專(zhuān)利名稱(chēng)：：聚乙二醇-干擾素α綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物。
背景技術(shù)：
：干擾素由Isaacs和Lindenmann在1957年發(fā)現(xiàn)，已知具有優(yōu)秀的抗病毒效果[Isaacs等人，Virusinterference,147(1957)]。干擾素分為I型(IFN-a、(3、w)和II型(IFN-力，由干擾素產(chǎn)生的細(xì)胞是不同的，例如白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T-細(xì)胞等。從1986年起，許可了修飾干擾素a并開(kāi)始用作多毛細(xì)胞白血病的治療劑。因此，干擾素是通過(guò)基團(tuán)重組技術(shù)產(chǎn)生并用于治療癌癥的第一種細(xì)胞因子[Pestka等人，Semin.Oncol.,24(1997)]。干擾素a是具有抗病毒和抗腫瘤活性的藥學(xué)活性蛋白質(zhì)，已經(jīng)在全世界超過(guò)40個(gè)國(guó)家中被用于治療超過(guò)14種腫瘤和病毒性疾病。干擾素a在臨床上的有效治療領(lǐng)域是多毛細(xì)胞白血病、卡波西肉瘤、慢性髓性白血病(CML)、B-細(xì)胞淋巴瘤、T-細(xì)胞淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、腎細(xì)胞癌[NagabhushanT丄.等人,Regulatorypracticeforbiopharmaceuticalproduction,221-234(1994)]。而且，干擾素是第一種能夠提高癌癥患者壽命的人類(lèi)蛋白質(zhì)，并預(yù)期能用于不同種類(lèi)的腫瘤如卵巢癌、乳腺癌、支氣管癌、膀胱癌、胃癌等和急性白血病[MosbeTalpaz等人，SeminarsinHepatology,38(3)，22-27(2001)]。特別地，目前使用干擾素a-2a(IFNa-2a)、干擾素a-2b及作為其突變蛋白的復(fù)合干擾素-l(IFN-conl)治療乙型或丙型肝炎。而且，已經(jīng)報(bào)告，如果病毒如乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)的感染是慢性進(jìn)行性的，則存在所述感染可能發(fā)展為肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)。因此，可以使用干擾素來(lái)預(yù)防癌癥。然而，類(lèi)似于通過(guò)基因工程方法產(chǎn)生的酶、蛋白質(zhì)、激素、肽，干擾素作為臨床上有用的蛋白質(zhì)治療法具有這樣的問(wèn)題例如體內(nèi)低穩(wěn)定性、體內(nèi)快速消除、重復(fù)給藥導(dǎo)致生成抗體和由此引起超敏反應(yīng)。尤其是，頻繁給藥如每天一次、每周3次等誘發(fā)患者的疼痛。此外，對(duì)于需要長(zhǎng)期治療的那些患者，這樣的給藥可能威脅他們的生命質(zhì)量。為了改善這些問(wèn)題，作為能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定并保持活性的藥物，研制了修飾聚乙二醇的蛋白質(zhì)治療法，并在目前被使用。聚乙二醇是強(qiáng)親水性的，可以在與治療蛋白質(zhì)鍵合時(shí)提高溶解性。而且，聚乙二醇有效地提高與其鍵合的蛋白質(zhì)的分子量，同時(shí)保持主要的生物學(xué)功能如酶活性以及受體結(jié)合。由此，聚乙二醇可以降低腎小球?yàn)V過(guò)，并有效地保護(hù)蛋白質(zhì)免受蛋白水解酶的降解。因此，聚乙二醇具有防止蛋白質(zhì)降解、提高穩(wěn)定性和循環(huán)時(shí)間、以及降低免疫原性的優(yōu)點(diǎn)。常用的直鏈聚乙二醇的分子量為約1，000~25,000道爾頓，但是，由于蛋白質(zhì)和肽有限的生物活性區(qū)域，使得在將許多直鏈高分子結(jié)合到蛋白質(zhì)或肽上，同時(shí)保留它們的活性方面，所述直鏈聚乙二醇具有局限。為了改善直鏈聚乙二醇的這些問(wèn)題，Wana，H等人試圖通過(guò)使用三氯三嗪，將支化的單甲氧基聚乙烯(mPEG)衍生物結(jié)合到蛋白質(zhì)上[Wa叫H等人Ann.N.YAcad,Sci.613:95-108(1990)]。然而，活化的支化聚乙二醇衍生物的尺寸大，因此在蛋白質(zhì)或肽的表面上誘導(dǎo)了空間位阻，從而降低修飾蛋白質(zhì)或肽的活性。而且，由于不完全支化的聚乙二醇衍生物，所述衍生物通常引起低的純化收率。韓國(guó)專(zhuān)利0396983試圖改善所述支化高分子衍生物的這些問(wèn)題。特別地，所述專(zhuān)利試圖通過(guò)延長(zhǎng)連接基以連接高分子和蛋白質(zhì)，使與生物活性區(qū)域鍵合的連接基的數(shù)目最小化，來(lái)保護(hù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并降低由支化高分子誘導(dǎo)的空間位阻，從而使生物活性的減少最小化。然而，作為具有長(zhǎng)連接基的活化支化的高分子衍生物——三-PEG-NHS包含過(guò)多的小分子量直鏈PEG-NHS和二-PEG-NHS,它們是制備連接基結(jié)構(gòu)時(shí)的雜質(zhì)。它們競(jìng)爭(zhēng)性地參與對(duì)干擾素的鍵合反應(yīng)，并產(chǎn)生難以純化的低分子PEG-干擾素a綴合物和二-PEG-干擾素a綴合物。因此，該方法具有低純度和低收率的問(wèn)題。因此，仍然需要能夠?qū)⒏蓴_素a的生物活性下降最小化、并具有高純度和良好穩(wěn)定性的大分子聚乙二醇-干擾素綴合物。發(fā)明公開(kāi)發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物，與本領(lǐng)域已知的干擾素a和聚乙二醇-干擾素a綴合物相比，本發(fā)明的綴合物具有高生產(chǎn)純度和收率，提高了血液中的半衰期，并將干擾素的生物活性下降最小化；本發(fā)明還提供了所述綴合物的制備方法，以及包含所述綴合物的藥物組合物。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供將三支化聚乙二醇衍生物結(jié)合到干擾素a上并具有高純度的高分子，以及包含所述分子的藥物組合物。下文詳細(xì)解釋本發(fā)明。聚乙二醇-干擾素a綴合物通過(guò)三支化聚乙二醇衍生物與干擾素a的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生，并可以由下列通式(l)表示H2f0(CH2CH20)n-Z-Y-干擾素aHfO(CH2CH20)mCH3H2CO(CH2CH20)mCH3(l)其中n為1-1,000的整數(shù)，m為IO-I，OOO的整數(shù)。在上面的綴合物中，聚乙二醇的平均分子量為400-45,000道爾頓，優(yōu)選30，000-45，000道爾頓，更優(yōu)選43,000道爾頓。隨著聚乙二醇的分子量越高，高分子綴合物的藥代動(dòng)力學(xué)就越好，但活性降低。因此，適當(dāng)?shù)姆肿恿亢苤匾作為干擾素a與聚乙二醇之間的連接基，為(CH2)S或(CH2)sNHCO(CH2)s，其中S為l-6的整數(shù)。Y是仲胺或酰胺鍵，通過(guò)干擾素分子的NH2官能團(tuán)與聚乙二醇衍生物的官能團(tuán)的鍵合反應(yīng)形成。8而且，本發(fā)明提供制備如下述通式(l)中所示的三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物的方法，其中聚乙二醇的平均分子量為400-45,000道爾頓，優(yōu)選30,000-45，000道爾頓，更優(yōu)選43，000道爾頓。本發(fā)明的三支化聚乙二醇衍生物是具有結(jié)合了三個(gè)直鏈的生物學(xué)可接受的高分子的支化結(jié)構(gòu)的活化高分子。甘油結(jié)構(gòu)中的全部三個(gè)OH(羥基)區(qū)域都與乙二醇單元分子聚合，且一個(gè)區(qū)域的末端作為官能團(tuán)被活化。除了活化區(qū)域外，其他兩個(gè)區(qū)域被單甲氧基取代以防止另外的反應(yīng)。當(dāng)制備上述支化的聚乙二醇衍生物時(shí)，可以自由控制每個(gè)直鏈聚乙二醇的尺寸，由此可以制備具有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)和分子量的高分子并將其鍵合到干擾素a上。鍵合至干擾素a的支化聚乙二醇(PEG)衍生物由下列通式(2)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(2)其中，n為l-l，000的整數(shù)且m為10-1,000的整數(shù)。所述綴合物中聚乙二醇單元的平均分子量為400-45,000道爾頓，優(yōu)選30,000-45,000道爾頓，更優(yōu)選43,000道爾頓。X是能夠與含有干擾素a的蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)，如下述通式(3)中所示。優(yōu)選地，X為式(3)的化合物中的N-羥基琥珀酰亞胺(a)或醛(b)，在鍵合反應(yīng)中，分別以高收率與干擾素a形成酰胺鍵和仲胺結(jié)構(gòu)鍵。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(3)Z作為干擾素a與聚乙二醇之間的連接基，為(CH2)S或(CH2)sNHCO(CH2)s，其中S為1-6的整數(shù)。在本發(fā)明中，干擾素a與支化聚乙二醇衍生物的反應(yīng)摩爾比率為1:0.5至1:50。優(yōu)選地，干擾素a與支化聚乙二醇衍生物的摩爾比率為l:0.5至1:3。隨著聚乙二醇與干擾素a的摩爾比率增加，單位時(shí)間內(nèi)單聚乙二醇-干擾素a綴合物的收率下降。而且，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防干擾素a接受性疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的聚乙二醇-干擾素a綴合物作為活性成分。所述組合物可以包含有效劑量的本發(fā)明的聚乙二醇-干擾素a綴合物、稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。本發(fā)明的藥物組合物可以配制成注射劑、膠囊劑、片劑、液體藥物、丸劑、軟膏劑、眼膏劑、洗眼劑、透皮吸收藥、糊劑、泥敷劑、貼劑、氣霧劑等。而且，本發(fā)明的藥物組合物的有效劑量可以根據(jù)患者的年齡、狀況、體重等而變化，但通常為每周一次或兩周一次。而且，所述組合物可以在每日有效劑量范圍內(nèi)每天給藥一次或多次。此外，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防干擾素a接受性疾病的方法，所述方法包括將本發(fā)明的綴合物作為有效成分給藥。所述干擾素a接受性疾病包括多毛細(xì)胞白血病、卡波西肉瘤、慢性髓性白血病(CML)、B-細(xì)胞淋巴瘤、T-細(xì)胞淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、腎細(xì)胞癌。并且所述疾病包括卵巢癌、乳腺癌、支氣管癌、膀胱癌、胃癌等，以及其他癌癥如急性白血病。特別通過(guò)下列實(shí)施例解釋本發(fā)明。下述實(shí)施例意在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但非意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。發(fā)明效果本發(fā)明涉及具有甘油結(jié)構(gòu)的生物活性的新的三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物。因此，本發(fā)明的特征在于，通過(guò)克服一些問(wèn)題(線性聚乙二醇不能將許多直鏈高分子鍵合到蛋白質(zhì)或肽上；支化的高分子衍生物在蛋白質(zhì)或肽的表面上誘導(dǎo)過(guò)度的空間位阻；以及連接基被延長(zhǎng)的支化高分子衍生物因純度低而具有低純化收率等)而具有高純度和高收率，將生物活性的下降最小化并提高在血液中的半衰期。因此，本發(fā)明的包含具有抗病毒活性和抗腫瘤活性的聚乙二醇-干擾素a綴合物的藥物組合物與本領(lǐng)域已知的干擾素a治療藥相比，具有下列效果將活性的下降最小化，并能改善治療效果，且通過(guò)由于體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)而減少給藥頻率而能使患者的不適感最小化。附圖描述圖1為說(shuō)明實(shí)施例1通過(guò)尺寸排阻高效液相色譜法(下文中SE-HPLC)的分析結(jié)果的示意圖。圖2為說(shuō)明實(shí)施例2通過(guò)SE-HPLC的分析結(jié)果的示意圖。圖3為說(shuō)明比較例1通過(guò)SE-HPLC的分析結(jié)果的示意圖。圖4為說(shuō)明比較例2通過(guò)SE-HPLC的分析結(jié)果的示意圖。圖5為說(shuō)明比較例3通過(guò)SE-HPLC的分析結(jié)果的示意圖。圖6為說(shuō)明比較例4通過(guò)SE-HPLC的分析結(jié)果的示意圖。圖7為說(shuō)明實(shí)施例1通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀(下文中MALDI-TOF)的分析結(jié)果的示意圖。圖8為說(shuō)明實(shí)施例2通過(guò)MALDI-TOF的分析結(jié)果的示意圖。圖9為說(shuō)明比較例1通過(guò)MALDI-TOF的分析結(jié)果的示意圖。圖10為說(shuō)明比較例2通過(guò)MALDI-TOF的分析結(jié)果的示意圖。圖11為說(shuō)明通過(guò)使用水皰性口炎病毒和Marbin-Darby牛腎細(xì)胞(MDBK)所得的，實(shí)施例1與比較例1和3的經(jīng)聚乙二醇修飾的干擾素a綴合物對(duì)致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE;)的抑制結(jié)果的示意圖。圖12為說(shuō)明干擾素a和實(shí)施例1的聚乙二醇-干擾素a綴合物的藥代動(dòng)力學(xué)的比較分析結(jié)果的示意圖。圖13為說(shuō)明通過(guò)使用Daudi細(xì)胞所得的，干擾素a和實(shí)施例1的聚乙二醇-干擾素a綴合物的抗腫瘤活性的效應(yīng)比較結(jié)果的示意圖。圖14為說(shuō)明干擾素a和實(shí)施例1的經(jīng)三支化聚乙二醇(PEG，MW43,000)修飾的干擾素a綴合物的生物活性根據(jù)溫度變化而改變的比較結(jié)果的示意圖。圖15為說(shuō)明干擾素a和實(shí)施例1的經(jīng)聚乙二醇修飾的干擾素a綴合物的生物活性的分析結(jié)果的示意圖。實(shí)施例<實(shí)施例1>通過(guò)使用三支化聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺，制備式(l)的三支化聚乙二醇(MW43,000Da)-干擾素a綴合物(I)將68mg分子量為43,000道爾頓的三支化聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺(NOFcorporation,日本)添加到在100mMN，N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH8.0)中的10mg干擾素a(Dong-APharm.Co.，Ltd.)中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。接著，通過(guò)添加0.1M甘氨酸終止反應(yīng)。將反應(yīng)物放入用40mMNaH2P04(pH4.0)緩沖溶液平衡過(guò)的Hiprep26/10(AmershamPharmaciaBiotech)脫鹽柱中，并通過(guò)用相同的緩沖溶液洗脫來(lái)改變緩沖溶液。通過(guò)該反應(yīng)除去與三支化聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺分離的N-羥基琥珀酰亞胺。將洗脫劑放入用40mMNaH2P04(pH4.0)緩沖溶液平衡過(guò)的SP瓊脂糖凝膠(SP-Sepharose)快速流陽(yáng)離子交換色譜(AmershamPharmaciaBiotech)中，然后通過(guò)液相色譜分離聚乙二醇-干擾素a綴合物。使用0~500mM濃度梯度的氯化鈉(NaCl)分餾聚乙二醇-干擾素a綴合物。通過(guò)HPLC和SDS-PAGE證實(shí)分餾洗脫物的形式和尺寸。并排除與干擾素a鍵合的二-三支化或三-三支化聚乙二醇形式的綴合物和在反應(yīng)后剩12余的未修飾干擾素a，以獲得標(biāo)題綴合物---個(gè)三支化聚乙二醇(MW43，000)與干擾素a鍵合的聚乙二醇-干擾素a綴合物(或者稱(chēng)為單-三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物)。通過(guò)尺寸排阻高效液相色譜法，證實(shí)反應(yīng)物的混合物由約47%單-聚乙二醇-干擾素a綴合物(單-PEG-IFNa)、約36%未修飾的干擾素a(IFNa)和其他物質(zhì)[二-PEG化的干擾素a綴合物(二-PEG-IFNa)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)]組成《參見(jiàn)圖1;在280nm測(cè)量吸光度；(a)二-PEG-IFNa的保留時(shí)間為約8分鐘，(b)單-PEG-IFNa的保留時(shí)間為約9分鐘，(c)IFNa的保留時(shí)間為約13.5分鐘，(d)NHS的保留時(shí)間為約15.3分鐘}。再通過(guò)使用MALDI-TOF分析分離的單-三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物，如圖7所示，其值為65943.2(m/z)(參見(jiàn)圖7)。<實(shí)施例2>通過(guò)使用三支化聚乙二醇醛，制備三支化聚乙二醇(MW43,000Da)-干擾素a綴合物(II)將68mg分子量為43,000道爾頓的三支化聚乙二醇醛(NOFcorporation,日本)添加到在40mM乙酸鈉(C2H3Na02)緩沖液(pH4.0)中的10mg干擾素a(Dong-APharm.Co.，Ltd.)中。將反應(yīng)混合物在低溫下攪拌14小時(shí)。接著，將反應(yīng)物放入用40mMNaH2P04(pH4.0)緩沖溶液平衡過(guò)的Hiprep26/10(AmershamPharmaciaBiotech)脫鹽柱內(nèi)，然后通過(guò)用相同的緩沖溶液洗脫來(lái)改變緩沖溶液。然后，將洗脫液放入用40mMNaH2P04(pH4.0)緩沖溶液平衡過(guò)的SP瓊脂糖凝膠快速流陽(yáng)離子交換色譜(AmershamPharmaciaBiotech)中，并通過(guò)液相色譜分離聚乙二醇-干擾素a綴合物。使用0~500mM濃度梯度的氯化鈉(NaCl)分餾聚乙二醇-干擾素a綴合物。通過(guò)HPLC和SDS-PAGE，從分餾的洗脫物中排除在反應(yīng)后剩余的干擾素a，以獲得標(biāo)題綴合物——聚乙二醇(MW43,000)-干擾素a綴合物(II)(單-三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物)，其中只有一個(gè)三支化聚乙二醇與干擾素a的N-末端鍵合。通過(guò)尺寸排阻高效液相色譜法，證實(shí)混合物由約42%單-聚乙二醇-干擾素a綴合物(單-PEG-IFNa)和約55%未修飾的干擾素a(IFNa)組成(參見(jiàn)圖2;在280nm測(cè)量吸光度；(a)單-PEG-IFNa的保留時(shí)間為約9.5分鐘，(b)IFNa的保留時(shí)間為約14分鐘}。接著，通過(guò)使用MALDI-TOF證實(shí)分離的單-三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物的純度和分子量，其值為66141.9(m/z)(參見(jiàn)圖8)。<比較例1>使用二支化聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺制備二支化聚乙二醇(MW40,000Da)-干擾素a綴合物(III)將63mg分子量為40,000道爾頓的二支化聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺(NOFcorporation,日本)添加到在100mMN,N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH8.0)中的通過(guò)己知方法[Pestka，Sci.Am.249，36(1983)]制備的10mg干擾素a中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。接著，通過(guò)添加O.lM甘氨酸終止反應(yīng)。將反應(yīng)物放入用40mMNaH2P04(pH4.0)緩沖溶液平衡過(guò)的Hiprep26/10(AmershamPharmaciaBiotech)脫鹽柱內(nèi)，并通過(guò)用相同的緩沖溶液洗脫來(lái)改變緩沖溶液。通過(guò)該反應(yīng)除去與三支化聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺分離的N-羥基琥珀酰亞胺。將洗脫液放入用40mMNaH2P04(pH4.0)緩沖溶液平衡過(guò)的SP瓊脂糖凝膠快速流陽(yáng)離子交換色譜(AmershamPharmaciaBiotech)中，并通過(guò)使用液相色譜從中分離聚乙二醇-干擾素a綴合物。使用0~500mM濃度梯度的氯化鈉(NaCl)分餾聚乙二醇-干擾素a綴合物。通過(guò)HPLC和SDS-PAGE證實(shí)分餾的洗脫物的形式和尺寸。接著，從中除去在反應(yīng)后剩余的干擾素a和其中兩(2)個(gè)或更多個(gè)二支化聚乙二醇與干擾素a鍵合的干擾素a綴合物，以獲得標(biāo)題綴合物，其中只有一個(gè)二支化聚乙二醇與干擾素a鍵合的干擾素a綴合物。通過(guò)尺寸排阻高效液相色譜法，證實(shí)混合物由約40%單-聚乙二醇-干擾素a綴合物(單-PEG-IFNa)、約50%未修飾的干擾素a(IFNa)和其他物質(zhì)[二-PEG化的干擾素a綴合物(二-PEG-IFNoc)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)]組成{參見(jiàn)圖3;在M0nm測(cè)量吸光度；(a)二-PEG-IFNa的保留時(shí)間為約8分鐘，(b)單-PEG-IFNa的保留時(shí)間為約9分鐘，(c)IFNa的保留時(shí)間為約13.5分鐘，(d)NHS的保留時(shí)間為約15分鐘}。接著，通過(guò)使用MALDI-TOF測(cè)量分離的單-二支化聚乙二醇-干擾素a綴合物的分子量，其值為62708.2(m/z)(參見(jiàn)圖9)。<比較例2>通過(guò)使用二支化聚乙二醇醛，制備二支化聚乙二醇(MW40,000Da)-干擾素a綴合物(IV)將63mg分子量為40,000道爾頓的二支化聚乙二醇酸(NOFcorporation,日本)添加到在40mM乙酸鈉(C2H3Na02)緩沖液(pH4.0)中的10mg干擾素a(Dong-APharm.Co.，Ltd.)中。將反應(yīng)混合物在低溫下攪拌10~14小時(shí)。接著，將反應(yīng)物放入用40mMNaH2PO4(pH4.0)緩沖溶液平衡過(guò)的Hiprep26/10(AmershamPharmaciaBiotech)脫鹽柱中，然后通過(guò)用相同的緩沖溶液洗脫來(lái)改變緩沖溶液。然后，將洗脫物放入用40mMNaH2P04(pH4.0)緩沖溶液平衡過(guò)的SP瓊脂糖凝膠快速流陽(yáng)離子交換色譜(AmershamPharmaciaBiotech)中，并通過(guò)液相色譜分離聚乙二醇-干擾素a綴合物。使用0~500mM濃度梯度的氯化鈉(NaCl)分餾反應(yīng)物。通過(guò)HPLC和SDS-PAGE證實(shí)分餾的的洗脫物。接著，從中除去在反應(yīng)后剩余的干擾素a，以獲得聚乙二醇-千擾素a綴合物(II)，其中只有一個(gè)二支化聚乙二醇與干擾素a綴合物的N-末端鍵合。通過(guò)尺寸排阻高效液相色譜法，證實(shí)混合物由約37%單-聚乙二醇-干擾素a綴合物(單-PEG-IFNa)和約60%未修飾的干擾素a(IFNa)組成(參見(jiàn)圖4;在280nm測(cè)量吸光度；(a)單-PEG-IFNa的保留時(shí)間為約9.5分鐘，(b)IFNa的保留時(shí)間為約14分鐘}。并且，通過(guò)使用MALDI-TOF測(cè)量分離的單-三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物的分子量，其值為62718.9(m/z)(參見(jiàn)圖10)。<比較例3>制備聚乙二醇-干擾素a綴合物，其中具有N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS酯)官能團(tuán)的賴(lài)氨酸結(jié)構(gòu)的二支化聚乙二醇(MW40,000Da)與干擾素a鍵合根據(jù)韓國(guó)專(zhuān)利10-0254097中描述的方法，通過(guò)將50mg干擾素a與二支化聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺(Nektar,America,平均分子量=40,000道爾頓)反應(yīng)來(lái)制備二支化聚乙二醇(MW40,000)-干擾素a綴合物。15通過(guò)尺寸排阻高效液相色譜法，證實(shí)混合物由約17%單-聚乙二醇-干擾素a綴合物(單-PEG-IFNa)、約74%未修飾的干擾素a(IFNa)和其他物質(zhì)[二-PEG化的干擾素a綴合物(二-PEG-IFNa)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)]組成(參見(jiàn)圖5;在280nm測(cè)量吸光度；(a)二-PEG-IFNa的保留時(shí)間為約8.5分鐘，(b)單-PEG-IFNa的保留時(shí)間為約9.5分鐘，(c)IFNa的保留時(shí)間為約14分鐘，(d)NHS的保留時(shí)間為約16.5分鐘}。<比較例4>制備聚乙二醇-干擾素a綴合物，其中具有N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS酯)官能團(tuán)的賴(lài)氨酸結(jié)構(gòu)的三支化聚乙二醇(MW43,000Da)與干擾素a鍵合通過(guò)韓國(guó)專(zhuān)利10-0396983中描述的方法制備三-PEG-NHS(MW43,000)，然后與3mg干擾素a反應(yīng)以獲得三支化聚乙二醇(MW43，000)干擾素a綴合物。通過(guò)尺寸排阻高效液相色譜法，證實(shí)混合物由約32%單-聚乙二醇-干擾素a綴合物(單-PEG-IFNa)、約52%未修飾的干擾素a(IFNa)和其他物質(zhì)[二-PEG化的干擾素a綴合物(二-PEG-IFNa)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)]組成(參見(jiàn)圖6;在280nm測(cè)量吸光度；(a)二-PEG-IFNa的保留時(shí)間為約8.5分鐘，(b)單-PEG-IFNa的保留時(shí)間為約9.5分鐘，(c)IFNa的保留時(shí)間為約14分鐘，(d)NHS的保留時(shí)間為約16.5分鐘}。通過(guò)使用上文制備的綴合物進(jìn)行特征描述和藥理學(xué)活性試驗(yàn)，其結(jié)果如下。<實(shí)驗(yàn)例1>聚乙二醇衍生物和干擾素a的反應(yīng)性試驗(yàn)為了試驗(yàn)上文使用的聚乙二醇衍生物和干擾素a的反應(yīng)性，通過(guò)尺寸排阻高效液相色譜法，由峰面積(圖l-6)確定通過(guò)使干擾素a與聚乙二醇反應(yīng)產(chǎn)生的單-聚乙二醇-干擾素a綴合物的量和未修飾的干擾素a的量，如實(shí)施例1和2與比較例1至4中所示。從而，可以獲得干擾素a對(duì)聚乙二醇結(jié)構(gòu)的反應(yīng)性(參見(jiàn)表l和2)。考慮未修飾的干擾素a的剩余量和所產(chǎn)生的單-聚乙二醇-干擾素a綴合物的量，實(shí)施例1和2中的三支化聚乙二醇與干擾素a的結(jié)合反應(yīng)性更加優(yōu)秀。<實(shí)驗(yàn)例2>聚乙二醇-干擾素a綴合物的分子量和收率通過(guò)MALDI-TOF分析由實(shí)施例1和2以及比較例1和2獲得的高純度聚乙二醇-干擾素a綴合物，以證實(shí)結(jié)果對(duì)應(yīng)于預(yù)期的分子量(參見(jiàn)圖7、8、9和10)?？紤]未修飾的干擾素a的量和所產(chǎn)生的單-聚乙二醇-干擾素a綴合物的收率，證實(shí)了實(shí)施例1和2具有極佳的純化收率[參見(jiàn)表l(比較使用N-羥基琥珀酰亞胺的聚乙二醇衍生物和干擾素a的反應(yīng)性和收率)和表2(比較使用醛的聚乙二醇衍生物和干擾素a的反應(yīng)性和收率)]。表1PEG-IFNa產(chǎn)生的單-PEG-IFNa(%)未修飾的IFNa(%)收率(％)實(shí)施例1473623比較例1415020比較例3177411比較例432521表2PEG-IFNa產(chǎn)生的單-PEG-IFNa(%)未修飾的IFNa(%)收率(％)實(shí)施例2425528比較例2376024<實(shí)驗(yàn)例3>聚乙二醇-干擾素a綴合物的抗病毒活性試驗(yàn)和體外活性試驗(yàn)為研究上文使用的聚乙二醇衍生物和干擾素a綴合物關(guān)于干擾素a的活性的效果，使用Marbin-Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞，通過(guò)致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)測(cè)定法，測(cè)量在實(shí)施例1以及比較例1和3中產(chǎn)生的各單-聚乙二醇-干擾素a綴合物的抗病毒活性。用水皰性口炎病毒(VSV)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行攻擊。并且，還測(cè)量了它們相對(duì)于干擾素a的活性(參見(jiàn)圖11)。為測(cè)量相對(duì)活性，將干擾素a稀釋105倍，將比較例1的聚乙二醇-干擾素a綴合物稀釋2X105倍，將實(shí)施例1的聚乙二醇-干擾素oi綴合物稀釋105倍并將比較例3的聚乙二醇-干擾素a綴合物稀釋2X104倍。在2-倍系列稀釋后，將它們添加到Marbin-Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞中，并用水皰性口炎病毒(VSV)進(jìn)行攻擊。之后，計(jì)算顯示TCIDso值(組織培養(yǎng)感染劑量，感染50%組織培養(yǎng)細(xì)胞的劑量)的連續(xù)稀釋比值，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法獲得各活性值。下述表3所示的結(jié)果指示，與二支化聚乙二醇-干擾素a綴合物相比，在三支化聚乙二醇-干擾素(x綴合物中，通過(guò)聚乙二醇改性所致的生物活性下降較小[參見(jiàn)表3(聚乙二醇-干擾素cx綴合物的生物活性)]。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><試驗(yàn)例4>聚乙二醇-干擾素a綴合物的藥效試驗(yàn)通過(guò)將干擾素a和實(shí)施例1的聚乙二醇-干擾素a綴合物皮下注射至體重為240~260g的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(SpragueDawley大鼠)中，進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)。在以1X1(flU/頭的量對(duì)它們注射后，在注射0分鐘、30分鐘、l小時(shí)、4小時(shí)、IO小時(shí)、24小時(shí)、34小時(shí)、2天、3天、4天、5天、6天和7天后，從大鼠中收集血樣。通過(guò)致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)測(cè)定法測(cè)量樣品的抗病毒活性，由此獲得干擾素a和聚乙二醇-干擾素a綴合物的半衰期(丁1/2)值(參見(jiàn)圖12)。與干擾素a相比，實(shí)施例1的三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物在血液中的半衰期提高了9.2倍[參見(jiàn)表4(干擾素a和聚乙二醇-干擾素a在大鼠(SpragueDawley大鼠)中的藥效學(xué))]。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>Tmax(小時(shí))148MRT(小時(shí))5.487.9CL/F(ml/hr/kg)893.62.52Vss/F(ml/kg)4803.8221.4Tl/2(小時(shí))4.541.5AUC(IU*hr/ml)1.12E+043.97E+06*上表中的縮寫(xiě)具有下列含義Tmax:達(dá)到最大濃度的時(shí)間Cmax:血液中的最大濃度MRT:血液中的平均殘留時(shí)間CL/F:總血漿清除率Vss/F:穩(wěn)態(tài)表觀分布容積tl/2:消除半衰期AUC:濃度時(shí)間曲線下面積<實(shí)驗(yàn)例5>聚乙二醇-干擾素a綴合物的抗腫瘤活性試驗(yàn)Daudi細(xì)胞(ATCCCCL-213)在37°C,002培養(yǎng)箱中，在添加了10%胎牛血清和0.5%青霉素-鏈霉素的RAPI1640(Gibco,美國(guó))培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天。在完成培養(yǎng)后，用培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌一次，然后稀釋以制成1(^個(gè)細(xì)胞/ml的密度。將干擾素a和實(shí)施例1的三支化聚乙二醇-干擾素ot綴合物分別稀釋至2mg/ml和19.2mg/ml。接著，將這些溶液各自連續(xù)稀釋10-倍，制得具有不同濃度的IO份樣品。之后，在96-微板的除了對(duì)照孔的所有孔中制備100^稀釋劑/L，向?qū)φ湛字刑砑?0^包含VSV的維持培養(yǎng)基。作為對(duì)照，制備包含細(xì)胞和病毒但不含樣品的孔。將微板在C02培養(yǎng)箱中，在37。C溫育5天。5天后，向每個(gè)孔中添加40^包含PMS(Promega,美國(guó))的MTS溶液，然后將其溫育1.5小時(shí)。在490nm測(cè)量它們的吸光度，以計(jì)算ECs。(50。/。有效濃度)。圖13所示的結(jié)果指示，聚乙二醇-干擾素ct綴合物具有與千擾素a相似的抗腫瘤活性(參見(jiàn)圖13)。<實(shí)驗(yàn)例6>聚乙二醇-干擾素a綴合物的溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)將干擾素a和實(shí)施例1的三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物添加到40mMNaH2P04(pH5.0)緩沖溶液中，以分別制得1mg/ml濃度的溶液。在0°C、20°C、37°C、50°C、7(TC和IO(TC將其溫育15分鐘，并冷卻至室溫，測(cè)量它們的生物活性(參見(jiàn)圖14)。圖14的結(jié)果指示，聚乙二醇-干擾素a綴合物比未修飾的千擾素a在藥學(xué)上更穩(wěn)定。<實(shí)驗(yàn)例7>聚乙二醇-干擾素a綴合物的抗胰蛋白酶消化的穩(wěn)定性試驗(yàn)用緩沖溶液將干擾素a和實(shí)施例1的三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物制成1mg/ml的濃度，分別將1mg胰蛋白酶(pH7.0)添加到每毫升溶液中，以在室溫下誘導(dǎo)蛋白酶解。在開(kāi)始反應(yīng)5分鐘、10分鐘、20分鐘、40分鐘、和60分鐘后，收集等份的每種溶液，并測(cè)量它們的生物活性(參見(jiàn)圖15)。結(jié)果顯示，聚乙二醇-干擾素a綴合物比未修飾的干擾素a更穩(wěn)定地抗蛋白酶。工業(yè)適用性本發(fā)明涉及具有甘油結(jié)構(gòu)的生物活性的新三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物。因此，本發(fā)明的特征在于，通過(guò)克服一些問(wèn)題(線性聚乙二醇不能將許多直鏈高分子鍵合到蛋白質(zhì)或肽上；支化的高分子衍生物在蛋白質(zhì)或肽表面上誘導(dǎo)過(guò)度的空間位阻；以及連接基被延長(zhǎng)的支化高分子衍生物因純度低而具有低純化收率等)而具有高純度和高收率，將生物活性的下降最小化并提高在血液中的半衰期。因此，本發(fā)明的具有抗病毒活性和抗腫瘤活性的包含聚乙二醇-干擾素a綴合物的藥物組合物與本領(lǐng)域已知的干擾素a治療劑相比，具有下列效果將活性的下降最小化，并能改善治療效果，且通過(guò)由于體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)而減少給藥頻率而能改善患者的依從性。20權(quán)利要求1.通式(1)的三支化聚乙二醇-干擾素α綴合物，其中聚乙二醇的平均分子量為400-45,000道爾頓，其中，n為1-1,000的整數(shù)；m為10-1,000的整數(shù)；Z作為干擾素α與聚乙二醇之間的連接基，為(CH2)S或(CH2)SNHCO(CH2)S，其中S為1-6的整數(shù)；Y是仲胺或酰胺鍵，其為干擾素分子中的NH2官能團(tuán)與聚乙二醇衍生物的官能團(tuán)之間的鍵。2.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量為30,000-45,000道爾頓。3.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量為43,000道爾頓。4.制備通式(l)的三支化聚乙二醇-干擾素a綴合物的方法，其中聚乙二醇的平均分子量為400-45,000道爾頓，所述方法包括使通式(2)的支化聚乙二醇衍生物與干擾素a形成共價(jià)鍵，H2CO(CH2CH20)n-Z-Y-干擾素aHfO(CH2CH20)mCH3H2CO(CH2CH20)mCH3(1)其中，n為1-1,000的整數(shù)；m為10-1,000的整數(shù)；Z作為干擾素a與聚乙二醇之間的連接基，為(CH2)S或(CH2)sNHCO(CH2)s，其中S為1-6的整數(shù)；Y是仲胺或酰胺鍵，其為干擾素分子的NH2官能團(tuán)與聚乙二醇衍生物的官能團(tuán)之間的鍵；H2CO(CH2CH20)n-XH—0(CH2CH20)mCH3H2CO(CH2CH20)mCH3(2)其中，n為1-1,000的整數(shù)；m為10-1,000的整數(shù)；X是由下面通式(3)表示的官能團(tuán)，其能與含有干擾素a的蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>Z作為干擾素a與聚乙二醇之間的連接基，為(CH2)S或(CH2)sNHCO(CH2)s，其中S為1-6的整數(shù)。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量為30,000-45,000道爾頓。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量為43,000道爾頓,7.權(quán)利要求4的方法，其中X為通式(3)中的(a)或(b)。8.權(quán)利要求4的方法，其中干擾素a與三支化聚乙二醇衍生物的摩爾比率為1:0.5至1:50。9.權(quán)利要求8的方法，其中干擾素a與三支化聚乙二醇衍生物在反應(yīng)中的摩爾比率為1:0.5至1:3。10.用于治療或預(yù)防干擾素a接受性疾病的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1、2或3之任一項(xiàng)的綴合物作為有效成分。11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述干擾素a接受性疾病為多毛細(xì)胞白血病、卡波西肉瘤、慢性髓性白血病(CML)、B-細(xì)胞淋巴瘤、T-細(xì)胞淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤和腎細(xì)胞癌。12.治療或預(yù)防干擾素a接受性疾病的方法，所述方法包括給藥權(quán)利要求l、2或3之任一項(xiàng)的綴合物作為有效成分。全文摘要本發(fā)明涉及通式(1)的三支化聚乙二醇-干擾素α綴合物，其中聚乙二醇的平均分子量為400-45,000道爾頓，還涉及包括所述綴合物的藥物組合物。通式(1)的生物活性的聚乙二醇-干擾素α綴合物具有抗病毒和抗腫瘤活性、由反應(yīng)中的高反應(yīng)性帶來(lái)的改善的收率和純度，并具有顯著提高血液中的半衰期和使干擾素的生物活性的下降最小化的效果。文檔編號(hào)A61K47/48GK101448525SQ200680054576公開(kāi)日2009年6月3日申請(qǐng)日期2006年5月12日優(yōu)先權(quán)日2006年5月12日發(fā)明者全炫圭,姜壽亨,崔允圭,張惠仁,曹永宇,李圣熙,柳沅英,金炳文申請(qǐng)人:東亞制藥株式會(huì)社