苗中代表的三種流感病毒菌抹的每一種測試(抗-HlNl、抗-H3N2和抗-B-抗體)。在0天和21天中和抗體滴度，分別對疫苗中代表的三種流感病毒柹、的每一種測試。衍生的變量(具有95%置信區(qū)間).接種前和接種后具有95%置信區(qū)間(95%CI)的血清HI抗體的幾何平均滴度(GMTs)21天時具有95%(31的血清陽轉(zhuǎn)率*21天時具有95%CI的轉(zhuǎn)變因子**.21天時具有95%CI的血清保護率***在所有時間點的血清NI抗體GMT(具有95%置信區(qū)間)*血清陽轉(zhuǎn)率定義為相比于第0天，在第21天時針對每種疫苗株的血清HI滴度增加至少4倍的接種者的百分率。**轉(zhuǎn)變因子定義為相比于第0天，在第21天時針對每種疫苗林的血清HIGMT增加的倍數(shù)。***保護率定義為接種后(針對每種疫苗林)的血清HI滴度等于40的接種者百分率，通常將該滴度看作指示保護作用。對于細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答觀察的變量在第0天和21天不同測試中每1(^當中細^g包因子陽性CD4/CD8細胞的頻率。每個測試都定量CD4/CD8T細胞針對以下物質(zhì)的應(yīng)答肽流感(pf)抗原(這些抗原的精確性質(zhì)和來源必須給出/解釋)裂解流感(sf)抗原全流感(wf)抗原衍生的變量.產(chǎn)生至少兩種不同細月包因子(CD40L、IL-2、IFNy、TNFa)的細胞.產(chǎn)生至少CD40L和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、IFNy)的細胞產(chǎn)生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L、TNFa、IFNy)的細胞產(chǎn)生至少IFNY和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、CD40L)的細胞.產(chǎn)生至少TNFa和另一種細月包因子(il-2、CD40L、IFNy)的細胞1.3.5.3.免疫原性的分析免疫原性分析基于總接種群體。對于每個治療組，計算以下參數(shù)(具有95%置信區(qū)間).在第0天和21天時HI和M抗體滴度的幾何平均滴度(GMT).在第0天中和21天時中和抗體滴度的幾何平均滴度(GMT)21天時的轉(zhuǎn)變因子.21天時的血清陽轉(zhuǎn)率(SC),定義為相比于第O天，在第21天時血清HI滴度增加至少4倍的接種者百分率。21天時的保護率定義為血清HI滴度=1:40的接種者百分率。.在各個時間點(第0天、第21天)針對每個接種組和針對每種抗原(肽流感(pf)抗原、裂解流感(sf)抗原和全流感(wf)抗原)總結(jié)CD4/CD8T-淋巴細胞屏蔽應(yīng)答的頻率(描述統(tǒng)計)。在各5種不同測試中對于每個接種組和每種抗原(pf、sf和wf)，在時間點(接種后-接種前)之間個體應(yīng)答差異的描述統(tǒng)計。使用無參數(shù)檢驗(Kmskall-Wallis檢驗)比較3組之間的局部差異，以各5種不同測試計算每種抗原的統(tǒng)計學p-值。所有顯著性檢驗都是雙尾的。低于或等于0.05的P-值被看作是統(tǒng)計學顯著的。實施例n-水包油乳液和佐劑制劑的制備和特征(a-生育酚和鯊烯)組成的有機相和含Tween80作為乳化劑的PBS水相。除非另有說明，否則在隨后的實施例中使用的水包油乳液佐劑制劑都制46成含以下的水包油乳化組分(給出終濃度)2.50/。鯊歸(v/v)、2.5%a-生育酚(v/v)、0.9。/。聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(v/v)(Tween80),參見WO95/17210。該乳液在隨后的實施例中稱為AS03，如下制備為2倍濃縮物。n.l.乳液SB62的制備IU丄實驗室規(guī)模制備將Tween80溶解在磷酸緩沖鹽水(PBS)中，獲得2%的PBS溶液。為提供100ml的2倍濃縮乳液，》走轉(zhuǎn)5gDLcc生育酚和5ml鯊烯，以徹底混合。加入90mlPBS/Tween溶液，徹底混合。然后將獲得的乳液通過注射器，最后使用M110S微流控設(shè)備進行微射流。獲得的油滴具有約120-180nm的大小(表示為通過PCS檢測的Z均值)。將其它佐劑/抗原組分加入到簡單混合物的乳液中。IU.2.放大規(guī)模的制備通過在強攪拌下混合由疏水組分(oc-生育酚和鯊烯)組成的油相和含水溶性組分(Tween80和PBSmod(改良型)，pH6.8)的水相，制備SB62乳液制品。在攪拌的同時，將油相(1/10總體積)轉(zhuǎn)移至水相(9/10總體積)，于室溫攪拌混合物15分鐘。然后在微流控器的相互作用腔中對獲得的混合物施加剪切力、沖擊力和空化力(15000PSI，8個循環(huán))，以產(chǎn)生亞微米油滴(分布在100-200nm之間)。獲得的pH在6.8±0.1之間。然后^f吏SB62乳液通過0.22inm膜過濾除菌，將除菌的原乳液冷凍儲存于2-8。C的Cupac容器中。將無菌惰性氣體(氮氣或氬氣)通入SB62最終原乳化液容器的死體積中達至少15秒。SB62乳液的最終組成如下Tween80:1.8%(v/v)19.4mg/ml;變烯5%(v/v)42.8mg/ml;cx-生育酚5%(v/v)47.5mg/ml;PBS-mod:NaCl121mM,KC12.38mM,Na2HP〇47.14mM,KH2P041.3mM;pH6.8±0.1。II.2.油滴粒度的動態(tài)光散射檢測n.2丄簡介油滴直徑的大小纟要照以下方法并在以下實-瞼條件下測定。油滴粒度量度以強度量度提供，并表示為通過PCS檢測的z均值。II.2.2.樣品制備對水包油乳液佐劑進行粒度纟全測，所述水包油乳液佐劑為4安照放大規(guī)模方法制備的SB62、AS03和AS03+MPL(50嗎/ml),后兩種臨使用前制備。樣品的組成在下文給出(參見章節(jié)11.2.4)。樣品用PBS7.4稀釋4000倍至8000倍。作為對照，用10mMNaCl稀釋PL-Nanocal粒度標準品100nm(目錄號6011-1015)。11.2.3.MalvernZetasizer3000HS粒度才僉測所有的粒度檢測都用兩臺MalvemZetasizer3000HS檢測。樣品以合適的稀釋度(通常為4000倍至20000倍的稀釋度，取決于樣品濃度)在用于Malvern分析的塑料比色皿中檢測，并采用兩種光學才莫式-或者真實的粒子折射率0和假想折射率0。-或者真實的粒子折射率1.5和假想折射率O.Ol(按照在文獻中得到的值，對乳液采用適合的光學模式)。技術(shù)條件如下-激光波長532nm(Zeta3000HS)。-激光功率50mW(Zeta3000HS)。-于90°才企測的散射光(Zeta3000HS)。.陽溫度25。C,-持續(xù)時間由軟件自動確定，-次數(shù)3次連續(xù)檢測，-z均值直徑通過累積量分析-粒度分布通過Contm或自動4b方法。自動化Malvern算法使用累積量、Contm和非負最小二乘(NNLS)算法的組合。由于Mie理論，強度分布可轉(zhuǎn)變?yōu)轶w積分布。11.2.4.結(jié)果(參見表2)累積量分析(Z均值直徑)表2樣品稀釋度記錄計數(shù)率ZAD多分散性SB625000179871530.06275201530.06365861520.07平均值73641530.06SB62(實施例IV)8000186401510.03286561510.00386341500.00平均值86431510.01SB62+MPL25ng(承),0187201540.03286591510.03387101520.02平均值86971520.02(*)如下制備注射用水、PBS10x濃縮液、250piSB62乳液和25嗎MPL混合在一起，以達到280pl終體積。z均值直徑(ZAD)大小以樣品中各種粒度的散射光量來權(quán)重(weighed)度量。該值與樣品的單峰分析相關(guān)，主要用于重現(xiàn)目的。計數(shù)率(CR)是散射光的檢測結(jié)果其對應(yīng)于每秒光子的千數(shù)。多分散性(Poly)指數(shù)是分布的寬度。其是分布廣泛性的無量綱檢測結(jié)果。Contm和自動化分才斤已按照以上闡述并帶有下述些微改變的方法制備和評價兩種另外的SB62制品(2倍濃縮的AS03):在為獲得用于Zetasizer3000HS的最佳計數(shù)率值而確定的兩個稀釋度10000x和20000x,在用于Malvern分析的塑料比色皿中檢測樣品，光學^t式與以上實施例中使用的相同。結(jié)果示于表3中。49表3SB62稀釋度IRContin分析(nm平均值)自動分析(nm平均值)真實值假想值強度體積強度體積10221/1000000149167150一1.50.011581391551431/20000001592001551961.50.01161141147-1023l細OO00158198155一1.50.011611401501441/20000001541851511821.50.01160133154--"此時獲得的值不一致。這些結(jié)果的示意圖示于圖1的制劑1023。由其可見，絕大部分粒子(例如至少80%)以強度計具有小于300nm的直徑。II.2.5.整體結(jié)i侖用MalvernZetasizer3000HS和兩種光學模式檢測不同稀釋度的SB62制劑。以上評價的制劑的粒度ZAD(即通過累積量分析獲得的強度平均值)約為150-155nm。當使用累積量算法時，我們觀察到稀釋度對ZAD和多分散性沒有影響。實施例III-佐劑化大流行裂解流感疫苗(包含H5N1菌抹)在雪貂中的臨床前評價III.1.基本原理和目標考慮感染敏感性和臨床應(yīng)答，雪貂模式的流感感染接近地類似人類流感。雪貂對曱型和乙型流感病毒(不含先前采用的病毒抹)感染是高度敏感的。因此，對于通過給予流感疫苗而賦予的保護研究，它提供了出色的才莫型系統(tǒng)。該研究探究了用AS03佐劑化的H5N1裂解疫苗針對用H5N1同抹50亡攻擊的雪貂的保護-丈果。實驗的目標是為了相比于用PBS或單獨佐劑進行免疫的雪貂，證明佐劑流感疫苗的效果。III.2.實驗設(shè)計III.2.1.治療/組〖表4)在第0天和21天，用全部人劑量(500pl疫苗劑量)肌肉內(nèi)注射36只成年遠系繁殖雄性雪貂(Mustelaputoriusfuro)(6只雪貂/組)(年齡大約8個月，體重0.8-1.5kg)。用與AS03組合的四個不同濃度的A/越南/1194/2004(NIBRG-14)(15、5.0、1.7和0.6jugHA)(標準人類劑量，250jiU/劑量)使四組雪貂(n=6)免疫。兩個對照組由安慰劑和AS03處理的動物組成。在第21天和42天收集血清，用于分析血清應(yīng)答。通過血凌是抑制反應(yīng)試驗，測定同源病毒的抗體滴度(HI滴度)。在第49天，通過鼻內(nèi)途徑，用1(^TCID5。劑量的同型菌抹A/越南/1194/04攻擊動物。在攻擊期間，收集鼻、咽喉和直腸拭子，以評價病毒釋出。尸體解剖之后，將每個動物右肺的腹側(cè)頭向、脊背頭向、腹側(cè)尾向和脊背尾向部分稱重，并在_80。C儲藏，直到分析為止。利用H5N1特異性TaqManPCR和MDCK細胞上的病毒滴定培養(yǎng)物來測定病毒滴度。數(shù)據(jù)可以分別用控制稀釋單位(CDU)和每克肺組織或每ml拭子的TCID5。來表示。CDU是用標準曲線測定的，標準曲線由連續(xù)稀釋的病毒原料產(chǎn)生，對各個稀釋物進行核苷酸提取，并用和試,驗樣品同樣的方法進行TaqmanPCR擴增。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>HI.2.2.疫苗制劑的制備111.2.2.2.用500^1劑量的水包油型乳狀液佐劑AS03A佐劑化的裂解H5N1方案1在包含硫柳汞、Tween80和TritonX100(其數(shù)量應(yīng)考慮它們在菌抹中的濃度)的最終原液緩沖液(PBSpH7.4)中預(yù)先制備預(yù)混合的緩沖液。免疫的當天，將15-5-1.7或0.6(ig的H5N1菌抹加入到預(yù)混合緩沖液中。攪拌30分鐘之后，加入250(al的SB62乳液。攪拌制劑30分鐘。在制劑完成1小時之內(nèi)，進行注射。方案2合適地，制劑制備如下。將Tween80、TritonXI00和石危柳汞加入到最終原液緩沖液(其數(shù)量應(yīng)考慮它們在菌抹中的濃度)中。攪拌5分鐘之后，加入15-5-1.7或0.6pg的H5N1菌抹。攪拌30分鐘之后，加入250pl的SB62乳液。攪拌制劑30分鐘。在制劑完成1小時之內(nèi)，進行注射。111.2.2.3.500W劑量AS03A方案1將250^1SB62乳液與250|ilPBSpH6.8混合，攪拌5分鐘，在4°C儲藏，直到給予為止。方案2合適地，制劑制備如下。將250plSB62乳液與250(ilPBSpH6.8混合，攪拌5分鐘。在制劑完成l小時之末，進行注射。注釋在各個制劑中，加入10倍濃縮的pbs，達到等滲，并且在最終體積中是l倍濃縮的。計算水體積，以達到目標體積。III.2.3.解讀(表5)表5<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>III.3.結(jié)果和結(jié)論表6總結(jié)了用同源H5N1菌抹攻擊之后的保護數(shù)據(jù)、HI滴度和肺組織與咽部拭子所帶病毒(在雪貂中獲得)。表6.針對用同源H5N1流感病毒的攻擊，用AS03佐劑化的H5N1接種的雪貂的保護。病毒荷載(數(shù)/總數(shù))e接種方案死亡數(shù)/總數(shù)HI滴度b肺組織(。/cO咽部拭子(%保護)3(%)PBS4/5(20)-5/5(100)5/5(100)單獨AS036/6(0)-6/6(100)6/6(100)AS03佐劑化的H5N1(0.6pg)2/6(67)+4/6(67)2/6(33)AS03佐劑化的H5N1(1.7嗎)1/5(80)+1/5(20)1/5(20)AS03佐劑化的H5N1(5pg)0/6(100)+++2/6(33)2/6(33)AS03佐劑化的H5N1(15嗎)0/6(100)+++1/6(17)1/6(17)a在接種期間(25天)，將用PBS免疫的一個動物和用1.7iag佐劑化疫苗的HA免疫的一個動物安樂死。在接種和這些致死率之間不存在明顯的聯(lián)系。b幾何平均HI滴度(D42):+++(>160),++(60陽160)+(40-60),-(<40)。c利用病毒培養(yǎng)物，確定帶有病毒載荷>102TCID5Q(每g組織或每ml拭子)的動物數(shù)目。m.3丄保護數(shù)據(jù)在用H5N1攻擊之前，將兩個動物安樂死。在接種期間(14天)，將用PBS免疫的一個動物安樂死(因為過分失重)。在接種期間(25天)，將用1.7ng佐劑化疫苗的HA免疫的一個動物安樂死(因為過分失重)。在接種和這些致死率之間不存在明顯的聯(lián)系。在用AS03佐劑化的H5N1疫苗接種的雪貂中，用A/越南/1194/04攻擊，表明了抗原劑量-依賴性保護或存活曲線(表6)?？梢员Ｗo所有用是，在所有用AS03佐劑化疫苗免疫的雪貂組中，針對同源A/越南/1194/2004病毒的平均HI滴度>40，包括在得到最低劑量的組中，在用AS03佐劑化的0.6和1.7pgH5N1裂解疫苗免疫的雪貂中，針對同源攻擊分別獲得66.67和80.00%的保護。用PBS或單獨佐劑免疫的所有雪紹，顯示出高于105TCID5o/g肺組織的病毒載荷，并且在咽部，在整個感染期間，所有動物釋出高水平病毒。相反，在大部分動物中，給予AS0354佐劑化疫苗可以降低病毒載荷，至低于每克肺組織或每ml液體(得自于咽部拭子)lt^TCID5o的閾值(表6)。用AS03佐劑化疫苗免疫的每組雪貂中，僅僅一或兩個具有中等至高病毒載荷(〉102TCID50)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)進行的統(tǒng)計分析產(chǎn)生下列結(jié)論-所有的疫苗劑量統(tǒng)計上不同于對照組-P值(Fischer's精密試驗)范圍從0.0276(對于最低的劑量)至0.0006(對于最高的劑量)-在這種模型中，誘導(dǎo)90%保護的估計劑量是2.9pg-在這種模型中，誘導(dǎo)100%保護的最低劑量估計在2.9和5嗎之間。m.3.2.體液應(yīng)答(m滴度)在每次免疫之后的第21和42天，測定體液對接種的免疫應(yīng)答。佳_用馬紅血球，通過血凝反應(yīng)抑制(HI)試驗測試血清樣品。結(jié)果提供于表6中。相比于用單獨PBS或AS03免疫的雪貂，AS03佐劑化單價H5N1裂解制劑誘導(dǎo)對同源菌抹的最強的HI應(yīng)答。與接受兩個最低劑量(佐劑化疫苗的1.7或0.8pgHA)的雪貂中的較低免疫應(yīng)答相比，可以在用最高抗原劑量(佐劑化疫苗的15或5pgHA)的劑量免疫的雪貂中觀察到所獲得的具有最高HI滴度的抗原劑量效果。如表6和圖2A所示，在用A/越南H5N1攻擊的雪貂中，發(fā)現(xiàn)在Hi滴度和保護之間具有相關(guān)性。在用H5N1裂解疫苗(用AS03佐劑化)免疫的雪貂中，高于40的HI滴度似乎與保護有關(guān)。111.3.3.體液應(yīng)答(中和抗體滴度)在每次免疫之后的第21和42天，也通過中和作用試-驗來測試體液對接種的免疫應(yīng)答。結(jié)果提供于圖3中。相比于單獨用PBS或AS03免疫的雪貂，AS03佐劑化單價H5N1裂解制劑誘導(dǎo)對異源菌抹的最強的中和抗體應(yīng)答。與接受兩個最低劑量(佐劑化疫苗的1.7或0.8figHA)的雪貂中的4支低免疫應(yīng)答相比，可以在用最高抗原劑量(佐劑化疫苗的15或5pgHA)的劑量免疫的雪貂中觀察到所獲得的具有最高HI滴度的抗原劑量效果。111.3.4.A/越南H5N1同源攻擊之后的病毒l奪出利用肺組織和鼻/咽喉/直腸4式子上的病毒培養(yǎng)物和TaqManPCR進4亍病毒釋出。55如表6所示，在用AS03佐劑化H5N1裂解疫苗免疫的雪貂中，根據(jù)肺組織和咽部拭子所荷載的病毒的減少(大部分動物低于102TCIDso每克組織或每ml拭子)，也觀察到保護作用。單獨用PBS或佐劑免疫的所有雪貂，在整個感染期間，在肺組織和在咽部，顯示出高病毒載荷。圖2B表明，在各個組中，通過PCR和病毒培養(yǎng)物，測定了平均病毒荷載。這表明，相對于單獨得到PBS或佐劑的對照組，得到佐劑化疫苗的所有組往往顯現(xiàn)出病毒荷載減少，用0.7pg佐劑化疫苗的HA免疫的雪貂顯示了病毒荷載的更適度的減少。可以看到，在用1.6、5或15貼佐劑化疫苗的HA免疫的雪貂之間差別不大。最后，對于肺中的病毒載荷，PCR結(jié)果與病毒滴定一致。此外，通過病毒培養(yǎng)物和PCR,在鼻和直腸拭子以及血漿中探究了病毒釋出。一般，與PCR分析相比較，病毒滴定不太敏感。該分析表明，接受PBS的2/5雪貂的鼻腔和直腸拭子中存在H5N1病毒。在該組中，1/5動物也在血清中釋出病毒。在直腸拭子或血漿中，用AS03佐劑化H5N1裂解疫苗免疫的動物，都沒有釋出病毒。有趣的是，各個獨立雪貂的分析表明，一些保護的雪貂具有高病毒載荷和低HI滴度，表明獲III.3.5.體溫探測所有動物的體溫。在接種期間，沒有觀察到身體溫度變化。用A/越南/1194/04攻擊可以引起發(fā)燒，身體溫度從40。C至42。C,起始攻擊之后，在12至24小時之間具有峰值。在經(jīng)受得住攻擊的動物中，在感染期間，身體溫度降低至正常水平。在第5天之前死亡的動物，在達到發(fā)燒峰值之后，顯示了體溫的快速降低。總之，血清學試"險表明，相比于單獨用PBS或佐劑免疫的動物，在用佐劑化疫苗免疫的動物中獲得的HI滴度顯著地高。用同源A/越南/1194/04病毒攻擊，顯示了抗原劑量依賴性存活曲線，相比于對照組，肺組織和咽部拭子(得到佐劑化疫苗的組)中的病毒載荷減少。對照組中的所有動物(用PBS或佐劑單獨免疫)釋出病毒到上呼吸道中，病毒載荷高于105TCIDWg肺，而在得到佐劑化疫苗的組中，僅僅一定比例的動物釋出病毒到上呼吸道中(4/17,105至107TCID50/g肺組織。大部分低于1(^TCID5o每克肺或每ml咽部拭子)。此外，與僅僅用安慰劑和佐56劑治療的組相比，得到佐劑化疫苗的組的肺組織中的病毒滴度降低。這種降低部分地由于抗原劑量依賴性，在5嗎抗原處達到明顯的平臺期。實施例IV在成年人口(年齡在18和60歲之間的成人)中用包含裂解流感抗原制劑和AS03佐劑的疫苗的臨床試-瞼IV.l.簡介在2006年在年齡18至60歲的成年人群中，普遍進行I期、盲測、隨機化的研究，以便評價大流行性流感候選物(以不同的抗原劑量(3.8pg,7.5pg,15(ig和30pgHA)給予，用佐劑AS03佐劑化、或不用佐劑AS03)的反應(yīng)原性和免疫原性。兩次肌注給予候選疫苗制劑的每次之后21天，測定體液免疫應(yīng)答(即抗血凝素、中和和抗神經(jīng)氨酸酶抗體滴度)和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(CD4和/或CD8T細胞應(yīng)答)。對于得到相同抗原含量的相應(yīng)的佐劑化組，無佐劑化的組充當參比。IV.2.研究設(shè)計使八個組(每組50個受試者)(計劃)平行得到下列疫苗(肌肉內(nèi))■一個組的50個受試者得到兩次給予大流行裂解病毒流感疫苗(包含3都gHA)■一個組的51個受試者得到兩次給予大流行裂解病毒流感疫苗(包含3.^gHA并用AS03佐劑化)■一個組的50個受試者得到兩次給予大流行裂解病毒流感疫苗(包含7.5pgHA)■一個組的50個受試者得到兩次給予大流行裂解病毒流感疫苗(包含7.5pgHA并用AS03佐劑化)醒一個組的50個受試者得到兩次給予大流行裂解病毒流感疫苗(包含15貼HA)■一個組的50個受試者得到兩次給予大流行裂解病毒流感疫苗(包含15pgHA并用AS03佐劑化)園一個組的50個受試者得到兩次給予大流行裂解病毒流感疫苗(包含30嗎HA)畫一個組的49個受試者得到兩次給予大流行裂解病毒流感疫苗(包含30ngHA并用AS03佐劑化)進行注冊，以保證每個組的一半受試者年齡在18和30歲之間。接種日程在第o和21天，兩次注射大流4亍性流感候選疫苗，收集血樣，在第21和42天解讀分析(HI抗體測定，NI抗體測定，中和抗體測定，和CMI分析)，研究結(jié)論(第51天)和研究終點(第180天)。IV.3.研究目標IV.3丄主要目標-按照抗血球凝集素抗體滴度，評價所研究疫苗引起的體液免疫應(yīng)答。-按照誘發(fā)的(solicited)局部和一般不利狀況、未誘發(fā)的(unsolicited)不利狀況和嚴重的不利狀況，評價所研究疫苗的安全和反應(yīng)原性。對于沐液免疫應(yīng)答在第0、21、42和180天觀察變量血清血凝-抑制抗體滴度。衍生變量(具有95%置信區(qū)間)-在第0、21、42和180天血清抗體的幾何平均滴度(GMT)-在第21、42和180天的血清陽轉(zhuǎn)率*畫在第21、42和180天的轉(zhuǎn)化因子**-在第0、21、42和180天的保護率****血球凝集素抗體應(yīng)答的血清陽轉(zhuǎn)率定義為接種前滴度<1:10和接種后滴度M:40或接種前滴度21:10并且接種后滴度具有至少四倍增加的接種者的百分比**轉(zhuǎn)化因子定義為相比于第0天，接種后血清HIGMT的增加倍數(shù)；***保護率定義為接種之后血清HI滴度240的接種者的百分比，通常將該滴度視作指示保護作用。安全/反應(yīng)原性^H介1.在每次接種后的7天隨訪期(即接種日和隨后6天)以及整個過程中誘發(fā)的局部和全身征兆和癥狀的百分率、強度以及同接種的關(guān)聯(lián)。2.在首次接種后的21天隨訪期，在第二次接種后的30天隨訪期以及整個過程中主動提供的局部和全身征兆和癥狀的百分率、強度以及同與接種的關(guān)聯(lián)。整個研究過程中嚴重不良事件的發(fā)生。IV.3.2.次要目標58-按照血清中和抗體滴度，評價所研究疫苗引起的體液免疫應(yīng)答。-按照流感特異性004/。08T淋巴細胞的頻率，評價所研究疫苗引起的細萬包介導(dǎo)免疫反應(yīng)。此外，使用Elispot技術(shù)，評價接種對流感特異性記憶B細胞的影響。對于體液免疫應(yīng)答在第0、21、42和180天觀察的變量血清中和抗體滴度。衍生的變量(具有95%置信區(qū)間)-在第0、21、42和180天血清抗體的幾何平均滴度(GMT)陽在第21、42和180天的血清陽轉(zhuǎn)率**中和抗體應(yīng)答的血清陽轉(zhuǎn)率定義為接種后滴度最少增加4倍的接種者的百分比。對于CMI應(yīng)答1.在產(chǎn)生至少兩種不同細胞因子(CD40L,IL-2,TNF-a,IFN-力的試驗中，細胞因子CD4/CD8細胞(每106)的頻率2.在至少產(chǎn)生CD40L和另一個信號分子((IL-2，IFN-y,TNF-a))的試驗中，細胞因子陽性CD4/CD8細胞(每106)的頻率3.在至少產(chǎn)生IL-2和另一個信號分子(CD40L,IFN-y，TNF-a)的試驗中，細胞因子陽性CD4/CD8細胞(每106)的頻率4.在至少產(chǎn)生TNF-a和另一個信號分子(IL-2，IFN-y,CD40L)的試驗中，細胞因子陽性CD4/CD8細胞(每106)的頻率在至少產(chǎn)生IFN-y和另一個信號分子(CD40L，IL-2,TNF-a)的試-驗中，細l包因子陽性CD4/CD8細月包(每106)的頻率試驗中，在第0、21、42和180天，每106個細胞的流感特異性記憶B細力包的頻率。IV.4.疫苗組合物和給予(表7)III.4.1.疫苗制備III.4.1.1.AS03佐劑化的流感疫苗的組合物AS03包含水包油SB62乳液，SB62乳液由包含DL-a-生育酚和鯊烯的油相與包含非離子型去污劑聚山梨酸酯80的水相組成。大流行性流感疫苗候選物的活性物質(zhì)是衍生自疫苗病毒抹A/越南/1194/2004(H5N1)NIBRG-14的甲醛失活的裂解病毒抗原。HA抗原的劑59量是每劑量3.8至30jLlg。用于制備AS03佐劑化流感疫苗的裂解病毒單價原液是按照與GSK生物制品特許的流行病流感疫苗？11^壓71^/06-111乂@所使用方法的相同方法制備的。為了該臨床試驗，用于制備臨床批次的病毒抹是H5N1疫苗抹A/越南/1194/04NIBRG-14重組體H5N1原型疫苗抹，其衍生自高度致病的A/越南/1194/04。通過NIBSC,爿使用反向遺傳學，已經(jīng)形成這種重組體原型菌抹(合適參考文獻是Nicolson等人2005,Vaccine,23，2943-2952))。重配林使H5和Nl片段與A/PR/8/34菌株骨架結(jié)合，并且使H5消除氨基-酸在HA裂解位點(其負責原始菌林的高毒性)的多元伸展。這是如下獲得的帶有含人類HA基因(改性，以除去高致病性決定因素)和NA基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染Vero細胞分離A/越南/1194/2004(H5N1)和包含PR8的內(nèi)部基因的質(zhì)粒。使救活的病毒兩次通過卵，然后按照參考文獻命名為病毒NIBRG-14。這種H5N1重配抹的減毒特征在臨床前的安全評估(由NIBSC進行)中進行了廣泛的記載，通常也用于傳統(tǒng)的流感疫苗抹。按照本發(fā)明的AS03佐劑化的大流行性流感候選疫苗是由0.5ml濃縮失活裂解病毒體抗原(存在于I型玻璃管中)和包含0.5mlAS03佐劑的預(yù)先填充的I型玻璃注射器組成的2組份疫苗。在注射時，將包含佐劑的預(yù)裝填針筒的內(nèi)含物注入到管瓶中，管瓶包含濃縮失活的裂解病毒抗原?；旌现?，將內(nèi)含物排出到針筒中，用肌注針替代原來的針。一劑重配的AS03佐劑化流感病毒候選疫苗相當于1ml。lml的每個疫苗劑量包含3.8、7.5、15或30]ug血細胞凝集素(HA)或任何合適數(shù)量的HA，該量是根據(jù)疫苗滿足本文所詳述的效果標準來確定的?；蛘?，按照本發(fā)明的AS03佐劑化的大流行性流感候選疫苗是由0.25ml濃縮失活裂解病毒體抗原(存在于I型玻璃管中)和包含0.25mlAS03佐劑的預(yù)先填充的I型玻璃注射器組成的2組份疫苗。在注射時，將包含佐劑的預(yù)裝填針筒的內(nèi)含物注入到管瓶中，管瓶包含濃縮失活的裂解病毒抗原?；旌现螅瑢?nèi)含物排出到針筒中，用肌注針替代原來的針。一劑重配的AS03佐劑化流感病毒候選疫苗相當于0.5ml。0.5ml的每個疫苗劑量包含3.8、7.5、0.55或30嗎血細胞凝集素(HA)或任何合適數(shù)量的HA,該量是根據(jù)疫苗滿足本文所詳述的效果標準來確定的。疫苗賦形劑是聚山梨酸酯80(Tween80)、辛基酚聚醚10(TritonX-IOO)、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鎂六水合物和注射用水。加入石克柳汞作為抗菌防腐劑，防止在4吏用期間污染，這是由于預(yù)料到，當大流行發(fā)生時，主要在多劑量器皿(管瓶或安瓿)中提供疫苗，這就需要防腐劑。為此，將大流行疫苗與硫柳汞(5嗎/劑量，作為防腐劑)一起配制。合適地，將大流行疫苗與作為防腐劑的10pg/劑量的硫柳汞一起配制，或稍微更高的劑量，例如最高達25(ig/劑量疫苗。III.4.1.2.制備裂解失活的流感H5N1抗原制劑通過在胚胎母雞卵中培育H5N1工作種來制備單價病毒原液。裂解失活的流感H5N1菌林單價原液的制備方法(在圖4中說明)，與制備單價原液a-RixTM的方法相同。基本上，單價原液的制備方法分成四個主要部分1)在授精母雞蛋中繁殖工作種，收集和集中感染的尿嚢液，以便獲得"粗品單價全病毒原液"(步驟1)。2)將各個病毒抹純化，產(chǎn)生"純化的單價全病毒原液"(步驟2-6)。3)用脫氧膽酸鈉裂解純化的單價全病毒原液，產(chǎn)生"純化的單價裂解病毒原液，，(步驟7-8/1)。4)純化的單價裂解病毒原液的失活分為兩步用脫氧膽酸鈉和用曱醛培養(yǎng)，而后進行超濾和無菌過濾，以便獲得"純化的單價失活裂解病毒原液"或"單價原液"(步驟8/2-9)。1)粗品單價全病毒原液的制備病毒接種物的制備胚胎卵的接種當天，通過將工作病毒晶種與包含25pg/mL氫化可的松和0.5mg/mL慶大霉素硫酸鹽的磷酸鹽緩沖液混合來制備接種物。將病毒接種物在室溫保持，直到接種為止。胚胎卵的接種將十一天大的培養(yǎng)前的胚胎卵用于病毒復(fù)制。用甲醛薰蒸殼之后，將卵轉(zhuǎn)移到制備室中。將大約120,000個卵用0.2mL病毒接種物進行接種，每個使用自動雞胚接種裝置。將接種卵在34.0。C培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)期的最后，視覺檢查卵的活胚胎與合適齡期的血管的存在。通過冷卻卵來殺死胚胎，并在2-8。C^賭藏12-46小時。61收集利用卵收集機械，從冷卻的胚胎卯中收集尿嚢液(大約12mL)。將尿嚢液收集在不銹鋼罐中(在2-8。C進行熱調(diào)節(jié))。在此步驟中，產(chǎn)品:故稱作"粗品單價全病毒原液"。不用儲藏粗品單價全病毒原液，而是緊接著將其轉(zhuǎn)入澄清步驟。2)純化單價全病毒原液的制備所有的操作在2-8。C進行，直到通過超速離心流動為止，其是在室溫下進行的。澄清通過連續(xù)中速離心，將收集的尿嚢液澄清。該步驟可除去大的顆粒，其是在收集尿嚢液期間收集到的大的顆粒(例如卵殼部分)。吸附步驟通過吸附到磷酸氬鉤凝膠上，該步驟通過病毒物質(zhì)的沉淀而進一步澄清尿嚢液。為了獲得磷酸氳釣(CaHP04)凝膠，將0.5mol/L磷酸氬二鈉(Na2HP04)和0.5mol/L氯化鈣(CaCl2)加入到澄清病毒中，達到每L1.87gCaHP04的最后濃度。沉降至少8小時至最大36小時之后，除去上清液，通過加入8.7%乙二胺四乙酸二鈉溶液，將包含流感病毒的沉降物再溶解。過濾將再懸浮的流感沉降物通過6卞m濾膜過濾，除去潛在剩余的球粒。流過超速離心通過等密超速離心(以線性蔗糖梯度(0-55%),每小時8-20升的流速)，將流感病毒進一步純化(除去蛋白和磷脂)和濃縮。使用含有0.01%p塞汞撒的蔗糖溶液55。/。(w/w)和含有0.01。/。蓬汞撒的磷酸鹽緩沖液(pH值7.4),形成梯度。這是在100±15fag/mL硫柳汞的存在下進行的，以便控制加工生物負荷，因為離心是在室溫下進行的。通過折射計測定蔗糖濃度，回收四個不同的餾份餾4分4/1:55-47%蔗糖餾份4/2:47-38%蔗糖餾份4/3:38-20%蔗糖62餾份4/4:20-0%蔗糖選擇餾份4/2的上限，以在高純度系數(shù)HA/蛋白和全病毒的最大回收之間進行平衡。選擇餾份4/2和4/3之間的限制，從而將餾份4/2中的卵清蛋白含量減到最小。基于在低蔗糖梯度范圍中得到的HA含量，選擇餾份4/3的下限。餾份4/2和4/3用于進一步的制備。大部分病毒收集在餾份4/2中。將包含病毒和蛋白兩者的餾份4/3進一步純化。首先，通過超濾法使餾份4/3的蔗糖濃度減到低于6%(為隨后的離心步驟所必需)。然后，通過離心使餾份4/3成粒，以除去任何溶解的污染物(蛋白)。將球粒再懸浮在磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)中，并徹底地混合，獲得均相懸浮液。對于餾份4/3,保持時間最大36小時，對于餾份4/2,最大60小時，對于純化餾份4/3,最大36小時。稀釋收集兩個鎦份(處理的餾份4/3和未處理的餾份4/2),通過加入60L磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)進行稀釋。在此步驟中，物質(zhì)的集中相當于"純化單價全病毒原液"。3)純化單價裂解病毒原液的制備在脫氧膽酸鈉的存在下流過超速離心將流感病毒裂解，利用離心進一步純化(通過線性蔗糖梯度(0-55%,用蔗糖溶液S8a和緩沖液S6a形成，包含1.5%脫氧膽酸鈉)。Tween-80以0.1%存在于梯度。以每小時8升的速度處理病毒。離心的最后，收集三個不同的餾份?；诹呀鈼l件的菌株依賴性效果，選擇主要榴份(餾份7/2)的范圍，目標是收集主要由斷裂的流感病毒抗原組成的餾份，同時盡可能地將剩余全病毒顆粒和磷脂(得自于裂解之后的病毒膜)減到最小。對于A/越南/1194/2004NIBRG-145,餾份7/2的范圍設(shè)置在20-41%蔗糖。在餾份7/2中濃縮血球凝集素抗原，其包含大約1.2%脫氧膽酸鈉。這種物質(zhì)相當于"純化單價裂解病毒原液"。4)純化的最終單價裂解失活病毒原液的制備過濾將餾份7/2在磷酸鹽緩沖液S7c(包含0.025%Tween-80)中稀釋三63倍。然后，將鎦份7/2逐漸濾出到0.45pm濾膜上，簡要地進行超聲處理(便于過濾)，過濾通過0.2膜。在過濾的最后，用包含0.025%Tween-80的磷酸鹽緩沖液(S107c)沖洗過濾器。由于過濾和沖洗，濾液的最終體積是原始餾份7/2體積的5倍。脫氧膽酸鈉失活將得到的溶液在22士2。C培養(yǎng)至少84小時。第一個失活步驟完畢后，用磷酸鹽緩沖液S7c稀釋該物質(zhì)，以減少總蛋白含量至500pg/mL的計算濃度甲醛失活將曱醛加入至100lug/mL的計算最后濃度。在20士2。C,在單次使用的低密度聚乙烯IOOL袋中進行至少72小時的失活。超濾使用連續(xù)緩沖液S7b和Slb,通過膜將失活的裂解病毒物質(zhì)進行超濾，切斷(cutoff)30,000Dalton分子量。體積減少之后，通過加入包含0.01%Tween-80的磷酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖鹽水(Slb),使體積在超濾(透濾)期間保持恒定。在超濾期間，曱醛、NaDoc和蔗糖含量降低。將該物質(zhì)濃縮至15-25升，緊接著轉(zhuǎn)移至最終過濾步驟。無菌過濾超濾之后，將裂解失活物質(zhì)逐漸濾出至0.2itim膜上。通過0.22pm無菌級膜的最終無菌過濾是在100級環(huán)境中進行的。在過濾的最后，用包含0.01%Tween-80的磷酸鹽緩沖鹽水溶液Slb沖洗過濾器。與此同時，將濾液稀釋至小于1000pg/mL的蛋白濃度，以避免在隨后的貯存期間聚集。得到的物質(zhì)是"純化單價失活裂解病毒原液，，或"單價原液，，。貯存將最后的裂解失活流感H5N1病毒的單價原液在2-8°C、在I型玻璃瓶中儲藏，最多18個月。III.4.1.3.帶有AS03佐劑化的H5N1的疫苗組合物的制備1)組合物肌注給予在一期臨床試驗評價的AS03佐劑化的失活裂解病毒大流行性流感候選疫苗H5Nl-007。疫苗是由濃縮失活裂解病毒體(H5N1)抗64原(存在于I型玻璃管中)和包含在預(yù)先填充的I型玻璃注射器中的AS03佐劑組成的2組份疫苗。一劑重配的AS03佐劑化大流行性流感疫苗相當于1ml。表7中給出組合物。由于研究H5N1-007是劑量探測研究，對于所測試的每個臨床批次，每劑量的HA含量是不同的。一個劑量包含3.8、7.5、15或30pgHA。疫苗包含下列得自于藥物制備過程的殘余物甲醛，卵清蛋白，蔗糖，石危柳7義和脫氧膽酸鈉。表7重配AS03佐劑化的大流4亍性流感候選疫苗的組合物組份每劑量數(shù)量活性組分失活裂解病毒體A/越南/1194/2004NIBRG-14(H5N1)30/15〃.5/3.8貼HAAS03佐劑-SB62乳液鯊烯10.68mgDL-a-生育酚*11.86mg聚山梨酸酯80(Tween80)*4.85mg賦形劑聚山梨酸酯80(Tween80)112.26ng/pgHA辛基酚聚醚10(TritonX-100)21.16赫gHA硫柳汞氯化鈉.5mg磷酸氫二鈉1mg磷酸二氫鉀0.36mg氯化鉀0.19mg氯化鎂六水合物2.38/12.84/18.07/20.65ng2)配制AS03佐劑化的大流行性流感疫苗的制備由三個主要步驟組成65(a)配制無佐劑的裂解病毒最終原液(2x濃縮)并分裝入抗原容器中(b)制備AS03佐劑，并裝入佐劑器皿中(c)AS03佐劑化的裂解病毒疫苗的臨時重組1)配制無佐劑的最終原液并分裝入抗原容器中。配制流程圖提供在圖5中。單價原液的體積基于HA含量(在配制之前按單價原液計量)和4000ml的目標體積。在連續(xù)攪拌下，將最終原液緩沖液(配制緩沖液包含氯化鈉7.699g/l;磷酸二鈉十二水合物2.600g/l;石粦酸二氬4甲0.373g/l;氯化鉀0.2g/l;氯化鎂六水合物0.1g/l)和合適體積的TntonX-100(5%辛基酚聚醚10(Triton乂-100)溶液)和硫柳汞(0.9%硫柳汞儲備溶液)混合在一起。然后在得到的原液緩沖液-TritonX-100-硫柳汞中稀釋單價原液H5N1,以便具有每ml最終原液60/30/15/7.6(igH5N1的最后濃度(每ml30、15、7.5或3.8貼HA/500pl最終原液)。將混合物攪拌30-60分鐘。pH值是7.2±0.3。不必加入Tween80,因為在單價原液中存在的Tween80的濃度(822貼/ml)足以達到濃度目標(12.26嗎/貼HA)。將最終原液無菌填充到3ml無菌I型(Ph.Eur.)玻璃管中。每個管瓶包含0.65ml±0.05ml的體積。2)AS03無菌佐劑原液的制備并裝入佐劑容器中。通過將兩個組分(SB62乳液和磷酸鹽緩沖液)混合來制備佐劑AS03。SB62乳液通過在強攪拌下混合由疏水組分(a-生育酚和鯊烯)組成的油相和含水溶性組分(Tween80和磷酸鹽-鹽水緩沖液，pH6.8)的水相，制備SB62乳液。在4覺拌的同時，將油相(1/10總體積)轉(zhuǎn)移至水相(9/10總體積)，于室溫攪拌混合物15分鐘。然后在微流控器的相互作用腔中對獲得的混合物施加剪切力、沖擊力和空化力(15000PSI,8個循環(huán))，以產(chǎn)生亞微米油滴(分布在100-200nm之間)。獲得的pH在6.8±0.1之間。然后4吏SB62乳液通過0.22mm膜過濾除菌，將除菌的乳化原液冷凍儲存于2-8。C的Cupac容器中。將無菌惰性氣體(氮氣)通入SB62乳化最終原液容器的死體積中達至少15秒。SB62乳液的最終組成如下(表8):表8<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>AS03佐劑系統(tǒng)通過將緩沖液(PBSmod)與SB62原液混合來制備AS03佐劑系統(tǒng)。在室溫下攪拌混合物15-45分鐘，用NAOH(0.05或0.5M)/HC1(0.03M或0.3M)將pH值調(diào)節(jié)至6.8士0丄在室溫下再攪拌15-20分鐘之后，測定pH值，通過0.22pm膜過濾來消毒混合物。將無菌AS03佐劑在+2-8°C儲藏，直到無菌填充到1.25ml無菌I型(Ph.Eur.)玻璃注射器中為止。每個針筒包含超出720^il(500|ul+220|ul超填部分)的體積。AS03佐劑的最終組成如下(表9):表9SB620.25ml鯊烯10.68mg生育酚11.86mg聚山梨酸酯804.85mgPBS隱mod:NaCl137mMKCI2.7mMNa2HP048.1mMKH2P041.47mMpH6.8±0.1體積0.5ml3)AS03佐劑化的裂解病毒疫苗的臨時重組。在注射時，將包含佐劑的預(yù)裝填針筒的內(nèi)含物注入到管瓶中，管瓶包含濃縮三價失活的裂解病毒體抗原?；旌现?，將內(nèi)含物排出到針筒中，用肌注針替代原有的針。一劑重配的AS03佐劑化流感候選疫苗相當于1ml。m.4.2疫苗制備在非慣用胳臂的三角肌區(qū)，肌肉內(nèi)給予疫苗。大流行性流感候選疫苗是2組分疫苗，其由存在于管瓶(抗原器皿)中的抗原和包含佐劑(佐劑器亞)或稀釋劑的預(yù)填充針筒組成。在注射時，將預(yù)裝填針筒的內(nèi)含物注入到管瓶中，管瓶包含抗原。混合之后，將內(nèi)含物排出到針筒中。用肌注針替代所使用的針。疫苗的一個劑量相當于1ml。IV.5研究人群結(jié)果總共400名受試者加入該研究8個組的每個組中有49至51名受試者。在接種的時候，總接種群的平均年齡是34.3歲，標準偏差12.76歲。分布在8個疫苗組中的受試者的平均年齡和性別是相似的。IV.6安全結(jié)論在研究群體(即18和60歲之間的成年人)中給予AS03佐劑化的大流行性流感候選疫苗是安全的，在臨床上是良好耐受的。68IV.7免疫原性結(jié)果對ATP群體的免疫原性進行分析(394名受試者)。III.7.1.體液免疫應(yīng)答為了評價由AS03佐劑4t的大流行性流感H5N1候選疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，計算每個治療組的以下參數(shù)(具有95%置信區(qū)間)在第0天、21天和42天時HI抗體滴度的幾何平均滴度(GMT);在第21和42天的血清陽轉(zhuǎn)率(SC);.，1;4rt/|，Hrfv^TZW^乂V陽厶l乂乂。i"i厶HJ"T7I>~>HJ).21天和42天時的^f呆護率。ni.7丄i抗血凝素抗體應(yīng)答a)HI幾何平均滴度(GMT)具有95%CI的HI抗體的GMT示于表IO(抗HI抗體的GMT)和圖6中。對于H5N1接種菌株，在八個研究組中，抗體的預(yù)接種GMT在相同范圍之內(nèi)。首次接種之后，在所有的非佐劑化組中，抗血球凝集素抗體水平僅僅以劑量依賴性方式很少量地增加。在佐劑化接種組中，首次接種之后，觀察到抗血球凝集素抗體水平更顯著的增加，在得到最高抗原劑量(HN30AD)的組中具有最高的GMT。第二次接種后，非佐劑化組的GMT比首次接種后的GMT有稍微提高。比4交起來，在所有佐劑化組中，第二次接種之后觀察到顯著提高的GMT，從3.8^g至7.5ng至15ng組，觀察到劑量依賴性增加。對于30^g組，觀察到的GMT比7.5pg組的GMT低。所有佐劑化研究組(包括3.8jagHA的最低劑量)，可以引起免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答滿足基于FDA制定指導(dǎo)(2006年3月)以及EMEA所建立標準的大流4亍疫苗的特許標準。表10-在不同時點的抗HA抗體的幾何平均滴度(GMT)(對免疫原性的ATP群組)95%Cl抗體組別時間N值LLULMinMax流感A/VIET/04ABHN30PRE495.24,85.6<■28.0Pl岡4914.18.922.6<10.012訓PII(D42)4920.012.532.1<10.0905.0圓5PRE495.34.85.9<翻■PI(D21)4910.46.915.6<10.0640.0PII(D42)4914.79.622.4<10.0640.0■PRE495.05.05.0<10.0<10.0PI(D21)496.85.48.7<10.0160.0PII(D42)498.56.311.5<10.0160.0畫PRE505.05,05.0<■<10.0PI(D21)505.14.95.4<10.020.0PII(D42)506,25.37.4<■57.0HN30ADPRE485.14.95.5<10.020.0PI(D21)4836.722.759.3<10.G640.0PII(D42)48187.5116.2302.7<10.01280.0HN15ADPRE495.14.95.2<10.010.0PI,4924.714.841.4<10.0謂.OPII(D42)49306.7218.4430.8<濕1810.0隱ADPRE505,44.86.0<10.040.0PI(D21)5024.615.838.4<10.0640.0PII(D42)50205.3135.1312.0<10.01280.0,ADPRE505.44.86.0<10.0肌0PI(D21)5012.98.918,7<■640.0PII(D42)50149.393.2239.1<10.01280.0HN30=H5N130貼麗15=H5N115嗎麗8=H5N17.5嗎HN4=H5N13.8貼HN30AD=H5N130ng+AS03HN15AD=H5N115|ig+AS03HN8AD=H5N17.5嗎+AS03HN4AD=H5N13.8ng+AS03GMT=對所有受試者計算的幾何平均抗體滴度N=具有可利用結(jié)果的受試者數(shù)目n/%=在特定范圍內(nèi)具有滴度的受試者的數(shù)目/百分數(shù)7095%[1=95%置信區(qū)間；LL=下限，UL=上限MIN/MAX=最小/最大PRE=預(yù)接種劑量1PI(D21)=接種后21天PII(D42)=接種后42天數(shù)據(jù)源=附表111八b)抗HI抗體滴度的轉(zhuǎn)化因子、血清保護率和血清陽轉(zhuǎn)率(與人中建立的流感疫苗保護作用的關(guān)聯(lián))結(jié)果提供在表ll(轉(zhuǎn)化因子)、12(血清保護率)和13(血清陽轉(zhuǎn)率)中。轉(zhuǎn)化因子(表ll,圖9)表示相比于第0天，在第21天和42天時針對疫苗抹的血清HIGMT的增加倍數(shù)。在4個非佐劑化組中，第二次接種之后的轉(zhuǎn)化因子從1.2至3.9之間變化，在佐劑化組中，從27.9至60.5之間變4b。在AS03佐劑化組中，轉(zhuǎn)化因子達到優(yōu)于歐洲官方對于成人流行暴發(fā)之間的疫苗要求的GMT(列出在表1中)的2.5倍增加。普遍地，對于大流行候選疫苗，相同標準適用于流4亍暴發(fā)之間的流感疫苗每年的特許。值得注意的是，除最低抗原濃度外，首次接種之后，所有的佐劑化組都獲得22.5的轉(zhuǎn)化因子。血清保護率(表12,圖8)表示在第21和42天的血清HI滴度>40的受試者的比例。在接種之前，發(fā)現(xiàn)3個受試者(l個在HN15組中，1個在HN8AD組中，1個在HN4D組中)對于疫苗抹H5N1A/越南/1194/2004具有抗體的保護性水平。對于H5N1,在接種之前，獲得血清保護個體的極低百分數(shù)，證明了先前研究中的觀察結(jié)果(BressonJL等人TheLancet.2006:367(9523):1657畫1664;TreanorJJetal.NEnglJMed.2006;354:1343-1351)。在第21天，在非佐劑化組中，血清保護率在0.0%至28.6%(表12)的范圍，而在佐劑化組中，受試者的26.0%至58.3%獲得保護性滴度。大流行性流感候選疫苗的第二個劑量之后，4.0至42.9%的受試者(在非佐劑化組中)和84.0%至95.9%的受試者(在佐劑化組中)具有等于或高于閾值的滴度，所述閾值認為是保護性的(即HI滴度21:40)。因而，2次接種之后，得到佐劑化大流行候選疫苗的高達95.9%的受試者(15HNAD組)具有>40的血清HI滴度，他們被視為針對H5N1接種菌抹是被保護的。所有四個候選制劑超過70%的血清保護率，這是71歐洲官方要求的(18-60歲人群)，即，首次劑量之后，相當大比例的受試者獲得保護性等級，而非佐劑化候選疫苗沒有達到該標準。血清陽轉(zhuǎn)率(表13,圖7)表示接種前滴度<1:10和接種后滴度^1:40的接種者的百分比，或接種前滴度21:10并且與第0天相比、在接種后的第21和42天滴度至少增加四倍的接種者的百分比。首次接種之后，非佐劑化組中的血清陽轉(zhuǎn)率在0.0%至14.9%的范圍(表13)。在相應(yīng)的佐劑化研究組中，首次接種之后，觀察到24.0%和58.3%之間的血清陽轉(zhuǎn)率，在接受不同抗原含量的4個佐劑化組中的3個組中，已經(jīng)超過EMEA的要求(在18-60歲人群中，要求血清陽轉(zhuǎn)率大于40%)。第二次接種之后，有4.0%和40.8%之間的受試者(在非佐劑化組中)、但有82.0%至95.9%的受試者(在佐劑化組中)，或獲得血清陽轉(zhuǎn)或四倍增加。因此，兩次接種之后，候選疫苗的所有四個佐劑化制劑滿足EMEA設(shè)定的特許標準，但只有最高劑量的非佐劑化疫苗才能達到該閾值(HN30:40.8%)。表11-在每個接種后的時點的HAI抗體滴度的血清陽轉(zhuǎn)因子(免疫原性的ATP群組)疫苗抹時間組別NGMR95%CILLU匕流感A/VIET/04ABPI(D21)HN30492.71.74.3圓5491.91.32.8隱491,41.11.7HN4501.01.01.1隨OAD487.14.311.7圖5AD494.92.9隱AD504.63.07.0陽AD502.41.73.5PII(D42)H隨493.92.46.2HN15492.81.94.1畫491.71.32.3■501.21.11.5謡OAD4836.422.758.5圓5AD4960.542.885.5H瞧D5038.124.858.4畫AD5027.917.245.2麗30=H5N130嗎麗15=H5N115ngHN8=H5N17.5嗎麗4=H5N13.8ngHN30AD=H5N130嗎+AS03麗15AD=H5N115貼+AS03HN8AD=H5N17.5嗎+AS03麗4AD=H5N13.8叫+AS03N=具有可利用結(jié)果的受試者數(shù)目n/%=在特定范圍內(nèi)具有滴度的受試者的數(shù)目/百分數(shù)PRE=接種前PI(D21)=接種后21天PII(D42)=接種后42天73表12-在第0天、21天和42天的血清保護率，定義為具有血清抗HA滴度21:40的接種者的百分比(免疫原性的ATP群組)<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>H固=H5N130嗎麗15=H5N115嗎麗8=H5N17.5ng麗4=H5N13.8|igHN30AD=H5N130|ig+AS03HN15AD=H5N115嗎+AS03麗8AD=H5N17.5嗎+AS03HN4AD=H5N13.8貼+AS03N=具有可利用結(jié)果的受試者數(shù)目n/%=在特定范圍內(nèi)具有滴度的受試者的數(shù)目/百分數(shù)PRE=接種前PI(D21)=接種后21天PII(D42)=接種后42天表13:每次接種后第21天和42天的抗HA抗體滴度的血清陽轉(zhuǎn)率(免疫原性的ATP群組)。疫苗抹時間組別N血清陽轉(zhuǎn)n%95%CI匕匕UL流感A/VIET/04ABPI(D21)HN30491326.514.941.1圓5491020.410.234.3隱4948.22.319.6HN45000.00.07.1陽OAD482858.343.272.4圓5AD492449.034.463.7隱AD502550.035.564.5陽AD501224.013.138.2PII(D42)HN30492040.827.055,8HN15491734.721.749.649816.37.329.7畫5024.00.513.7HN30AD484185.472.293.9HN15AD494795.986.099.5圓AD504590.078.296.7H陽D504182.068.691.4麗30=H5N130嗎HN15=H5N115嗎腦8=H5N17.5ng麗4=H5N13.8ngHN30AD=H5N130pg+AS03HN15AD=H5N115嗎+AS03麗8AD=H5N17.5嗎+AS03HN4AD=H5N13.8貼+AS03N=具有可利用結(jié)果的受試者數(shù)目PI(D21)=接種后21天PII(D42)-接種后42天數(shù)據(jù)源=附表111八n/%=接種前滴度<1:10和接種后滴度》1:40的受試者的數(shù)目/百分數(shù)，或接種前滴度21:10并且接種后滴度具有至少四倍增加的受試者的數(shù)目/百分數(shù)。95%置信區(qū)間，LL=下限，UL=上限結(jié)論75在流感大流行的情況下，大比例的人群對于大流4亍性流感菌一木是原初態(tài)的，并且可能2劑量疫苗的保護。為了降低潛在大流行疫苗中的抗原含量并因此增加疫苗供應(yīng)，使用佐劑策略，因為已經(jīng)表明，非佐劑化H5N1候選疫苗(H5N1是引起下一次流感大流行的標志性候選物)只是在使用大劑量抗原以后可以引起免疫應(yīng)答(TreanorJJ等人NEnglJMed.2006;354:1343-1351)。在本文報道的第一個試驗中，對于含有AS03的H5N1大流行性流感候選疫苗，可以獲得下列結(jié)果對于所有測試的不同血凝素劑量，與普通抗原制劑相比，佐劑AS03有明顯的益處。第二次接種后，在HI抗體的GMT中，XH察到佐劑化組有明顯的優(yōu)勢得到最低抗原劑量(3.8pgHA)的測試的佐劑化組的GMT,還比在非佐劑化組中由最高抗原劑量(2次注射30ngHA)引起的、獲得的最高GMT高7.5倍。在第42天，在佐劑化組的任何一個與非佐劑化組的任何一個之間，沒有95%CI重疊。,對于3.8)ag、7.5叱、15昭和3(Vg加上佐劑的組，在第42天的血清陽轉(zhuǎn)率分別是82.0%、90.0%、95.9%和85.6%。這對于所測試的用AS03佐劑化的所有四個抗原含量，優(yōu)于歐洲官方所要求的40%。只有一個非佐劑化組(最高抗原劑量組(3(Vg)),剛能達到高于設(shè)定閾值的百分數(shù)。對于3.8^g、7.5pg、15^g和3(Vg加上佐劑的組，在四個佐劑^匕組中，在第42天的血清保護率分別是84.0%、90.0%、95.9%和85.4%。對于低于60歲的成年組，EMEA要求的百分數(shù)是70%,因此，所有的佐劑化組滿足該標準，而普通的非佐劑化組都不能獲得所要求的血清保護率。在該研究中，用不同的候選疫苗制劑接種兩次之后，對于四個佐劑化組，血清陽轉(zhuǎn)因子大于27.9,因此大大地超過2.5的設(shè)定要求。對于非佐劑化組，得到最高抗原劑量(15昭和3(Vg)的2個組以2.8(HN15組)和3.9(HN30組)滿足要求。對于EMEA列出的三個標準，其對評{介大流4亍性流感候選疫苗也合適，使用第二劑量的相應(yīng)H5N1疫苗(用AS03佐劑化)之后，所有的佐劑化組都達到了對該年齡組所限定的所有三個標準。第二劑量之后，所有的佐劑化組也達到了FDA推薦的血清陽轉(zhuǎn)、血清保護和轉(zhuǎn)化因子標準。III.7.1.2抗血凝素抗體應(yīng)答異源菌抹認為針對抗原性不同的H5N1菌林(得自于疫苗抹)評價免疫原性，可以進一步評價大流行疫苗候選物的潛力。對得到接種菌抹的受試者的血清進行交叉反應(yīng)性測試，并且評價由疫苗對抗原性不同的菌抹作出反應(yīng)而誘導(dǎo)的抗體的潛力。為了評價交叉反應(yīng)性，選擇H5NlA/印度尼西亞/5/2005。H5N1A/印度尼西亞屬于進化枝2,而H5N1A/越南/1194/2004,疫苗抹，屬于進化枝1,并且是第一次大流行疫苗原型菌抹，得自于WHO公開的新遺傳組。因此，可以認為兩個菌抹的抗原性是不同的。a)在研究H5N1-007中，針對H5N1印度尼西亞的幾何平均滴度和血清陽性(表l4)血清反應(yīng)陽性的定義為HI抗體滴度》1:10。對于印度尼西亞，在用越南菌抹第一次接種之前，所有的受試者是血清反應(yīng)陰性的。第二次接種之后，佐劑化組的高達48。/。的受試者(28。/。3.8jag組，48%7.5jug組，26.5%15jug組，33.3%30jug組)獲得血清陽性狀態(tài)。比較起來，在3.8、7.5和15jug非佐劑化組中根本觀察不到血清陽性，而在最高抗原非佐劑化組(30jug)中，對于H5N1印度尼西亞，僅僅發(fā)現(xiàn)2%(1個受試者)是血清反應(yīng)陽性的。77表14:在第0天、21天和42天(利用疫苗組)時，ffl抗體滴度的血清陽性率和GMT(免疫原性的ATP群組)>=1[)1跳GMT95%Cl95%CI菌抹組別時間Nn%LLUl_值l_LU匕MinMax流感靡D/05ABHN30PRE4900.00.07.35.05.05.0<10.0<10.0PI(D21)4912.00.110.95.14.95.4<10.020.0PII(D42)4912.00.110.95.14.95.2<10.010.0圓5PRE4900.00.07.35.05.05.0<10.0<10.0PI(D21)4900.00.07.35.05.05.0<10.0<10.0PII(D42)4900.00.07.35.05.05.0dO.O<10.0圓PRE4900.00.07.35.05.05.0<10.0<10.0PI(D21)4900.00.07.35.05.05.0<10.0<10.0Pll,4900.00.07.35.05.05.0<10.0<10.0畫PRE4900.00.07.35.05.05.0<10.0<10.0PI(D21)4900.00.07.35.05.05.0<10.0<10.0Pll岡5000.00.07.15.05.05.0<10.0<10.0,OADPRE4800.00.07.45.05.05.0<10.0<10.0PI(D21)4848.32.320.05.94.97.1<10.0226.0PII(D42)481633.320.448.411.78.017.2<10.0226.0圓5ADPRE4800.00.07.45.05.05.0<10.0<■PI(D21)4924.10.514.05.44.86.0,10.0訓PII(D42)491326.514.941.110.27.114.7<10.0226.0畫ADPRE5000.00.07.15.05.05.0<10.0<10.0PI(D21)5048.02.219.25.75.06.4<10.040.0PII(D42)502448.033.762.613.99.720.1<10.0320.0畫ADPRE5000.00.07.15.05.05.0<10.0<■PI(D21)5012.00.110.65.14.95.4<10.020.0PII(D42)501428.016.242.59.97.014.0<10.0226.0HN30=H5N130嗎，HN15=H5N115嗎，HN8=H5N17.5嗎，HN4=H5N13.8貼HN30AD=H5N130嗎+AS03,HN15AD=H5N115嗎+AS03'HN8AD-H5N17.5嗎+AS03,HN4AD-H5N13.8貼+AS03N=可利用結(jié)果的受試者數(shù)目n/o/。-血清反應(yīng)陽性受試者(HI滴度>=1:10)的數(shù)目/百分數(shù)95%0=95%置信區(qū)間，LI^下限，UL=上限GMT-幾何平均抗體滴度Min/Max=最小/最大PRE=接種前劑量l(第0天)PI(D21)=首次接種之后"天(第"天)PII(D42)=第二次接種之后21天(第42天)b)在研究H5N1-007中，針對H5N1印度尼西亞的血清保護(表I5)第二次接種之后，在佐劑化組中，發(fā)現(xiàn)高達32.0%的受試者針對印78度尼西亞菌株(不包含在疫苗中)是血清保護的。在3.8jug、7.5ng、]5jug和30jug佐劑化組中，第二次接種之后，20.0%、32.0%、20.4%和29.2%的受試者分別具有>1:40的滴度。在非佐劑化組中，沒有受試者是血清保護的。表15-在第0天、21天和42天(利用疫苗組)時HI抗體滴度的血清保護率(SP)(免疫原性ATP群組)。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>HN30=H5N130ng，HN15=H5N115嗎，HN8=H5N17.5嗎，HN4=H5N13.8嗎HN30AD=H5N130叱+AS03,HN15AD=H5N115嗎+AS03,HN8AD-H5N17.5貼+AS03HN4AD=H5N13.8嗎+AS03PRE=接種前劑量I(第O天)PI(D21)=首次接種之后21天(第21天)PH(D42)=第二次接種之后21天(第42天)N=可利用結(jié)果的受試者的數(shù)目n/%=血清保護受試者(HI滴度>=l:40)的數(shù)目/百分數(shù)n/%UNPROT-無保護受試者(HI滴度<1:40)的數(shù)目/百分數(shù)95%<:1=95%置信區(qū)間，LL=下限，UL=上限c)在研究H5N1-007中，針對H5N1印度尼西亞的血清陽轉(zhuǎn)(表16)在佐劑化組中，高達32.0%的受試者針對印度尼西亞菌抹(不包含在疫苗中)獲得血清陽轉(zhuǎn)。在3.8jug、7.5Mg、15jig和30jug佐劑化組中，第二次接種之后，各自20.0%、32.0%、20.8%和29.2%的受試者是血清陽轉(zhuǎn)的。在非佐劑化組中，沒有受試者表明是血清陽轉(zhuǎn)的。表16:在第21天和42天(利用疫苗組)時HI抗體滴度的血清陽轉(zhuǎn)率(SC)(免疫原性ATP群組)。sc疫苗抹疫苗組時間Nn%95%CI匕L流感圓0PI(D21)4900.00.07.3A/l隱5PH(D42)4900.00.07.3AB圓5PI(D21)4900.00.07.3PII(D42)4900.00.07.3HN8Pl罔4900.00.07.3PII(D42)4900.00.07.3隨PI(D21)4800.00.07.4PII(D42)4900.00.07.3HN30ADPI(D21)4824.20.514.3PII(D42)481429.217.044.1國5ADPI(D21)4812.10.111.1PII(D42)481020.810.535.0隨ADPI(D21)5012.00.110.6PII(D42)501632.019.546.7,ADPI(D21)5000.00.07.1PII(D42)501020.0■33.7HN30=H5N130ng,麗15-H5N115嗎，HN8=H5N17.5嗎，HN4=H5N13.8嗎HN30AD=H5N130嗎+AS03，HN15AD=H5N115嗎+AS03,HN8AD=H5N17.5ng+AS03,HN4AD=H5N13.8嗎+AS03PI(D21^首次接種之后21天(第21天)，PII(D42)=第二次接種之后21天(第42天)N=可利用結(jié)果的受試者的數(shù)目n/%=在特定POST處血清陽轉(zhuǎn)的數(shù)目/百分數(shù)95%(31=95%置信區(qū)間，LL=下限，UL=上限d)在研究H5N1-007中，針對H5N1印度尼西亞的血清陽轉(zhuǎn)因子在該試-瞼中，佐劑化組獲得2和2.8之間的血清陽轉(zhuǎn)因子。在3.8jug、7.5jug、15Mg和30Mg佐劑化組中，血清陽轉(zhuǎn)因子分別是2.0、802.8、2.1和2丄e)針對H5NlA/印度尼西亞的交叉反應(yīng)性數(shù)據(jù)的結(jié)論在結(jié)論中，2個劑量的裂解病毒候選疫苗(用AS03佐劑進行佐劑化)之后，與在亞洲引起人類相當多發(fā)病和致死率的疫苗株相比較，H5N1菌抹(源于不同的進化枝)獲得的交叉反應(yīng)性數(shù)據(jù)是陽性的。高達48%的受試者顯示了被引發(fā)跡象，高達32%的受試者針對非疫苗抹實際上是血清保護的。這些結(jié)果表明，大流行疫苗的佐劑化可以針對疫苗候選物中使用的大流行菌抹的漂移變體提供交叉反應(yīng)性。這些結(jié)果證明了佐劑化疫苗的引發(fā)和交叉引發(fā)的潛力。III.7.1.3對同源菌抹H5N1A/越南的中和抗體應(yīng)答中和試驗是定量分析可抑制流感病毒與細胞粘附、滲入到細胞中以及在細胞中繁殖的抗體的方法。盡管對于血球凝集素抑制試驗確定了血清保護閾值，但對于該試驗，情況不是這樣的?；蛘?，中和滴度增加四倍可用于評價接種的個體是否針對接種菌抹或異源菌株具有應(yīng)答。血清陽轉(zhuǎn)率是CHMP/FDA用以評價候選流感疫苗效果的一個關(guān)鍵免疫原性參數(shù)。在使用漂移菌抹的這種中和試驗中，預(yù)計血清樣品的測試將至少可以預(yù)報已經(jīng)針對給定菌林(不同于疫苗林)"被引發(fā)的"個體的頻率。a)在研究H5N1-007中，在針對H5N1越南的中和試-驗中測定的幾何平均滴度和血清陽性(表n)血清陽性的閾值設(shè)置為>1:28的滴度，中和試-驗也是高靈敏度的試驗。在非佐劑化組中，在第0天的GMT的范圍是14.0至18.1,在佐劑化組中，GMT的范圍是18.5至25.2。第二次接種之后，對于3.8、7.5、15和30|ag組的非佐劑化組，滴度以劑量依賴性方式分別增加至43.9、61.7、86.9和177.8。在佐劑4b組中，對于3.8、7.5、15和30pg組，分別獲得381.0、421.2、464.7和333.3的滴度，完全重復(fù)了HI滴度中的觀察結(jié)果從3.8Mg至7.5yg至15jug的佐劑化組，觀察到GMT的劑量依賴性增加(表17)。81表17:在第0天、21天和42天，中和抗體滴度的血清陽性率和GMT(免疫原性的ATP群組)<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>HN30=H5N130嗎；HN15=H5N115嗎；HN8=H5N17.5pg;HN4=H5N13.8叫HN30AD=H5N130嗎+AS03;HN15AD=H5N115^g+AS03;HN8AD=H5N17.5嗎+AS03;麗4AD=H5N13.8嗎+AS03N=可利用結(jié)果的受試者的數(shù)目n/%=血清反應(yīng)陽性受試者(HI滴度>=1:10)的數(shù)目/百分數(shù)95%01=95%置信區(qū)間，LL=下限，UL=上限GMT=幾何平均抗體滴度Min/Max=最小/最大PRE=接種前劑量l(第0天)PI(D21)=首次接種之后21天(第21天)PII(D42)=第二次接種之后21天(第42天)b)在研究H5N1-007中，針對H5N1越南的中和抗體滴度的血清陽轉(zhuǎn)率(表18)如上所述，針對流感菌4朱，四倍增加用于測定血清陽轉(zhuǎn)。因此，如果獲得四倍增加，在第O天僅僅包括血清反應(yīng)陽性的受試者，因此減去潛在背景。第二次劑量之后，在非佐劑化組中，可以再次以劑量依賴性方式觀察到血清陽轉(zhuǎn)在3.8、7.5、15和30jug組中，血清陽轉(zhuǎn)的受試者分別為20.9、37.5、53.5和76.0%。在佐劑化組中，在3.8、7.5、15和30jug組中，86.0、83.3、86.0和100.0%的受試者分別具有血清陽轉(zhuǎn)，因此也證明了HI結(jié)果。值得注意的是，佐劑化疫苗的首次劑量之后，在四個佐劑化組中，66.7至88.0%的受試者實現(xiàn)血清陽轉(zhuǎn)。表18:在接種后的各個時點的中和抗體滴度(源于Dresden)的血清陽轉(zhuǎn)率(SC)(免疫原性的ATP群組)菌林時間組別NSCn%95%CIaUL流感A/第21天HN30251976.054.990.6VIET/04AB剛5432046.531.262.3■40922.510.838.5HN443716.36.830.7,OAD252288.068.897.5圓5AD433786.072.194.7畫AD422866.750.5肌4■AD443068.252.481.4第42天HN30251976.054.990.6HN15432353.537.768.8HN8401537.522.754.2HN443920.910.036.0國0AD2525100.086.3徵0HN15AD433786.072.194.7,AD423583.368.693.0隱AD433786.072.194.7HN30=H5N130嗎；HN15=H5N115嗎；HN8=H5N17.5^g;HN4=H5N13.8ngH罷AD=H5N130嗎+AS03;麗15AD=H5N115嗎+AS03;H兩AD=H5N17.5貼+AS03;麗4AD=H5N13.8嗎+AS03N=可利用結(jié)果的受試者的數(shù)目n/%=血清陽轉(zhuǎn)G妻種后(atPOST)至少4倍增加)的受試者的數(shù)目/百分數(shù)95%(:1=95%置信區(qū)間，LL=下限，UL=上限對于越南菌林，在10A和10B中分別說明了GMT滴度和血清陽轉(zhuǎn)83率。在結(jié)論中，針對疫苗抹(越南)測定的中和抗體證明了HI所獲得的結(jié)果。首次劑量后的大流行候選疫苗之后，在所有的佐劑化組(包括3.8jug的最低劑量組)中，超過65%的受試者獲得了血清陽轉(zhuǎn)，第二劑量的大流行候選疫苗之后，超過80%的受試者獲得了血清陽轉(zhuǎn)。III.7.1.4對異源菌抹H5N1A/印度尼西亞的中和抗體應(yīng)答本文下面提供了(3.8jiig和7.5jiigHA佐劑化組)的部分數(shù)據(jù)。正如所討論的那樣，由于測定抗體(除了抑制病毒粘附之外，還抑制流感病毒滲入到細胞中，和抑制流感病毒在細胞與細l包間的繁殖)的中和試-驗的性質(zhì)，評價漂移菌株可以進一步評價疫苗對于非疫苗株的引發(fā)潛力。a)在研究H5N1-007中，針對H5N1A/印度尼西亞的中和試驗中所測定的幾何平均滴度和血清陽性(表19)在兩個最低的佐劑化組中，兩個劑量疫苗之后，對于3.8jug和7.5yg佐劑化組，針對印度尼西亞菌林獲得的GMT分別是70.6和73.1。表19:在第O天、21天和42天，針對印度尼西亞菌抹的中和抗體滴度的血清陽性率和GMT(免疫原性的ATP群組)>=2811/DILGMT95%Cl95%Cl抗體組別時間Nn%LLUL值匕LULMinMax流感A/IND/05ABH隱DPRE35822.910.440.117.615.120.4<28.057.0PI(D21)352777.159.989.647.535.364.0<28.02810PII(D42)353497.185.199.999.073.1134.0<28.0453.0,ADPRE38410.52.924.816.313.919.1<28.0113.0PI(D21)382873.756.986.641.931.955.1<28.0226.0PII(D42)3834肌575.297.193.170.6122.7<28.0284.0HN8AD=H5N17.5嗎+AS03,麗4AD=H5N13.8嗎+AS03N=可利用結(jié)果的受試者的數(shù)目n/%=血清反應(yīng)陽性受試者(HI滴度>=1:10)的數(shù)目/百分數(shù)95%(:1=95%置信區(qū)間，LL=下限，UL=上限GMT=幾何平均抗體滴度Min/Max=最小/最大PRE=接種前劑量l(第0天)，PI(D21)=首次接種之后21天(第21天)，PII(D42)=第二次接種之后21天(第42天)b)在研究H5N1-007中，針對H5N1A/印度尼西亞的中和抗體滴度的血清陽轉(zhuǎn)率(表20)針對抗原性不同的非接種菌林，3.8和7.5Mg佐劑化組得到了高血清陽轉(zhuǎn)率當針對A/印度尼西亞菌抹測試時，84.2%的受試者實現(xiàn)血清陽轉(zhuǎn)。85表20:在接種后的各個時點的中和抗體滴度(針對印度尼西亞菌抹)的血清陽轉(zhuǎn)率(SC)(免疫原性的ATP群組)菌抹時間疫苗組NSC(4倍)n%95%CI匕LUL流感細D/05ABPI(D21)圓AD351337.121.555.1圓AD381539,524.056.6PII(D42),AD352262.944.978.5■AD383284.268.794.0HN8AD=H5N17.5(ig+AS(B，HN4AD=H5N13.8pg+AS03DDC—"t^拙"^i^l曇1/楚n:f、DTm，l、_女'》t在拙^，1^P/楚，1^、DTT/'FM^、一i—'j^r',itrj/i'j玉iV々'"z、乂，i丄、L/厶i&j'乂、'j^t'ii厶i厶iy、7，1乂—第二次接種之后u天(第"天)N-可利用結(jié)果的受試者的數(shù)目n/%=血清陽轉(zhuǎn)(接種后至少4倍增加)的受試者的數(shù)目/百分數(shù)95%(:1=95%置信區(qū)間，LL-下限，UL=上限在中和試驗中，交叉反應(yīng)性的可利用數(shù)據(jù)表明了佐劑化疫苗(包含異源菌抹)對于試驗的印度尼西亞菌抹的顯著效果，并且證明了候選疫苗的可交叉反應(yīng)的潛力。III.7.1.5細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)為了評價CMI,請參見I.2、1.3和IV.3.2部分。佐劑在提高疫苗的免疫原性方面的一個重要性能是能夠刺激細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)。在這種試驗中，可以預(yù)見流感特異性CD4-和CD8-細胞的評價(包括Thl相關(guān)的細胞因子的頻率)以及記憶B細胞的頻率的評價。對兩個最低抗原組(用AS03佐劑化或不用AS03佐劑化)的T細胞應(yīng)答，數(shù)據(jù)是可得到的。CMI結(jié)果可以表示為細l包因子-陽性CD4T細l包的頻率。中間值(包括第一和第三個四分點，參見表21)提供在圖11中。結(jié)果表明，與非佐劑化組相比，佐劑化組明顯地引起更強得多的CD4應(yīng)答。86表21:在各個時點對頻率-陽性CD4T細胞(每百萬個CD4T細胞)的描述統(tǒng)計學(免疫原性的ATP群組)<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>菌抹測試描述疫苗組時間NNmiss.GmtQ1中間值Q3Max畫AD0天473615.32512.00775.001021.002951.00第21天4913001.772189.003371.004762.0011124.00第42天4823295.3823肌003167.504804.508690.00CD4-■0天491409.56237.00420.00727.002560.00IFNG第21天482719.52440.00806.001097.503618.00第42天491758.46563.00715.001045.002402.00,AD0天491476.45333.00584.00778.001903.00第21天4911003.7784謹1240.001986.005743.00第42天4911321.30929.001328.001672.003945.00HN80天481462.73322.00509.50979.502423.00第21天463694.955肌00849.501254.002104.00第42天490714.16531.00876.00簡.002146.00H瞧D0天473398.24241.00490.00637.002531.00第21天4911406.88980.001465.002587.006676.00第42天4821471.29967.001417.502444.0U4763.00CD4-0天491595.36384.00613.00簡.002145.00IL2第21天4821223.32787.001276.001804.006000.00第42天4911370.121027.001479.002016.004233.00HN4AD0天491686.60501.00770.00965.001795.00第21天4912479.782082.002963.004348.0010102.00第42天4912797.792062.002758.003617.008095.00隱0天481611.24515.50744.001093.502638.00第21天4631225.921003.001374.001742.002606.00第42天4901099.43942.001374.001706.002536.00HN8AD0天473484.64458.00665.00982.002588.00第21天4912591.082015.003205.004678.0010746.00第42天4823056.632172.002981.504462.008662.00CD4-HN40天491566.24353.00590.00957.002270.00T阻第21天482995.66655.001089.001523.005373.00第42天4911039.47733.001240.001532.003492.00,AD0天491595.65538.00691.00867.001760.00第21天4911703.321471.001859.003174.007577.00第42天4912286.391711.002222.002957.007650.00隱0天481526.47435.50643.001036.502489.00第21天4631004.27708.001120.501516.001976.00第42天490856.00740.00994.001363.002396.00HN8AD0天473504.74401.00628.00908.002892.00第21天4912099.731486.002373.003822.006886.00第42天4822442.381786.502400.503564.507629.00麗8=H5N17.5貼麗4=H5N13地HN8AD=H5N17.5嗎+AS03HN4AD=H5N13.8嗎+AS03N-可利用結(jié)果的受試者的數(shù)目；Nmiss.=失去結(jié)果的患者的數(shù)目GM=幾何平均SD=標準偏差Q1,Q3=四分之一和四分之三MIN/MAX=最小/最大88推理分析證明，首次4妻種之后的21天(IFNy陽性CD4細胞除外)和笫二次接種之后在第42天，與得到相同劑量的非佐劑化組相比，在佐劑化組中，細胞因子陽性CD4細胞的誘導(dǎo)顯著地高。因此，在由疫苗引起的抗體的血清評價中看到的佐劑效果，通過CMI結(jié)果得到了證明。類似方式的分析表明，對CMI的效果清楚地是佐劑依賴性，而不是劑量依賴性的(只對比3.8ng和7.5jug劑量)，其與HI結(jié)果一致(參見表22)。表22:在各個時點對細胞因子-陽性CD4T細胞頻率的推論統(tǒng)計學(p-值得自于克魯斯凱-沃利斯檢驗)比較組測試描述第O天的第21天的第42天的P-值P-值P-值佐劑效果隨和HN4ADCD4-ALLDOUBLES0.2150<0.0001<0.0001CD4-CD40L0.2190<0細1<0細1CD4-IFNG0.13200.0012<0細1CD4-IL20.2497<0,0001<0.0001CD4-TNFA0.3130<0細1<0.0001HN8和,ADCD4-ALLDOUBLES0.4433<0.0001<0.0001CD4-CD40L0.4749<0.咖1<0.咖1CD4-IFNG0.2771<0細<0.咖1CD4-IL20.3114<0細1<0.咖1CD4-TNFA0.4657<0.咖1<0,咖1劑量效果HN4和HN8CD4-ALLDOUBLES0.26030.67740.3880CD4-CD40L0.28720.69410.3181CD4-IFNG0.20540.36410.6366CD4-IL20.23380.82640.2677CD4-TNFA0.35380.90670.2137HN4AD和HN8ADCD4-ALLDOUBLES0.40550.39580.2146CD4-CD40L0.40760.43660.2424CD4-IFNGO.濯0.10370.2146CD4-IL20.32420.56730.2528CD4-TNFA0.47030.32680.3787HN8=H5N17.5貼HN4=H5N13.8嗎麗8AD=H5N17.5ng+AS03HN4AD=H5N13.8嗎+AS03總之，用兩個最低的測試抗原劑量，與潛在大流行菌林A/越南組合的AS03能夠刺激細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。此外，在佐劑化組中觀察到的89應(yīng)答比無佐劑化組i秀導(dǎo)的CD4應(yīng)答更強。IV.8.總體結(jié)"i侖IV.8.1.反應(yīng)原性和安全結(jié)果下次流感大流4亍的標志(leading)候選物是禽病毒H5N1,其在烏與人之間傳播的病例中已經(jīng)導(dǎo)致了高死亡率，雖然沒有完全證明有效的人與人之間的傳播。H5N1表明了與全球輸送網(wǎng)組合的人與人之間有效擴散的能力，該結(jié)果可能是影響高比例個體的廣泛的流感突發(fā)，在所有國家引起增加的致死和發(fā)病率。因此，必須建立接種的免疫有效和抗原減量(sparing)方法，以潛在地防止大流行的石皮壞效果。這可以通過4吏用合適佐劑來實現(xiàn)，并且新佐劑增加H5N1候選疫苗效果的免疫原性可以首次示于這種試^驗中。設(shè)計這種研究，評^介(1)在健康成人中，用水包油乳化液(即AS03)佐劑化的或不用其佐劑化的大流行性流感候選疫苗的安全和反應(yīng)原性，(2)抗體和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。反應(yīng)原性數(shù)據(jù)表明，與無佐劑組相比較，佐劑化的大流行候選疫苗可以誘導(dǎo)(與抗原含量無關(guān))更多局部和全身癥狀。然而，所有4個佐劑化組的安全特性在臨床上是可接受的。沒有報道嚴重的不利狀況。由這些結(jié)果可以斷定，用AS03佐劑化的大流行候選疫苗的反應(yīng)原性和安全特性是令人滿意和臨床上可接受的。IV.8.2.免疫原性結(jié)果關(guān)于免疫應(yīng)答，用AS03佐劑化的大流行性流感候選疫苗對所有抗原內(nèi)容者卩觀'ji式(3.8ng,7.5pg,15fig禾口30pgHA,H5N1A/越南/1194/2004)均超出了歐洲官方對裂解病毒體流感疫苗的年注冊要求("NoteforGuidanceonHarmonisationofRequirementsforinfluenzaVaccines，，fortheimmuno-logicalassessmentoftheannualstrainchanges-CPMP/BWP/214/96),該要求目前用作評價大流行候選流感疫苗的基石出(Guidelineondossierstructureandcontentforpandemicinfluenzamarketingauthorizationapplication,CPMP/VEG/4717/03)。對于在該試一驗中須'j試的佐劑化大流行'性流感候選疫苗的四個不同抗原含量，在健康成人中是免疫原性的，其對流感血球凝集素形成出色的抗體應(yīng)答，通過HI測定(表23)。90表23<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>此外，評價對抗原性不同菌林(H5N1A/印度尼西亞/5/05)的交叉反應(yīng)性的數(shù)據(jù)(用血球凝集素抑制試驗)表明，在佐劑化組中，還產(chǎn)生了針對漂移菌抹的接種者的交叉引發(fā)。通過使用同源與異源菌抹的中和試驗的評價，完成血清測定。同樣，通過中和試驗，可以證明疫苗候選物的免疫原性和交叉保護潛力?？傊?，2劑量的新佐劑化大流行性流感候選疫苗可以在在3.8(ig的最低測試劑量、在4艮高比例的受試者中(針對疫苗株H5N1A/越南/1194/2004)誘導(dǎo)保護性滴度，優(yōu)于評價流感疫苗的免疫原性所建立的所有標準。此外，獲得的結(jié)果證明了候選大流行前疫苗針對漂移(drift)菌抹誘導(dǎo)免疫性的能力。該結(jié)果支持了要求保護的疫苗組合物在大流行情況下實現(xiàn)血清保護的用途，其中，大流行前引發(fā)是用包含菌抹(其對循環(huán)大流行菌林是異源的)的疫苗進行的。換句話說，要求保護的組合物可用于引發(fā)對漂移的大流行菌抹的隨后應(yīng)答。該結(jié)果支持了要求保護的組合物用異源和同源的1-和2-劑量來引發(fā)-力。強大流行單價(H5Nl)流感疫苗(用AS03佐劑化)的用途-用一或兩個劑量的佐劑化疫苗(包含一種大流行菌抹(例如越南菌抹))、以選擇的劑量(包括低HA數(shù)量)來引發(fā)患者，-幾個月以后(例如6或12個月以后)，隨后給予通過一個劑量的i)相同大流行菌抹(例如越南菌抹，即同源引發(fā)-加強)或ii)異源(例如印度尼西亞菌抹，即異源引發(fā)-加強)菌抹，作為加強。這種佐劑化疫苗的價值重要地在于如下狀況，在這種狀況中，在大流行開始之前或大約在大流4亍開始時，個體已經(jīng)一皮與'大流4亍'菌林相同的菌抹或與其不同的菌抹引發(fā)一次或兩次之后宣布大流行。權(quán)利要求1.單價流感疫苗組合物，其包含與佐劑組合的低量流感病毒抗原或抗原性制品，所述流感病毒或其抗原性制品得自流感病毒菌株，該流感病毒菌株與大流行爆發(fā)相關(guān)或具有與大流行爆發(fā)相關(guān)的潛力，其中低抗原數(shù)量每劑量不超過15μg的血細胞凝集素(HA)，和其中所述佐劑是水包油乳液，其包含可代謝油、甾醇或生育酚和乳化劑。2.按照權(quán)利要求l的組合物，其中所述生育盼是cc-生育酚。3.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的組合物，其中所迷可代謝的油是鯊烯。4.按照權(quán)利要求1至3的任一項的組合物，其中所述可代謝的油是以所述免疫原性組合物的總體積的0.5%至20%的量存在的。5.按照權(quán)利要求1至4的任一項的組合物，其中所述可代謝的油是以所述免疫原性組合物的總體積的1.0%至10%的量存在的。6.按照權(quán)利要求1至5的任一項的組合物，其中所述可代謝的油是以所述免疫原性組合物的總體積的2.0%至6.0%的量存在的。7.按照權(quán)利要求1至6的任一項的組合物，其中所述生育酚或oc-生育酚是以所述免疫原性組合物的總體積的1.0%至20%的量存在的。8.按照權(quán)利要求1至7的任一項的組合物，其中所述生育酚或a-生育酚是以所述免疫原性組合物的總體積的1.0%至5.0%的量存在的。9.按照權(quán)利要求1至8的任一項的組合物，其中鯊烯生育酚或鯊烯a生育酚的比例等于或小于1。10.按照權(quán)利要求1至9的任一項的組合物，其中所述乳化劑是Tween80。11.按照權(quán)利要求1至10的任一項的組合物，其中所述乳化劑是以所述免疫原性組合物的0.01至5.0。/。重量(w/w)的量存在的。12.按照權(quán)利要求1至11的任一項的組合物，其中所述乳化劑是以所述免疫原性組合物的0.1至2.0。/。重量(w/w)的量存在的。13.按照權(quán)利要求1至12的任一項的組合物，其中HA抗原的量不超過每劑量10pg。14.按照權(quán)利要求13的組合物，其中HA抗原的量每劑量不超過8|ug或4pg或2pg。15.:按照;K利要求12至14的任一項的組合物，其中HA抗原的量在每劑量1-7.5)Lig或1-5pg之間。16.按照權(quán)利要求15的組合物，其中HA抗原的量包含每種菌抹2.5至7.5pg之間的HA。17.按照權(quán)利要求1至16的任一項的組合物，其中所述大流行性流感病毒抹選自H5N1，H9N2，H7N7,H2N2,H7N1和H1N1。18.按照權(quán)利要求17的組合物，其中所述大流行性流感病毒林選自H5N1，H9N2，H7N7,H2N2,H7N1和H1N1。19.按照權(quán)利要求1至19的任一項的組合物，其中抗原或抗原組合物是下列形式純化的全流感病毒，無活性流感病毒，或流感病毒的亞單4立llH分。20.按照權(quán)利要求19的組合物，其中所述無活性流感病毒是裂解流感病毒。21.按照權(quán)利要求1至20的任一項的組合物，其中所述流感抗原或抗原性組合物源自于細胞培養(yǎng)物或在胚胎期的卵中制備。22.權(quán)利要求1至20的任一項所要求的組合物在藥物中的用途。23.—種試劑盒，其包括包含低數(shù)量流感病毒抗原或其抗原性制品的單元和包含權(quán)利要求1至12的任一項所定義的水包油佐劑的單元。24.按照權(quán)利要求23的試劑盒，其中所述抗原是HA。25.按照權(quán)利要求24的試劑盒，其中所述HA的數(shù)量如權(quán)利要求1或^l利要求13至16中所定義。26.制備用于大流行情況或大流4亍前的情況的流感疫苗組合物的方法，該方法包括將流感病毒抗原與水包油乳液佐劑混合，提供每劑量包含不超過15ng流感血細力包凝集素抗原的疫苗單元，所述流感病毒抗原得自單一流感病毒菌株，其與大流行爆發(fā)相關(guān)或具有與大流行爆發(fā)相關(guān)的潛力。27.權(quán)利要求26所要求的方法，其中水包油乳狀液佐劑如權(quán)利要求1至12的任一項所定義。28.(a)低數(shù)量的流感病毒抗原或其抗原性制品和(b)水包油乳液佐劑在制備權(quán)利要求1-22的任一項所要求的免疫原性組合物中的用途，所述流感病毒抗原或其抗原'性制品得自于單一流感菌林，其與大流行相關(guān)或具有與大流行有關(guān)的潛力，所述免疫原性組合物用于誘導(dǎo)以下至少一種i)改善的CD4T-細胞免疫應(yīng)答，ii)在人中針對所述病毒或抗原性組合物改善的B-細胞記憶應(yīng)答，iii)改善的體液應(yīng)答。29.按照權(quán)利要求28的用途，其中所述CD4T細胞免疫應(yīng)答包括誘導(dǎo)可交叉反應(yīng)的CD4T輔助應(yīng)答，或誘導(dǎo)可交叉反應(yīng)的體液免疫應(yīng)答。30.OM氏數(shù)量的大流4于性流感病毒抗原或其流感病毒血J求湊是集素抗原的抗原性制品，其得自于單一流感菌株，與大流行相關(guān)或具有與大流行有關(guān)的潛力，和(b)權(quán)利要求1至12的任一項所定義的水包油乳液佐劑，在制備用于針對流感病毒感染進行保護的批量疫苗或疫苗試劑盒中的用途。31.按照權(quán)利要求29至30的任一項的用途，其中所述免疫應(yīng)答或保護作用滿足至少一個、至少兩個、或所有三個關(guān)于流感疫苗效果的國際管理標準。32.按照權(quán)利要求28至31的任一項的用途，其中所述免疫應(yīng)答或保護作用是在一或兩個劑量的疫苗之后獲得的。33.按照權(quán)利要求29至32的任一項的用途，其中所述疫苗是胃腸外給予的。34.權(quán)利要求27至28的任一項所要求的方法或權(quán)利要求29至34的任一項所要求的用途，其中所述HA抗原數(shù)量如權(quán)利要求14至17的任一項所定義。35.流感病毒或其抗原性制品在制備免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于預(yù)先用權(quán)利要求1至21的任一項所要求的免疫原性組合物預(yù)先接種的人的再接種。36.按照權(quán)利要求35的用途，其中再接種所使用的組合物包含佐劑。37.按照權(quán)利要求36的用途，其中所述佐劑是水包油乳狀液佐劑。38.按照權(quán)利要求35至37的任一項的用途，其中所述用于再接種的免疫原性組合物包含流感病毒或其抗原性制品，所述流感病毒或其抗原性制品與大流行有關(guān)或具有與大流行有關(guān)的潛力。39.按照權(quán)利要求38的用途，其中所述大流行毒林選自H5N1，H9N2，H7N7,H2N2,H7N1和H1N1。40.按照權(quán)利要求38或權(quán)利要求39的用途，其中所述用于再接種的免疫原性組合物包含流感病毒或其抗原性制品，它們與用于第一次接種的流感病毒或其抗原性制品共有共同的CD4T-細胞表位或共同的B細胞表位。41.按照權(quán)利要求35至40的任一項的用途，其中首次接種用包含可潛在地引起大流行的流感菌林的流感組合物進行，再接種用包含循環(huán)大流4亍菌4朱的流感組合物進4亍。42.得自于第一種流感菌抹的抗原或抗原性制品在制備權(quán)利要求1至21的任一項所要求的免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于針對變異流感菌林所引起流感的保護作用。43.纟要照權(quán)利要求42的用途，其中第一種流感菌^f朱與大流^t有關(guān)或具有與大流行有關(guān)的潛力。44.^按照;f又利要求42的用途，其中變體流感菌^f朱與大流^t有關(guān)或具有與大流行有關(guān)的潛力。全文摘要本發(fā)明涉及單價流感疫苗制劑和針對流感疾病進行免疫的接種方式、它們在藥物中的用途，尤其是它們在增加對各種抗原的免疫響應(yīng)中的用途，和制備方法。尤其是，本發(fā)明涉及單價流感免疫原性組合物，該組合物包含與水包油乳液佐劑組合的流感抗原或其抗原性制品，所述流感抗原或其抗原性制品得自流感病毒株，毒株與大流行爆發(fā)相關(guān)或具有與大流行爆發(fā)相關(guān)的潛力，水包油型乳液佐劑包括可代謝的油、甾醇或生育酚例如α生育酚、和乳化劑。文檔編號A61K39/145GK101489586SQ200680055376公開日2009年7月22日申請日期2006年10月27日優(yōu)先權(quán)日2006年7月17日發(fā)明者E·J·哈農(nóng),J·斯蒂芬尼申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司